CN117897479A - 使用细菌酶氧官能化多种底物的方法 - Google Patents

使用细菌酶氧官能化多种底物的方法 Download PDF

Info

Publication number
CN117897479A
CN117897479A CN202280056969.3A CN202280056969A CN117897479A CN 117897479 A CN117897479 A CN 117897479A CN 202280056969 A CN202280056969 A CN 202280056969A CN 117897479 A CN117897479 A CN 117897479A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
substrate
calpain
peroxidase activity
amino acid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202280056969.3A
Other languages
English (en)
Inventor
尼古拉·龙卡
许霍·范贝克
马可·威尔海尔默斯·弗拉耶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hegao Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Hegao Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hegao Biotechnology Co ltd filed Critical Hegao Biotechnology Co ltd
Publication of CN117897479A publication Critical patent/CN117897479A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y111/00—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11)
    • C12Y111/02—Oxidoreductases acting on a peroxide as acceptor (1.11) with H2O2 as acceptor, one oxygen atom of which is incorporated into the product (1.11.2)
    • C12Y111/02003—Plant seed peroxygenase (1.11.2.3)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明涉及蛋白质工程和生物催化领域，特别涉及使用细菌酶氧化脂肪族烯烃和萜烯的方法。提供了用于氧官能化所关注的底物的方法，包括使脂肪族烯烃或萜烯底物与过氧化氢源和具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(EC 1.11.2.1)接触，其中多肽选自由以下各项组成的组：(a)多肽，包括当与表1中所示的Seq.No.2的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少50％配对序列一致性的氨基酸序列，并且包括至少以下血红素配合基序：i)HXXFFD；ii)H(X)XD，其中X是任何氨基酸；和(b)(a)的多肽的片段，具有油体钙蛋白样过氧化酶活性。

Description

使用细菌酶氧官能化多种底物的方法
技术领域
本发明涉及蛋白质工程和生物催化领域。更具体地，本发明涉及新的多肽，除其他之外，这些多肽能够使环状和非环状脂肪族烯烃、萜烯、乙烯基芳烃以及相关化合物氧化。本发明还涉及与其相关的方法和用途。
背景技术
萜烯是主要由植物、特别是针叶树产生的一类不饱和烃。萜烯进一步以碳数分类：单萜烯(C10)、倍半萜烯(C15)、二萜烯(C20)等。(https://en.wikipedia.org/wiki/Terpene)。由于它们的高挥发性和令人愉悦的嗅觉特性，因而萜烯对于调味品和香料工业、以及对于食品&饲料、以及当改性时对于药物和精细化学品工业是高度受关注的。萜烯的氧官能化、特别是以立体-、区域-和对映体选择性方式的羟基化和环氧化是经常需要的反应。一些单萜，像α-蒎烯、β-蒎烯、3-蒈烯、柠檬烯(苧烯，limonene)、莰烯、萜品油烯(异松油烯，terpinolene)已经被认为是可用于工业应用的可再生原料。
这项工作建立在植物种子过氧化酶的已知特性上，植物种子过氧化酶已经被描述为属于油体钙蛋白样(钙结合)蛋白(J.Biol.Chem.Vol.281,NO.44,pp.33140-33151,2006年11月3日)。这些是包含血红素的蛋白质，其包含EF-手钙结合基序。这些蛋白质发现于燕麦微粒体(microsomes)和脂滴(lipid droplets)中，它们是膜结合的并且它们催化不饱和脂肪酸的氢过氧化物依赖性单加氧，从而作为产物产生脂肪酸氢过氧化物。在植物中，它们与环氧化物水解酶一起形成所谓的“过氧化酶途径”。参见例如US2012/03019323，其涉及由于油体钙蛋白多肽的表达而具有增加的油含量的重组含油微生物。具体公开了来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)的植物油体钙蛋白。Blée等人(FEBS J.279(2012),3981-3995)报道了拟南芥油体钙蛋白样过氧化酶的环氧化功能。
Fuchs等人(J.Mol.Catalysis B:Enzymatic 96(2013)52-60)公开了番茄(Solanum lycopersicum)油体钙蛋白样过氧化酶用于萜烯的氧官能化的用途。
各种报道可见于描述植物油体钙蛋白和真菌同源物的重组生产的文献中。然而，在商业规模上应用这些酶受到多种障碍的阻碍。现有的油体钙蛋白样/过氧化酶的改善和(工业)应用的主要缺点是它们是真菌或植物来源的事实。这需要植物或真菌表达系统，这阻碍了生产和工程化的努力。
因此，本发明人提出克服至少部分的这些缺点。更具体地，提出鉴定(识别，确认，identify)非真菌和非植物来源的并具有高底物混杂性(即，对多组(商业相关的)底物示出油体钙蛋白样过氧化酶活性)的新酶。理想地，该酶可以在快速生长且易于操作的宿主细胞(例如，酵母宿主细胞)中以高水平表达，或更优选地在甚至更快速生长且更易于操作的宿主细胞(例如，细菌宿主细胞)中表达。
发明内容
出人意料地发现，使用拟南芥油体钙蛋白(AEE85247.1)的序列，可以鉴定出多种对各种萜烯和其他不饱和分子显示出所需催化活性(即，环氧化和羟基化)的细菌同源物。这些酶可以以良好的产率在细菌中表达和从细菌中纯化。开发了使用洗涤剂(除垢剂，detergent)的容易程序，用于从宿主细胞中分离重组产生的酶。此外，使用分泌信号，重组蛋白的产量可以增加并且其定位可以靶向膜和周质(外周胞质，periplasm)。有利地，这些酶可以以分离的形式和以全细胞的形式使用。
这种转化的主要产物是可以自发地或使用催化剂(化学的或酶促的)进一步水解的环氧化物。我们设想在此描述的酶和方法可以用于F&F、化妆品和食品&饮料。除了那些应用之外，存在使用改性的萜烯和不饱和结构单元作为药物和聚合物工业中的结构单元的潜力。
因此，本发明涉及具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的分离的多肽，其选自由以下各项组成的组：
(a)多肽，包括当与Seq.No.2(参见图1；表1)的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少50％配对序列一致性的氨基酸序列，并且包括至少以下血红素配合基序(heme-coordinating motifs)：
i)HXXFFD，
ii)H(X)XD，优选HXXD，更优选HXSD，最优选HGSD，其中X是任何氨基酸；
(b)(a)的多肽的片段，具有油体钙蛋白样过氧化酶活性。
在一个实施方式中，本发明提供了一种用于所关注的底物的氧官能化的方法，包括使环状或非环状脂肪族烯烃或萜烯底物与过氧化氢源和具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(EC 1.11.2.1)接触，其中该多肽选自由以下各项组成的组：
(a)多肽，包括当与图1中所示的序列的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少50％配对序列一致性的氨基酸序列，并且包括至少以下血红素配合基序：
i)HXXFFD；
ii)H(X)XD，优选HXXD，更优选HXSD，最优选HGSD；其中X是任何氨基酸；以及
(b)(a)的多肽的片段，具有油体钙蛋白样过氧化酶活性。
在具体方面中，本发明提供了一种用于所关注的底物的氧官能化的方法，包括使底物与过氧化氢源和具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(EC 1.11.2.1)接触，其中该多肽是细菌来源的并且选自由以下各项组成的组：
(a)多肽，包括优选地当与图1的Seq.NO.2-10中描绘的细菌序列中的任一个的至少150个连续氨基酸残基比对时具有至少60％配对序列一致性的氨基酸序列，并且包括至少以下血红素配合基序：
i)HXXFFD；
ii)H(X)XD，优选HXXD，更优选HXSD，其中X是任何氨基酸；以及
(b)(a)的多肽的片段，具有油体钙蛋白样过氧化酶活性。
现有技术并未教导或建议在本文中鉴定的细菌多肽，更不用说它们有利地用于所关注的底物的氧官能化。
在此使用的术语“具有油体钙蛋白样过氧化酶活性”是指催化不饱和脂肪酸环氧化的能力。示例性的活性包括环氧化，例如油酸的环氧化。
使用本领域已知的测定法，可以容易地筛选具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(片段)。例如，不饱和脂肪酸如油酸的环氧化。此外，可以使用本领域已知的测定法鉴定显示过氧化物酶活性的多肽。例如，可以检测ABTS(2,2’-次偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸))、愈创木酚和/或2,6-二甲氧基苯酚的氧化(Van Bloois et al.Appl MicrobiolBiotechnol.2010；86(5):1419-1430)。优选地，当使用5μM酶时，根据本发明的具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽显示出在25℃下在4h内转化至少15％的1mM油酸的体外活性。
术语“配对序列一致性百分比”通常是指当将两个蛋白质序列进行比对时，在全部位置上在两个比对序列中具有相同氨基酸的氨基酸残基位置之间的系数。相对于本文中公开的氨基酸序列的序列一致性百分比(％)定义为候选序列中与参考序列中的氨基酸残基配对一致的氨基酸残基的百分比，即在比对序列并在必要时引入缺口以获得最大序列一致性百分比之后，并且不考虑任何保守取代作为序列一致性的一部分的本公开的蛋白质分子或片段。出于确定氨基酸序列一致性百分比的目的的比对可以按本领域技术范围内的各种方式实现，例如，当使用具有自由端缺口的全体比对方法、BLAST、ALIGN、或Megalign(DNASTAR)软件比对时，使用公开可得到的计算机软件(如配对序列一致性)。本领域技术人员可以确定用于测量比对的适当参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。
术语“氨基酸”或“氨基酸残基”是指α-或β-氨基羧酸。当与蛋白质或肽结合使用时，术语“氨基酸”或“氨基酸残基”通常是指具有其本领域公认的定义的α-氨基羧酸，如选自由以下各项组成的组的氨基酸：L-丙氨酸(Ala或A)；L-精氨酸(Arg或R)；L-天冬酰胺(Asn或N)；L-天冬氨酸(Asp或D)；L-半胱氨酸(Cys或C)；L-谷氨酰胺(Gln或Q)；L-谷氨酸(Glu或E)；甘氨酸(Gly或G)；L-组氨酸(His或H)；L-异亮氨酸(Ile或I)；L-亮氨酸(Leu或L)；L-赖氨酸(Lys或K)；L-甲硫氨酸(Met或M)；L-苯丙氨酸(Phe或F)；L-脯氨酸(Pro或P)；L-丝氨酸(Ser或S)；L-苏氨酸(Thr或T)；L-色氨酸(Trp或W)；L-酪氨酸(Tyr或Y)；以及L-缬氨酸(Val或V)，尽管可以根据需要使用修饰的、合成的或罕见的氨基酸，例如像牛磺酸、鸟氨酸、硒代半胱氨酸、高胱氨酸、羟脯氨酸、硫脯氨酸、碘酪氨酸、3-硝基-酪氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、刀豆氨酸、5-羟基色氨酸、肌肽、环亮氨酸、3,4-二羟基苯丙氨酸、N-乙酰半胱氨酸、脯氨醇、烯丙基甘氨酸或乙脒-2-羧酸。通常，氨基酸可以分组为具有非极性侧链(例如，Ala、Cys、Ile、Leu、Met、Phe、Pro、Val)；带负电荷侧链(例如，Asp、Glu)；带正电荷侧链(例如，Arg、His、Lys)；或不带电荷极性侧链(例如，Asn、Cys、Gln、Gly、His、Met、Phe、Ser、Thr、Trp、以及Tyr)。
如在本文中使用的“片段”是指亲本蛋白质的具有过氧化酶活性的部分。这样的片段可以包含亲本蛋白质的连续氨基酸。“片段”还可以是指其中亲本蛋白质的片段融合在一起的蛋白质。与亲本蛋白质相比，片段还可以包含修饰，如氨基酸取代、氨基酸缺失或氨基酸插入。
用于本发明的酶包含至少两个血红素配合基序HXXFFD(在图1中表示为“基序1”)和H(X)XD(在图1中表示为“基序3”)，其中X是任何氨基酸。
在一个实施方式中，基序1中的X残基中的至少一个选自由V、S和A组成的组。优选的基序包括含有序列VS、AE、VA、SA、VD或VS的那些。
基序3为序列H(X)XD，表示H和D残基可以被一个或两个氨基酸残基隔开。在一个方面，基序3为HXD，其中X优选为酸性残基如D。优选地，基序3具有序列HXXD，优选地其中间隔X残基独立地选自G、S、A和D。更优选地，基序3是HXSD，最优选HGSD。
用于本发明的多肽可以进一步含有钙结合EF-手基序。例如，钙结合EF-手基序包含至少两个，优选所有的谷氨酸残基，表示为图1)中的M2、M4和M5，对应于Seq.No.2的氨基酸序列的残基E42、E129和E150。在一个实施方式中，存在对应于M2和M4、M2和M5、或M4和M5的谷氨酸残基。在具体方面，存在对应于M2、M4和M5的谷氨酸残基。
在一个实施方式中，多肽包含具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的与图1的Seq.No.2-10中任一个具有至少65％、70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％配对序列一致性的序列或其片段。
优选地，序列显示具有过氧化酶活性的与Seq.No.2-10的任一个，更优选地与Seq.No.2或3(T3A1和T3G1酶)具有至少75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％配对序列一致性，或其片段。
根据本发明使用的多肽可以在其N-和/或C-末端包括(通过基因融合)一个或多个另外的氨基酸序列或蛋白质标签。在一个实施方式中，多肽包括N端标签。在另一个实施方式中，多肽包括C-末端标签。在另外的实施方式中，多肽包括N-和C-末端标签两者。另外的标签序列可以有助于多肽的表达产量、折叠、溶解、纯化和/或固定。此类序列在本领域中是熟知的。示例性融合标签包括(N-末端)分泌信号序列，如DsbA或Tat信号序列，麦芽糖结合蛋白，N-利用物质A(NusA)，谷胱甘肽S-转移酶(GST)，生物素羧基载体蛋白，硫氧还蛋白，和纤维素结合结构域；短肽标签如寡聚组氨酸(6xHis；His-标签)、寡聚赖氨酸、S-肽和FLAG肽。示例性溶解度标签包括SUMO(小泛素样修饰剂)或MBP(麦芽糖结合蛋白)。在具体方面，酶含有N-末端His-标签。可替换地或另外地，其设置有SUMO标签。该标签序列可以在其用于催化过氧化酶反应之前从该多肽去除(蛋白水解地)。例如，可以使用SUMO特异性蛋白酶如Ulp1切割SUMO融合蛋白以去除SUMO部分。
多肽可以以任何合适的形式或纯化程度使用。在一个实施方式中，多肽包含在全细胞或无细胞提取物中。在另一实施方式中，多肽作为(部分)纯化的并且任选地固定的酶使用。
本发明还涉及包含一种或多种根据本发明的多肽的组合物。例如，组合物包含全细胞、渗透化细胞、细胞提取物或包含本发明的重组表达酶的无细胞提取物。在另一实施方式中，组合物包含可溶或固定形式的酶。组合物可以是包括一种或多种过氧化酶、一种或多种底物、H2O2源、和/或产物的反应混合物。
还提供了编码根据本发明的多肽的分离的多核苷酸。多核苷酸可以包含在核酸构建体或表达载体中，优选地其中多核苷酸可操作地连接至指导多肽在表达宿主中产生的一个或多个控制序列。示例性表达载体是本领域已知的。载体优选地含有一个或多个选择标记，其允许容易地选择转化的、转染的、转导的等细胞。选择标记是基因，其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等。在一个实施方式中，载体是大肠杆菌表达载体。例如，可以使用基于pET(IPTG-可诱导的)的载体或基于pBAD(阿拉伯糖可诱导的)的载体来表达多肽。
控制序列可以是启动子，即被宿主细胞识别以表达编码本发明多肽的多核苷酸的多核苷酸。启动子含有介导多肽表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变的、截短的和杂合的启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的细胞外或细胞内多肽的基因获得。控制序列还可以是前导序列，即对于宿主细胞翻译而言重要的mRNA的非翻译区。前导序列可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的5’-末端。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导序列。控制序列还可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子可操作地连接至编码多肽的多核苷酸的3’-末端。在宿主细胞中有功能的任何终止子可用于本发明。细菌宿主细胞的优选终止子是从克劳氏芽孢杆菌碱性蛋白酶(Bacillus clausii alkaline protease)(aprH)、地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(Bacillus licheniformis alpha-amylase)(amyL)、以及大肠杆菌核糖体RNA(Escherichia coli ribosomal RNA)(rrnB)的基因获得。控制序列还可以是启动子下游和增加基因表达的基因编码序列上游的mRNA稳定区。合适的mRNA稳定区的实例是从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)cry11IA基因和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SP82基因获得。
本发明的另一实施方式涉及重组宿主细胞，其包含编码本文所公开的多肽的本发明的核酸构建体或表达载体。在一个方面，编码核酸序列是表达载体的一部分。在另一个实施方式中，编码核酸序列整合在宿主细胞的基因组中。例如，可以通过本领域中已知的方法将编码基因整合到宿主生物的基因组中，这些方法包括基因组编辑方法、同源重组、以及涉及CRISPR Cas系统的方法。
宿主细胞可以是在本发明多肽的重组生产中有用的任何细胞，例如原核生物或真核生物。例如，宿主细胞是细菌宿主细胞或真菌宿主细胞。原核宿主细胞可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。革兰氏阳性细菌包括芽孢杆菌属(Bacillus)、短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、梭菌属(Clostridium)、肠球菌属(Enterococcus)、土芽孢杆菌属(Geobacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋芽孢杆菌属(Oceanobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、链球菌属(Streptococcus)、以及链霉菌属(Streptomyces)。革兰氏阴性细菌包括弯曲杆菌属(Campylobacter)、大肠杆菌(E.coli)、黄杆菌属(Flavobacterium)、梭杆菌属(Fusobacterium)、螺杆菌属(Helicobacter)、泥杆菌属(Ilyobacter)、奈瑟氏菌属(Neisseria)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙门氏菌属(Salmonella)、副球菌属(Paracoccus)和脲原体属(Ureaplasma)。
在具体的方面，宿主细胞是大肠杆菌。为了与基于pET的载体一起表达，可以使用大肠杆菌BL21、大肠杆菌C41/C43或大肠杆菌BL21AI菌株，而对于基于pBAD的载体，可以使用大肠杆菌NEB10β、大肠杆菌TOP10、大肠杆菌BL21AI和其他标准菌株。
重组细菌宿主可以是任何芽孢杆菌，包括解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、短型短芽孢杆菌(Brevibacillus brevis)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)、克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、迟缓芽孢杆菌(Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)。重组细菌宿主还可以是任何链霉菌属，包括不产色链霉菌(Streptomyces achromogenes)、阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)、灰色链霉菌(Streptomyces griseus)、以及变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)。重组细菌宿主还可以是任何副球菌属，包括脱氮副球菌(Paracoccus denitrificans)、善变副球菌(Paracoccus versutus)、胡萝卜副球菌(Paracoccus carotinifaciens)、马氏副球菌(Paracoccus marcusii)和玉米黄副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)。
在另一个实施方式中，宿主细胞是真菌宿主细胞，优选地其中重组真菌宿主细胞是选自由以下各项组成的组的属的成员：曲霉属(Aspergillus)、布拉霉属(Blakeslea)、葡萄孢属(Botrytis)、假丝酵母属(Candida)、尾孢菌属(Cercospora)、隐球菌属(Cryptococcus)、小克银汉霉属(Cunninghamella)、镰刀菌属(Fusarium(赤霉菌属(Gibberella))、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、油脂酵母属(Lipomyces)、被孢霉属(Mortierella)、毛霉属(Mucor)、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、须霉属(Phycomyces)、毕赤酵母属(Pichia(汉逊酵母(Hansenula))、柄锈菌属(Puccinia)、腐霉属(Pythium)、红冬孢酵母属(Rhodosporidium)、红酵母属(Rhodotorula)、酵母属(Saccharomyces)、核菌属(Sclerotium)、木霉属(Trichoderma)、毛孢子菌属(Trichosporon)、法夫酵母属(Xanthophyllomyces(法夫酵母(Phaffia))和耶氏酵母属(Yarrowia)，或者是选自由以下各项组成的组的种：土曲霉(Aspergillus terreus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、三孢布拉霉(Blakesleatrispora)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、日本假丝酵母(Candida japonica)、铁红假丝酵母(Candida pulcherrima)、拉考夫假丝酵母(Candida revkaufi)、热带假丝酵母(Candida tropicalis)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、烟草尾孢(Cercosporanicotianae)、弯曲隐球菌(Cryptococcus curvatus)、棘孢小克银汉霉(Cunninghamellaechinulata)、雅致小克银汉霉(Cunninghamella elegans)、藤仓镰刀菌(Fusariumfujikuroi)(玉米赤霉(Gibberella zeae))、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)、产脂油脂酵母(Lipomyces lipoferus)、高山被孢霉(Mortierella alpina)、拉曼被孢霉(Mortierella ramanniana)、深黄被孢霉(Mortierella isabellina)、葡酒色被孢霉(Mortierella vinacea)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、布拉克须霉(Phycomycesblakesleanus)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、区别柄锈菌(Puccinia distincta)、畸雌腐霉(Pythium irregulare)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、粘红酵母(Rhodotorula glutinis)、禾本红酵母(Rhodotorula graminis)、胶红酵母(Rhodotorulamucilaginosa)、松树红酵母(Rhodotorula pinicola)、纤细红酵母(Rhodotorulagracilis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、白绢小核菌(Sclerotium rolfsii)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、皮状丝孢酵母(Trichosporon cutaneum)、出芽丝孢酵母(Trichosporon pullulans)、红法夫酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)(红法夫酵母(Phaffia rhodozyma))和解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。
可以将宿主细胞基因修饰以具有改善遗传操作、蛋白质分泌、蛋白质稳定性和/或对于过氧化酶的表达或分泌所希望的其他特性的特征。例如，可以对宿主细胞进行修饰以含有能够去除与本发明的多肽融合的标签序列的酶。例如，宿主细胞包括载体，该载体不仅编码所关注的SUMO-和His-标记的过氧化酶，而且编码SUMO标记的Ulp1蛋白酶。这两种蛋白质的共表达导致从SUMO标签体内切割所关注的酶，同时还留下可以通过镍亲和层析从可溶性细胞溶解物中纯化的形式的所关注的酶。
还提供了生产具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽的方法，包括(a)在有利于生产多肽的条件下培养所述宿主细胞；和(b)回收多肽。用于生长本发明宿主的合适培养基是本领域熟知的，例如参见Sambrook等人，Molecular Cloning(1989)，见上文。通常，合适的培养基含有用于宿主系统生长的所有必需营养素。培养基可以补充有选择用于宿主-载体系统的抗生素。培养基可以补充有5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)以改善血红素合成，或者可以向培养基中添加氯化血红素(氯化铁血红素)。以此方式，可以改善全酶的量。
在一个方面，本发明提供了生产具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽的方法，包括：
(a)在有利于生产本发明多肽的条件下培养表达该多肽的宿主细胞；
(b)从宿主细胞制备包含膜相关蛋白的部分；
(c)使用洗涤剂溶解所述膜相关蛋白，以及
(d)从溶解的部分(上清液)中回收所述多肽。
在本文中还提供了细菌宿主细胞部分，该细菌宿主细胞部分包括通过以上方法的步骤(a)和(b)可获得的具有过氧化酶活性的重组膜相关多肽。
因此，表达的多肽可以以全细胞、渗透化细胞、细胞提取物或包含本发明酶的无细胞提取物的形式使用。在另一实施方式中，酶以可溶或固定的形式使用。可以使用本领域已知的方法从细胞中回收表达的酶。任选地，可以使用本领域熟知的方法富集(例如，纯化或部分纯化)蛋白质。例如，多肽可以通过常规过程分离，包括离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发、色谱法(例如，离子交换色谱法、固相结合色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法、色谱聚焦色谱法、以及尺寸排阻色谱法)和/或过滤、或沉淀。根据需要，蛋白再折叠步骤可以用于完成成熟蛋白的构型。最后，可以在最终纯化步骤中使用高效液相色谱法(HPLC)。
如本领域技术人员将理解的，在本文中公开的多肽在将广泛范围的底物转化成所希望的产物中发现其应用。在一个实施方式中，底物是脂肪族烯烃、乙烯基芳烃或萜烯。
例如，本发明提供了用于氧官能化环状或非环状(即直链)脂肪族烯烃或乙烯基芳烃底物的方法，包括使底物与过氧化氢源和具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽接触。脂肪族烯烃或乙烯基芳烃可以是未取代的或取代的。例如，脂肪族烯烃底物具有一个或多个选自由以下各项组成的组的取代基：卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、巯基、磺酰基、甲酰基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、氨基甲酰基和氨磺酰基。优选地，取代基选自由以下各项组成的组：氯、羟基、羧基和磺酰基；特别是氯和羧基。合适的底物包括含有至少三个碳原子并且在一端具有碳-碳双键(例如C＝C键)的脂肪族烯烃。
示例性非环状脂肪族烯烃底物包括丙烯、丁烯、戊烯、己烯、庚烯、辛烯、壬烯、癸烯、十一烯、十二烯、十三烯、十四烯、十五烯或十六烯、或它们的异构体。在一个方面，脂肪族烯烃底物选自由以下各项组成的组：丙烯、1-丁烯、1-戊烯、1-己烯、2-己烯、3-己烯、1-庚烯、1-辛烯、2-甲基-2-丁烯、2,3-二甲基-2-丁烯、顺式/反式-2-丁烯、异丁烯、1,3-丁二烯、2-、3-和4-辛烯、油酸以及它们的异构体。
示例性环状脂肪族烯烃底物包括C3-C12环烯烃，如环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯和环辛烯。
示例性乙烯基芳烃底物包括苯乙烯、β-甲基苯乙烯、茚和茋。
在一个方面，该方法包括将苯乙烯氧化成苯乙烯环氧化物和/或苯乙烯醛。在一个具体方面，本文中提供的酶在氧化反应中用作催化剂，产生作为直接反马尔科夫尼科夫过氧化酶产物的醛，即不是作为由环氧化物的重排产生的次级产物。例如，使用多肽T3G1、T3A1、T3A2或其功能片段将苯乙烯直接转化为其醛。
在另一实施方式中，本发明提供了一种用于氧官能化所关注的萜烯底物的方法，包括使萜烯底物与过氧化氢源和在本文中公开的具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽接触。萜烯底物可以是异戊二烯或单萜烯。在一个方面，萜烯是环萜烯，优选单环单萜烯，如柠檬烯。例如，提供了一种用于将(+)-柠檬烯转化成顺式-柠檬烯环氧化物的方法。
更进一步地，本发明涉及一种用于制备取代的或未取代的靛蓝染料的方法，包括优选地在6-9范围内的pH下使取代的或未取代的吲哚与过氧化氢源以及在本文中定义的多肽接触。优选地，多肽是T3A1、T3G1或其功能片段。
还涵盖一种用于降解(并且因此在大多数情况下脱色)纺织品染料、优选乙烯基砜偶氮染料、更优选活性蓝19(RB 19)的方法，包括优选在3-6范围内的pH下使染料与过氧化氢源以及根据本发明的多肽接触，具体地其中多肽是T3G1、T3A1、T3A2或其功能片段。
油体钙蛋白样过氧化酶所需的过氧化氢可以作为过氧化氢水溶液或用于原位产生过氧化氢的过氧化氢前体提供。在溶解时释放过氧化酶可用的过氧化物的任何固体实体可用作过氧化氢源。在水或适当的水基介质中溶解时产生过氧化氢的化合物包括金属过氧化物、过碳酸盐、过硫酸盐、过磷酸盐、过氧酸、烷基过氧化物、酰基过氧化物、过氧酯、脲过氧化物、过硼酸盐和过氧羧酸或其盐。
过氧化氢的替代来源是过氧化氢生成酶系统，例如氧化酶连同用于该氧化酶的底物。氧化酶和底物的组合的实例包括但不限于氨基酸氧化酶(参见，例如US 6,248,575)和合适的氨基酸、葡萄糖氧化酶(参见，例如WO 95/29996)和葡萄糖、乳酸氧化酶和乳酸、半乳糖氧化酶(参见，例如WO00/50606)和半乳糖、甲酸氧化酶和甲酸盐(Willot et al.；2020,ChemCatChem第12卷,第10期,pp.2713-2716)以及醛糖氧化酶(参见，例如WO 99/31990)和合适的醛糖。
过氧化氢或过氧化氢源可以在本发明方法开始时或过程中加入，例如作为一次或多次单独添加的过氧化氢；或作为分批进料连续地添加。过氧化氢的典型量对应于0.001mM至25mM的水平，优选对应于0.005mM至5mM的水平，并且特别是对应于0.01至1mM或0.02至2mM过氧化氢的水平。过氧化氢也可以以对应于0.1mM至25mM的水平、优选0.5mM至15mM的水平、更优选1mM至10mM的水平、并且最优选2mM至8mM过氧化氢的水平的量使用。本发明的方法可以用固定的过氧化酶进行。
因此，本发明还涉及根据本发明的多肽作为催化剂、优选作为油体钙蛋白样过氧化酶反应的催化剂的用途。
本发明的方法可以在水性溶剂或缓冲系统(反应介质)中进行。合适的缓冲系统容易被本领域技术人员识别，包括磷酸钾盐(K-Pi)缓冲液和Tris.HCl缓冲液。
根据本发明的方法可以在0℃至90℃、优选地5℃至80℃、更优选地10℃至70℃、甚至更优选地15℃至60℃、最优选地20℃至50℃、并且特别是20℃至40℃的温度下进行。本发明的方法可以使用10秒至(至少)24小时、优选1分钟至(至少)12小时、更优选5分钟至(至少)6小时、最优选5分钟至(至少)3小时、并且特别是5分钟至(至少)1小时的处理时间。
附图说明
图1：拟南芥(Arabidopsis thaliana)油体钙蛋白(No.1)和九种新发现和表征的细菌同源物(No.2-10)的氨基酸序列比对：T3G1-gb|NDD31306.1、T3A1-tpg|HHO53497.1、T3B1-ref|WP_146069755.1、T3C1-ref|WP_141736382.1、T3D1-ref|WP_104985314.1、T3E1-gb|TPW18992.1、T3F1-gb|PIQ25853.1、T3H1-gb|KYF87516.1、T3A2-gb|KAB2893313.1。保守序列基序显示在顶部。
图2：针对9种纯化酶的底物筛选。上部四行对应于在pH 4的乙酸钾盐缓冲液中测试的底物，并且下部四行对应于在pH 7的磷酸钾盐缓冲液中测试的底物。测试以下底物：KI-碘化钾；ABTS-2,2’-次偶氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)；2,6-DMP-2,6-二甲氧基-苯酚；RB19-活性蓝19；吲哚；间甲酚；靛蓝胭脂红-靛蓝胭脂红。列CTRL是不添加酶(仅缓冲液和底物)的对照样品。通过添加H2O2(终浓度2mM)引发反应。
图3：从Rz＝0.7的无细胞提取物(小图A)和从Rz＝2.4的Triton X-100辅助提取细胞碎片沉淀(小图B)纯化的SUMO-T3G1的UV-Vis光谱。Rz值是Soret带(约405nm)的吸光度与280nm处的吸光度之间的比率，用于评估血红素负荷。
具体实施方式
实验部分
实施例1：新的油体钙蛋白样酶的克隆、表达和纯化。
使用拟南芥油体钙蛋白(Arabidopsis thaliana caleosin)(AEE85247.1)的序列，我们鉴定了含有保守基序H-X-X-F-F-D和H-(X)-X-D的多种细菌同源物，这些基序提供了最可能直接与血红素辅因子相互作用并形成活性位点的两个组氨酸残基。除了这两个基序(图1中的基序1和3)，还存在可能充当钙结合位点的保守谷氨酸(E)残基(基序M2、M4和M5)。
将9个细菌同源物(参见表1)的合成基因克隆到pBAD载体中以编码具有SUMO肽的融合蛋白。将这些构建体转化到大肠杆菌NEB10B中，将其用于在标准条件下表达。简言之，在补充有氨苄青霉素、5-氨基乙酰丙酸和0.02％阿拉伯糖的TB培养基中进行表达。表达在30℃下进行16h。通过超声处理破碎收获的细胞，并且使用固定化金属螯合亲和色谱法(IMAC)根据用于纯化的标准程序进一步处理提取物。
表1：用于本发明的具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的细菌酶。
T3G1·gb|NDD31306.1.T3A1-tpg|HHO53497.1，T3B1-ref|WP_146069755.1，T3C1-ref|WP_141736382.1，T3D1-ref|WP_104985314.1，T3E1-gb|TPW18992.1，T3F1-gb|PIQ25853.1，T3H1-gb|KYF87516.1，T3A2-gb|KAB2893313.1.
实施例2：油体钙蛋白样过氧化酶活性的定性分析
针对一组常规过氧化物酶底物的初始筛选显示以活性形式产生这些酶。除T3B1之外，它们全部都在pH 4下显示出针对ABTS的活性，并且它们中的一些能够在pH 4和pH 7下氧化2,6-DMP(T3A1、T3C1、T3E1、T3G1、T3H1和T3A2)。与已知的细菌过氧化物酶(DyP-过氧化物酶)(它们限于仅在较低pH下具有活性)相比，该信息已经显示出令人关注的特征。此外，这些新的酶能够进行染料脱色/氧化，如使用RB19作为底物所示。然后，检测到非常令人关注的特征，由吲哚产生蓝色的能力，这对应于靛蓝的形成。这直接归因于酶催化氧插入的能力。这促使我们针对大量不同底物测试代表性酶T3G1。该筛选结果总结在表2中。
表2.针对其确认并测量转化率的底物列表。反应混合物包含1mM底物、2mM H2O2和7μM酶(T3G1，5+2μM)。通过添加H2O2至多至1mM(终浓度)和5μM酶开始反应；在90min之后，添加另一等分部分的H2O2以使H2O2浓度达到2mM，以及对应于2μM的另一等分部分的T3G1，总共添加7μM酶。
/>
a)“痕量”表示针对对照样品中不存在的预期质量所观察到峰，该峰低于定量限值。
可检测的产物
实施例3：容易纯化方法的开发
将代表活性和高度表达的酶(根据小规模试验)的多肽T3A1和T3G1再次在500mlTB 0.5mM 5-ALA、0.02％阿拉伯糖中在30℃下过夜表达，并且尝试从澄清的无细胞提取物中纯化。对于T3A1，获得了大量的蛋白质，但具有低的血红素负荷。对于T3G1，获得少量负载血红素的酶。CFE澄清后在沉淀中观察到强烈的红色。考虑到植物同源物是已知的膜相关蛋白，这表明大部分细菌重组蛋白位于膜部分中。将沉淀重悬于缓冲液A(具有150mM NaCl的50mM磷酸钾盐缓冲液pH 7.5)中的1％Triton X-100中并且在冰上孵育20分钟，然后在12000rpm下旋转沉降1小时。
所获得的上清液具有强烈的红色，而沉淀变成黄色/棕色。使用IMAC层析在Ni-Sepharose树脂上使用本领域已知的方案纯化该酶，并且该酶具有强烈的红色和增加的Rz值。Rz值是Soret带(约405nm)的吸光度与280nm处的吸光度之间的比率，用于指示血红素负荷。参见图3的UV-Vis光谱。
总之，使用这种简单方法，我们能够获得高产量的充分负载的活性酶，而没有针对膜相关酶所描述的常见障碍。
ThermoFluor方法可以用于测量蛋白质的表观熔融温度。该实验显示Tmapp(T3G1)＝61℃，该实验将T3G1置于适度稳定的酶中。
实施例4：优化用于全细胞转化的系统
考虑到萜烯环氧化/羟基化是对于多种用途所关注的反应，并且萜烯是挥发性化合物，我们考察了使用全细胞进行转化的可能性。为此目的，照常进行表达并且从诱导培养物和对照大肠杆菌培养物的5ml培养物沉淀细胞。然后，将细胞重悬于pH 7的磷酸钾盐缓冲液中，添加底物并且添加1mM H2O2。在1h之后，添加另一等分部分的H2O2并且将反应再孵育一小时。然后，通过使用乙酸乙酯的萃取终止反应，并且使用GC-MS分析样品。
在确认产物形成后，尝试改善酶在细菌膜和周质中的定位。这通过将T3G1重新克隆到pBAD载体中作为具有DsbA信号序列的融合蛋白来完成。表达试验显示所产生的蛋白质的产量增加。

Claims (20)

1.一种用于氧官能化所关注的底物的方法，包括使所述底物与过氧化氢源和具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽(EC 1.11.2.1)接触，其中所述多肽是细菌来源的并且选自由以下各项组成的组：
(a)包括以下的多肽：与图1的Seq.No.2-10中的任一个具有至少60％配对序列一致性的氨基酸序列，以及至少以下血红素配合基序：
i)HXXFFD；
ii)H(X)XD，优选HXXD，更优选HXSD，
其中X是任何氨基酸；以及
(b)(a)的多肽的片段，具有油体钙蛋白样过氧化酶活性。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多肽包含钙结合EF-手基序。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述钙结合EF-手基序包含对应于表2中所示的Seq.No.2的氨基酸序列的E42、E129和E150的两个或更多个谷氨酸残基。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述多肽包含与图1的Seq.No.2-10中的任一个具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％配对序列一致性的序列，或其具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的片段。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述多肽包含Seq.No.
2或3的序列，或其具有过氧化酶活性的片段。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽进一步包含能够增强表达、溶解、纯化、靶向、分泌和/或固定的N-和/或C-末端蛋白标签。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述多肽包含在全细胞或无细胞提取物中，或其中所述多肽作为纯化的酶和可选地固定的酶使用。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述底物是脂肪族烯烃、乙烯基芳烃或萜烯。
9.根据权利要求8所述的方法，其中脂肪族烯烃底物具有选自由卤素、羟基、羧基、氨基、硝基、氰基、巯基、磺酰基、甲酰基、乙酰基、甲氧基、乙氧基、氨基甲酰基和氨磺酰基组成的组中的一种或多种取代基。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述取代基选自由氯、羟基、羧基和磺酰基组成的组，特别是氯和羧基。
11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述脂肪族烯烃包含至少三个碳原子，并且在一端具有碳-碳双键。
12.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中脂肪族烯烃底物是非环状脂肪族烯烃，优选地选自由丙烯、丁烯、戊烯、己烯、庚烯、辛烯、壬烯、癸烯、十一烯、十二烯、十三烯、十四烯、十五烯或十六烯以及它们的异构体组成的组。
13.根据权利要求8-11中任一项所述的方法，其中，脂肪族烯烃底物是环状脂肪族烯烃，优选地选自由环丙烯、环丁烯、环戊烯、环己烯、环庚烯和环辛烯组成的组。
14.根据权利要求8所述的方法，其中乙烯基芳烃底物是苯乙烯、β-甲基苯乙烯、茚或茋。
15.根据权利要求8所述的方法，其中萜烯底物是异戊二烯或单萜烯，优选地其中所述萜烯是环萜烯，更优选单环单萜烯，如柠檬烯。
16.一种用于制备取代的或未取代的靛蓝染料的方法，包括使取代的或未取代的吲哚与过氧化氢源和权利要求1-7中任一项所限定的多肽接触，优选地其中所述多肽包含Seq.No.2或3的序列，或其具有过氧化酶活性的片段。
17.权利要求1-7中任一项所限定的多肽作为生物催化剂的用途，优选地作为用于氧官能化，优选地环氧化脂肪族烯烃、乙烯基芳烃或萜烯底物的催化剂的用途。
18.一种核酸构建体或表达载体，包含编码权利要求1-7中任一项所限定的多肽的多核苷酸序列，所述多核苷酸序列可操作地连接至指导所述多肽在细菌或真菌表达宿主中生产的一个或多个控制序列。
19.一种重组宿主细胞，优选细菌或真菌宿主细胞，包含权利要求18所述的核酸构建体或表达载体。
20.一种生产具有油体钙蛋白样过氧化酶活性的多肽的方法，包括：
(a)在有利于生产所述多肽的条件下培养权利要求19所述的宿主细胞；
(b)从所述宿主细胞制备包含膜相关蛋白的部分；
(c)使用洗涤剂溶解所述膜相关蛋白，以及
(d)从溶解的部分(上清液)中回收所述多肽。
CN202280056969.3A 2021-07-20 2022-07-20 使用细菌酶氧官能化多种底物的方法 Pending CN117897479A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP21186631 2021-07-20
EP21186631.4 2021-07-20
PCT/NL2022/050425 WO2023003464A1 (en) 2021-07-20 2022-07-20 Methods for oxyfunctionalization of various substrates using bacterial enzymes.

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN117897479A true CN117897479A (zh) 2024-04-16

Family

ID=76999690

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202280056969.3A Pending CN117897479A (zh) 2021-07-20 2022-07-20 使用细菌酶氧官能化多种底物的方法

Country Status (3)

Country Link
EP (1) EP4373924A1 (zh)
CN (1) CN117897479A (zh)
WO (1) WO2023003464A1 (zh)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1932312A (en) 1931-12-04 1933-10-24 John C Hobgood Hat blocking machine
CA2189542A1 (en) 1994-05-03 1995-11-09 Karen M. Oxenbýll Alkaline glucose oxidase
EP1525798B1 (en) 1997-12-22 2011-11-23 Novozymes A/S Carbohydrate oxidase and use thereof in baking
US6248575B1 (en) 1998-05-18 2001-06-19 Novozymes Biotech, Inc. Nucleic acids encoding polypeptides having L-amino acid oxidase activity
US6090604A (en) 1999-02-24 2000-07-18 Novo Nordisk Biotech, Inc. Polypeptides having galactose oxidase activity and nucleic acids encoding same

Also Published As

Publication number Publication date
WO2023003464A1 (en) 2023-01-26
EP4373924A1 (en) 2024-05-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2158313B1 (en) Fungal peroxygenases and methods of application
JP7443656B2 (ja) レチニルエステルの生産
Engleder et al. On the current role of hydratases in biocatalysis
CN102822348A (zh) 用真菌过氧酶区域选择性羟化脂族烃类化合物
JP2017221206A (ja) ペルオキシゲナーゼを用いたエポキシ化
Shi et al. Biochemical and molecular characterization of a novel laccase from selective lignin-degrading white-rot fungus Echinodontium taxodii 2538
CN111107834A (zh) 类视黄醇的生物合成
Matsushita‐Morita et al. Characterization of recombinant prolyl aminopeptidase from Aspergillus oryzae
Guterl et al. Uneven twins: Comparison of two enantiocomplementary hydroxynitrile lyases with α/β-hydrolase fold
Zelena et al. Escherichia coli as a production host for novel enzymes from basidiomycota
CN111108204A (zh) 脱羧酶、和使用了该脱羧酶的不饱和烃化合物的制造方法
Hahn et al. Recombinant expression and characterization of al-amino acid oxidase from the fungus Rhizoctonia solani
Wu et al. Cloning, expression in Escherichia coli, and enzymatic properties of laccase from Aeromonas hydrophila WL-11
WO2020011847A1 (en) Method of heterologous expression of active fungal unspecific peroxygenase in bacterial host cells for fatty-acid epoxidation and other oxygenation reactions
CN105925518A (zh) 烯烃生产
Schüttmann et al. Induction, characterization, and heterologous expression of a carotenoid degrading versatile peroxidase from Pleurotus sapidus
Baumgart et al. Biochemical characterisation of aconitase from Corynebacterium glutamicum
Tonin et al. Different recombinant forms of polyphenol oxidase A, a laccase from Marinomonas mediterranea
Baek et al. Characterization of a thermostable D-stereospecific alanine amidase from Brevibacillus borstelensis BCS-1
Imami et al. Depolymerization of lignosulfonates by submerged cultures of the basidiomycete Irpex consors and cloning of a putative versatile peroxidase
CN117897479A (zh) 使用细菌酶氧官能化多种底物的方法
Choudhury et al. Production and recovery of recombinant propapain with high yield
Roy et al. Continuous biotransformation of pyrogallol to purpurogallin using cross‐linked enzyme crystals of laccase as catalyst in a packed‐bed reactor
Arai et al. Application of protein N-terminal amidase in enzymatic synthesis of dipeptides containing acidic amino acids specifically at the N-terminus
JP2012065591A (ja) エルゴチオナーゼ、およびエルゴチオネインの定量方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication