BR112020010971A2 - uso de celobiose oxidase para redução de redução de reação de maillard - Google Patents
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Abstract
A presente invenção refere-se a um processo para a redução de reação Maillard (e pelo que surgimento de cor marrom) em um alimento ou produto alimentício (preferivelmente um produto alimentício laticínio tal como, por exemplo, queijo mozzarella), em que o processo compreende contato do produto com uma enzima celobiose oxidase EC 1.1.99.18.
Description
Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "USO DE CELOBIOSE OXIDASE PARA REDUÇÃO DE REDUÇÃO DE REA- ÇÃO DE MAILLARD". Campo da Invenção
[0001] A presente invenção refere-se a um processo para a redu- ção da reação de Maillard (e pelo que a cor castanha) em um alimento ou produto alimentício (preferivelmente um produto alimentício laticínio tal como, por exemplo, queijo mozzarella), em que o processo com- preende contato de produto com uma enzima celobiose oxidase EC
1.1.99.18. Técnica Antecedente
[0002] Uma concentração relativamente alta de galactose pode resultar em "cor castanha" durante aquecimento de queijos como é frequentemente descrito quando, por exemplo, queijo mozarella, pro- duzido através de uso de S. thermophillus (ST), é usado para, por exemplo, produção de pizza.
[0003] O fenômeno de formação de cor castanha é acreditado ser devido à reação Maillard em que galactose como açúcar redutor está reagindo com grupos amino de aminoácidos / peptídeos.
[0004] Além deste principal problema durante produção de queijo de pizza, quantidades em excesso de galactose livre também condu- zem a problemas de pós acidulação e desequilíbrio na flora de outros produtos laticínios, tais como, por exemplo, queijos macios.
[0005] Muitos fabricantes de pizza assam pizzas em temperaturas > 260ºC. Nestas altas temperaturas a tendência de queijo a adquirir excessivamente a cor marrom tornou-se um conceito particular para a indústria de mozzarella.
[0006] WO02/39828A2 (Danisco) descreve uso de enzima hexose oxidase (HOX) (EC1.1.3.5) para redução de reação Maillard (e pelo que surgimento de cor marrom) em queijo tal como queijo mozzarella.
[0007] Hexose oxidase (EC1.1.3.5) usa "cátion Cu" como cofator ativo e celobiose oxidase (EC1.1.99.18) usa dinucleotídeo adenina fla- vina (FAD) como cofator — por esta razão e outras, elas são enzimas diferentes e por isso têm diferente número de classificação de comis- são de enzima (Número EC).
[0008] O produto comercialmente disponível LactoYIELD (Chr. Hansen A/S, Denmark) compreende uma celobiose oxidase (EC
1.1.99.18), que aqui alternativamente pode ser chamada lactose oxi- dase (LOX) ou carboidrato oxidase.
[0009] EP 1041890B1 (Novozymes) e o artigo de Feng Xu et al. (Eur. J. Biochem. 268, 1136-1142 (2001)) descrevem a celobiose oxi- dase (EC 1.1.99.18) como presente em LactoYIELD) — estes docu- mentos da técnica anterior não descrevem uso de celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) para redução da reação Maillard (e pelo que desenvol- vimento de cor marrom) em um alimento ou produto alimentício tal como, por exemplo, queijo mozzarella.
[0010] A sequência de aminoácidos madura da celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) como presente me LactoYIELD é posição 23-495 de SEQ ID NO: 2 de EP 1041890B1, que inicia com Gly em posição 23 e termina com Lys em posição 495.
[0011] O polipeptídeo de posição 23-495 de SEQ ID NO: 2 de EP1041890B1 é aqui provido como posição 1-473 de SEQ ID NO:1.
[0012] EP2988601B1 (Arla) parágrafo [0014] lê: "Foi surpreenden- temente verificado que um processo para oxidar lactose em leite e produtos relacionados com leite a ácido lactobiônico é efetivo para re- dução de sabor-fora, por exemplo, sabor "cozido", em um produto re- lacionado com leite, tal como um produto relacionado com leite tratado em alta temperatura. Ao mesmo tempo, foi verificado que para manter o aroma e vida de prateleira do produto relacionado com leite, lactose oxidante deve ser mantida baixa". Em exemplos de trabalho LactoY|-
ELD é usado para oxidação de lactose no leite. Redução do assim chamado aroma-estranho em leite de UHT através de oxidação de lac- tose no leite pode ser vista como, não diretamente e não ambiguamen- te, relacionada a uso de, por exemplo, LactoYIELD para obter uma significante quantidade reduzida de galactose e pelo que menos for- mação de cor marrom como aqui discutido.
[0013] É evidente para aqueles versados na técnica que leite UHT como discutido em EP2988601B1 (Arla) não é um produto de leite fermentado com bactérias de ácido lático (LAB) (tal como, por exem- plo, um produto iogurte) ou produto laticínio de quijo. Sumário da Invenção
[0014] O problema a ser resolvido pela presente invenção é prover um novo processo para a redução da reação Maillard (e pelo que for- mação de cor marrom) em um alimento ou produto alimentício (preferi- velmente um produto alimentício laticínio tal como, por exemplo, um queijo — mais preferivelmente um queijo mozzarella).
[0015] A solução é baseada em que a presente invenção identifi- cou que a enzima celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) como presente em LactoYIELD é boa na solução de problema mencionado acima (ver, por exemplo, os Exemplos de trabalho aqui).
[0016] Como discutido acima — celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) pode ser alternativamente chamada lactose oxidase (LOX) ou carboi- drato oxidase.
[0017] No Exemplo 1 LactoYIELD foi adicionado à superfície de um queijo mozzarella retalhado e após 14 dias de estocagem fria foi obtida uma significante redução de galactose e desenvolvimento de cor marrom (após aquecimento para 100ºC por 70 minutos) foi signifi- cantemente reduzido.
[0018] O Exemplo 2 demonstra que LactoYIELD (LOX) é mais es- tável termicamente que hexose oxidase (HOX) descrita em WO02/
39828A2 (Danisco) discutida acima.
[0019] Esta é uma vantagem significante de LOX sobre HOX, uma vez que, por exemplo, um número de alimentos / produtos alimentícios (por exemplo, produtos alimentícios laticínios) são fabricados através de um processo que envolve uma etapa de aquecimento.
[0020] Por exemplo, queijo Mozzarrella é fabricado através de um processo que envolve uma etapa de aquecimento. Como conhecido na técnica - Mozzarellla é fabricado através de assim chamado método de pasta filata (isto é, Mozzarella é um exemplo de um assim chamado queijo pasta filata).
[0021] Queijos fabricados através da técnica pasta filata podem sofrer um tratamento de plastificação e amassamento do coalho fresco em água quente (isto é, uma etapa de aquecimento, em que a tempe- ratura pode ser, por exemplo, de 50 a 95ºC).
[0022] O Exemplo 3 mostra que através de adição de LactoYIELD (LOX) diretamente ao leite antes de acidulação do leite foi possível fa- bricar um produto queijo compreendendo uma quantidade reduzida significante de galactose.
[0023] Discutido acima, WO02/39828A2 (Danisco) menciona bre- vemente a possibilidade de adição da ali descrita enzima HOX direta- mente ao leite na página 7, linhas 25-32. Entretanto, em nenhum dos Exemplos de trabalho de WO02/39828A2 (Danisco) estava a enzima HOX adicionada diretamente ao leite — isto é, isso é simplesmente mencionado como uma possibilidade teórica. Como discutido acima, o presente Exemplo 2 demonstra que LactoYIELD (LOX) é mais estável termicamente que hexose oxidase (HOX) descrita em WO02/39828º2 discutida acima (Dan isco) — da mesma maneira, se HOX é adicionada diretamente ao leite pode-se esperar que uma subsequente etapa de aquecimento (por exemplo, como discutido acima para fabricação de Mozzarella) pode ser mais danosa para HOX que para LOX.
[0024] O Exemplo 4 mostra que LactoYIELD (LOX) trabalha bem para redução de surgimento de cor marrom mesmo na presença de agentes antiformação de torta.
[0025] Em suma, os presentes exemplos de trabalho demonstram que enzima celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) como presente em Lac- toYIELD é boa em redução de reação Maillard (e pelo que reduzindo o problema de surgimento de cor marrom) em um alimento ou produto alimentício.
[0026] Ainda, resultados de nossos exemplos de trabalho tornam plausível que LOX é melhor que (HOX) descrita em WO02/39828*º2 (Danisco) em relação à solução deste problema.
[0027] Prima facie não há razão para acreditar que os resultados positivos aqui discutidos não devam ser genericamente obtidos atra- vés do uso de outra apropriada enzima celobiose oxidase (EC
1.1.99.18).
[0028] Uma razão para isto é que enzimas da mesma classe EC têm genericamente um número de características em comum, o que pode ser visto como uma razão para que elas sejam designadas na mesma classe EC.
[0029] Da mesma maneira, um primeiro aspecto da invenção refe- re-se a um processo para a redução de reação Maillard em um alimen- to ou produto alimentício (preferivelmente um produto alimento laticí- nio), em que o processo compreende contato de produto com uma en- zima celobiose oxidase EC 1.1.99.18.
[0030] Expresso de modo alternativo, o primeiro aspecto e suas concretizações aqui relevantes podem ser formulados como uso de uma enzima celobiose oxidase EC 1.1.99.18 para a redução de reação Maillard em um alimento ou produto alimentício (preferivelmente um produto alimentício laticínio), em que o uso envolve um processo com- preendendo contato de produto com uma celobiose oxidase EC
1.1.99.18.
[0031] Aqueles versados na técnica podem determinar rotineira- mente se uma enzima de interesse é uma enzima com o número de Comissão de Enzima (número EC) EC 1.1.99.18 ou não.
[0032] Como discutido acima, hexose oxidase (EC 1.1.3.5) usa "cátion Cu" como cofator ativo e celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) usa dinucleotídeo adenina flavina (FAD) como cofator — por esta e outras razões, elas são enzimas diferentes e elas por isso têm diferentes nú- meros de classificação de Comissão de Enzima (números EC).
[0033] Dito em outras palavras e como entendido por aqueles ver- sados no presente contexto — o primeiro aspecto não cobre um pro- cesso não envolvendo contato de produto com uma enzima celobiose oxidase EC 1.1.99.18 — isto é, por exemplo, não cobre um processo que somente envolve uso de, por exemplo, uma enzima hexose oxida- se EC 1.1.3.5.
[0034] Como entendido por aqueles versados no presente contex- to — o termo "redução de reação Maillard" refere-se àquela extensão em que uma reação Maillard é reduzida e/ou o período de tempo re- querido para término de uma reação Maillard é aumentado.
[0035] Uma concretização da presente invenção é descrita abaixo, so mente por meio de exemplos. Como entendido por aqueles versa- dos no presente contexto, uma combinação de uma concretização pre- ferida com uma outa concretização preferida pode ser vista mesmo como uma concretização mais preferida. Desenhos
[0036] Figura 1: Teste de formação de cor marrom de retalhos de queijo mozzarella. Retalhos simples colocados em cavidade e placa aquecida a 100ºC por 75 minutos. Cada coluna mostra réplicas de queijo submetidas a diferente tratamento com LOX. Amostras 1-3: Re- talhos de queijo Mozzarella fabricado usando Hannilase XP, tratado com LOX e estocado por 14 dias a 5ºC. 1: controle sem LOX, 2: 0,01 LOXU/g, 3: 0,02 LOXU/g. Amostras 10-12: Queijo Mozzarella fabricado usando CHYMAX M, tratado com LOX e estocado por 14 dias a 5ºC.
10: controle sem LOX, 11: 0,01 LOXU/g, 12: 0,02 LOXU/g.
[0037] Figura 2: Mesmo tratamento de amostra como na figura 1, mas com adição de catalase Catazyme (0,1 U por g de queijo).
[0038] Figura 3: Dados demonstrando que LactoYield (LOX) tra- balha mesmo na presença de agente antiformação de torta — ver Exemplo 3 aqui para ainda detalhes. Negro O LOXU/g, azul 0,01 LOXU/g, vermelho 0,05 LOXU/g. Tina 4 é uma amostra de queijo con- trole com alto nível de galactose (>0,5%) e Gouda 45+ é uma amostra de queijo controle sem ou com muito pouca galactose residual.
[0039] Figura 4: A: testado justo após preparação de coalho. B: testado após estocagem de coalho por 1 semana a 5ºC.
Descrição Detalhada da Invenção Enzima celobiose oxidase (EC 1.1.99.18)
[0040] Preferivelmente, a enzima celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) é uma enzima:
[0041] (i) compreendendo a sequência de polipeptídeos de po- sição 23-495 de SEQ ID NO: 2 de EP 1041890B1, que começa com Gly em posição 23 e termina com Lys em posição 495; ou
[0042] (i)) uma variante de (i), em que a variante compreende menos que 20 (preferivelmente menos que 10, mais preferivelmente menos que 5) alterações de aminoácidos (preferivelmente uma substi- tuição, uma deleção ou uma inserção — mais preferivelmente uma substituição) como comparada a sequência de polipeptídeos de (i).
[0043] O polipeptídeo de posição 23-495 de SEQ ID NO: 2 de EP1041890B1 é provido aqui como posição 1-473 de SEQ ID NO: 1.
[0044] Da mesma maneira, preferivelmente a enzima celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) é uma enzima: (i) compreendendo a sequência de polipeptídeos de posição 1-473 de SEQ ID NO: 1, que começa com Gly em posição 1 e termina com Lys em posição 473; ou (ii): uma vari- ante de (i), em que a variante compreende menos que 20 (preferivel- mente menos que 10, mais preferivelmente menos que 5) alterações de aminoácidos (preferivelmente uma substituição, uma deleção ou uma inserção — mais preferivelmente uma substituição) como compa- rada à sequência de polipeptídeos de (i).
[0045] Partindo de uma enzima de interesse (aqui a enzima celo- biose oxidase (EC 1.1.99.18) de item (i) acima) — é trabalho de rotina para aqueles versados na técnica fabricar uma variante com a mesma / similar atividade de celobiose oxidase (por exemplo, fazendo-se as assim chamadas mudanças conservativas — por exemplo, uma mu- dança de um aminoácido para aminoácido similar (por exemplo, mu- dança de um aminoácido hidrofóbico para um outro aminoácido hidro- fóbico).
[0046] Dito em outras palavras — é trabalho de rotina para aqueles versados fabricar uma variante de item (ii) acima — da mesma maneira, não é acreditado ser necessário descrever / discutir isto em maiores detalhes aqui. Parâmetros de Processo Preferidos
[0047] Baseado no presente ensinamento técnico e o conhecimen- to genérico comum daqueles versados na técnica, é trabalho de rotina para aqueles versados na técnica otimizar parâmetros relevantes de processo (por exemplo, temperatura, tempo, quantidade de enzima usada, etc.) de modo a obter-se redução de reação de Maillard (e pelo que formação de cor marrom) em um alimento ou produto alimentício (preferivelmente um produto alimentício laticínio) —- da mesma maneira, não é aqui requerido descrever isto em maiores detalhes.
[0048] A enzima pode ser contatada com alimento ou produto ali- mentício durante sua preparação ou ela pode ser contatada com o alimento após o produto ter sido preparado ainda antes do alimento ou produto alimentício ser submetido a condições que possam resultar na indesejável reação Maillard. No aspecto anterior a enzima será incor- porada no alimento. No último aspecto, a enzima estará presente so- bre a superfície do alimento. Quando presente sobre a superfície rea- ção Maillard ainda é evitada quando ela é a superfície de um material exposta a secagem e oxigênio atmosférico que sofre a predominante reação Maillard.
[0049] Quando contatada com alimento ou produto alimentício du- rante sua preparação a enzima pode ser contatada em qualquer está- gio apropriado durante sua produção. No aspecto em que o produto alimentício é um produto laticínio ela pode ser contatada com o leite durante acidulação do leite e precipitação do coalho de leite. Neste processo a enzima pode não ser ativa durante as condições anaeróbi- cas criadas durante a acidulação e precipitação de proteína de leite mas será ativa no produto laticínio tal como queijo quando condições aeróbicas são criadas. Uma vez em condições aeróbicas a enzima oxida o açúcar redutor e reduz a tendência para reação Maillard.
[0050] Para aplicação da enzima à superfície do alimento ou pro- duto alimentício, pode-se aplicar a enzima em qualquer maneira apro- priada.
[0051] Tipicamente, a enzima é provida em uma solução ou dis- persão e espargida sobre o produto alimentício. A solução / dispersão pode compreender a enzima em uma quantidade de 1-50 unidades de enzima / mL.
[0052] A enzima também pode ser adicionada em forma seca ou pulverizada. Quando em forma úmida ou seca a enzima pode ser combinada com outros componentes para contato com o produto ali- mentício. Por exemplo, quando a enzima está em forma seca ela pode ser combinada com um agente antiformação de torta.
[0053] Em alguns aspectos a presente invenção ainda compreen- de a etapa de contato de alimento ou produto alimentício com uma ca- talase.
[0054] Em um aspecto preferido, o alimento ou produto alimentício é embalado dentro de um recipiente impermeável para oxigênio após contato com a enzima. Nós identificamos que a enzima em ação com o açúcar redutor pode consumir oxigênio dentro de um recipiente. Consumo do oxigênio reduzirá a atividade microbiológica no alimento / produto alimentício e aperfeiçoará a vida em prateleira. A prática nor- mal de embalagem em atmosfera controlada pode ser então dispen- sada.
[0055] Será apreciado por aqueles versados na técnica que na prática da presente invenção contata-se o produto alimentício laticínio com uma quantidade suficiente de enzima para prevenir e/ou reduzir uma reação Maillard — é trabalho de rotina para aqueles versados na técnica identificar uma tal quantidade suficiente de enzima.
[0056] Quantidades típicas de enzima que podem ser contatadas com o produto alimentício são de 0,05 a 5 U/g (unidades de enzima por grama de produto alimentício), de 0,05 a 3 U/g, de 0,05 a 2 U/g, de 0,1 a 2 U/g, de 0,1 a 1,5 U/g, e de 0,5 a 1,5 U/g.
[0057] Como aqui discutido no Exemplo de trabalho — a quantida- de de LactoYIELD (LOX) pode ser determinada de acordo com conhe- cimento público assim chamada unidade LOXU/g. Unidade LOXU/g é pública disponível / conhecida (e pelo que possível de determinar para aqueles versados) a partir da folha de Informação de Produto disponí- vel para o público para LactoYIELD Chr. Hansen A/S Denmark; Ver- são: 5 PI GLOB EN 02-24-2017 — a folha de Informação de Produto para LactoYIELD pode ser obtida com requisição para Chr. Hansenj A/S Denmark ou simplesmente comprando-se o produto LactoYIELD.
[0058] Pode ser preferido que quantidades típicas de enzima celo-
biose oxidase (EC 1.1.99.18) que possam ser contatadas com o pro- duto alimentício sejam de 0,0001 a 10,0 LOXU/g, tal como de 0,001 a 5,0 LOXU/g ou mais preferivelmente de 0,001 a 1,0 LOXU/g ou mes- mo mais preferivelmente de 0,005 a 0,1 LOXU/g.
[0059] Como discutido acima, o Exemplo 3 mostra que através de adição de LactoYIELD (LOX) diretamente ao leite antes de acidulação do leite foi possível fabricar um produto queijo compreendendo uma significante quantidade reduzida de galactose.
[0060] Da mesma maneira, uma concretização preferida pode se referir a um processo para a redução de reação Maillard em um produto alimentício laticínio, em que o processo compreende as seguintes eta- pas: (a): contatar leite com enzima celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) de primeiro aspecto e/ou quaisquer suas concretizações antes, duran- te ou após acidulação do leite; e (d): ainda realizar quaisquer etapas adequadas para finalmente terminar com o produto alimentício laticínio compreendendo uma quantidade reduzida de galactose e pelo que um produto com uma redução de reação Maillard.
[0061] Pode ser preferido que o produto alimentício laticínio seja um produto alimentício de queijo, em que uma concretização preferida pode relacionar-se a um processo para a redução de reação Maillard em um produto alimentício de queijo, em que o processo compreende as seguintes etapas: (a): contatar leite com enzima celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) de primeiro aspecto e/ou quaisquer suas concretiza- ções antes, durante ou após acidulação do leite; (b) coagular leite aci- dificado de (i) e separação de coalho do soro de leite coalhado; (c) es- tocar coágulo de (ii) sob condições, em que as enzimas oxidase pre- sentes no coágulo desempenham oxidação de galactose presente no coalho; (d) realizar ainda etapas adequadas para finalmente terminar com o produto queijo compreendendo uma quantidade reduzida de galactose e pelo que um produto com uma redução de reação Mail-
lard.
[0062] Em relação à etapa (a) acima — a enzima pode ser contata- da com o leite em qualquer forma apropriada — por exemplo, contatan- do enzima líquida com o leite.
[0063] Como discutido abaixo em relação às conclusões de Exemplo de trabalho 3 — adsorção de LOX sobre uma partícula evita a transferência da enzima para soro de leite coalhado. Isto não somente preserva o valor de soro de leite coalhado, mas também permite dosa- gem de somente um décimo da enzima requerida. A presença de LOX em coalho de queijo catalisa a oxidação de galactose a ácido galactô- nico que resultará em reduzida formação de cor marrom com cozimen- to.
[0064] WO02/39828A2 (Danisco) discutida acima nem mesmo menciona a possibilidade de adsorção da ali descrita enzima hexose oxidase sobre partículas.
[0065] Da mesma maneira, preferivelmente a etapa (a) acima está contatando leite com partículas compreendendo enzimas celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) ligadas / encapsuladas antes, durante ou após acidulação do leite.
[0066] Pode ser preferido que o produto alimentício laticínio seja um produto alimentício de queijo, em que uma concretização preferida pode relacionar-se a um processo para a redução de reação Maillard em um produto alimentício de queijo, em que o processo compreende as seguintes etapas:
[0067] (a) contatar leite com partículas compreendendo enzima celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) ligada / encapsulada de primeiro as- pecto e/ou quaisquer suas concretizações antes, durante ou após aci- dulação do leite;
[0068] (b) coagular leite acidificado de (i) e separação de coalho do soro de leite coalhado;
[0069] (c) estocarcoalho de (ii) sob condições, em que as enzimas oxidase presentes no coalho desempenham oxidação de galactose presente no coalho;
[0070] (d) realizar ainda etapas adequadas para finalmente termi- nar com o produto queijo compreendendo uma quantidade reduzida de galactose e pelo que um produto com uma redução de reação Mail- lard.
[0071] O Exemplo 3 de trabalho descreve partículas com uma dis- tribuição de diâmetro de partícula que trabalha muito bem — isto é, evi- ta a transferência da enzima para soro de leite coalhado.
[0072] Não há razão para acreditar que partículas com uma distri- buição de diâmetro de partícula relativamente menor / maior do que usada em Exemplo 3 não funcionem razoavelmente bem.
[0073] Da mesma maneira, em uma concretização preferida as partículas compreendendo enzima oxidase ligada / encapsulada de etapa (a) são partículas tendo uma distribuição de diâmetro de partícu- la (D(v,0,1)) de pelo menos 10 nm e uma distribuição de diâmetro de partícula (D(v, 0,9)) de menos que 500 um — mais preferivelmente uma distribuição de diâmetro de partícula (D(v,0,1)) de pelo menos 0,1 um e uma distribuição de diâmetro de partícula (D(v,0,9)) de menos que 200 um — mesmo mais preferivelmente uma distribuição de diâmetro de partícula (D(v,0,1)) de pelo menos 0,5 um e uma distribuição de di- âmetro de partícula (D(v,0,9)) de menos que 100 um.
[0074] De acordo com a técnica, o termo "D(v,0,1)" representa o diâmetro de partícula no qual 10% da distribuição de partículas está abaixo e "D(v,0,9)" representa o diâmetro de partícula no qual 90% da distribuição de partículas está abaixo.
[0075] Consequentemente, se, por exemplo, D(v,0,1) = 2Uum e D(v,0,9) = 200 um então ali existirão relativamente muitas (mais que 90%) das partículas que têm um diâmetro de partícula acima de 2 um e ali existirão relativamente muitas (pelo menos 90%) das partículas que têm um diâmetro de partícula de menos que 200 um => a maioria das partículas terá um diâmetro de partícula dentro da faixa de 2um a 200 um.
[0076] Como conhecido na técnica — em relação a partículas de forma irregular o conceito de "diâmetro esférico equivalente" é generi- camente usado, em que alguma propriedade física da partícula é rela- cionada a uma esfera que pode ter a mesma propriedade (por exem- plo, mesmo volume) — da mesma maneira, diâmetro de partícula aqui refere-se ao bem conhecido conceito de "diâmetro esférico equivalen- te".
[0077] De acordo com a técnica — o termo "v" no termo "D(v,0,1)" e "D(v,0,9)" refere-se a volume — isto é, distribuição de volume.
[0078] É trabalho de rotina para aqueles versados na técnica me- dir aqui relevantes valores "D(v,0,1)" e D(v, 0,9)" — por exemplo, atra- vés de uso de uma apropriada aparelhagem Malvern ou uma outra aparelhagem apropriada.
[0079] Em Exemplo 3 de trabalho aqui as partículas de etapa (a) foram fabricadas de agarose. Aqueles versados na técnica conhecem um número de apropriados tipos de partículas que são aceitáveis / au- torizadas para fabricação de produto alimentício / alimento e quaisquer de tais tipos de partículas apropriados em princípio podem ser usados como tipos de partículas apropriadas em etapa (a).
[0080] Pode ser preferido que as partículas em etapa (a) sejam pelo menos um tipo de partícula selecionado do grupo consistindo em: celulose e derivados da mesma, agarose, dextrano, polímeros tais como, por exemplo, poliacrilatos, poliestireno, poliacrilamida, polimeta- crilato ou copolímeros.
[0081] Como evidente para aqueles versados no presente contex- to — o termo "pelo menos um" refere-se àquelas partículas em etapa
(a) que é claro podem ser diferentes tipos de partículas — por exemplo, 50% de um tipo e 50% de um outro tipo.
[0082] O pedido de patente internacional com número de pedido PCT: PCT/EP2018/050317 foi depositado em 8 de janeiro de 2018 e ainda não publicado na data de depósito do presente pedido de paten- te.
[0083] PCT/EP2018/050317 descreve partículas — assim chama- das partículas de oligômero CGMP — em que oligômero CGMP está reticulado, via ligações isopeptídeo covalentes intermoleculares, oli- gômeros de glicomacropeptídeo caseína (CGMP) (oligômeros CGMP), em que CGMP monomérico é o peptídeo contendo os resíduos de aminoácidos 106-169 de k-caseína e monômeros de oligômeros CGMP são CGMP monoméricos.
[0084] Exemplo 6 de trabalho de PCT/EP2018/050317 descreve partículas de oligômeros CGMP compreendendo encapsulação de lac- tose oxidase (LOX, LactoYIELD).
[0085] PCT/EP2018/050317 não mostra diretamente e não ambi- guamente uso de LOX em um processo para a redução de reação Maillard em um alimento ou produto alimentício como aqui discutido — por exemplo, o termo "formação de cor marrom" não é mesmo menci- onado em PCT/EP2018/050317.
[0086] Pode ser preferido que as partículas em etapa (a) sejam pelo menos um tipo de partícula selecionado do grupo consistindo em: partículas de oligômero CGMP,.em que oligêômero CGMP está reticu- lado, via ligações isopeptídeo covalentes intermoleculares, oligômeros glicomacropeptídeo caseína (CGMP) (oligômeros CGMP), em que CGMP monomérico é o peptídeo contendo os resíduos de aminoáci- dos 106-169 de k-caseína e monômeros de oligômeros CGMP são CGMP monoméricos. Alimento e Produto Alimentício
[0087] Materiais de partida alimento e produto alimentício úteis in- cluem qualquer material relevante — por exemplo, material que é con- vencionalmente submetido a uma etapa de fermentação bacteriana de ácido lático tal como leite (por exemplo, leite de soja ou leite de vaca, preferivelmente leite de vaca), materiais vegetais, produtos de carne, sucos de frutas, mosto, massas e massas moles.
[0088] Preferivelmente, o produto é um produto alimentício laticí- nio, preferivelmente um produto alimentício laticínio fermentado.
[0089] Os produtos fermentados, que são obtidos através do mé- todo, incluem como exemplos típicos produtos laticínios tais como leite fermentado, iogurte, queijo, incluindo produtos frescos de queijo, pro- dutos de queijo macio, cheddar, mozzarella ou soro de manteiga.
[0090] Em uma concretização preferida, o produto laticínio é queijo macio, queijo cheddar, queijo pasta filata ou queijo mozzarella — mais preferivelmente, o produto laticínio é queijo pasta filata, queijo ched- dar, ou queijo mozzarella — mais preferivelmente o produto laticínio é queijo mozzarella ou queijo cheddar (preferivelmente usado para fabri- cação de pizza).
[0091] Como discutido acima — Exemplo 2 aqui demonstra que LactoYIELD (LOX) é mais estável termicamente do que hexose oxida- se (HOX) descrita em WO02/39828A?2 discutida acima (Danisco).
[0092] Esta é uma vantagem significante de LOX sobre HOX, uma vez que, por exemplo, um número de alimentos / produtos alimentícios (por exemplo, produtos alimentícios laticínios) são fabricados através de um processo que envolve uma etapa de aquecimento.
[0093] Por exemplo, queijo Mozzarella é fabricado através de um processo que envolve uma etapa de aquecimento. Como conhecido na técnica — Mozzarella é fabricado através de assim chamado método de pasta filata (isto é, Mozzarella é um exemplo de um assim chamado queijo pasta filata).
[0094] Queijos fabricados a partir da técnica pasta filata podem sofrer um tratamento plastificante e de amassamento do coalho fresco em água quente (isto é, uma etapa de aquecimento, em que a tempe- ratura pode, por exemplo, ser de 50 a 95ºC).
[0095] Da mesma maneira, em uma concretização preferida o ali- mento ou produto alimentício é um produto fabricado através de um processo que envolve uma etapa de aquecimento e o contato do pro- duto com a enzima celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) foi feito antes de etapa de aquecimento ser realizada. Em relação a esta concretização , um produto preferido pode ser um queijo pasta filata (tal como, por exemplo, queijo Mozzarrella).
[0096] A etapa de aquecimento pode, por exemplo, ser uma etapa de aquecimento para uma temperatura acima de 40ºC, tal como acima de 50ºC ou tal como acima de 70ºC.
[0097] Como discutido acima, muitos fabricantes de pizza assam pizza em temperaturas > 260ºC e ali então podem existir significantes problemas de desenvolvimento de cor marrom.
[0098] Da mesma maneira, em uma concretização preferida o alimento ou produto alimentício é um produto usado em um processo (por exemplo, para fabricação de pizza) envolvendo uma etapa de aquecimento para uma temperatura acima de 40ºC, tal como acima de 80ºC ou tal como acima de 100ºC ou tal como acima de 150ºC.
[0099] Em relação a esta concretização, um produto preferido po- de ser um queijo pasta filata (tal como, por exemplo, queijo Mozzarel- la) — que pode ser usado para fabricação de pizza ou alternativamente expresso queijo de pizza.
[00100] Queijo retalhado (tal como, por exemplo, mozzarella) co- mercialmente disponível para o consumidor normalmente contém agente antiformação de torta. O papel de agente antiformação de torta é evitar que retalhos de queijo colem uns aos outros e formem um grumo de queijo que não pode ser espalhado facilmente sobre, por exemplo, uma pizza.
[00101] Agente antiformação de torta é normalmente composto por amido de, por exemplo, batata e milho. Uma vez que amido é um po- lissacarídeo natural contendo altas quantidades de grupos açúcares redutores pode-se antecipar que amido contribui significantemente pa- ra desenvolvimento de cor marrom Maillard. Assim , uma solução con- trolando somente redução de galactose pode não ser útil para um pro- duto retalhado com agentes antiformação de torta aplicados tal como amido.
[00102] O Exemplo 4 mostra que LactoYIELD (LOX) trabalha bem mesmo na presença de agentes antiformação de torta de amido — mais especialmente produto de queijo mozzarella retalhado compre- endendo agentes antiformação de torta de amido.
[00103] Da mesma maneira, em uma concretização preferida o ali- mento ou produto alimentício (preferivelmente um produto alimentício, tal como preferivelmente um produto queijo em retalhos (por exemplo, queijo mozzarella) é um produto compreendendo agentes antiforma- ção de torta de amido (por exemplo, amido de batata e/ou milho).
[00104] “Como conhecido na técnica — o termo "queijo retalhado" refere-se a um queijo que foi enviado através de um retalhador para criação de retalhos de queijo. Queijo retalhado é genericamente usado como um ingrediente. Ele é misturado com outros ingredientes ou usado como um produto que se põe em cima para alimentos tais como saladas, sanduíches, sopa, pizza, lasanha, e muitos outros pratos sa- borosos. Ele é disponível em muitas variedades diferentes, tais como mozzarella, cheddar, parmesão, e Suíço.
[00105] Da mesma maneira, preferivelmente o queijo retalhado é um queijo retalhado mozzarella, um queijo retalhado Cheddar, um queijo retalhado parmesão ou u m queijo retalhado Suíço.
[00106] Em concretizações adicionais, o material substrato é um material de partida para uma alimentação de animal tal como silagem, por exemplo, grama, material cereal, ervilhas, alfafa ou folha de beter- raba sacarina, em que culturas bacterianas são inoculadas na colheita de alimentação a ser ensilada de modo a obter uma sua preservação, ou em produtos de despejo animal ricos em proteínas tais como restos de abatedouro e restos de peixes, também com o objetivo de preser- vação destes restos para propósitos de alimentação animal. Aspecto Separado da Invenção
[00107] “Como discutido acima em relação às conclusões de Exem- plo 3 de trabalho — adsorção de LOX sobre uma partícula evita a trans- ferência da enzima para soro de leite coalhado. Isto não so mente pre- serva o valor do soro de leite coalhado, mas também permite alguém dosar somente um décimo da enzima requerida. Presença de LOX em coalho de queijo catalisa a oxidação de galactose a ácido galactônico o que resultará em reduzido desenvolvimento de cor marrom com co- zimento.
[00108] WO02/39828A2 (Danisco) discutida acima nem mesmo menciona a possibilidade de adsorção da enzima hexose oxidase (HOX) aqui descrita sobre partículas.
[00109] Sem ser limitado por teoria — não há razão prima facie para acreditar que adsorção de HOX sobre uma partícula pode não render um processo aperfeiçoado sobre os processos descritos em WO02/ 39828A2 (Danisco) discutida acima, em que todos os exemplos de trabalho descrevem essencialmente somente adição de "espargimento sobre" da enzima HOX para a superfície do produto (por exemplo, queijo mozzarella).
[00110] Da mesma maneira, um aspecto separado da invenção refere-se a um processo para a redução de reação Maillard em um produto alimentício de queijo, em que o processo compreende as se-
guintes etapas:
[00111] (a) contatar leite com partículas compreendendo enzima hexose oxidase (EC 1.1.3.5) e/ou celobiose oxidase (EC 1.1.99.18) ligada / encapsulada de primeiro aspecto e/ou quaisquer suas concre- tizações antes, durante ou após acidulação do leite;
[00112] (b) coagular leite acidificado de (i) e separação de coalho do soro de leite coalhado;
[00113] (c) estocar coalho de (ii) sob condições, em que as enzi- mas oxidase presentes no coalho desempenham oxidação de galacto- se presente no coalho;
[00114] (d) realizar ainda etapas adequadas para finalmente ter- minar com o produto queijo compreendendo uma quantidade reduzida de galactose e pelo que um produto com uma redução de reação Mail- lard.
[00115] O inteiro comprimento de sequência de polipeptídeo (inclu- indo sequência pré / sinal — isto é, à montante de peptídeo maduro) da enzima hexose oxidase (HOX) discutida em WO02/39828A2 (Danisco) é aqui mostrado como sequência de polipeptídeo de posição de SEQ ID NO: 2. Ela é CAS NO: 9028-75-5 e número de referência UniProt "Uni- ProtKB-P93762(HOX CHOCR)" (http://www.uniprot.org/uniprot/P93762).
[00116] Preferivelmente, a enzima hexose oxidase é uma enzima:
[00117] (: compreendendo a parte madura / ativa da sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 aqui; ou
[00118] (ii): uma variante de (i), em que a variante compreende menos que 20 (preferivelmente menos que 10, mais preferivelmente menos que 5) alterações de aminoácidos (preferivelmente uma substi- tuição, uma deleção ou uma inserção — mais preferivelmente uma substituição) como comparada à sequência de polipeptídeo de (i).
[00119] Um exemplo de u ma parte madura / ativa da sequência de polipeptídeo de SEQ ID NO: 2 aqui de item (i) é o produto Danisco /
DuPont comercialmente disponível enzima HOXGridamyl Surebake 800 — ele é aqui usado em um exemplo de trabalho.
[00120] Concretizções preferidas descritas acima (por exemplo, com referência a tipos de partículas preferidos; diâmetro de partícula preferido; produto alimentício de queijo preferido; etc.) também são concretizações preferidas de aspecto separado acima da invenção. Exemplos Exemplo 1 - Dados experimentais de LactoYIELD (LOX)
[00121] É abaixo referida que a dosagem de enzima foi LOXU por g de queijo.
[00122] —LOXU foi determinada de acordo com a folha de Informação de Produto comercialmente disponível para LactoYIELD, Chr. Hansen A/S Denmark; Versão: 5 Pl GLOB EN 02-24-2017. Como discutido abaixo — neste Exemplo foram usados ao redor de 0,01 — 0,02 LOXU/g
[00123] Neste experimento LactoYIELD foi adicionado à superfície de um queijo mozzarella em retalhos. Um queijo mozzarella produzido tanto usando Hannilase XP (mucor pepsina XL-typw) como CHY-MAX M (quimosina camelo) e a mesma cultura foi retalhado e estocado a - 18ºC. Uma quantidade de 5,0 g de retalhos de queijo foi transferida para um tubo de 15 mL e adicionados 0,5 mL de enzima LactoYIELD diluída em acetato de sódio 0,05 M, pH 5,2. Dosagem de enzima foi O, 0,01 ou 0,02 LOXU por g de queijo. O tubo foi fechado com uma tam- pa à prova de ar, invertido por 20 minutos e estocado a 5ºC. Após 14 dias de estocagem a amostra foi analisada para habilidade para cor marrom e para galactose.
[00124] “Desenvolvimento de cor marrom foi estudado através de colocação de retalhos simples de queijo em uma cavidade de uma placa de 96 cavidades. A placa foi aquecida para 100ºC por 70 minu- tos. A partir dos resultados mostrados na Figura 1 e Figura 2 é visto que tratamento de queijo mozzarella em retalhos com LOX em 0,01 —
0,02 LOXU/g reduziu a habilidade do queijo para desenvolver cor mar- rom. Adição de catalase (Catazyme) pareceu aumentar o efeito da en- zima LactoYIELD e resultou mesmo em menos desenvolvimento de cor marrom.
[00125] A amostra foi analisada para galactose através de disper- são de 4 g de queijo em 25 mL de água até homogeneização e inver- são de tubo por 30 minutos. Enzima LOX na suspensão foi inativada através de imersão de amostra em um banho de água a 80ºC por 25 minutos. A fase aquosa foi recuperada após centrifugação e mantida em -18ºC antes de análises. Galactose foi quantificada por HPLC. Na Tabela 1 é visto que a concentração de galactose declina para um ní- vel de menos que 200 mg/100 g quando a amostra de queijo é tratada com LOX. Redução de galactose com adição de LOX está em boa concordância com a redução observada de desenvolvimento de cor marrom. Tabela 1. Medição de galactose residual em retalhos de queijo. Coagulante LactoYield | Catazyme Galactose Residual dao Ro mata [erva Jo o le era for o Tag ema fo o a eme o a Ts emas Jor o ls Remessa eae o a ss eme o or Ts
Exemplo 2 - LactoYIELD (LOX) é mais estável termicamente que HOX
[00126] Uma etapa inerente em produção de queijo pasta filata é estiramento térmico do coalho. Aqui pães de queijo de coalho recen- temente fabricados são submetidos a água quente em um processo de estiramento que serve para plastificar o coalho. No assim chamado aparelho de cozer coalho é estirado em água tendo temperaturas de até, por exemplo, 80-85ºC para tempos de retenção de 2-3 minutos. O tratamento resulta em temperaturas de coalho tão altas como 65-70ºC. A atividade de enzimas que são adicionadas a leite de queijo e retidas em coalho tem de ser preservada durante o inteiro processo de fabri- cação de queijo. Para avaliar o potencial impacto de um tratamento térmico de LOX, uma solução tamponada da enzima foi aquecida para temperaturas na faixa de 50-80ºC para vários tempos de retenção a partir de 5-30 minutos. O tampão empregado foi uma solução de ace- tato de sódio 50 mM de pH 5,2, que é o pH alvo de coalho mozzarella entrando em estiramento térmico. Após aquecimento a enzima foi co- locada sobre gelo e atividade foi medida. As enzimas HOX (produto de Danisco / DuPont comercialmente disponível Grindamyl Surebake 800 descrito em WO02/39828A2 discutida acima) e GOX (glicose oxidase — produto comercialmente disponível G6125 de Sigma) foram incluídas como referência. O mesmo ensaio foi usado para todas as medições de atividade de enzimas das três enzimas. Medição de atividade foi feita em um ensaio peroxidase acoplado usando 4-amino antipirina (4AA) e N-etil-N-sulfo propil-m-toluidina (Tops) como os agentes cro- mogênicos para Eur. J. Biochem. 268, 1136-1142 (2001). Atividade foi convertida para atividade relativa através de normalização para ativi- dade de uma amostra controle não tratada da respectiva enzima na mesma diluição. Plotagem de atividade como função de tempo de re- tenção resultou em decaimento exponencial simples a partir do qual foi calculada uma taxa constante. A partir da equação de Arrhenius des-
crevendo a relação em ter constante de taxa e temperatura, foram cal- culadas constantes de taxas em temperaturas de 50 — 72ºC e conver- tidas em valores de meia — vida para uma reação de 1º ordem.
[00127] NaTabela2? é visto que LOX é estável em temperaturas de 65-72ºC enquanto GOX e HOX perderam considerável atividade den- tro de 2-5 minutos. Tabela 2: Valores de meia-vida em minutos para inativação térmica de LOX, GOX e HOX em pH 5,2. Exemplo 3 - Adição de LactoYIELD (LOX) leite de queijo — partículas melhores
[00128] Abaixo é feita referência a enzima "ligada a partículas" — as partículas tiveram uma distribuição de diâmetro de partícula (D(v, 0,1)) de pelo menos 2 um e uma distribuição de diâmetro de partícula (D(v, 0,9)) de menos que 200 um.
[00129] A partícula foi fabricada de agarose (Workbeads WB40S) — D(v, 0,5) de 40 um.
[00130] Um modelo de queijo de escala diminuída foi feito em pla- cas de 96 cavidades empregando um processo simulando fabricação de queijo. A leite desnatado foi adicionado CaCl2 para 0,5 g/L, glicono delta-lactoneglicona (GDL) para 0,9 g/L para acidulação química e Ha- lactase para 5 NLU/mL para hidrólise de lactose a glicose e galactose. Imediatamente após dissolução de GDL, o leite foi transferido para uma placa de 96 cavidades com 1,25 mL em cada cavidade. A enzima LactoYield (LOX) foi adicionada em diferentes níveis tanto como en- zima líquida ou como ligada a partículas com diâmetro de partícula como dado acima. Catalase foi adicionada como enzima líquida em diferentes níveis. Adição de LOX marcou início do experimento (t = O).
A placa foi aquecida para 30ºC e foi misturada por agitação. Em t = 10 minutos coagulante foi adicionado a cada cavidade (0,04 IMCU/mL) e agitação da placa interrompida cinco minutos depois. Adição de coa- gulante resultou em coagulação do leite para coalho de coalheira. Em t = 35 minutos o coalho foi cortado através de movimentação de uma ponta de pipeta para frente e para trás umas poucas vezes antes de aumento de temperatura para 40ºC e início de agitação da placa. Em t = 60 minutos parte do soro de leite coalhado foi removido e deslocado com água e agitação continuada. Uma amostra de soro de leite coa- lhado foi mantida para análise de atividade LOX. Finalmente, em t = 70 minutos, a placa foi girada em uma centrífuga a 3000 rpm por 20 minu- tos e soro de leite coalhado foi removido por inversão da placa. Na placa permaneceu um pequeno pedaço de coalho de coalheira.O coa- lho foi estocado a 5ºC e amostras foram tomadas para análises após O, 4, 8, e 12 dias. Coalho foi dissolvido em 1,0 mL de 0,5 M Na3- citrato, e açúcar extraído do coalho de coalheira dissolvido através de diminuição de pH para 4,5 com ácido clorídrico e tomando uma amos- tra do sobrenadante após centrifugação. Galactose foi analisada usando um kit de ensaio enzimático de Megazyme (K LACGAR). Ati- vidade de LOX em soro de leite coalhado foi medida usando um en- saio colorimétrico empregando 2,6-dicloro indofenol como receptor de elétrons.
[00131] Os resultados demonstraram que uma significante fração da atividade LOX é transferida para soro de leite coalhado quando a enzima é adicionada como uma formulação líquida. Quando a enzima LOX é ligada a uma partícula de 40 micrometros, a enzima não pode ser detectada em soro de leite coalhado. Isto sugere que a enzima particiona seletivamente para coalho quando associada com uma par- tícula de tamanho de micrometro.
[00132] Resultados relacionando-se a desenvolvimento de galacto-
se no coalho durante estocagem a 5ºC mostraram que controle sem LOX adicionada teve o mesmo teor de galactose durante o período de estocagem de 13 dias. Em coalho fabricado com LOX houve um declí- nio em galactose durante estocagem. No final de estocagem galactose diminuiu para < 200 mg/ 100 kg (< 0,2 %). Isto mostra que a lactose oxidase oxidou galactose a ácido galactônico em coalho de queijo du- rante estocagem. É mais provável que a redução de galactose resulta- rá no menor desenvolvimento de cor marrom do coalho de queijo.
[00133] Em conclusão, adsorção de LOX sobre uma partícula evita a transferência da enzima para soro de leite coalhado. Isto não somen- te preserva o valor do soro de leite coalhado, mas também permite a alguém dosar somente um décimo da enzima requerida. Presença de LOX em coalho de queijo catalisa a oxidação de galactose a ácido ga- lactônicoo que resultará em reduzido desenvolvimento de cor marrom durante cozimento. Exemplo 4 - LactoYield (LOX) trabalha mesmo na presença de agen- tes antiformação de torta
[00134] O experimento reportado no Exemplo 1 foi baseado em queijo retalhado para o propósito. Queijo retalhado comercialmente disponível para o consumidor sempre contém agente antiformação de torta. O papel de agente antiformação de torta é evitar que retalhos de queijo colem uns nos outros formando um grumo de queijo que não pode ser facilmente espalhado sobre, por exemplo, uma pizza. Agente antiformação de pizza é composto por amido de, por exemplo, batata e milho. Uma vez que amido é um polissacarídeo natural contendo altas quantidades de grupos açúcares redutores pode-se antecipar que amido contribuirá significantemente para desenvolvimento de cor mar- rom Maillard. Assim, uma solução controlando somente redução de galactose pode não ser útil para um produto retalhado aplicado com agentes antiformação de torta tal como amido.
[00135] LOX pode oxidar carboidratos poliméricos diferente de seus análogos funcionais, HOX e GOX (Eur. J. Biochem. 268, 1136- 1142, 2001). Para testar se a atividade de LOX na direção de amido foi alta o suficiente para controlar desenvolvimento de cor marrom de queijo mozzarella com agente antiformação de torta, o experimento de Exemplo 1 foi repetido usando queijo retalhado do supermercado ten- do amido de batata na lista de ingredientes.
[00136] LOX foi aplicada à superfície de queijo retalhado e estoca- do em tubos com tampas fechadas hermeticamente. Após 2 semanas de estocagem a 4ºC desenvolvimento de cor marrom foi testado. À partir do resultado mostrado aqui na Figura 3 é visto que tratamento com LOX de queijo mozzarella retalhado contendo amido de batata tem uma forte influência sobre a cor do queijo após aquecimento para 100ºC por 100 minutos, em que adição de LOX rendeu significante- mente menos desenvolvimento de cor marrom. Exemplo 5
[00137] O efeito de adição de LOX a leite antes de fabricação de queijo foi estudado usando um modelo de queijo miniaturizado. Micro queijo foi preparado em placas de 96 cavidades de 2 mL fabricadas de polipropileno. A cada cavidade foram adicionados 1,25 mL de leite contendo recentemente adicionados delta-gliconolactono, cloreto de cálcio, lactase e catalase. LOX foi adicionada em três dosagtens: ne- nhuma LOX, 0,1 LOXU/mL e 0,5 LOXU/mL. A placa foi incubada a 32ºC com agitação por 10 minutos. Subsequentemente, o coagulante de leite CHY-MAX foi adicionado a cada cavidade em uma dosagem de 0,04 IMCU/mL. Agitação foi interrompida 7 minutos após adição de coagulante, e 18 minutos depois o gel de coalheira (coágulo) formado foi cortado com uma ponta de pipeta. Justo após corte, temperatura foi aumentada para 40ºC, e 5 minutos depois agitação foi iniciada. Agita- ção da placa foi feita para imitar agitação de coalho na tina de queijo.
Após 20 minutos de agitação 400 yuL de soro de leite coalhado foram removidos de cada cavidade e substituídos com 400 ul de água para diluir açúcares em coalho e soro de leite coalhado. Agitação da placa a 40ºC foi continuada por 15 minutos, e então coalho e soro de leite coa- lhado foram separados por centrifugação da placa em um campo cen- trífugo relativo de 3214 g. Soro de leite coalhado foi decantado da pla- ca e as pequenas peças de coalho de coalheira (queijo) permanece- ram na placa. Finalmente, a placa foi aquecida para 65ºC por 15 mi- nutos para imitar estiramento térmico de queijo pasta filata. Duas pla- cas foram fabricadas: uma foi testada para desenvolvimento de cor marrom imediatamente após sua preparação , e a outra foi estocada a 5ºC antes de testes. Desenvolvimento de cor marrom foi testado atra- vés de colocação de placa de cavidades de 2 mL de profundidade em um aquecedor de placas por 2 h oras a 100ºC.
[00138] O teste de desenvolvimento de cor marrom mostrou que todas as amostras de coalho na placa testada justo após preparação de coalho tornaram-se marrons independente de dosagem de enzima, enquanto para coalho na placa estocada por 1 semana houve uma signi- ficante redução em desenvolvimento de cor marrom em uma dosagem LOX de 0,1 LUXO/mL ou maior (ver aqui Figura 4). Isto mostra que adi- ção de LOX a leite de queijo antes de fabricação de queijo pode ser usa- da para redução de desenvolvimento de cor marrom de queijo através de controle de quantidade de açúcar redutor residual. Uma fração da enzi- ma é retida no coalho, e durante estocagem fria do coalho a enzima retida oxidará açúcares redutores a seus correspondentes ácidos. Referências 1: WO02/39828A2 (Danisco) 2: EP1041890B1 (Novozymes) 3: Article of Feng Xu et al (Eur. J. Biochem. 268, 1136-1142 (2001)) 4: EP2988601B1 (Arla)
Claims (15)
1. Processo para a redução de reação Maillard em um ali- mento ou produto alimentício (preferivelmente um produto alimentício laticínio), caracterizado por compreender contato do produto com uma enzima celobiose oxidase EC 1.1.99.18; e em que a enzima oxidase é contatada com o alimento ou produto alimentício durante sua preparação ou contatada com o ali- mento ou produto alimentício após o produto ter sido preparado ainda antes de alimento ou produto alimentício ser submetido a condições que podem resultar na indesejável reação Maillard; e em que a enzima oxidase é contatada com o alimento ou produto alimentício sob condições, em que as enzimas oxidase de- sempenham oxidação de galactose presente no alimento ou produto alimentício e/ou em que as enzimas oxidase realizam oxidação de ga- lactose presente sobre a superfície do alimento ou produto alimentício.
2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracteriza- do por a enzima celobiose oxidase EC 1.1.99.18 ser uma enzima: (i): compreendendo a sequência de polipeptídeo de posição 1-473 de SEQ ID NO: 1, que começa com Gly em posição 1 e termina com Lys em posição 473; ou (ii): uma variante de (i), em que a variante compre- ende menos que 20 (preferivelmente menos que 10, mais preferivel- mente menos que 5) alterações de aminoácidos (preferivelmente uma substituição, uma deleção ou uma inserção — mais preferivelmente uma substituição) como comparada à sequência de polipeptídeo de (i).
3. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado por a enzima celobiose oxidase EC
1.1.99.18 ser uma enzima: (i): compreendendo a sequência de polipeptídeo de posição 1-473 de SEQ ID NO: 1, que começa com Gly na posição 1 e termina com Lys na posição 473; e em que a quantidade de enzima celobiose oxidase EC
1.1.99.18 que é contatada com o produto alimentício é de 0,001 a 1,0 LOXU/9g.
4. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado por o produto ser um produto alimen- tício laticínio e o processo compreender as seguintes etapas: (a): contatar leite com a enzima celobiose oxidase EC
1.1.99.18 antes, durante ou após acidulação do leite; e (d): realizar ainda etapas adequadas para finalmente termi- nar com o produto alimentício laticínio compreendendo uma reduzida quantidade de galactose e pelo que um produto com uma redução de reação Maillard.
5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracteriza- do por o produto ser um produto alimentício de queijo e em que o pro- cesso compreende as seguintes etapas: (a): contatar leite com a enzima celobiose oxidase EC
1.1.99.18 antes, durante ou após acidulação do leite; (b): coagular leite acidificado de (i) e separar coalho do soro de leite coalhado; (c): estocar o coalho de (ii) sob condições, em que as enzi- mas oxidase presentes no coalho realizam oxidação de galactose pre- sente no coalho; (d): realizar ainda etapas adequadas para finalmente termi- nar com o produto queijo compreendendo uma reduzida quantidade de galactose e pelo que um produto com uma redução de reação Mail- lard.
6. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 4 e 5, caracterizado por a etapa (a) acima estar contatando leite com partículas compreendendo enzimas celobiose oxidase EC
1.1.99.18 ligadas / encapsuladas antes, durante ou após acidulação do leite.
7. Processo, de acordo com a reivindicação 6, caracteriza- do por o produto ser um produto alimentício de queijo e em que o pro- cesso compreende as seguintes etapas: (a): contatar leite com partículas compreendendo enzima celobiose oxidase EC 1.1.99.18 ligada / encapsulada antes, durante ou após acidulação do leite; (b): coagular o leite acidificado de (i) e separar o coalho do soro de leite coalhado; (c): estocar o coalho de (ii) sob condições, em que as enzi- mas oxidase presentes no coalho realizam oxidação de galactose no coalho; (d): realizar ainda etapas adequadas para finalmente termi- nar com o produto queijo compreendendo uma reduzida quantidade de galactose e pelo que um produto com uma redução de reação Mail- lard.
8. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 6 e 7, caracterizado por as partículas compreendendo enzima oxidase ligada / encapsulada de etapa (a) serem partículas tendo uma distribuição de diâmetro de partícula (D(v, 0,1)) de pelo menos 0,1 um e uma distribuição de diâmetro de partícula (D(v, 0,9)) de menos que 200 um; e em que as partículas na etapa (a) são de pelo menos um ti- po de partícula selecionado do grupo consistindo em: celulose e deri- vados da mesma, agarose, dextrano, polímeros tais como, por exem- plo, poliacrilatos, poliestireno, poliacrilamida, polimetacrilato, copolímeros ou partículas de oligômero CGMP, em que oligômero CGMP está reticu- lado, via ligações de isopeptídeo covalente intermolecular, oligômeros de glicomacropeptídeo de caseína (CGMP) (oligômeros CGMP), em que CGMP monomérico é o peptídeo contendo os resíduos de amino- ácidos 106-169 de k-caseína e monômeros de oligômeros CGMP são CGMP monoméricos.
9. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 3, caracterizado por a celobiose oxidase ser contatada com alimento ou produto alimentício sendo espargida sobre o produto como uma solução ou dispersão.
10. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado por o produto ser um produto alimen- tício laticínio e em que o produto laticínio é um produto de leite fermen- tado com bactérias de ácido lático (LAB) (tal como, por exemplo, um produto iogurte) ou um produto queijo.
11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracteri- zado por o produto ser queijo pasta filata, preferivelmente em que o queijo pasta filata é um queijo mozzarella.
12. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 10 e 11, caracterizado por o produto ser um produto fabricado através de um processo que envolve uma etapa de aquecimento e o contato do produto com a enzima celobiose oxidase EC 1.1.99.18 foi feito antes de etapa de aquecimento ser realizada e em que a etapa de aquecimento é uma etapa de aquecimento para uma temperatura acima de 40ºC.
13. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado por o produto ser um produto usado em um processo (por exemplo, para fabricação de pizza) envolvendo uma etapa de aquecimento para uma temperatura acima de 100ºC; e em que o produto é um queijo pasta filata, preferivelmente em que o queijo pasta filata é um queijo mozzarella.
14. Processo, de acordo com qualquer uma das reivindica- ções precedentes, caracterizado por o produto ser um produto queijo retalhado compreendendo agentes antiformação de torta de amido (por exemplo, amido de batata e/ou milho) e em que o produto queijo retalhado é queijo mozzarella, queijo cheddar, queijo parmesão ou queijo Suíço.
15. Uso de uma enzima celobiose oxidase EC 1.1.99.18 pa- ra a redução de reação Maillard em um alimento ou produto alimentí- cio (preferivelmente um produto alimentício laticínio), caracterizado por o uso envolver um processo compreendendo contato do produto com uma enzima celobiose oxidase EC 1.199.18 como definido em qual- quer uma das reivindicações precedentes.
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