CN1407856A

CN1407856A - 改进生面团和面包质量的方法

Info

Publication number: CN1407856A
Application number: CN00816665A
Authority: CN
Inventors: J·B·瑟
Original assignee: Danisco AS
Current assignee: DuPont Nutrition Biosciences ApS; Danisco US Inc
Priority date: 1999-12-03
Filing date: 2000-12-01
Publication date: 2003-04-02
Also published as: CA2392116A1; EP1108360A9; JP2003515332A; BR0016068A; EP1108360A1; MXPA02005452A; EP1233676A1; NZ518687A; WO2001039602A1; AU1723801A

Abstract

制备生面团的方法，此方法包含将可以同时水解非极性脂、糖脂和磷脂的酶加入生面团。可以加入该酶的一种或更多底物，如双半乳糖甘油二酯(DGDG)等半乳糖脂或磷脂酰胆碱(PC)等磷脂。可以将脂底物以谷物脂如燕麦油的形式加入生面团中。该方法提供了延展性改进和粘度减低的生面团，和具有高比容、改进的柔软度和极佳的屑结构的烘烤面包产品。

Description

改进生面团和面包质量的方法

本发明涉及制造生面团和基于生面团的产品的领域，特别是涉及改进生面团的强度和切削性及面包和其它烘烤产品的屑结构。具体地说，本发明提供了一种用可以水解生面团中的非极性和极性脂的酶制作生面团和面包，从而改进生面团和烘烤成品质量的方法。

技术背景和先有技术

在烘烤行业中已知可以使用酶，如淀粉酶、木聚糖酶、氧化酶和蛋白酶而改进生面团和生面团的加工特性和/或改进烘烤产品而获得体积增加、延缓陈腐和提高柔软度。

将脂酶作为烘烤添加剂也是已知的。可以定义为催化酰基甘油水解的羧酸酯酶(EC3.1.1.3)是生理上十分重要的酶，与淀粉酶和蛋白酶一起成为三种主要的消化酶。它们水解酰基甘油酯为甘油脂和脂肪酸，但也可在酯化或酯交换反应中起作用。

因此，美国专利3,368,903公开了当添加从植物种子中分离的纯化脂酶制剂到面包生面团混合物中时，对面包陈腐具有显著延缓作用。

JP-62-285749-A描述了一种制作面包的方法，其中将脂酶与有活力的谷蛋白和卵磷脂混合添加到生面团中。然而，据报道该脂酶使面包体积和面包屑弹性等质量特征变坏。

Mohsen等(Egypt.J.Food Sci.，1986，14：175-182)描述了由德列马根霉产生的酯酶可以改善面包的柔软度。

EP468731A1公开了一种包含葡萄糖氧化酶与各种氧化酶或水解酶如脂酶的结合的改进面包的组合物。获得了足够体积的面包。然而，根据此先有技术文献，单独使用脂酶不产生具有满意质量的面包。

WO-94/04035公开了一种通过添加微生物来源的脂酶(EC3.1.1.3)到生面团而改进生面团(添加或不添加脂肪)和/或由生面团制作的烘烤产品特性的方法。使用微生物脂酶导致体积增加并改进烘烤产品的柔软度。另外，也发现了抗陈腐作用。

EP585988A1公开了一种包含至少一种脂酶、至少一种半纤维素酶和至少一种淀粉酶的面包改进剂组合物。烘烤实验表明，在生面团中单独使用脂酶，不添加脂肪，使烘烤产品的体积减小，而当在含添加脂肪的生面团中使用脂酶时没有观察到对体积的作用。

WO98/45453公开了从黑色曲霉得到的脂酶在改进面包屑结构中的用途。然而，这种酶对面包体积和柔软度没有显著改进作用。

因此从先有技术可以得出脂酶的作用，当作为生面团添加剂时对于抗陈腐或延缓屑变硬及改善面包体积是高度可变的。

WO98/45453公开的脂酶的一个重要作用是，除了甘油三酯水解作用，它可以水解面粉中的极性糖脂，如双半乳糖甘油二酯(DGDG)。假定面包屑结构改进作用可能与后一种作用相关。已经表明黑色曲霉脂酶没有磷脂水解作用。

已知使用磷脂酶可以改进面包质量。因此，JP-82-66213公开了磷脂酶C和溶血磷脂酶在改进冷冻生面团中的用途，EP575133A公开了磷脂酶A1在改进生面团加工特性中的用途，JP-60-078529描述了磷脂酶A在改进小麦面生面团和面条的机械特性中的用途，EP109244A公开了磷脂酶A可以用于改进生面团的特性。

由于本领域中已知添加脂酶或磷脂酶到生面团可以改进生面团的机械特性和/或烘烤成品的质量，因此一个重要的问题是存在于面粉中的各个酶的脂底物量是有限的。小麦面粉生面团中的脂酶底物是内源性脂，其中约50％为非极性脂，50％为极性糖脂和磷脂。

目前用于烘烤行业中的一些脂酶，包括公开于EP585998和WO94/04035的脂酶仅仅对非极性脂部分是有活性的，因此形成游离脂肪酸和甘油以及较少的甘油单酯和甘油二酯。然而对生面团或面包质量的有益作用是有限的，因为游离脂肪酸可能对面包质量有不利的作用。除了对酰基甘油的作用外，公开于WO98/45453的真菌脂酶对极性糖脂有一定的水解作用。

另外，如上所述，建议将磷脂酶A和C作为改进生面团和/或面包的添加剂。这种磷脂酶的酶促作用是将存在于生面团中的磷脂转化为已知是有效乳化剂的对应溶血磷脂酶。然而，面包生面团中的内源性磷脂量相对较少，因此选择性对磷脂有活性的添加酶改进生面团和面包的作用是有限的。

因此需要一种可以水解生面团中基本所有磷脂类型，即非极性酰基甘油和极性磷脂以及糖脂的生面团和/或面包改进酶。本发明是基于对可以同时利用所有这些脂作为底物的脂解活性酶的发现，以及发现添加这种酶到生面团导致生面团稳定性和强度以及加工特性显著改进，并导致以面包体积、面包屑结构、面包屑外形和颜色、以及面包柔软度的显著改进而体现的烘烤面包产品的质量改进。这些新型酶的一个特别使人感兴趣和重要的方面是它们可以优选作用于极性脂，这提示在酰基甘油水解酯酶中观察到的不良反应可以通过优选水解极性脂的选择性酶而得到控制。这些新型酶的另一使人感兴趣和重要的方面是，与短链脂肪酸如C₄到C₁₀脂肪酸相比，它们优选作用于长链脂肪酸，如C₁₂到C₂₀脂肪酸。

先有技术已经表明在从德列马根霉得到的脂酶中，链长度选择性受氨基酸取代的影响。R.D.Joerger等(Lipids，29(6)377-384(1994))表明突变体F95D，F112W和V209W对C₄和C₈酸的优选性改变。R.R.Klein等(JAOCS，74(11)1401-1407(1997))公开了突变体V206T+F95D对C₈脂肪酸具有更高的选择性。R.R.Klein等(Lipids32(2)123-130(1997))表明突变体V209W+F112W，V94W和F95D+F214R对C₄到C₈脂肪酸具有更高的水解活性，并提示中链长度特异性的结构决定簇可能存在于酰基结合沟的远端。

已经发现本发明的酶改进生面团和面包的作用可以通过添加如燕麦油等谷物脂形式的糖脂和/或磷脂到生面团中而进一步增强。

发明概述

因此，本发明第一方面涉及一种制备生面团的方法，所述方法包含在生面团成分中添加一种酶，这种酶在生面团的条件下可以水解非极性脂、糖脂和磷脂，或添加含该酶的组合物，并混合生面团成分而获得生面团。这种酶的任何脂底物可以是天然存在于面粉中的脂，或可以被添加到生面团中。

另一方面，提供了一种改进生面团的组合物，包含一种酶，这种酶在生面团的条件下可以水解非极性脂、糖脂和磷脂，并可选择性水解至少另一种生面团成分。另一种生面团成分可以是，例如对生面团特性和/或由生面团制成的烘烤产品的质量有改进作用的其它酶。

另一方面，本发明涉及一种通过本发明的方法获得的生面团和通过烘烤这种生面团而获得的烘烤产品，以及根据本发明制备的面条和意大利面食产品。

发明详述

本发明有利地提供了一种改进基于面粉的生面团和由这种生面团制成的产品的特性的方法。对于烘烤产品来说，这是通过提供一种制备烘烤产品的方法而达到的，这种烘烤产品具有高度需要的关于面包体积、屑结构和外形的特征，并额外具有由柔软度的增加而反映的延长的储存期，即相对于未使用本发明的酶而制作的烘烤产品来说，延迟了这种烘烤产品的陈腐。尽管目前优选将此方法用于制作酵母发酵的面包产品如面包条、卷或烤面包，也考虑了将此方法用于任何其它类型的生面团和基于生面团的产品，如面条和意大利面食产品及蛋糕，其质量可以通过添加本发明的酶而得到改善。

本方法包含一个实质步骤，即将有效量的，在生面团条件下可以水解非极性脂、糖脂和磷脂的酶，或含该酶的组合物直接加入已经混合的生面团或作为一种或更多生面团成分而加入生面团。

在本发明的内容中，一般用表达式“有效量”描述在生面团条件下足够使生面团中的甘油三酯、磷脂和糖脂产生可检测的水解的量。下面的实施例中给出了检测这些水解活性的分析方法的例子。更具体地说，这一表达式可以涉及不仅产生上述脂底物的可检测的水解，还导致形成一定水平酶催化终产物的量，该终产物的水平可以改进生面团的特性，如显著改进粘度评分和/或延展性评分，这些改进归因于酶的添加，或者，如果烘烤生面团，该终产物水平可以改进烘烤产品的质量，如面包体积增加，柔软度增加或改进屑结构。

本发明的酶可以具有一些甘油三酯水解作用。除了甘油三酯水解活性，该酶也可以具有对磷脂和糖脂的水解活性。

另外，本发明的酶对磷脂和糖脂可以具有显著水解活性，但具有较不显著的甘油三酯水解作用。

可以将本发明的酶描述为可以同时水解酰基甘油(甘油酯)(即，它具有通常与称作脂酶(EC3.1.1.3)的一类酶相关的酯酶活性)、磷脂和糖脂如半乳糖脂的多功能酶。因此，此酶具有与许多通常称作磷脂酶的酶相关的水解活性。磷脂通过两组不同的酶以两种不同的方式切断，其中一种包含在一组脂酶中，包括磷脂酶A₁和磷脂酶A₂和磷酸二酯酶(磷脂酶C和D)。本发明的酶可以具有任何这些磷脂酶活性。

已经发现具有本发明的酶的水解特征的酶可能对脂底物中的脂肪酸成分具有不同的亲和性，这表示本发明的酶可能优选水解含短链脂肪酸如C₄到C₁₀脂肪酸的脂，或者它可能优选水解含长链脂肪基团如C₁₂到C₂₀脂肪酸的脂。对长链脂肪酸基团具有优选性的酶可以在如黄油脂肪或其它脂质含有丁酸基团的生面团中特别有用，因为已知的一个问题是游离丁酸可能引起不好的口感和味道。

在一个更优选的方面，与短链脂肪酸如C₄到C₁₀脂肪酸相比，本发明的酶优选水解含长链脂肪酸，如C₁₂到C₂₀脂肪酸的脂。这就是说，该酶优选对短链脂肪酸具有相对低的活性，但对具有长链脂肪酸的甘油酯特别有活性。

更优选地，本发明的酶对短链脂肪酸无活性。

使用对短链脂肪酸活性相对低的酶可以避免或抑制产生不好的味道，不好的味道可以由短链脂肪酸的释放而导致。

从这种选择性底物分布得到的一种提示是，可以根据配方和其脂含量选择在给定生面团中特别有活性的酶。

具有这里所描述的性质的酶可以来自于各种来源，包括植物、动物和微生物如细菌和真菌物种，包括酵母菌物种。本发明的酶可以来源于天然产生该酶的生物体或可以通过用编码该酶的基因转化适当的宿主细胞而重组产生。该酶可以自身包含其所有酶活性的活性位点，也可以通过合成或使用重组DNA技术构建具有这里所描述的酶活性的杂交酶。

另外，起初不具有这里所定义的特定性质的酶可以通过例如改变其氨基酸序列而进行修饰，从而提供具有这里所定义的性质，并具有所需底物特异性的酶。通过随机诱变(US4,814,331，WO93/01285和WO 95/22615)而修饰酶以及通过位点特异性诱变(WO97/04079)修饰脂解酶而获得其改进性能是本领域中公知的。通用的概念是在所讨论的脂解酶的氨基酸链的结构部分中插入、去除或取代氨基酸。适于进行修饰的酶是可以水解酯键的酶。这种酶包括，例如，酯酶，如三酰甘油脂酶(EC3.1.1.3)、脂蛋白脂酶(EC3.1.1.34)、甘油单酯脂酶(EC3.1.1.23)、溶血磷脂酶、阿魏酸酯酶和酯酶(EC3.1.1.1，EC3.1.1.2)。

适于修饰的酶可以来自于各种来源，包括植物、动物和微生物如细菌和真菌物种，包括酵母菌物种。适于修饰的酶的例子为假单孢菌脂酶，例如从葱头假单孢菌(US5,290,694)、P.glumae(Frenken N等(1992)Appl.Envir.Microbiol.583787-3791)，类产碱假单孢菌(EP 0 334 462)或假单孢菌SD705株(WO95/06720，EP 0 721981，WO96/27002，EP 0 812 910)得到的脂酶。另外，可以选择的适于修饰的酶可以是例如真菌脂解酶，如腐质霉族和结合菌族的脂解酶和真菌角质酶(cutinases)。脂解酶腐质霉族由从H.lanuginosaDSM4109株得到的脂酶和与此脂酶有大于50％同源性的脂酶组成。从H.lanuginosa(与Thermomyces lanuginosus同义)得到的脂酶描述于EP 0 258 068和EP 0 305 216，并具有表示于US5,869,438的SEQ ID NO.2的1-269位置的氨基酸序列。

目前优选用于本发明的酶为脂酶SP972和脂酶SP979，其作用详细描述于下面的实施例。

大多数谷物面粉含有可以作为本发明酶的底物的甘油三酯等非极性脂和磷脂和糖脂等极性脂。因此，在本发明方法的一种实施方案中，非极性脂、包括双半乳糖甘油二酯(DGDG)的半乳糖脂等糖脂、以及磷脂酰胆碱(PC)等磷脂中的至少一种是存在于用于生面团的面粉中的天然存在(或内源性)脂成分。

然而，生面团可能不含有足量本发明酶的所有脂底物。因此本发明包括给生面团补充至少一种非极性脂、糖脂和磷脂，从而为酶提供足够的底物。应该理解“足够的底物”表示为获得上述生面团改进或烘烤产品改进作用，三种主要类型的脂底物都是足够的。

本发明酶的补充脂底物可以是非极性脂，如酰基甘油。根据本发明，可以使用各种这样的脂，如植物油、植物脂肪、动物油、动物脂肪，如黄油脂肪和起酥。在这一点上，特别有用的脂是从谷物中得到的油或脂肪，如燕麦油。除甘油三酯外，燕麦油一般包含5-25％磷脂和5-12％糖脂。可以分馏燕麦油，产生具有高极性脂含量的部分。

因此本发明的方法的一方面是可以将一种或更多磷脂加入生面团。在这一点上，有用的磷脂包括磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)、卵磷脂和磷脂酰乙醇胺(PE)。

根据本发明，加入的酶量为10-100,000LUT/千克面粉或10-100,000PLU/千克面粉，单位的名称是下面实施例中所定义的，如50-50,000LUT或PLU/千克面粉，包括100-10,000LUT/千克面粉或100-10,000PLU/干克面粉。

本发明可以进一步有利地提供一种获得具有前面所定义的改进质量的烘烤产品。因此，在一种实施方案中，通过本发明的方法制备的生面团是面包生面团，此方法包含另一步，即烘烤生面团而获得烘烤产品。烘烤面包产品的一个特别需要的特征是如实施例中定义的高比容。因此，加入本发明的酶优选使烘烤产品的比容相对于在除没有加入酶外，其它都相同的条件下制作的烘烤产品增加至少10％。更优选地，比容的增加至少为20％，如至少30％，如至少40％。

本发明可以进一步提供意大利面食生面团、面条生面团和蛋糕生面团或面糊和由这种生面团或面糊制作的成品。

本领域中已知脂酶以外的其它酶可以对改进生面团性质和烘烤产品质量起作用。除了本发明的酶，将至少另一种酶加入生面团也包含在本发明的范围内。另一种酶包括淀粉降解酶如内或外淀粉酶、支链淀粉酶、脱支酶，木聚糖酶等半纤维素酶，纤维素酶和氧化还原酶，如葡萄糖氧化酶、脂酶、磷脂酶和己糖氧化酶。

已经发现本发明的酶可以对某些糖脂如包括转化为一种有效表面活性剂即双半乳糖甘油单酯(DGMG)的双半乳糖甘油二酯(DGDG)的半乳糖脂特别具有活性。因此在有用的实施方案中，本发明的酶可以水解至少25％的起初存在于生面团中的DGDG，优选水解至少50％DGDG，如至少60％或至少75％。

此酶的另一种有用的脂底物是磷脂、磷脂酰胆碱(PC)。因此，在有用的实施方案中，此酶可以降解至少25％，优选至少50％包括至少60％如至少75％的起初存在于生面团中的PC。

这些酶的一个有利的方面是它们对前面定义的某些脂底物类型比对其它类型具有更强的水解活性。因此相对于非极性甘油三酯，这些酶对极性脂相对更有活性。这可以通过分析任何被水解的脂底物类型的量，然后构建描述任何脂底物对，如甘油三酯与糖脂或甘油三酯与磷脂的水解间的关系的曲线而说明。

在特定实施方案中，本发明的酶的特征在于酶水解甘油三酯的能力和水解糖脂的能力之间的关系可以描述为斜率为至少1.0，如至少1.5或至少2.0的曲线，或其特征在于酶水解甘油三酯的能力和水解磷脂的能力之间的关系可以描述为斜率为至少0.1，如至少0.2，包括至少0.5或至少1.0的曲线。

另一方面，本发明提供了一种改进生面团的组合物，包含一种在生面团条件下可以水解非极性脂、糖脂和磷脂，并选择性水解至少另一种生面团成分的酶。另一种生面团成分可以是，如另一种前面所定义的酶，包括不具有本发明酶的底物分布的脂酶或磷脂酶。其它可以加入组合物的适当生面团成分包括小麦面粉、米粉和玉米粉等谷物面粉、酵母、化学发酵剂、生面团加强剂如氧化还原酶和抗坏血酸、乳化剂、糖、上述类型的酰基甘油、磷脂如大豆卵磷脂和蛋卵磷脂、糖脂和盐。

本发明的另一方面提供了一种制备上述生面团的方法，其中如上所述将酶加入组合物并根据本发明的方法获得生面团。这种生面团可以是新鲜生面团，可选择在控制的保护气氛下包装使其保持新鲜，或可以是冷冻生面团。

尽管一些具有这里定义的特定性质的酶可以由本领域中的技术人员轻易鉴定，本发明进一步提供了一种方法，用于鉴定可以水解非极性脂、糖脂和磷脂或鉴定另一些酶，这些酶适合开发为可以水解非极性脂、糖脂和磷脂的酶。这些适合开发为本发明酶的酶是从黑色曲霉得到的脂酶，公开于WO98/45453(在此引入作为参考)。

本发明进一步提供了一种开发可以水解非极性脂、糖脂和磷脂的酶的方法。

克隆编码酶的核苷酸序列

编码具有此处定义的特定性质的酶或适于修饰的酶的核苷酸序列可以从任何产生该酶的细胞或生物体分离。许多分离核苷酸序列的方法是本领域公知的。

例如，可以使用产生酶的生物体中的染色体DNA或信使RNA构建基因组DNA和/或cDNA文库。如果已知该酶的氨基酸序列，可以合成标记的寡核苷酸探针，并用其从生物体制备的基因组文库中识别编码酶的克隆。另外，含有与另一种已知酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针可以用于识别编码酶的克隆。在后一种情况下，使用低严格性的杂交和洗涤条件。

此外，可以通过以下方法鉴别编码酶的克隆，将基因组DNA片段插入质粒等表达载体，用得到的基因组DNA文库转化酶阴性细菌，然后将被转化细菌平铺于含酶底物(即麦芽糖)的琼脂糖上，从而允许识别表达该酶的克隆。

在另一种替代方案中，可以通过已确立的标准方法，如BeucageS.L.等(1981)在Tetrahedron Letters22，p1859-1869中描述的phosphoroamidite法，或Matthes等(1984)在EMBO J.3，p801-805中描述的方法而合成制备编码酶的核苷酸序列。在phosphoroamidite法中，如在自动DNA合成器中合成寡核苷酸，纯化、退火、连接和在适当载体中克隆。

核苷酸序列可以是混合的基因组和合成来源，混合的合成和cDNA来源，或混合的基因组和cDNA来源，按照标准技术通过连接(适当的)合成、基因组或cDNA来源的片段而制备。每一个被连接片段对应于整个核苷酸序列的各种部分。也可以通过使用特异性引物的聚合酶链式反应(PCR)而制备DNA序列，例如美国专利4,683,202或Saiki R K等(Science(1998)239，pp487-491)的描述。

核苷酸序列

本发明也包括编码具有这里定义的特定性质的酶的核苷酸序列。这里用到的“核苷酸序列”是指寡核苷酸序列或多核苷酸序列及其变异体、同源物、片段和衍生物(如其部分)。核酸序列可以是基因组或合成或重组来源，可以是双链或单链，代表有意义链或反义链。

与本发明有关的术语“核苷酸序列“包括基因组DNA、cDNA、合成DNA和RNA。它优选表示DNA，更优选表示本发明的编码序列的cDNA。

在一种优选实施方案中，本发明的核苷酸序列本身不包含当与处于天然环境中的与其天然相关的序列连接时，存在于其天然环境中的本发明的天然核苷酸序列。为了更容易参考，我们将称此优选实施方案为“非天然核苷酸序列”。在这一点上，“天然核苷酸序列”表示处于其天然环境，并且与一个与其天然相关的完整启动子可操作性连接时的完整核苷酸序列，该启动子也处于其天然环境中。因此，本发明的酶可以由在其天然生物体中的核苷酸序列表达，但其中该核苷酸序列不处于在该生物体中与其天然相关的启动子的控制下。

本发明的酶可以与其它酶结合使用。因此本发明也包含了酶的组合，其中该组合包含了本发明的酶和另一种酶，它可以是本发明的另一种酶。

该酶优选不是天然酶。在这一点上，“天然酶”表示处于其天然环境中并由其天然核苷酸序列表达时的完整酶。

一般地，本发明的核苷酸序列是用重组DNA技术(即重组的DNA)制备。然而，在本发明的其它实施方案中，整个或部分核苷酸序列可以是用本领域中公知的化学方法合成的(见Caruthers MH等(1980)Nuc Acids Res Symp Ser215-23和Horn T等(1980)Nuc Acids ResSymp Ser225-232)。

氨基酸序列

本发明也包括具有这里所定义的特定性质的酶的氨基酸序列。

这里使用的“氨基酸序列”是“肽”和/或“蛋白”的同义词。在一些情况下，“氨基酸序列”与“肽”同义。在一些情况下，“氨基酸序列”与“酶”同义。

可以从适当的来源制备/分离氨基酸序列，或可以合成或可以使用重组DNA技术制备。

变异体/同源物/衍生物

本发明也包含本发明的酶的任何氨基酸或任何编码这种酶的核苷酸序列的变异体、同源物和衍生物的用途。这里，名词“同源物”表示与主题氨基酸和主题核苷酸序列具有一定同源性的实体。这里“同源性”可以等同于“同一性”。

在本发明的内容中，同源序列包括至少75，85或90％等同于，优选至少95或98％等同于主题序列的氨基酸序列。一般地，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，在本发明的内容中，优选根据序列同一性表达同源性。

在本发明的内容中，同源序列包括至少75，85或90％等同于，优选至少95或98％等同于编码本发明的酶的核苷酸序列(主题序列)的核苷酸序列。一般地，同源物将包含与主题氨基酸序列相同的活性位点。尽管也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性，在本发明的内容中，优选根据序列同一性表达同源性。

同源性比较可以通过肉眼进行，或通常利用容易获得的序列比较程序的帮助。这些商业上可获得的计算机程序可以计算两个或更多序列之间的同源百分比。

可以对邻接序列进行同源百分比计算，即将一个序列与另一个序列进行对比，并将一个序列中的每个氨基酸与另一个序列中的对应氨基酸进行直接比较，一次一个残基。这称作“无空位”对比。一般地，这种无空位对比只在相对少的残基中进行。

尽管这是一个非常简单和稳定的方法，它不能考虑例如，在本来为等同的序列对中，一个插入或缺失将使后面的氨基酸对比失效，这样会导致在进行总体对比时同源百分比很大程度减低。因此，将大多数序列对比方法设计为产生考虑了可能的插入和缺失而不对总体同源性得分进行过度罚分的最优对比。这是通过在序列对比中插入“空位”而试图使局部同源性最大化而达到的。

然而，这些更复杂的方法给出现在对比中的每个空位指定了“空位罚分”，因此，对于同样数目的等同氨基酸，一个具有尽可能少的空位的序列对比反映了两个对比序列之间的更高的相关性，它将比有许多空位的序列得到更高分。一般使用的“亲族空位值”对空位的存在罚掉相对高的值，对于空位中的每个后续的残基罚掉更少的分。这是最常用的空位评分系统。高空位罚分当然将产生具有更少空位的最优对比。大多数对比程序允许修改空位罚分。然而，当使用这种序列对比软件时优选使用默认值。例如当使用GCG Wisconsin Bestfit软件包时，氨基酸序列的默认空位罚分为每个缺口-12，每个延伸-4。

因此计算最大同源百分比首先要求产生最优对比，考虑空位罚分。执行这种对比的适当计算机程序为GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux et al 1984 Nuc.Acids Research 12 p387)。其它可以进行序列对比的软件的例子包括，但不限于BLAST软件包(见Ausubel et al 1999 Short Protocols in Molecular Biology，4thEd-Chapter18)，FASTA(Altschul et al 1990 J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORK对比工具序列。BLAST和GENEWORK都可进行离线和在线搜索(见Ausubel et al 1999，7-58到7-60页)。然而，对于一些应用，优选使用GCG Bestfit程序。一种称作BLAST2序列的新工具也可以用于比较蛋白和核苷酸序列(见FEMS Microbiol Lett1999 174(2)：247-50；FEMS Microbiol Lett 1999 177(1)：187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。

尽管最终同源性百分比可以根据同一性而测量，对比过程自身一般不以全或无配对比较为基础。相反，通常使用标准的相似性评分矩阵将得分分配到每个以化学相似性或进化距离为基础而进行的配对比较。这种常用矩阵的一个例子是BLOSUM62矩阵，即BLAST程序系列的默认矩阵。GCG Wisconsin程序一般用公共默认值或如果已提供，则使用客户符号比较表(更详细内容见使用者手册)。对于一些应用，优选将公共默认值用于GCG软件包，或在使用其它软件的情况下，使用默认矩阵如BLOSUM62。

一旦软件产生最优对比，就可以计算同源百分比，优选序列等同百分比。软件一般作为序列对比的一部分进行此计算并产生数字结果。

序列也可以有产生沉默改变并导致产生功能等同物质的氨基酸残基缺失、插入或取代。只要保持了物质的二级结合活性，可以根据残基极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性、和/或双亲性的相似而进行有意的氨基酸取代。例如，带负电的氨基酸包括天门冬氨酸和谷氨酸；带正电的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸；以及具有相似亲水性值的有不带电极性首基的氨基酸包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、天门冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸。

可以进行保守的取代，例如根据下表。在第二列的同一格中的氨基酸，优选第三列的同一行中的氨基酸可以互相取代：

脂肪族	非极性	GAP
		GAP	ILV
		极性-不带电	ILV	CSTM
	NQ			CSTM
	NQ		极性-带电	DE
	KR			DE
	KR	芳香族			HFWY

本发明也包含可以发生相似物取代相似物，如碱性取代碱性、酸性取代酸性、极性取代极性等的同源取代(这里用到的取代和替代都表示用可选择的氨基酸残基交换存在的氨基酸残基)。也可以发生非同源取代，即从一类残基取代为另一类，或引入非天然氨基酸如鸟氨酸(此后称作Z)，二氨基丁酸鸟氨酸(此后称作B)、正亮氨酸乌氨酸(此后称作O)、pyriylalanine、噻吩丙氨酸、萘基丙氨酸和苯基甘氨酸。

也可用非天然氨基酸替代，包括α*和α双取代*氨基酸、N-烷基氨基酸*、乳酸*、天然氨基酸的卤化衍生物如三氟酪氨酸*、对-氯苯丙氨酸*、对-溴苯丙氨酸*、对-碘苯丙氨酸*、L-烯丙基甘氨酸*、β-丙氨酸*、L-α-氨基丁酸*、L-γ-氨基丁酸*、L-α-氨基异丁酸*、L-ε-氨基己酸*、7-氨基庚酸*、L-甲硫氨酸砜^#*、L-正亮氨酸*、L-正缬氨酸*、对-硝基-L-苯丙氨酸*、L-羟基脯氨酸^#、L-硫脯氨酸*、苯丙氨酸(Phe)的甲基衍生物，如4-甲基苯丙氨酸*、五甲基苯丙氨酸*、L-苯丙氨酸(4-氨基)^#、L-酪氨酸(甲基)*、L-苯丙氨酸(4-异丙基)*、L-Tic(1，2，3，4-四羟基异喹啉-3-羧酸)*、L-二氨基丙酸*和L-苯丙氨酸(4-苄基)*。符号*是为上述讨论(关于同源或非同源取代)的目的而使用的，表示衍生物的疏水性，而#是用于表示衍生物的亲水性，#*表示双亲性特征。

变异氨基酸序列可以包括可以插入序列的任意两个氨基酸残基之间的适当间隔基，如甲基、乙基等烷基或丙基以及氨基酸间隔基如甘氨酸或β丙氨酸残基。本领域的技术人员将容易理解，变异的其它形式包括以peptoid形式存在的一种或更多氨基酸残基。为了避免疑问，“peptoid形式”是指变异氨基酸残基，其中α碳取代基是在残基的氮原子上，而不是在α碳上。制备peptoid形式的肽的方法是本领域中公知的，如Simon RJ et al.，PNAS(1992)89(20)，9367-9371和Horwell DC，Trends Biotechnol.(1995)13(4)，132-134。

用于本发明中的核苷酸序列可以包括合成或修饰核苷酸。许多不同类型的寡核苷酸修饰是本领域中公知的。这些修饰包括磷酸甲酯和硫代磷酸酯主链和/或在分子的3’和/或5’端加入吖啶或聚赖氨酸链。对本发明而言，应该理解这里描述的核苷酸序列可以用本领域中的任意可行方法进行修饰。这些修饰的进行可以是为了增强本发明的核苷酸序列的体内活性或寿命。

本发明也包含与这里提出的序列，或其任意衍生物、片段或衍生物互补的核苷酸序列。如果序列与其片段互补，那么此序列可以用作探针，从而识别其它生物中的相似编码序列。

可以通过许多途径获得不与本发明的序列100％同源，但处于本发明范围中的多核苷酸。这里描述的序列的其它变异体可以通过探测从一定范围的个体，如不同人群中的个体制作的DNA文库等方法获得。此外，可以获得其它病毒/细菌、或细胞同源物特别是哺乳动物细胞(如大鼠、小鼠、牛和灵长目动物细胞)中的细胞同源物，并且这些同源物及其片段总体上将可以与这里列出的序列选择性杂交。这些序列的获得可以通过在中度至高度严格条件下探测由其它动物物种基因组DNA文库制作的cDNA文库，以及用包含所附序列表中的任意序列的全部或部分的探针探测这些文库。可以应用相似的考虑，以获得物种同源物和本发明的多肽或核苷酸序列的等位基因变异体。

变异体和株/种同源物也可以用简并PCR获得，它将使用的引物被设计为定向于本发明序列内编码变异体和同源物的保守氨基酸序列内的序列。可以通过例如，对比来源于一些突变体/同源物的氨基酸序列而预测保守序列。可以用本领域中已知的计算机软件进行序列对比。例如GCG Wisconsin PileUp程序已经被广泛应用。

应用于简并PCR的引物将包含一个或更多简并位置，并将在相对于用已知序列的单序列引物克隆序列时所用条件严格性更低的条件下使用。

此外，这些多肽可以通过特征序列的定点诱变获得。这在例如要求用沉默密码子序列改变来优化表达多核苷酸序列的特定宿主细胞的优选密码子的位置可能是有用的。为引入限制酶识别位点，或改变由多核苷酸编码的多肽的性质或功能，可能需要其它序列改变。

本发明的多核苷酸(核苷酸序列)可以用于产生引物，如PCR引物、用于其它扩增反应的引物，探针，如通过使用放射性或非放射性标记的常规方法用显示性标记进行标记的探针，或可以克隆到载体的多核苷酸。这些引物、探针和其它片段长度可以为至少15个，优选至少20个，例如至少25、30或40个核苷酸，并且包含在本发明所用名词多核苷酸的范围内。

本发明的多核苷酸如DNA多核苷酸和探针可以重组、合成或通过本领域中的技术人员可行的方法产生。也可以通过标准技术克隆。

通常，引物是用合成方法产生，包括逐步制造需要的核酸序列，每次一个核苷酸。实现这种自动技术的方法是本领域中已有的。

一般可以用重组方法，如使用PCR(聚合酶链式反应)克隆技术产生更长的多肽。这包括制造在需要克隆的定位于脂的序列区域侧翼的引物对(如约15到30个核苷酸)，使引物与从动物或人细胞获得的mRNA或cDNA接触，在允许所需区域扩增的条件下进行聚合酶链式反应，分离扩增片段(如通过在琼脂糖凝胶上纯化反应混合物)并回收扩增DNA。可以将引物设计为包含适当的限制酶识别位点，使扩增的DNA被克隆到适当的克隆载体。

杂交

本发明也包括与本发明的序列互补的序列或可以与本发明的序列或其互补序列杂交的序列。

这里用到的名词“杂交”应包括“一种使核酸链通过碱基配对与互补链结合的过程”，以及在聚合酶链式反应(PCR)技术中进行的扩增过程。

本发明也包含可以与这里所述序列，或其任意衍生物、片段或其衍生物互补的序列杂交的核苷酸序列的用途。

名词“变异体”也包括可以与这里所述核苷酸序列杂交的序列的互补序列。

名词“突变体”优选包括可以在严格条件下(如50℃和0.2×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})与这里所述核苷酸序列杂交的序列的互补序列。

名词“突变体”更优选包括可以在高严格条件下(如65℃和0.1×SSC{1×SSC＝0.15M NaCl，0.015M柠檬酸钠pH7.0})与这里所述核苷酸序列杂交的序列的互补序列。

本发明也涉及可以与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括这里所述序列的互补序列)。

本发明也涉及可以与本发明的核苷酸序列杂交的核苷酸序列(包括这里所述序列的互补序列)的互补序列。

可以在中度到最大严格条件下与这里所述核苷酸序列杂交的多核苷酸序列也包括在本发明的范围中。

在一个优选方面，本发明包含可以在严格条件下(如50℃和0.2×SSC)与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。

在一个更优选的方面，本发明包含可以在高严格条件下(如65℃和0.1×SSC)与本发明的核苷酸序列或其互补序列杂交的核苷酸序列。

定点诱变

一旦分离出编码酶的核苷酸序列，可能需要使序列突变，从而制备本发明的酶。

可以用合成寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有所需突变位点的侧翼核苷酸序列。

适合的方法公开于Morinaga et al(Biotechnology(1984)2，p646-649)，其中在携带酶基因的载体中建立单链DNA空位，酶编码序列。然后将携带所需突变的合成核苷酸退火于单链DNA的同源部分。然后将DNA聚合酶I填入剩余的空位(克列诺片段)并用T4连接酶连接构建体。

美国专利4,760,025公开了通过进行基因盒的微小改变而引入编码多个突变的寡核苷酸。然而，通过上述Morinaga法甚至可以在任意一个时间引入更多的突变，因为可以引入各种长度的多个寡核苷酸。

另一种将突变引入编码酶的核苷酸序列的方法描述于Nelson andLong(Analytical Biochemistry(1989)，180，p147-151)。这种方法包括含需要突变的PCR片段的三步产生法，该突变是通过在PCR反应中使用化学合成的DNA链作为引物之一而引入的。可以通过用限制性内切酶切除DNA片段并将其重新插入表达质粒，从PCR产生的片段分离携带突变的DNA片段。

另外，Sierks et al(Protein Eng(1989)2，621-625andProtein Eng(1990)3，193-198)描述了曲霉属葡糖淀粉酶的定点诱变。

酶的表达

本发明中使用的核苷酸序列可以被插入重组可复制载体。载体可以用于在相容的宿主中和/或由容的宿主复制和以酶的形式表达该核苷酸序列。可以用包括启动子/增强子和其它表达调节信号的控制序列控制表达。可以使用原核启动子和在真核细胞中起作用的启动子。可以使用组织特异性或刺激特异性启动子。也可以使用包含从两种或更多不同的上述启动子得到的序列元件的嵌合启动子。

通过核苷酸序列表达而由宿主重组细胞产生的酶可以被分泌或包含在细胞内，这取决于使用的序列和/或载体。可以将编码序列设计为具有信号序列，该信号序列指导物质编码序列通过特定原核或真核细胞膜而分泌。

表达载体

名词“表达载体”表示可以体内或体外表达的构建体。

表达载体优选掺入生物体基因组。“掺入”优选包括稳定掺入基因组。

本发明的载体优选包含本发明的构建体。选择性表达的，优选本发明的核苷酸序列存在于载体中，核苷酸序列在其中被可操作性连接到调节序列，使得调节序列可以通过适当宿主生物体提供核苷酸序列的表达，即载体为表达载体。

本发明的载体可以被转化到下面叙述的适当宿主细胞中，从而提供本发明多肽的表达。因此，本发明的另一方面提供了一种制备用于本发明后续用途的多肽的方法，包含在提供由载体表达编码多肽的编码序列的条件下培养用上述表达载体转化或转染的宿主细胞，并回收所表达的肽。

载体可以是例如，具有提供的复制起点的质粒、病毒或噬菌体，可以选择用于所述多肽表达的启动子，也可选择启动子的调节因子。载体的选择通常将依赖于所引入的宿主细胞。

本发明的载体可以包含一种或更多可选择的标记基因。用于工业微生物的最适当的选择系统是由一组选择标记形成的、不要求宿主生物体中突变的系统。适当的选择标记可以是从枯草芽孢杆菌或地衣形芽孢杆菌得到的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的基因。其它的选择标记可以是曲霉选择标记，如amdS，argB，niaD和sC，或产生潮霉素抗性的标记。其它真菌选择标记的例子为ATP合成酶的基因、亚单位9(oliC)、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶(pvrA)、腐草霉素和苯菌灵抗性基因(benA)。非真菌选择标记的例子为细菌G418抗性基因(也可以用于酵母，但不能用于丝状真菌)、氨苄青霉素抗性基因(大肠杆菌)、新霉素抗性基因(芽孢杆菌属)以及编码β葡糖醛酸糖苷酶(GUS)的大肠杆菌uidA基因。其它适当的选择标记包括从枯草芽孢杆菌或地衣形芽孢杆菌得到的dal基因。另外，可以通过共转化完成选择(如WO91/17243中所描述)。

载体可以体外使用，如用于产生RNA或用于转染或转化宿主细胞。

因此，可以将用于本发明用途的核苷酸序列掺入载体(一般是可复制载体)，例如克隆或表达载体。载体可以用于在相容宿主细胞中复制核酸。因此在另一种实施方案中，本发明提供了一种通过将本发明的核苷酸序列引入可复制载体，将载体引入相容的宿主细胞，并且在产生载体复制的条件下使宿主细胞生长而制造本发明的核苷酸序列的方法。可以从宿主细胞回收载体。适当的宿主细胞在下文中联系表达载体而描述。

用于连接编码具有这里定义的特定性质的酶的本发明的DNA构建体和调节序列、以及将它们插入适当含有复制所必需的信息的载体的过程是本领域技术人员熟知的(例如见Sambrook et al MolecularCloning：A laboratory Manual，2nd Ed.(1989))。

载体可以进一步包含使载体在讨论的宿主细胞中复制的核苷酸序列。这种序列的例子是质粒pUC19，pACYC177 pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。

调节序列

在一些应用中，本发明中使用的核苷酸序列被可操作性连接到可以通过所选的宿主细胞等提供核苷酸序列表达的调节序列。通过实施例的方式，本发明涵盖了包含与这种调节序列可操作性连接的本发明的核苷酸序列的载体，即载体为表达载体。

名词“可操作性连接的”是指一种并列位置，其中所描述的成分处于允许它们以试图达到的方式起作用。与编码序列“可操作性连接”的调节序列的连接方式允许在与控制序列相容的条件下完成编码序列的表达。

名词“调节序列”包括启动子和增强子及其它表达调节信号。

名词“启动子”是在本领域的常规含义范围内使用的，如RNA聚合酶结合位点。

编码本发明的酶的核苷酸序列的增强表达也可以通过选择异源调节区，如启动子、分泌前导序列和终止子区而完成，这可以增加表达，并且如果需要，可以增加感兴趣蛋白从所选表达宿主的分泌水平和/或提供对本发明酶的表达的诱导型控制。在真核生物中，聚腺苷酸化序列可以与编码酶的核苷酸序列可操作性连接。

本发明的核苷酸序列优选可以与至少一个启动子可操作性连接。

除了编码本发明核苷酸序列的基因的天然启动子，也可使用其它启动子来指导本发明多肽的表达。可以根据启动子指导本发明的核苷酸序列在所需表达宿主中的表达的效率而选择启动子。

在另一种实施方案中，可以选择组成型启动子用于指导本发明所需核苷酸的表达。这种表达构建体可以提供额外的益处，因为它不需要在含诱导底物的培养基中培养表达宿主。

优选用于真菌表达宿主中的强组成型和/或诱导型启动子的例子为可以从木聚糖酶(xlnA)、肌醇六磷酸酶、ATP合成酶、亚单位9(olic)、丙糖磷酸异构酶(tpi)、醇脱氢酶(AdhA)、α淀粉酶(amy)、淀粉葡糖苷酶(AG-从glaA基因得到)、乙酰胺酶(amdS)、和甘油醛-3-磷酸脱氢酶(gpd)启动子的真菌基因获得的启动子。对真菌宿主中的转录有用的启动子的其它例子是来自于编码米曲霉TAKA淀粉酶、啤酒糖酵母的TPI(丙糖磷酸异构酶)启动子(Alber et al(1982)J.Mol.Appl.Genet.1，p419-434)、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉中性α淀粉酶、黑色曲霉酸稳定α淀粉酶、黑色曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的基因的启动子。

强酵母启动子的例子是可以从醇脱氢酶、乳糖酶、3-磷酸甘油酸激酶和丙糖磷酸异构酶的基因获得的启动子。

强细菌启动子的例子是α淀粉酶和SP02启动子，以及从细胞外蛋白酶基因得到的启动子。用于指导核苷酸转录特别是在细菌宿主中转录的其它适当启动子的例子是大肠杆菌lac操纵子启动子、天蓝色链霉菌琼脂糖酶基因dagA启动子、地衣形芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyL)启动子、嗜热脂肪芽孢杆菌产麦芽糖淀粉酶基因(amyM)启动子、解淀粉芽孢杆菌α淀粉酶基因(amyQ)启动子、枯草芽孢杆菌xy1A和xy1B基因启动子。

杂交启动子也可以用于改善表达构建体的诱导型调节。

启动子也可以另外包含确保或增加在适当宿主中的表达的特征。例如，这些特征可以存在于保守区如普里布诺框或TATA框。启动子甚至可以包含其它影响(如维持、增强、减弱)本发明核苷酸序列的表达水平的序列。例如，其它适当的序列包括Sh1内含子或ADH内含子。其它序列包括诱导型元件—如温度、化学、光或应激诱导型元件。也可以存在增强转录或翻译的适当元件。后一种元件的一个例子是TMV5’信号序列(见Sleat 1987 Gene217，217-225和Dawson 1993 PlantMol.Biol.23：97)。

构建体

名词“构建体”与“接合体”、“盒”和“杂交体”是同义的一包括直接或间接附着于启动子的用于本发明用途的核苷酸序列。间接附着的例子是在启动子和本发明的核苷酸序列间提供适当的间隔基如内含子序列，如Sh-1内含子或ADH内含子。与本发明有关的名词“融合的”也是如此，它包括直接或间接附着。在一些情况下，此名词不涵盖一般与野生型基因启动子相关的蛋白的编码核苷酸序列的天然组合，也不涵盖它们都处于天然环境的情况。

构建体甚至可以包含或表达一种标记，该标记允许在例如细菌，优选芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌、或该标记转移到的植物中选择遗传构建体。可以使用存在的各种标记，如编码麦芽糖-6-磷酸异构酶(特别是对于植物)的标记或提供抗生素抗性，如G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素抗性的标记。

对于一些应用，本发明的构建体优选包含至少一个与启动子可操作性连接的核苷酸序列。

宿主细胞

与本发明相关的名词“宿主细胞”包括任何包含上述核苷酸序列或表达载体的细胞，它被用于重组产生具有这里所述特定性质的酶。

因此，本发明的另一种实施方案提供了用表达本发明的酶的核苷酸序列转化或转染的宿主细胞。所述核苷酸序列优选由复制或表达该核苷酸序列的载体携带。将选择与该载体相容的细胞，可以是例如原核(例如细菌)细胞、真菌、酵母或植物细胞。

革兰氏阴性菌大肠杆菌被广泛用作异源基因表达的宿主。然而，大量异源蛋白容易在细胞内聚集。从大量大肠杆菌细胞内蛋白中后续纯化所需蛋白有时会很困难。

相对于大肠杆菌，芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌，如枯草芽孢杆菌、地衣形芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、B.alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、变青链霉菌或鼠灰链霉菌，可能非常适于用作异源宿主，因为它们可以分泌蛋白至培养基。其它可能适于用作宿主的细菌是链霉菌属和假单孢菌属的细菌。

根据编码本发明酶的核苷酸序列的性质，和/或是否需要进一步加工被表达蛋白，可以优选真核宿主如酵母或其它真菌。总的说来，酵母细胞比真菌细胞更优选，因为它们容易操作。然而，一些蛋白从酵母细胞中分泌不良，或在一些情况下加工不当(如在酵母中糖基化过多)。在这些情况下，应选择不同的真菌宿主生物。

合适的酵母生物可以选自克鲁维氏酵母属、糖酵母属或裂殖糖酵母属，如啤酒糖酵母、或汉逊氏酵母属的物种(公开于英国专利申请9927801.2)。

合适的丝状真菌可以是例如属于曲霉属物种的株，如米曲霉或黑色曲霉，或尖孢镰孢、禾谷镰孢(在完全阶段称作玉蜀黍赤霉，以前称作Sphaeria zeae，与Gibberella roseum和Gibberella roseumf.sp.Cerealis同义)或硫色镰孢(在完全阶段称作Gibberellapuricaris，与Fusarium trichothercioides，Fusariumbactridioides，Fusarium sambucium，Fusarium roseum和Fusarium roseum var.Graminearum同义)、Fusarium cerealis(与Fusarium crokkwellnse同义)或Fusarium venenatum。

典型的表达宿主可以选自例如黑色曲霉、Aspergillus nigar var.tubigenis、Aspergillus niger var.awamori、棘孢曲霉、构巢曲霉、米曲霉、Trichoderma reesei、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、乳克鲁维氏酵母和啤酒糖酵母。

适当宿主细胞-如酵母、真菌和植物宿主细胞的使用可以提供翻译后修饰(如豆蔻酰化、糖基化、截短、酯化和酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸磷酸化)，可能需要通过翻译后修饰而赋予本发明的重组表达产物最优的生物学活性。

宿主可以是蛋白酶缺陷或无蛋白酶株。例如具有碱性蛋白酶基因“alp”缺失的米曲霉JaL125蛋白酶缺陷株。此株描述于WO97/35956。

生物体

与本发明有关的名词“生物体”包括任何可以包含编码本发明的酶的核苷酸序列和/或由它们得到的产物的生物体，和/或在其中的启动子可以允许本发明的核苷酸序列在生物体中表达的生物体。

合适的生物体可以包括原核生物、真菌、酵母或植物。

与本发明相关的名词“转基因生物”包括任何包含编码本发明的酶的核苷酸序列和/或由它们得到的产物的生物体，和/或在其中的启动子可以允许本发明的核苷酸在生物体中表达的生物体。核苷酸序列优选掺入生物体的基因组。

名词“转基因生物”并不包含在天然环境中，处于天然环境中的天然启动子控制之下的天然核苷酸编码序列。

因此，本发明的转基因生物包括含有编码本发明的酶、本发明的构建体、本发明的载体、本发明的质粒、本发明的细胞、本发明的组织的核苷酸序列中的任意一种或其任意组合，或其产物的生物体。例如，转基因生物体也可以包含由异源启动子控制的编码本发明的酶的核苷酸序列。

宿主细胞/生物体的转化

如前面所提到的，宿主生物体可以是原核或真核生物。合适的原核宿主的例子包括大肠杆菌和枯草芽孢杆菌。关于原核宿主的转化的教义在本领域中已有详细记载，如见Sambrook et al(MolecularCloning：A Laboratory Manual，2nd edition，1989，Cold SpringHarbor Laboratory Press)和Ausubel et al.，Current Protocolsin Molecular Biology(1995)，John Wiley & Sons，Inc。

如果使用原核宿主，那么在转化前需要适当修饰核苷酸序列—如去除内含子。

在另一种实施方案中，转基因生物可以是酵母。在这一点上，酵母也被广泛用作异源基因表达的载体。啤酒糖酵母具有长期工业使用的历史，包括将其用于异源基因表达。异源基因在啤酒糖酵母中的表达综述于Goodey et al(1987，Yeast Biotechnology，D R Berryet al，eds，pp401-429，Allen and Unwin，London)和king et al(1989，Molecular and Cell Biology ot Yeasts，E F Walton andG T Yarronton，eds，pp107-133，Blackie，Glasgow)。

出于一些原因，啤酒糖酵母非常适于异源基因表达。首先，它对人类是非致病的，不会产生某些内毒素。其次，在多个世纪不同目的的商业开发后它具有长期安全史。这导致了广泛的公共可接受性。第三，对于该生物的广泛商业使用和研究产生了对其遗传学和生理学以及大规模发酵特征的明确认识。

啤酒糖酵母中异源基因表达和基因产物的分泌综述于EHinchcliffe E Kenny(1993，＂Yeast as a vehicle for theexpression of heterologous genes＂，Yeasts，Vol5，Anthony HRose and J Stuart Harrison，eds，2nd edition，Academic PressLtd.)。

可以使用一些类型的酵母载体，包括整合载体，为了维持并且自动复制质粒载体，它们要求与宿主基因组的重组。

为制备转基因糖酵母，通过将本发明的核苷酸序列插入设计用于在酵母中表达的构建体而制备表达构建体。已经开发了一些类型的用于异源表达的构建体。这些构建体包含在酵母中有活性的、与本发明的核苷酸融合的启动子，通常使用酵母来源的启动子，如GAL1启动子。通常使用酵母来源的信号序列，如编码SUC2信号肽的序列。在酵母中有活性的终止子终止表达系统。

为转化酵母，开发了一些转化方案。例如，可以通过Hinnen等(1978，Proceedings of the National Academy of Sciences of theUSA75，1929)；Beggs，J D(1978，Nature，London，275，104)；和Ito，H等(1983，J Bacteriology 153，163-168)等的教导制备本发明的转基因糖酵母。

可以用各种选择性标记选择转化的酵母细胞。用于转化的标记包括许多营养缺陷型标记，如LEU2、HIS4和TRP1，及显性抗生素抗性标记，如氨基糖苷抗生素标记，如G418。

丝状真菌细胞可以由包括原生质体形成和原生质体转化的过程转化，然后用已知方式再生细胞壁。曲霉属作为宿主微生物的用途描述于EP 0 238 023。

另一种宿主生物是植物。构建遗传修饰植物的基本原则是在植物基因组中插入遗传信息，以便获得插入遗传物质的稳定保持。插入遗传信息存在一些技术，两个主要原理是直接引入遗传信息和通过使用载体系统引入遗传信息。常用技术的综述可以见Potrykus(Annu RevPlant Physiol Plant Mol Biol[1991]42：205-225)和Christou(Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17-27)。其它对植物转化的教导见EP-A-0449375。

用核苷酸序列转化的宿主细胞可以在诱导产生被编码酶和促进从细胞和/或培养基回收酶的条件下培养。

用于培养细胞的培养基可以是任何适于使所讨论的宿主细胞生长并获得酶表达的常规培养基。可以从供应商获得适当的培养基或根据公开的配方制备(如描述于美国典型培养物保藏中心目录中的配方)。

由重组细胞产生的蛋白可以出现在细胞表面。本领域的技术人员应该理解，如果需要，可以给含有编码序列的表达载体设计指导编码序列通过特定原核或真核细胞膜分泌的信号序列。其它重组构建体可以连接编码序列与促进可溶蛋白纯化的多肽结构域的编码核苷酸序列(Kroll DJ et al(1993)DNA Cell Biol 12：441-53)。

酶可以从宿主细胞分泌并可以通过熟知的程序方便地从培养基回收，包括通过离心或过滤从培养基分离细胞，以及通过硫酸铵等盐从沉淀培养基的蛋白成分，然后使用层析法如离子交换层析、亲和层析等。

分泌

通常，需要将酶从表达宿主分泌到培养基中，然后可以从培养基更容易地回收酶。根据本发明，可以根据所需表达宿主选择分泌先导序列。也可以在本发明的内容中使用杂交信号序列。

异源分泌先导序列的典型例子是来源于真菌淀粉葡糖苷酶(AG)基因(glaA-如从曲霉属得到的18氨基酸和24氨基酸译本)、a因子基因(酵母如糖酵母属、克鲁维氏酵母属和汉逊氏酵母属)和α淀粉酶基因(芽孢杆菌属)。

融合蛋白

为了有助于提取和纯化等，本发明的氨基酸序列可以作为融合蛋白产生。融合在一起的蛋白的例子包括谷胱甘肽-S-转移酶(GST)、6xHis、GAL4(DNA结合和/或转录激活域)和β半乳糖苷酶。在相互融合的蛋白和感兴趣的蛋白序列间包括蛋白水解切割位点，以便允许去除融合蛋白序列可能是方便的。融合蛋白优选不防碍蛋白序列的活性。

融合蛋白可以包含抗原或与本发明的物质融合的抗原决定簇。在此实施方案中，融合蛋白可以是非天然存在的融合蛋白，包含一种可以作为对免疫系统提供泛化刺激的佐剂的物质。抗原或抗原决定簇可以附着于物质的氨基或羧基端。

在本发明的另一种实施方案中，氨基酸序列可以与异源序列连接而编码融合蛋白。例如，为了筛选可以影响物质活性的试剂的肽文库，编码由商购抗体识别的表达异源表位的嵌合物质可能是有用的。

在下面的非限制性实施例和附图中进一步举例说明了本发明，其中：

图1说明了商购脂酶GRINDAMYL^TM EXEL16(200ppm)(左侧的面包卷)、脂酶SP972(分别为1000，2500和5000LUT/千克面粉)(面包卷2-4)与没有添加脂酶的对照(右侧面包卷)相比对面包屑结构的作用；

图2表示添加单独的燕麦脂(左侧的面包)、燕麦脂+1010ppm SP979(中间的面包)和燕麦脂+200ppm GRINDAMYL^TM EXEL16(右侧面包卷)对面包体积和面包屑结构的作用，

图3说明了脂酶SP972和脂酶SP979水解甘油三酯的能力和它们水解糖脂的能力之间的关系，和

图4说明了脂酶SP972和脂酶SP979水解甘油三酯的能力和它们水解磷脂的能力之间的关系。

实施例

材料和方法

1.使用的酶

指定为SP972和SP979的酶制剂是从Novo Nordisk，Bagsvaerd，Denmark获得，这些酶是可以水解非极性脂、糖脂和磷脂的修饰脂解酶。酶的名称是Novo Nordisk所使用的。

此外，一种商业上可获得的酶制剂是从Fluka Chemie AG，Switzerland(指定分类号为62299)获得的。该酶来源于Candidaantarctica。

下列酶用作参考：GRINDAMYL^TM EXEL16(Danisco Ingredients，Brabrand，Denmark)和Stalingase^TM(Gist-brocadesl Delfts，theNetherlands)。

2.用三丁酸甘油酯作为底物测量的脂酶活性(LUT和LIPU)

用Food Chemical Codex，4th edition，National AcademyPress，1996，p.803所描述的方法测量基于用三丁酸甘油酯作为底物的脂酶活性，进行的修改为将样品溶解在去离子水中，而不是甘氨酸缓冲液，pH计稳定点为5.5而不是7。

1LUT定义为在测定条件下每分钟可以释放2μmol丁酸的酶量。1LIPU定义为在测定条件下每分钟可以释放1μmol丁酸的酶量。

3.基于将向日葵油作为底物而进行的脂酶测定(LUSol，pH6.5)

反应物：将8.4g阿拉伯树胶溶解于100ml去离子水中，并加入100ml 30mM的CaCl₂。缓慢加入36ml向日葵油，同时用Ultra TurraxTM搅拌器以20,000rpm的转速进行搅拌，得到乳状液。

测定：在烧杯中将20ml向日葵油乳状液在30℃下平衡5分钟，用pH计将pH值调节为6.3-6.5。加入2ml酶制剂，然后连续加入0.05NNaOH，而将pH6.5保持10分钟。计算加入0.05N NaOH作为时间的函数所作曲线的斜率。

1LUSol定义为在测定条件下每分钟可以释放1μmol脂肪酸的酶量。

4.磷脂酶测定(PLU，pH8.0)

底物：在加热到40-50℃下将8g卵磷脂酶粉末(MetarinP，074793)溶解于150ml水。加入40ml 50mM的CaCl₂，将水加至200ml。用Ultra Turrax^TM搅拌器以20,000rpm的转速将底物混合物混匀1分钟。

测定：将20.0ml底物转移到烧杯中，在30℃下平衡5分钟，将pH值调至8.0。加入2ml酶制剂，然后连续10分钟加入0.05N NaOH，将pH保持在8.0。

计算加入0.05N NaOH作为时间的函数所作曲线的斜率。1PLU定义为在测定条件下每分钟可以释放1μmol脂肪酸的酶量。

5.烘烤实验(烤面包)

用带钩的Hobart^TM搅拌器将2000g丹麦改良面粉、30g干酵母、30g糖、30g盐和400布雷本登单位(BU)+3％的水以低速捏和2分钟并用高速捏和10分钟。混合后的生面团温度为25℃。在30℃下放置10分钟。将生面团分为每个生面团750g，在33℃下再放置5分钟，用Glimik^TM造型器进行85％RH.造型。在33℃下将生面团在罐中发酵50分钟，在Wachtel^TM烤箱中220℃下烘烤40分钟，蒸汽注射16秒。冷却后，称量面包，用油菜籽置换法(rape seed displacementmethod)测量面包体积。

主观评价面包屑，分级为1到10，其中1＝粗糙结构，10＝均质结构。

将在有盖的罐中烘烤的三条面包储存于20℃，用于进行硬度测量。

6.硬度测量

用连接于计算机的Instron^TM UTM模型4301测量面包硬度。测量条件如下

测压盒 Max100N

活塞直径 50mm

十字头速度 200mm/min

压缩 25％

面包片厚度 11mm

将力转化为N/dm²。结果计算为每条面包10个面包片的平均值。

7.烘烤实验(硬皮面包卷)

用带钩的Hobart^TM搅拌器将1500g丹麦改良面粉、90g压缩酵母、24g糖、24g盐和400布雷本登单位+2％的水以低速捏和2分钟并以高速捏和6分钟。生面团温度为26℃。将生面团定量为1350g，在30℃下放置10分钟，用Fortuna^TM造型器进行造型。在34℃下将已造型的生面团发酵45分钟，在Bago^TM烤箱中220℃下烘烤18分钟，用蒸汽烘烤12秒。冷却后，称量面包卷，用油菜籽置换法测量面包卷体积。

按如下公式计算面包卷的比容

8.微量烘烤实验

在30℃下用50g Brabrender^TM搅拌碗将50g丹麦改良面粉、10g干酵母、0.8g糖、0.8g盐、70ppm抗坏血酸和400布雷本登单位的水捏和5分钟。在34℃下放置10分钟。将生面团分为每个生面团15g，用一种设备造型，生面团在其中的木板和有机玻璃框之间滚动。在34℃下将生面团发酵45分钟，在Voss^TM家用烤箱中225℃下烘烤8分钟。烘烤后，将微型面包条冷却至周围环境温度，20分钟后称量面包条，用油菜籽置换法测量面包卷体积。切开面包，评价面包屑和皮。

9.脂提取和脂肪酸分析

立即冷冻20g完全发酵的生面团并冻干。用咖啡豆磨将冻干的生面团磨碎，使其通过800μm的筛。用带螺旋盖的15ml离心管分装2g冻干的生面团。加入10ml水饱和的丁醇(WSB)。将离心管置于沸水浴中10分钟。在环境温度下将离心管置于Rotamix^TM仪器中以45rpm旋转20分钟，然后置于沸水浴中10分钟，在环境温度下置于Rotamix^TM仪器中旋转30分钟。将离心管在3,500g下离心5分钟。将5ml上清液转移到管瓶中。在氮流动下将WSB蒸发干。

将提取物中的游离脂肪酸作为异辛烷中的铜盐分析，在715nm下测量，根据基于油酸的标准曲线定量(Kwon D.Y.and J.S.Rhee(1986)，A Simple and Rapid Colourimetric Method forDetermination of Free Fatty Acids for Lipase Assay JAOCS63：89)。

10.HPLC分析

柱：具有水衣的LiChrospher^TM100 DIOL 5μm(Merck art.16152)250×4.0id，50℃。

移动相：

A：庚烷/异丙醇/丁醇/四氢呋喃/异辛烷/H₂O^*，64.5/17.5/7/5/5/1

B：异丙烷/丁醇/四氢呋喃/异辛烷/H₂O^*，730/7/5/5/10

*每升移动相1mmol三氟乙酸

(pH＝6.6，用NH₃调节)

泵：Waters^TM510+梯度控制器

梯度：

流速：ml/min	时间：min	％A	％B
流速：ml/min	时间：min	％A	％B	1.0	0	100	0
1.0	25	0	100	1.0	0	100	0
1.0	25	0	100	1.0	30	0	100
1.0	35	100	0	1.0	30	0	100
1.0	35	100	0	1.0	40	100	0

检测器：CUNOW^TM DDL21(蒸发光散射)(温度：100℃，电压：600V，气流：6.01/min)

注射器：Hewlett Packard^TM1050，注射体积50μl

样品制备：将小麦脂溶于5ml CHCl₃/CH₃OH(75：25)中，超声波处理10分钟，滤过孔大小为0.45μm的过滤器。

计算：PC的标准曲线(International Lecithin andPhospholipid Society的卵磷脂标准)

参考文献：Arnoldsson，KC and P.Kaufmann(1996)，Chromatographia38：317

11.气相层析法

使用装备了WCOT融合硅柱的Perkin Elmer^TM8420毛细管气相层析，12.5×0.25mmID和0.1μm5％苯基甲基聚硅氧烷(CP Sil8 CB，从Chrompack得到)，用氦气作为载体，在如下条件下进行：

检测器：FID，385℃

烤炉方案：

方案号	1	2	3	4
方案号	1	2	3	4	烤炉温度，℃	80	200	240	360
等温时间，min	2	0	0	10	烤炉温度，℃	80	200	240	360
等温时间，min	2	0	0	10	温度速率，℃/min	20	10	12

样品制备：将50mg小麦脂溶于含有2mg/ml十七烷作为内部标准的12ml庚烷∶吡啶为2∶1的溶液。将500μl转移到crimp管瓶中，加入100μl MSTFA(N-甲基-N-三甲代甲硅烷基-三氟乙酰胺)并且在90℃下反应15分钟。

计算：甘油一、二和三酯和游离脂肪酸的反应因子是通过参考这些成分的混合物而判断的。根据这些反应因子，可以计算小麦脂中的甘油一、二和三酯和游离脂肪酸含量。

12.用于下列实施例中的酶的酶促活性

酶	LIPU/g	LUSol/g	PLU/g
酶	LIPU/g	LUSol/g	PLU/g	脂酶SP979	0	65	1984
脂酶SP972	280	40	2450	脂酶SP979	0	65	1984
脂酶SP972	280	40	2450	GRINDAMYL EXEL16	3000	450	0
Stalingase，#1867，纯化的	42.5	24.7	5	GRINDAMYL EXEL16	3000	450	0
Stalingase，#1867，纯化的	42.5	24.7	5	脂酶3(2524-120)	4600	2910	24

实施例1

SP972和GRINDAMYL^TM EXEL16在硬皮面包卷中的作用

按前面所述程序烘烤和检验面包卷。结果总结于表1.1。

表1.1. 比容知面包屑评分(1-10)

酶	比容，ml/g	面包屑评分
酶	比容，ml/g	面包屑评分	无酶对照	5.33	4
200ppm EXEL16	5.65	7	无酶对照	5.33	4
200ppm EXEL16	5.65	7	1000LUT/kg SP972	5.70	6
2500LUT/kg SP972	5.99	8	1000LUT/kg SP972	5.70	6
2500LUT/kg SP972	5.99	8	5000LUT/kg SP972	5.46	8

从此烘烤实验中取出完全发酵的生面团，测量游离脂肪酸的含量。结果总结于表1.2：

表1.2.发酵生面团中的游离脂肪酸含量

酶	游离脂肪酸百分比
酶	游离脂肪酸百分比	无酶对照	0.229
200ppm EXEL 16	0.303	无酶对照	0.229
200ppm EXEL 16	0.303	1000LUT/kg SP972	0.349
2500LUT/kg SP972	0.324	1000LUT/kg SP972	0.349
2500LUT/kg SP972	0.324	5000LUT/kg SP972	0.364

这些结果表示脂酶SP972对生面团中脂肪酸形成的明确作用。

此外，通过添加脂酶972，面包体积显著改善，此酶赋予了更白和更均质的面包屑结构，如图1所示。

实施例2

补充脂酶的发酵生面团中的脂肪酸和极性脂含量

用50g Brabender^TM淀粉测定记录仪在30℃下将5个实验生面团(1-5)搅拌5分钟，在34℃下发酵5分钟。然后立即冷冻和冻干。

实验生面团的组成总结于表2.1：

表2.1.实验生面团的组成

成分	实验生面团1(对照)	实验生面团2	实验生面团3	实验生面团4	实验生面团5
成分	实验生面团1(对照)	实验生面团2	实验生面团3	实验生面团4	实验生面团5	改良面粉，g	50	50	50	50	50
干酵母，g	0.38	0.38	0.38	0.38	0.38	改良面粉，g	50	50	50	50	50
干酵母，g	0.38	0.38	0.38	0.38	0.38	盐，g	0.75	0.75	0.75	0.75	0.75
500BU(54％)水，ml	27	26.19	24.95	22.94	18.87	盐，g	0.75	0.75	0.75	0.75	0.75
500BU(54％)水，ml	27	26.19	24.95	22.94	18.87	SP972(560LUT/ml)，ml	0	0.813	2.05	4.06	8.13
LUT/kg面粉	0	894	2236	4472	8943	SP972(560LUT/ml)，ml	0	0.813	2.05	4.06	8.13

用GC分析脂肪酸含量。这些分析的结果总结于表2.2：

表2.2.实验生面团1-5中的脂肪酸含量

实验生面团	脂肪酸百分比
实验生面团	脂肪酸百分比	1	0.180
2	0.394	1	0.180
2	0.394	3	0.410
4	0.469	3	0.410
4	0.469	5	0.522

此外，用上述HPLC分析对照生面团(实验生面团1)和实验生面团5的极性脂含量。结果总结于表2.3：

表2.3.含0和8943LUT脂酶的实验生面团中各自的极性脂含量

极性脂	对照生面团1中的极性脂百分比	实验生面团5中的极性脂百分比
极性脂	对照生面团1中的极性脂百分比	实验生面团5中的极性脂百分比	酰化磷脂酰乙醇胺(APE)	0.044	0.056
双半乳糖甘油二酯(DGDG)	0.209	0.022	酰化磷脂酰乙醇胺(APE)	0.044	0.056
双半乳糖甘油二酯(DGDG)	0.209	0.022	磷脂酰胆碱(PC)	0.051	0.003
双半乳糖甘油单酯(DGMG)	0.015	0.103	磷脂酰胆碱(PC)	0.051	0.003
双半乳糖甘油单酯(DGMG)	0.015	0.103	溶血磷脂酰胆碱(LPC)	0.268	0.301

以上结果显示了脂酶SP972对脂肪酸形成的明确作用。甚至在最低的894LUT/kg面粉的剂量下，也观察到了实验生面团中脂肪酸含量的显著增加。HPLC分析表明关于水解磷脂和糖脂的显著作用。

因此，这些实验表明SP972脂酶可以利用甘油酯、磷脂和糖脂作为底物。

实施例3

单独的和与大豆卵磷脂结合的脂酶SP972对硬皮面包卷生面团中脂肪酸和极性脂含量及烘烤成的面包卷质量的作用

检验单独的和与大豆卵磷脂结合的脂酶SP972对硬皮面包卷质量的活性。用商购的脂酶产品GRINDAMYL^TM EXEL16(EXEL16)和商购的DATEM乳化剂，Panodan^TM A2020作为对比进行实验。

使用的酶量和乳化剂添加剂及分别烘烤的面包卷质量总结于表3.1：

表3.1.酶与乳化剂添加和面包质量

	比容，ml/g	面包屑评分(1-10)	面包皮评分(1-10)
	比容，ml/g	面包屑评分(1-10)	面包皮评分(1-10)	对照	5.95	3	3
0.2％Panodan A2020	6.14	N.D1	N.D1	对照	5.95	3	3
0.2％Panodan A2020	6.14	N.D1	N.D1	750LUT/kg SP972	6.77	8	7
1500LUT/kg SP972	6.65	7	6	750LUT/kg SP972	6.77	8	7
1500LUT/kg SP972	6.65	7	6	750LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	6.94	5	8
1500LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	7.2	5	7	750LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	6.94	5	8
1500LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	7.2	5	7	900LUT/kg EXEL16	6.38	7	5
1800LUT/kg EXEL16	6.2	6	6	900LUT/kg EXEL16	6.38	7	5
1800LUT/kg EXEL16	6.2	6	6	900LUT/kg EXEL16+0.5％卵磷脂	6.3	5	7
1800LUT/kg EXEL16+0.5％卵磷脂	6.35	7	7	900LUT/kg EXEL16+0.5％卵磷脂	6.3	5	7

用脂酶SP972与GRINDAMYL^TM EXEL16或Panodan A 2020乳化剂对比的烤烘实验表现出单独使用SP972或与大豆卵磷脂结合都具有极佳的烘烤性能。结果比商购的脂酶GRINDAMYL^TM EXEL16显著更佳。

按前面描述的方法分析从生面团中提取的脂的游离脂肪酸和极性脂。这些分析的结果总结于表3.2和3.3：

表3.2.含有乳化剂、单独的或与卵磷脂结合的脂酶SP972、或单独的或与卵磷脂结合的GRINDAMYL ^TM EXEL16的生面团中的脂肪酸含量

	游离脂肪酸，wt％
	游离脂肪酸，wt％	0.2％Panodan A2020	0.129
750LUT/kg SP972	0.148	0.2％Panodan A2020	0.129
750LUT/kg SP972	0.148	1500LUT/kg SP972	0.235
750LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	0.269	1500LUT/kg SP972	0.235
750LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	0.269	1500LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	0.280
900LUT/kg EXEL16	0.263	1500LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	0.280
900LUT/kg EXEL16	0.263	1800LUT/kg EXEL16	0.330
900LUT/kg EXEL16+0.5％卵磷脂	0.337	1800LUT/kg EXEL16	0.330
900LUT/kg EXEL16+0.5％卵磷脂	0.337	1800LUT/kg EXEL16+0.5％卵磷脂	0.346

表3.3.在补充了单独的或与卵磷脂结合的脂酶SP972或单独的或与卵磷脂结合的GRINDAMYL ^TM EXEL16的生面团中的极性脂含量 (wt％)

	DGDG	DGMG	PC	LPC
	DGDG	DGMG	PC	LPC	750LUT/kg SP972	0.089	0.083	0.023	0.303
750LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	0.116	0.076	0.031	0.326	750LUT/kg SP972	0.089	0.083	0.023	0.303
750LUT/kg SP972+0.5％卵磷脂	0.116	0.076	0.031	0.326	900LUT/kg EXEL16	0.233	0.018	0.067	0.285
900LUT/kg EXEL16+0.5％卵磷脂	0.240	0.015	0.015	0.290	900LUT/kg EXEL16	0.233	0.018	0.067	0.285

以上结果表明GRINDAMY^TM EXEL16对DGDG和PC水解无作用。因此可以得出结论，与商购的脂酶GRINDAMYL^TM EXEL16相比，由脂酶SP972影响的生面团中磷脂和糖脂的修饰对脂酶972的面包改进作用很重要。

实施例4

脂酶SP972在补充了燕麦脂的生面团中的酶促活性

在补充了燕麦脂部分，2133-18-1的模型生面团中检验脂酶SP972。生面团的配方如下：

表4.1.补充燕麦脂的生面团的组成

生面团成分	生面团1	生面团2	生面团3	生面团4
生面团成分	生面团1	生面团2	生面团3	生面团4	改良小麦面粉，g	10	10	10	10
30％NaCl，g	0.5	0.5	0.5	0.5	改良小麦面粉，g	10	10	10	10
30％NaCl，g	0.5	0.5	0.5	0.5	燕麦脂，2133-18-1，g	0.25	0.25	0.25	0.25
水(500BU)(53.7％)，ml	4.87	4.87	4.87	4.87	燕麦脂，2133-18-1，g	0.25	0.25	0.25	0.25
水(500BU)(53.7％)，ml	4.87	4.87	4.87	4.87	SP972，LUT/kg面粉	0	500	1000	5000

用50g Brabender淀粉测定记录仪在30℃下搅拌生面团。60分钟后，发酵，冷冻和冻干生面团，然后从冻干的生面团中提取脂，并用HPLC分析极性脂。结果总结于表4.2：

表4.2.补充燕麦脂的生面团中极性脂的含量。数值为冻干生面团的重量百分比

极性脂成分	生面团1(对照)	生面团2	生面团3	生面团4
极性脂成分	生面团1(对照)	生面团2	生面团3	生面团4	DGDG	0.751	0.633	0.504	0.221
PC	0.301	0.209	0.159	0.055	DGDG	0.751	0.633	0.504	0.221
PC	0.301	0.209	0.159	0.055	DGMG	0.032	0.094	0.112	0.233
LPC	0.276	0.342	0.342	0.409	DGMG	0.032	0.094	0.112	0.233

以上结果表明，加入燕麦脂使磷脂和糖脂的水平均增加，SP972脂酶很大程度利用了DGDG和PC作为底物。因此，添加酶对生面团中更多极性脂成分的形成具有显著作用。

实施例5

评估将生面团中加入谷脂和脂酶SP979的可能协同作用的烘烤实验

进行烘烤实验，实验中研究了单独使用分馏的燕麦脂制剂(2133-100-1)和与脂酶SP979或GRINDAMYL^TM EXEL16结合使用时对面包质量的影响，从而评估是否可以证明燕麦脂和脂酶的协同作用。制作生面团和烘烤生面团的程序描述于上述“微量烘烤实验”。使用的添加剂含量和关于面包质量的结果总结于表5.1：

表5.1.燕麦脂和脂酶对面包质量的作用

添加剂	比容，ml/g	相对体积
添加剂	比容，ml/g	相对体积	无添加剂的对照	4.01	100
燕麦脂，0.3％	3.91	98	无添加剂的对照	4.01	100
燕麦脂，0.3％	3.91	98	燕麦脂，0.3％+1010ppm SP979	5.75	143
燕麦脂，0.3％+200ppm EXEL16	4.70	117	燕麦脂，0.3％+1010ppm SP979	5.75	143

这些烘烤实验表明燕麦脂和脂酶SP979的结合对体积影响很大。单独使用燕麦脂部分对面包体积没有任何改进作用。也非常明确，尽管商购的脂酶GRINDAMYL^TM EXEL16表现出轻微的体积改进作用，但与SP979脂酶相比，体积改进作用明显较低，SP979脂酶与不含添加剂的对照相比，比容改进了43％，相对于商购的脂酶，比容改进了约22％。

除了改进面包体积，添加脂酶SP979使面包屑结构和面包外观改进。这一结果表示于图2，从中可以看出，用SP979烘烤的面包具有更好和更柔软的面包屑结构和显著弹性。

实施例6

单独的和与酰基甘油结合的脂酶SP972对生面团质量和烤面包质量的作用

按前面的描述在烘烤实验中用烤面包检验单独的和与大豆油结合的SP972，比较使用GRINDAMYL^TM EXEL16和DIMODAN^TM SDM-T对生面团特征和面包质量的作用。这些实验中的生面团质量参数和面包质量的结果总结于下表：

表6.1.单独或结合的脂酶SP972、大豆油、起酥、GRINDAMYL ^TM EXEL16和乳化剂DIMODAN ^TM SDM-T对生面团延展性和粘度的作用

	搅拌后的生面团评分(0-10)		造型后的生面团评分(0-10)
	搅拌后的生面团评分(0-10)		造型后的生面团评分(0-10)		添加剂	延展性	粘度	延展性	粘度
对照	5	5	5	5	添加剂	延展性	粘度	延展性	粘度
对照	5	5	5	5	2％起酥	5	5	6	5
2％起酥+500LUT/kg SP972	6	5	7	5	2％起酥	5	5	6	5
2％起酥+500LUT/kg SP972	6	5	7	5	500LUT/kg SP972	6	5	6	5
1％大豆油	6	5	6	5	500LUT/kg SP972	6	5	6	5
1％大豆油	6	5	6	5	1％大豆油+500LUT/kg SP972	6	5	7	5
1000LUTkg SP972	6	5	7	4	1％大豆油+500LUT/kg SP972	6	5	7	5
1000LUTkg SP972	6	5	7	4	1％大豆油+1000LUT/kgSP972	6	5	7	4
0.4％DIMODAN^TM SDM-T	6	5	6	5	1％大豆油+1000LUT/kgSP972	6	5	7	4
0.4％DIMODAN^TM SDM-T	6	5	6	5	200ppm EXEL16	6	5	7	5
2％起酥+200ppm EXEL16	6	5	7	4	200ppm EXEL16	6	5	7	5
2％起酥+200ppm EXEL16	6	5	7	4	1％大豆油+200ppm EXEL16	6	5	7	4

表6.2.单独或结合的脂酶SP972、大豆油、起酥、GRINDAMYL ^TM EXEL16和乳化剂DIMODAN ^TM SDM-T对比容、面包屑质量和柔软度的作用

添加剂	比容	面包屑评分	柔软度，第3天	柔软度，第7天
添加剂	比容	面包屑评分	柔软度，第3天	柔软度，第7天	对照	3.72	4	82	129
2％起酥	3.98	7	57	91	对照	3.72	4	82	129
2％起酥	3.98	7	57	91	2％起酥+500LUT/kg SP972	4.63	3	48	69
500LUT/kg SP972	4.26	7	45	75	2％起酥+500LUT/kg SP972	4.63	3	48	69
500LUT/kg SP972	4.26	7	45	75	1％大豆油	4.05	1	63	96
1％大豆油+500LUT/kg SP972	4.65	5	48	77	1％大豆油	4.05	1	63	96
1％大豆油+500LUT/kg SP972	4.65	5	48	77	1000LUTkg SP972	4.01	7	44	70
1％大豆油+1000LUT/kgSP972	3.29	10	100	135	1000LUTkg SP972	4.01	7	44	70
1％大豆油+1000LUT/kgSP972	3.29	10	100	135	0.4％DIMODAN^TM SDM-T	4.17	7	58	89
200ppm EXEL16	3.25	7	108	146	0.4％DIMODAN^TM SDM-T	4.17	7	58	89
200ppm EXEL16	3.25	7	108	146	2％起酥+200ppm EXEL16	3.87	6	55	86
1％大豆油+200ppm EXEL16	4.12	4	73	104	2％起酥+200ppm EXEL16	3.87	6	55	86

这些烘烤实验证实添加单独的和与酰基甘油脂结合的脂酶SP972使面包体积和柔软度显著改进，而且这一作用明显优于商购的脂酶GRINDAMYL^TM EXEL16。此外，从上表中可以看出，添加脂酶SP972可以改进生面团延展性和面包屑评分。从以上结果也可以明显看出SP972与大豆油和起酥结合时产生非常良好的作用。

相对于脂酶SP972，添加GRINDAMYL^TM EXEL16不改进面包柔软度。

实施例7

脂酶SP979对生面团特征和面包质量的作用

在烤面包烘烤实验中检验对短链甘油三酯活性相对较低，但对具有长链脂肪酸的甘油酯和磷脂特别有活性的脂酶SP979。制作烤面包的程序如前面所述，但加入表7.1中所示的添加剂，表7.1概括了关于生面团和面包质量的实验结果。

表7.1.单独的或与卵磷脂或大豆油结合的脂酶SP979对生面团和面包质量的作用

	造型后的生面团评分		比容	面包屑评分	第1天的柔软度	第3天的柔软度	第7天的柔软度
	造型后的生面团评分								延展性	粘度
对照	5	5							延展性	粘度	4.4	3	37	69	103
对照	5	5	500PLU/kg SP979	6	5	4.27	8	32	59	90	4.4	3	37	69	103
1000PLU/kg SP979	6	5	500PLU/kg SP979	6	5	4.27	8	32	59	90	5.19	8	20	42	61
1000PLU/kg SP979	6	5	2000PLU/kg SP979	6	5	4.84	7	21	39	67	5.19	8	20	42	61
0.5％lecithin	6	5	2000PLU/kg SP979	6	5	4.84	7	21	39	67	4.82	6	25	52	76
0.5％lecithin	6	5	500PLU/kg SP979+0.5％卵磷脂	6	5	4.43	8	31	58	87	4.82	6	25	52	76
1000PLU/kg SP979+0.5％卵磷脂	6	5	500PLU/kg SP979+0.5％卵磷脂	6	5	4.43	8	31	58	87	5.21	6	19	38	60
1000PLU/kg SP979+0.5％卵磷脂	6	5	2000PLU/kg SP979+05％卵磷脂	6	5	4.88	8	20	38	59	5.21	6	19	38	60
500PLU/kg SP979+1％大豆油	6	5	2000PLU/kg SP979+05％卵磷脂	6	5	4.88	8	20	38	59	4.8	8	24	38	69
500PLU/kg SP979+1％大豆油	6	5	1000PLU/kg SP979+1％大豆油	6	5	4.91	9	24	41	67	4.8	8	24	38	69
2000PLU/kg SP979+1％大豆油	6	5	1000PLU/kg SP979+1％大豆油	6	5	4.91	9	24	41	67	4.33	6	34	56	86
2000PLU/kg SP979+1％大豆油	6	5	0.4％DIMODAN SDM-T	6	5	4.44	8	31	55	86	4.33	6	34	56	86

这些烘烤实验表现出非常令人感兴趣的脂酶SP979对面包体积和面包屑结构的改进作用。此作用明显优于商购的乳化剂D IMODAN^TMSDM-T。

甚至更有趣的是，该酶对面包柔软度的作用明确表示单独的或与酰基甘油和磷脂结合的脂酶SP979具有显著的柔软度改进作用。已经观察到在本实验中制作的添加了SP979的面包的面包屑是湿润的，并且这种面包的面包屑结构非常均匀，与不含添加剂的对照面包相比，咬下的一口更短。

实施例8

单独的或与燕麦脂结合的脂酶SP979对面包质量的作用

根据前面描述的程序进行面包烘烤实验，但添加了表8.1中指出的添加剂，表中概括了对生面团中比容和游离脂肪酸形成的作用(比色分析)：

表8.1.脂酶979对面包体积和游离脂肪酸形成的作用

	比容	游离脂肪酸的重量百分比
	比容	游离脂肪酸的重量百分比	对照	3.53	0.241
0.3％燕麦脂2133-100-1	3.72	0.243	对照	3.53	0.241
0.3％燕麦脂2133-100-1	3.72	0.243	0.3％燕麦脂+1010ppm SP979	5.45	0.416
0.3％燕麦脂+200ppm EXEL16	4.5	0.377	0.3％燕麦脂+1010ppm SP979	5.45	0.416
0.3％燕麦脂+200ppm EXEL16	4.5	0.377	1010ppm SP979	4.84	0.338
200ppm EXEL16	4.08	0.317	1010ppm SP979	4.84	0.338

以上结果证明了脂酶SP979的显著生面团加强作用，反映于比容的增加和面包屑结构和外观。当与燕麦油结合时，SP979的作用甚至更显著。

将此烘烤实验中发酵的生面团冻干并提取其中的脂，然后进行HPLC分析。分析结果见表8.2：

表8.2.脂酶SP979对生面团中糖脂和磷脂水解的作用(数值用重量百分比表示)

	DGDG	MGDG	PC	LPC
	DGDG	MGDG	PC	LPC	对照	0.176	0.033	0.025	0.193
0.3％燕麦脂2133-100-1	0.190	0.031	0.036	0.224	对照	0.176	0.033	0.025	0.193
0.3％燕麦脂2133-100-1	0.190	0.031	0.036	0.224	0.3％燕麦脂+1010ppm SP979	0.089	0.020	0.006	0.228
0.3％燕麦脂+200ppm EXEL16	0.188	0.031	0.038	0.197	0.3％燕麦脂+1010ppm SP979	0.089	0.020	0.006	0.228
0.3％燕麦脂+200ppm EXEL16	0.188	0.031	0.038	0.197	1010ppm SP979	0.061	0.018	0.007	0.114
200ppm EXEL16	0.203	0.039	0.032	0.229	1010ppm SP979	0.061	0.018	0.007	0.114

从这些结果可以看出，脂酶SP979可以水解糖脂(DGDG)和磷脂(PC)。实际上，50％以上存在的DGDG和PC是通过添加SP979而被水解的。

实施例9

脂酶SP972和脂酶SP979与商购的脂酶GRINDAMYL^TM EXEL16和Stalingase^TM对生面团和面包质量的改进作用

在模型生面团系统中比较脂酶SP972和脂酶SP979和两种商购的脂酶GRINDAMYL^TM EXEL16和Stalingase^TM(Gistbrocades)(后一种酶也称作#1867)的脂水解作用。在32℃下将生面团放置1小时并冻干，用HPLC分析极性脂，用GLC分析极性脂。

模型生面团具有以下组成：

表9.1.模型生面团的组成

	生面团1	生面团2	生面团3	生面团4	生面团5
	生面团1	生面团2	生面团3	生面团4	生面团5	改良面粉，g	50	50	50	50	50
30％NaCl，g	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	改良面粉，g	50	50	50	50	50
30％NaCl，g	2.5	2.5	2.5	2.5	2.5	水，500BU，53.7％，ml	24.35	24.35	24.35	24.35	24.35
SP972，LUT/kg面粉		2000				水，500BU，53.7％，ml	24.35	24.35	24.35	24.35	24.35
SP972，LUT/kg面粉		2000				SP979，PLU/kg面粉			1000
EXEL16，ppm				200		SP979，PLU/kg面粉			1000
EXEL16，ppm				200		Stalingase^TM，ppm					200

生面团中的游离脂肪酸和甘油三酯(GLC分析)和极性脂，DGDG和PC(HPLC)的含量总结于表9.2：

表9.2.模型生面团中游离脂肪酸、甘油三酯和极性脂的含量(值用重量百分比表示)

	游离脂肪酸	甘油三酯	DGDG	PC
	游离脂肪酸	甘油三酯	DGDG	PC	对照	0.188	0.378	0.204	0.023
2000LUT SP 972	0.419	0.251	0.026	0.002	对照	0.188	0.378	0.204	0.023
2000LUT SP 972	0.419	0.251	0.026	0.002	1000PLU SP979	0.285	0.359	0.153	0.009
200ppm EXEL16	0.257	0.321	0.224	0.022	1000PLU SP979	0.285	0.359	0.153	0.009
200ppm EXEL16	0.257	0.321	0.224	0.022	200ppm Stalingase^TM	0.285	0.276	0.217	0.024

根据这些值，可以计算在生面团中形成的游离脂肪酸(FFA)的含量和分别在生面团中水解的甘油三酯、DGDG和PC的量。这些数据见表9.3：

表9.3.模型生面团中游离脂肪酸的形成和甘油三酯、DGDG和PC 的水解(wt％)

	形成的FFA	水解的DGDG	水解的PC	水解的甘油三酯
	形成的FFA	水解的DGDG	水解的PC	水解的甘油三酯	对照	0	0	0	0
2000LUT SP972	0.230	0.178	0.021	0.127	对照	0	0	0	0
2000LUT SP972	0.230	0.178	0.021	0.127	1000PLU SP979	0.097	0.051	0.014	0.019
200ppm EXEL16	0.069	-0.020	0.001	0.057	1000PLU SP979	0.097	0.051	0.014	0.019
200ppm EXEL16	0.069	-0.020	0.001	0.057	200ppm Stalingase^TM	0.097	-0.013	-0.001	0.102

当用上表中所示生面团中形成的FFA的量表示生面团中的脂酶活性时，明确证明脂酶SP972和脂酶SP979与所检验的两种商购的脂酶相比，在水解糖脂(DGDG)和磷脂(PC)方面非常有活性，而两种商购的脂酶对这些底物无作用。

关于对甘油三酯的作用，脂酶972和脂酶SP979都是有活性的，然而程度低于所检验的两种商购的脂酶。

因此，这些结果证实本发明的两种脂酶水解广泛的脂底物，包括非极性脂，如甘油三酯和极性脂，如糖脂、DGDG和磷脂、PC。

表9.3中总结的数据也可以用图表示，表现酶水解甘油三酯和水解糖脂的能力之间的关系(图3)，以及酶水解甘油三酯的能力和水解磷脂的能力之间的关系(图4)。从这些图中可以看出，脂酶SP972和脂酶SP979分别关于DGDG之间的这种关系可以分别描绘为斜率为1.3965和2.6405的曲线，关于PC的对应值分别为0.1648和0.7248。

这些数据明确说明了相对于对甘油三酯的作用，脂酶SP972和脂酶SP979对糖脂和磷脂具有相对高的活性。

实施例10

脂酶SP979和SP972对不同脂肪酸的作用

通过制作含黄油脂肪的实验生面团评估SP979和SP972脂酶对不同脂肪酸的活性。检验商购脂酶产品GRINDAMYL^TM EXEL16作为对比。

根据表10.1中列出的配方制作实验生面团：

表10.1.含黄油脂肪的实验生面团组成

	1	2	3	4
	1	2	3	4	改良面粉2000063，g	10	10	10	10
干酵母，g	0.1	0.1	0.1	0.1	改良面粉2000063，g	10	10	10	10
干酵母，g	0.1	0.1	0.1	0.1	盐，g	0.15	0.15	0.15	0.15
甘庶，g	0.15	0.15	0.15	0.15	盐，g	0.15	0.15	0.15	0.15
甘庶，g	0.15	0.15	0.15	0.15	黄油，Lurpak，g	0.1	0.1	0.1	0.1
水500BU+7％，ml	6	6	6	6	黄油，Lurpak，g	0.1	0.1	0.1	0.1
水500BU+7％，ml	6	6	6	6	抗坏血酸0.1％solution.ml	0.4	0.4	0.4	0.4
GRINDAMYLEXEL16，ppm		400			抗坏血酸0.1％solution.ml	0.4	0.4	0.4	0.4
GRINDAMYLEXEL16，ppm		400			SP972，LIPU/kg面粉			200
SP979，PLU/kg面粉				1000	SP972，LIPU/kg面粉			200

用50g Brabender^TM搅拌碗搅拌四种实验生面团(1-4)并发酵(如标题为“8.微量烘烤实验”的部分所详细描述)。发酵后将生面团冷冻并冻干。用水饱和的丁醇提取生面团中的所有脂。在BondElut-NH2柱上分离生面团脂中的游离脂肪酸，用GLC分析脂肪酸甲酯形式的游离脂肪酸组成(见表10.2)。通过分光光度法分析作为铜盐形式的生面团脂中游离脂肪酸的总量(％，以生面团干重计算)(也见表10.2)。表10.2.生面团中的游离脂肪酸，以及游离脂肪酸的脂肪酸组成

	1	2	3	4
	1	2	3	4		对照	Gr.Exel16	SP972	SP979
生面团中的游离脂肪酸	0.0925％	0.252％	0.290％	0.192％		对照	Gr.Exel16	SP972	SP979
生面团中的游离脂肪酸	0.0925％	0.252％	0.290％	0.192％	脂肪酸
组成，％					脂肪酸
组成，％					C6		0.1	0.1	0.1
C8		0.2	0.1	0.1	C6		0.1	0.1	0.1
C8		0.2	0.1	0.1	C10	0.3	0.7	0.4	0.3
C12	1.5	1.5	0.9	0.9	C10	0.3	0.7	0.4	0.3
C12	1.5	1.5	0.9	0.9	C14	0.9	3.1	2.3	1
C15	0.4	0.7	0.6	0.3	C14	0.9	3.1	2.3	1
C15	0.4	0.7	0.6	0.3	C16	38.1	35.8	36.4	36.4
C16∶1	1.4	0.9	0.7	0.6	C16	38.1	35.8	36.4	36.4
C16∶1	1.4	0.9	0.7	0.6	C17	0.4	0.7	0.6	0.4
C18	9.3	8.6	7.8	6.2	C17	0.4	0.7	0.6	0.4
C18	9.3	8.6	7.8	6.2	C18∶1	20.1	18.9	15.5	12.9
C18∶2	24.6	26	32.3	38.2	C18∶1	20.1	18.9	15.5	12.9
C18∶2	24.6	26	32.3	38.2	C18∶3	1.4	1.6	1.4	1.5
C20	0.5	0.3	0.3	0.3	C18∶3	1.4	1.6	1.4	1.5
C20	0.5	0.3	0.3	0.3	C20∶1	1.4	0.9	0.7	0.8

根据游离脂肪酸的量和脂肪酸组成，可以计算相对于没有添加脂酶的对照生面团，含脂酶的生面团所产生的游离脂肪酸量。

例如，与没有添加脂酶的生面团1相比，含脂酶GRINDAMYL EXEL16的生面团2中产生的C16脂肪酸(棕榈酸)量计算如下：

\frac{0.252 \times 35.8}{100} \cdot \frac{0.0925 \times 38.1}{100} = 0.05497 %

0.05497％＝549.7ppm每千克干生面团

根据此数据，可以计算相对于长链脂肪酸(碳原子数≥10)量，生面团中产生的短链脂肪酸(碳原子数≤10)量(见表10.3)。

表10.3每千克生面团中的脂肪酸微摩尔数和短链脂肪酸的相对活性

	微摩尔脂肪酸/千克干生面团
	微摩尔脂肪酸/千克干生面团
	2Gr.Exel16	3SP972	4SP979
	2Gr.Exel16	3SP972	4SP979	C6	0.022	0.025	0.017
C8	0.035	0.020	0.013	C6	0.022	0.025	0.017
C8	0.035	0.020	0.013	C10	0.086	0.051	0.017
C12	0.119	0.061	0.017	C10	0.086	0.051	0.017
C12	0.119	0.061	0.017	C14	0.306	0.256	0.048
C15	0.058	0.057	0.008	C14	0.306	0.256	0.048
C15	0.058	0.057	0.008	C16	2.144	2.742	1.351
C16∶1	0.038	0.029	0.000	C16	2.144	2.742	1.351
C16∶1	0.038	0.029	0.000	C17	0.052	0.051	0.015
C18	0.459	0.493	0.116	C17	0.052	0.051	0.015
C18	0.459	0.493	0.116	C18∶1	1.028	0.933	0.219
C18∶2	1.525	2.529	1.804	C18∶1	1.028	0.933	0.219
C18∶2	1.525	2.529	1.804	C18∶3	0.098	0.099	0.057
C20	0.009	0.013	0.004	C18∶3	0.098	0.099	0.057
C20	0.009	0.013	0.004	C20∶1	0.031	0.024	0.008
短/长链脂肪酸的摩尔比	2.44	1.32	1.29	C20∶1	0.031	0.024	0.008

表10.3中的结果表明，不同的脂酶对同样底物中的不同脂肪酸具有不同的活性，它表明脂酶SP 972和SP 979与GRINDAMYL EXEL 16相比，对短链脂肪酸的活性较低。

实施例11

商购脂酶对极性脂的活性

评价了从瑞士Fluka Chemie AG购得的商品分类号为62299的脂酶活性。在模型生面团系统中检验此脂酶，并与没有添加脂酶的对照生面团进行比较。

根据表11.1的配方用10g面粉制作生面团

表11.1实验生面团的组成

	1	2
	1	2	Dk改良面粉，g	10	10
干酵母，g	0.1	0.1	Dk改良面粉，g	10	10
干酵母，g	0.1	0.1	盐	0.15	0.15
水(500BU＝60％)，ml	6	6	盐	0.15	0.15
水(500BU＝60％)，ml	6	6	Fluka脂酶62299，mg		3.3

在30℃下用50g Brabender^TM搅拌碗将生面团(1-2)捏和5分钟，在34℃下发酵45分钟。发酵后将生面团冷冻并冻干。用水饱和的丁醇提取冻干的生面团。用比色法分析作为铜盐的分离的生面团脂中的游离脂肪酸，生面团脂也用HPLC分析(见表11.2)。

表11.2生面团脂的HPLC分析

HPLC分析	对照，‰	Fluka脂酶62299‰
HPLC分析	对照，‰	Fluka脂酶62299‰	MGDG	0.36	0.37
MGMG	0	0.07	MGDG	0.36	0.37
MGMG	0	0.07	PA	0.05	0
APE	0.2	0.15	PA	0.05	0
APE	0.2	0.15	DGDG	1.91	1.66
PC	0.42	0.19	DGDG	1.91	1.66
PC	0.42	0.19	LPE	0.2	0.19
DGMG	0	0.16	LPE	0.2	0.19
DGMG	0	0.16	LPC	2.63	2.44
脂肪酸分析	1.01	2.1	LPC	2.63	2.44

表11.2的结果表明62299号Fluka脂酶在形成游离脂肪酸的过程中在生面团系统中是有活性的，62299号Fluka脂酶对糖脂(DGDG)和磷脂(PC)都是有活性的。

总结

现在用编号的段落总结本发明：

1.一种制备生面团的方法，该方法包含在生面团成分中加入在生面团条件下可以水解非极性脂、糖脂和磷脂的酶，或加入含所述酶的组合物，并混合生面团成分而获得生面团。

2.第1段的方法，其中至少一种非极性脂、糖脂和磷脂是存在于用于生面团的面粉中的天然存在的脂成分。

3.第2段的方法，其中天然存在的脂为磷脂。

4.第3段的方法，其中磷脂为磷脂酰胆碱(PC)。

5.第2段的方法，其中天然存在的脂为糖脂。

6.第5段的方法，其中糖脂为双半乳糖甘油二酯(DGDG)。

7.第1段的方法，其中将至少一种非极性脂、糖脂和磷脂加入生面团。

8.第7段的方法，其中加入的非极性脂为酰基甘油。

9.第8段的方法，其中加入的酰基甘油选自植物油、植物脂肪、动物油、动物脂肪、起酥和黄油。

10.第9段的方法，其中植物油为天然存在的谷物油，包括燕麦油。

11.第7段的方法，其中加入的极性脂为选自磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的磷脂。

12.第1段的方法，其中生面团为酵母发酵的生面团。

13.第1段的方法，其中加入的酶量为10-100,000LUT/千克面粉或10-100,000PLU/千克面粉。

14.第13段的方法，其中酶量为100-10,000LUT/千克面粉或100-10,000PLU/千克面粉。

15.第1段的方法，其中生面团为面包生面团，该方法包含另一步，即烘烤生面团而获得烘烤产品。

16.第1段的方法，其中生面团选自意大利面食生面团、面条生面团和蛋糕生面团或面糊。

17.第1段的方法，其中加入的酶量使烘烤产品的比容相对于在除未添加酶外，其它都相同的条件下制作的烘烤产品增加至少10％。

18.第1段的方法，其中将另一种酶加入生面团。

19.第18段的方法，其中另一种酶选自脂酶、淀粉降解酶、半纤维素酶、纤维素酶和氧化还原酶。

20.第1段的方法，其中最初存在于生面团中的DGDG的至少25％被水解。

21.第1或第20段的方法，其中最初存在于生面团中的PC的至少25％被水解。

22.第1段的方法，其中酶的特征在于该酶水解甘油三酯的能力和水解糖脂的能力之间的关系可以描绘为斜率至少为1.0的曲线。

23.第1段的方法，其中酶的特征在于该酶水解甘油三酯的能力和水解磷脂的能力之间的关系可以描绘为斜率至少为0.1的曲线。

24.前面任何一段中的方法，其中所述非极性脂为包含C₄到C₁₀脂肪酸的甘油三酯和包含C₁₂到C₂₀的脂肪酸的甘油三酯，其中与包含C₄到C₁₀脂肪酸的甘油三酯相比，该酶优先水解所述包含C₁₂到C₂₀的脂肪酸的甘油三酯。

25.一种制备生面团的方法，所述方法包含在生面团成分中加入在生面团条件下可以水解包含C₄到C₁₀脂肪酸的甘油三酯、包含C₁₂到C20的脂肪酸的甘油三酯、糖脂和磷脂的酶，与包含C₄到C₁₀脂肪酸的甘油三酯相比，该酶优先水解所述包含C₁₂到C₂₀的脂肪酸的甘油三酯，以及混合生面团成分而获得生面团。

26.第25段的方法，其中所述糖脂为双半乳糖甘油二酯。

27.一种制备生面团或由生面团制备的烘烤产品的方法，包含：

a)检验至少一种酶对甘油三酯中的C₄到C₁₀脂肪酸、甘油三酯中的C₁₂到C₂₀脂肪酸、双半乳糖甘油二酯和磷脂的水解活性，

b)选择对双半乳糖甘油二酯和磷脂具有水解活性，并且相对于C₄到C₁₀脂肪酸，对C₁₂到C₂₀脂肪酸具有更强活性的酶，和

c)将所选的酶加入生面团。

28.一种改进生面团的组合物，包含在生面团条件下能够水解非极性脂、糖脂和磷脂，并且可选择水解至少另外一种生面团成分的酶。

29.第28段的组合物，包含另一种酶，该酶选自脂酶、淀粉降解酶、半纤维素酶、纤维素酶和氧化还原酶。

30.第28段的组合物，其中另外一种生面团成分选自谷物面粉、酵母、化学发酵剂、生面团加强剂、乳化剂、糖、酰基甘油、磷脂、糖脂和盐。

31.第1段的方法，其中将酶加入28-30段的任意一段的组合物。

32.通过1-27和31段的任意一段的方法获得的生面团。

33.第32段的生面团，该生面团被冷冻或在控制的气氛下被包装。

34.通过烘烤32段的生面团而获得的烘烤产品。

35.由32段的生面团制作的面条产品。

36.由32段的生面团制作的意大利面食产品。

在此引入前面的说明书中提到的所有公开文献作为参考。本领域的技术人员应该明确，对所描述本发明的方法和系统所做的各种修饰和改变不离开本发明的范围和精神。尽管本发明是联系特定优选实施方案而描述的，应该理解本发明要求保护的范围不应该过分限制于这些特定实施方案。实际上，所描述的执行本发明的方式的各种修饰对分子生物学和相关领域的技术人员应该是很明显的，意欲包含在本发明的范围内。

Claims

2.权利要求1的方法，其中至少一种非极性脂、糖脂和磷脂是存在于用于生面团的面粉中的天然存在的脂成分。

3.权利要求2的方法，其中天然存在的脂为磷脂。

4.权利要求3的方法，其中磷脂为磷脂酰胆碱(PC)。

5.权利要求2的方法，其中天然存在的脂为糖脂。

6.权利要求5的方法，其中糖脂为双半乳糖甘油二酯(DGDG)。

7.权利要求1的方法，其中将至少一种非极性脂、糖脂和磷脂加入生面团。

8.权利要求7的方法，其中加入的非极性脂为酰基甘油。

9.权利要求8的方法，其中加入的酰基甘油选自植物油、植物脂肪、动物油、动物脂肪、起酥和黄油。

10.权利要求9的方法，其中植物油为天然存在的谷物油，包括燕麦油。

11.权利要求7的方法，其中加入的极性脂为选自磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的磷脂。

12.权利要求1的方法，其中生面团为酵母发酵的生面团。

13.权利要求1的方法，其中加入的酶量为10-100,000LUT/千克面粉或10-100,000PLU/千克面粉。

14.权利要求13的方法，其中酶量为100-10,000LUT/千克面粉或100-10,000PLU/千克面粉。

15.权利要求1的方法，其中生面团为面包生面团，该方法包含另一步，即烘烤生面团而获得烘烤产品。

16.权利要求1的方法，其中生面团选自意大利面食生面团、面条生面团和蛋糕生面团或面糊。

17.权利要求1的方法，其中加入的酶量使烘烤产品的比容相对于在除未添加酶外，其它都相同的条件下制作的烘烤产品增加至少10％。

18.权利要求1的方法，其中将另一种酶加入生面团。

19.权利要求18的方法，其中另一种酶选自脂酶、淀粉降解酶、半纤维素酶、纤维素酶和氧化还原酶。

20.权利要求1的方法，其中最初存在于生面团中的DGDG的至少25％被水解。

21.权利要求1或20的方法，其中最初存在于生面团中的PC的至少25％被水解。

22.权利要求1的方法，其中酶的特征在于该酶水解甘油三酯的能力和水解糖脂的能力之间的关系可以描绘为斜率至少为1.0的曲线。

23.权利要求1的方法，其中酶的特征在于该酶水解甘油三酯的能力和水解磷脂的能力之间的关系可以描绘为斜率至少为0.1的曲线。

24.前面任意一项权利要求的方法，其中所述非极性脂为包含C₄到C₁₀脂肪酸的甘油三酯和包含C₁₂到C₂₀的脂肪酸的甘油三酯，其中与包含C₄到C₁₀脂肪酸的甘油三酯相比，该酶优先水解所述包含C₁₂到C₂₀的脂肪酸的甘油三酯。

25.一种制备生面团的方法，所述方法包含在生面团成分中加入在生面团条件下可以水解包含C₄到C₁₀脂肪酸的甘油三酯、包含C₁₂到C₂₀的脂肪酸的甘油三酯、糖脂和磷脂的酶，与包含C₄到C₁₀脂肪酸的甘油三酯相比，该酶优先水解所述包含C₁₂到C₂₀的脂肪酸的甘油三酯，以及混合生面团成分而获得生面团。

26.权利要求25的方法，其中所述糖脂为双半乳糖甘油二酯。

c)将所选的酶加入生面团。

29.权利要求28的组合物，包含另一种酶，该酶选自脂酶、淀粉降解酶、半纤维素酶、纤维素酶和氧化还原酶。

30.权利要求28的组合物，其中另外一种生面团成分选自谷物面粉、酵母、化学发酵剂、生面团加强剂、乳化剂、糖、酰基甘油、磷脂、糖脂和盐。

31.权利要求1的方法，其中将酶加入权利要求28-30的任意一项的组合物。

32.通过权利要求1-27和31的任意一项的方法获得的生面团。

33.权利要求32的生面团，该生面团被冷冻或在控制的气氛下被包装。

34.通过烘烤权利要求32的生面团而获得的烘烤产品。

35.由权利要求32的生面团制作的面条产品。

36.由权利要求32的生面团制作的意大利面食产品。