ES2284897T3 - Procedimiento para la preparacion de una masa con una enzima. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de preparación de una masa de harina, comprendiendo dicho procedimiento añadir a los componentes de la masa una cantidad eficaz de una enzima que en las condiciones de la masa hidroliza un glucolípido y un fosfolípido, pero no hidroliza un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido entre 4, 5 y 6, 5, y mezclar los componentes de la masa para obtener la masa.
Description
Procedimiento para la preparación de una masa
con una enzima.
La presente invención se refiere a la
preparación de masas y de productos a base de masa de harina y, en
especial, pero no exclusivamente, para mejorar la consistencia y la
maquinabilidad de las masas, y el volumen, la blandura y la
estructura de la miga de pan y de otros productos de panadería.
En la industria alimentaria son muy utilizados
los aditivos para mejorar la calidad del producto alimenticio. Uno
de los aditivos alimentarios más utilizados es el emulsionante y en
especial el monoglicérido.
El monoglicérido se produjo al principio como
una mezcla de mono-, di- y triglicéridos. Sin embargo, se desarrolló
posteriormente tecnología para producir monoglicéridos muy
purificados por destilación molecular. Los monoglicéridos se
producen habitualmente mediante una reacción de glicerólisis, en la
que el triglicérido y el glicerol se hacen reaccionar a temperatura
elevada superior a 200ºC utilizando catalizadores alcalinos.
Como alternativa a la utilización de
catalizadores alcalinos y temperaturas elevadas se han realizado
muchos intentos para utilizar enzimas tales como lipasas en la
producción de monoglicéridos. En un artículo de revista,
Bornscheuer (Enzyme and Microbial Technology
17:578-585, 1995) menciona la glicerólisis
enzimática de triglicéridos en presencia o ausencia de disolventes
y que los monoglicéridos pueden producirse por glicerólisis
enzimática en fase sólida.
Los monoglicéridos pueden utilizarse como
emulsionantes en muchas aplicaciones alimentarias. En la industria
de la panificación, los monoglicéridos se han utilizado para mejorar
la blandura del pan formando complejos con el almidón y retardando
de este modo la cristalización de la amilopectina y el comienzo del
endurecimiento del pan.
Las lipasas (E.C. 3.1.1.3) también se han
utilizado directamente en la producción del pan. Por ejemplo, en la
patente EP 0 585 988 se reivindica que la adición de lipasa a la
masa produce una mejora del efecto contra el endurecimiento. Se
sugiere que cuando se añade a la masa una lipasa obtenida de
Rizhopus arrhizus puede mejorar la calidad del pan
resultante cuando se utiliza en combinación con grasa/manteca. El
documento WO 94/04035 da a conocer que puede conseguirse una
blandura mejorada añadiendo una lipasa a la masa sin adición de
ninguna grasa y/o aceite adicional a la masa. Castello, P. ESEGP
89-10 dic. 1999 Helsinki, demuestra que las lipasas
exógenas pueden modificar el volumen del pan. Así pues, las lipasas
(E.C. 3.1.1.3) que hidrolizan los triacilgliceroles eran conocidas
porque presentaban ventajas para la utilización en la industria de
la panificación.
En el documento WO 98/45453 se ha demostrado que
la cantidad de monoglicérido en las masas tratadas con lipasa
aumenta sólo muy ligeramente, ya que la lipasa añadida a la masa
degrada fácilmente los monoglicéridos a glicerol y libera ácidos
grasos. Esto se explica por el hecho de que la lipasa reconoce la
parte de ácido graso de la molécula en la zona activa y como los
monoglicéridos y diglicéridos están más orientados en la interfase
donde la lipasa es activa, los monoglicéridos y diglicéridos se
degradan fácilmente durante la adición de la lipasa a una matriz
que contiene emulsiones de grasa/aceite. Incluso con respecto a las
lipasas 1.3 específicas, que solamente hidrolizan los ácidos grasos
de un triglicérido en las posiciones 1 y 3 dejando el
2-monoglicérido como producto de reacción, el
2-monoglicérido resultante se reconfigura fácilmente
a 1-monoglicérido, que puede ser hidrolizado por
las lipasas 1.3 específicas.
Durante la degradación enzimática de los
triglicéridos por las lipasas convencionales se forman
monoglicéridos, diglicéridos, ácidos grasos libres y glicerol.
Típicamente, el aumento de monoglicéridos en la
masa tratada con una o más lipasas es inferior al 0,1% (referido al
peso de harina) con o sin grasa o aceite añadidos. Sin embargo, la
dosis convencional de monoglicérido requerida en la masa para que
produzca una mejora, por ejemplo, en la suavidad del pan resultante
está comprendida típicamente aproximadamente entre 0,3 y 0,8%
referido al peso de la harina (Krog, N. Cereal Food World,
24, 10, 1979). Por lo tanto, cualquier efecto beneficioso de
la adición de lipasas convencionales a la masa, tal como se sugirió
en los documentos EP 0 585 988 y WO 94/04035, no es un resultado de
un contenido creciente de monoglicérido solo.
Algunas lipasas además de presentar un efecto
hidrolizante del triglicérido, son capaces de hidrolizar lípidos
polares tales como glucolípidos, p. ej. digalactosildiglicérido
(DGDG) y fosfolípidos (véase por ejemplo el documento WO
01/39602).
El sustrato para las lipasas en la harina de
trigo es del 2 al 3% de lípidos de trigo endógenos, que son una
mezcla compleja de lípidos polares y no polares. Los lípidos polares
pueden dividirse en glucolípidos y fosfolípidos. Estos lípidos
están constituidos por glicerol esterificado con dos ácidos grasos y
un grupo polar. El grupo polar contribuye a la actividad
superficial de estos lípidos. La escisión enzimática de uno de los
ácidos grasos en estos lípidos conduce a lípidos con una actividad
superficial mucho mayor. Es bien conocido que emulsionantes, tales
como DATEM, con gran actividad superficial son muy operativos cuando
se añaden a la masa.
Se ha descubierto, sin embargo, que la
utilización de lipasas (E.C. 3.1.1.3) en la masa en determinadas
condiciones puede tener consecuencias perjudiciales, tales como la
producción de harinas en mal estado, un impacto perjudicial sobre
la actividad de la levadura y/o un efecto negativo sobre el volumen
del pan. El efecto negativo sobre el volumen del pan se denomina
con frecuencia sobredosis. La sobredosis puede conducir a una
disminución en la elasticidad del gluten que produce una masa que
es demasiado dura y por tanto produce volúmenes reducidos. Además,
o alternativamente, dichas lipasas pueden degradar la materia grasa,
el aceite o la grasa de la leche añadida a la masa.
El documento WO 00/32758 describe variantes de
enzima lipolítica.
El documento GB 2 358 784 A describe un
procedimiento de preparación de masa que comprende añadir a una masa
una enzima que puede hidrolizar un lípido no polar, un glucolípido
y un fosfolípido.
El documento WO 02/00852 A2 describe un grupo de
genes de enzima que codifican enzimas lipolíticas con alta
homología aislados de cepas de Fusarium y
Acremonium.
El documento WO 02/03805 A describe la adición a
la masa de una combinación de dos enzimas lipolíticas con
diferentes especificidades.
El documento WO 02/065854 A2 describe el
tratamiento de materias primas para productos alimenticios amiláceos
tales como fideos, frituras y productos para refrigerio con enzima
lipolítica.
El documento WO 02/066622 A2 describe nuevos
genes aislados con alta homología al gen de la lipasa.
Un descubrimiento con potencial para desarrollos
futuros de la presente invención consiste en que, sorprendentemente,
la utilización de una enzima, que en las condiciones de la masa es
capaz de hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, pero que es
incapaz, o sustancialmente incapaz, de hidrolizar un triglicérido
y/o un 1-monoglicérido, presenta ventajas, y supera
los inconvenientes relacionados con la utilización de lipasas (E.C.
3.1.1.3) que son capaces de hidrolizar lípidos no polares en una
masa.
La presente invención proporciona en primer
aspecto un procedimiento de preparación de una masa de harina,
comprendiendo dicho procedimiento añadir a los componentes de la
masa una cantidad eficaz de una enzima que en las condiciones de la
masa es capaz de hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, en el
que dicha enzima es incapaz, de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5, y mezclar los componentes de la masa para obtener
la masa.
En un segundo aspecto de la presente invención,
se proporciona un procedimiento de preparación de una masa o
producto de panadería preparado a partir de una masa que
comprende:
- (a)
- probar la actividad hidrolítica de por lo menos una enzima para con un triglicérido, un 1-monoglicérido, un fosfolípido y un glucolípido;
- (b)
- seleccionar una enzima con actividad hidrolítica para con un fosfolípido y un glucolípido y que no tenga actividad hidrolítica para con un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5; y
- (c)
- añadir la enzima seleccionada a la masa.
La presente invención proporciona en un tercer
aspecto una masa que mejora la composición que comprende una
cantidad eficaz de una enzima con actividad hidrolítica para con un
fosfolípido y un glucolípido y que no tiene actividad hidrolítica
para con un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en
el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5 y, opcionalmente, un
componente de la masa adicional.
En un cuarto aspecto, la presente invención
proporciona una masa que puede obtenerse por el procedimiento según
la presente invención.
En un quinto aspecto, la presente invención
proporciona una masa obtenida por el procedimiento según la presente
invención.
En un sexto aspecto, la presente invención
proporciona un producto de panadería que puede obtenerse horneando
una masa según la presente invención.
En un séptimo aspecto, la presente invención
proporciona un producto de panadería obtenido horneando una masa
según la presente invención.
La presente invención proporciona además, en un
octavo aspecto, un producto de fideos preparado a partir de una
masa según la presente invención.
En un noveno aspecto, la presente invención
proporciona un producto de pasta preparado a partir de una masa
según la presente invención.
En un décimo aspecto, la presente invención
proporciona un procedimiento de preparación de una masa que mejora
la composición en la que una cantidad eficaz de una enzima con
actividad hidrolítica para con un fosfolípido y un glucolípido y
que no presenta actividad hidrolítica para con un triglicérido y/o
un 1-monoglicérido en el intervalo de pH
comprendido entre 4,5 y 6,5, se mezcla, opcionalmente, con un
componente adicional de la masa.
En un decimoprimer aspecto, un procedimiento
según la presente invención puede comprender las etapas
siguientes:
- (a)
- probar la actividad hidrolítica de por lo menos una enzima para con un triglicérido, un 1-monoglicérido, un fosfolípido y un glucolípido;
- (b)
- seleccionar una enzima con actividad hidrolítica para con un fosfolípido y un glucolípido y que no tenga actividad hidrolítica para con un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5.
La presente invención proporciona en su
decimosegundo aspecto un procedimiento de preparación o desarrollo
de una enzima con actividad hidrolítica para con un fosfolípido y un
glucolípido y que no presenta actividad hidrolítica para con un
triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo
de pH comprendido entre 4,5 y 6,5, que comprende:
- (a)
- seleccionar una lipasa con actividad hidrolítica para con un fosfolípido, un glucolípido y un triglicérido y/o un 1-monoglicérido,
- (b)
- modificar por inserción, deleción o sustitución de por lo menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos, típicamente cerca o en el sitio activo, a fin de alterar la actividad de la lipasa de tal forma que la lipasa se modifica para no tener ninguna, o sustancialmente ninguna, actividad contra un triglicérido y/o un 1-monoglicérido.
En un decimotercer aspecto, la presente
invención proporciona la utilización de una cantidad eficaz de una
enzima que en las condiciones de la masa es capaz de hidrolizar un
glucolípido y un fosfolípido, en la que dicha enzima es incapaz de
hidrolizar un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en
el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5, en la preparación
de una masa para proporcionar una masa con aumento de volumen de la
masa y/o aumento de la consistencia del gluten en comparación con
una masa sin dicha enzima.
En un decimocuarto aspecto, la presente
invención proporciona un procedimiento para eliminar los lípidos
polares de un aceite comestible, comprendiendo dicho procedimiento
la adición a un aceite comestible de una enzima que es capaz de
hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, en la que dicha enzima
es incapaz de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5.
En un decimoquinto aspecto, la presente
invención proporciona un aceite comestible, tal como un aceite de
soja o un aceite de colza, que se puede obtener o se obtiene por el
procedimiento según la presente invención.
En un decimosexto aspecto, la presente invención
proporciona una proteína que en las condiciones de la masa presenta
una o más de las características siguientes:
- i)
- es capaz de hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, en la que dicha enzima es incapaz, o sustancialmente incapaz, de hidrolizar un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5.
- ii)
- un peso molecular de aproximadamente 57 y/o aproximadamente 87 kDa cuando se determina por análisis SDS-PAGE;
en la que dicha proteína puede obtenerse a
partir de Vigna unguiculata.
En un decimoséptimo aspecto, la presente
invención proporciona un procedimiento de preparación de una masa
de harina, comprendiendo dicho procedimiento la adición a los
componentes de la masa de una enzima que comprende la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID nº: 12, o una variante, homóloga
o derivada de la misma y mezclar los componentes de la masa para
obtener la masa.
Para facilitar la referencia, éstos y otros
aspectos de la presente invención se exponen a continuación en los
encabezamientos de los apartados apropiados. Sin embargo, lo dado a
conocer en cada apartado no está limitado necesariamente a cada
apartado concreto.
Preferentemente la enzima capaz de hidrolizar un
glucolípido y un fosfolípido, en la que dicha enzima es incapaz de
hidrolizar un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en
el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5 es una acil
hidrolasa lipolítica (LAH) (E.C. 3.1.1.26).
Obsérvese que la enzima E.C. 3.1.1.26 según las
recomendaciones de la International Union of Biochemistry and
Molecular Biology (IUBMB) para Nomenclatura Enzimática (1992) se
refiere a una "galactolipasa" que actúa también en
2,3-di-O-acil-1-O-(6-O-\alpha-D-galactosil-\beta-D-galactosil)-D-glicerol,
y fosfatidilcolina y otros fosfolípidos. En la bibliografía (como
por ejemplo, Biochemica et Biophysica Acta 1215 (1994)
66-73) las enzimas comprendidas en el número de
enzima E.C. 3.1.1.26 se han denominado acil hidrolasas lipolíticas
(LAH) y otras de dichas denominaciones. Las expresiones
galactolipasa y acil hidrolasa lipolítica (LAH) tal como se utiliza
en la presente memoria se consideran que son sinónimos de la misma
enzima, es decir, la que está comprendida en la clasificación E.C.
3.1.1.26 y que presenta actividad tanto en galactolípidos como en
fosfolípidos.
Preferentemente la enzima capaz de hidrolizar un
glucolípido y un fosfolípido, en el que dicha enzima es incapaz de
hidrolizar un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en
el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5, se aísla del
extracto soluble de la hoja de judía de vaca y/o se aísla de los
tilacoides de la hoja del trigo.
De manera apropiada, la enzima capaz de
hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, en la que dicha enzima
es incapaz de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5 puede presentar la secuencia de aminoácidos
mostrada en la SEC. ID nº: 1 y puede ser una variante, homóloga o
derivada de la misma.
De manera apropiada, la enzima capaz de
hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, en la que dicha enzima
es incapaz de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5 puede presentar la secuencia de aminoácidos que es
por lo menos el 75%, más preferentemente por lo menos el 85%, más
preferentemente por lo menos el 90%, homóloga a la SEC. ID nº:
1.
De manera apropiada, la enzima capaz de
hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, en la que dicha enzima
es incapaz de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5 puede ser codificado por la secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC. ID nº: 2 o puede ser una variante,
homóloga o derivada de la misma.
De manera apropiada, la enzima capaz de
hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, en la que dicha enzima
es incapaz de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5 puede ser codificada por una secuencia de
nucleótidos mostrada en la SEC ID nº 2 que es por lo menos el 75%,
más preferentemente por lo menos el 85%, más preferentemente por lo
menos el 90%, homóloga a la SEC. ID nº: 2.
De manera apropiada, la enzima capaz de
hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, en la que dicha enzima
es incapaz de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5 puede ser una proteína que tenga un peso molecular
de aproximadamente 57 kDa y/o aproximadamente 87 kDa cuando se
determina por análisis SDS-PAGE y que puede
obtenerse a partir de Vigna unguiculata.
Preferentemente, la proteína que tiene un peso
molecular de aproximadamente 57 y/o aproximadamente 87 kDa se aísla
utilizando el mismo procedimiento que se detalla en la presente
memoria.
La expresión "una enzima que en las
condiciones de la masa es capaz de hidrolizar un glucolípido y un
fosfolípido, en la que dicha enzima es incapaz de hidrolizar un
triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo
de pH comprendido entre 4,5 y 6,5" incluye una enzima que en las
condiciones de la masa hidroliza un glucolípido y un fosfolípido,
pero que no hidroliza, un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5.
Para algunas formas de realización la enzima
puede añadirse en forma de una composición que comprende dicha
enzima.
Una cantidad eficaz de la enzima debería
añadirse, de modo que la enzima, en las condiciones de la masa o en
condiciones de descrudecimiento, es capaz de hidrolizar un
glucolípido y un fosfolípido, y es incapaz de hidrolizar un
triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo
de pH comprendido entre 4,5 y 6,5. Alternativamente o además, una
cantidad eficaz de una composición que contiene dicha enzima puede
añadirse a la masa ya sea directamente a una masa ya mezclada o
como componente de uno o más componentes de la masa.
La expresión "cantidad eficaz" en la
presente memoria significa una cantidad de la enzima añadida que es
suficiente para efectuar, en las condiciones de la masa o en las
condiciones de descrudecimiento, la hidrólisis detectable de uno o
más glucolípidos y de uno o más fosfolípidos presentes en la masa,
mientras que la enzima añadida no afecte, o no afecte
significativamente, a las concentraciones de triglicérido y/o
1-monoglicérido. Más específicamente, la expresión
puede referirse a una cantidad de la enzima añadida que no produzca
únicamente hidrólisis detectable de un glucolípido y fosfolípido,
mientras que no afecte de manera sustancial a la concentración de
triglicéridos y/o 1-monoglicéridos, pero que,
además, produzca la formación de productos enzimáticos finales por
hidrólisis de glucolípidos y fosfolípidos, o la falta de formación
de productos enzimáticos finales mediante ninguna, o
sustancialmente ninguna, actividad sobre los triglicéridos y/o
1-monoglicéridos en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5, a un nivel que produzca propiedades mejoradas de la
masa o si la masa se hornea, una calidad mejorada del producto de
panadería, tal como el aumento de volumen del pan, aumento de
suavidad o mejora de la estructura de la miga o la eliminación de
lípidos polares del aceite comestible.
De manera ventajosa, por lo menos uno de entre
el triglicérido, el 1-monoglicérido, el glucolípido
y el fosfolípido en la masa es un componente lípido natural que
aparece en la harina utilizada para la masa.
Propiamente, el fosfolípido es fosfatidilcolina
(PC) y/o el glucolípido es digalactosildiglicérido (DGDG).
Cuando se da el caso que se añade un lípido
polar, propiamente el lípido polar puede ser un fosfolípido, tal
como uno o más seleccionados del grupo constituido por
fosfatidilinositol (PI), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilcolina
(PC) y fosfatidiletanolamina (PE).
Preferentemente, la masa es una masa fermentada
por levadura. Aunque, se prefiere utilizar el procedimiento de la
presente invención para la preparación de productos de pan
fermentados con levadura tales como barras de pan, panecillo o pan
tostado, se contempla asimismo la utilización del procedimiento para
cualquier otro tipo de masa y de productos a base de masa tales
como fideos y productos de pasta y pasteles, la calidad de los
cuales puede mejorarse mediante la adición de la enzima según la
presente invención.
Preferentemente, la enzima se añade en una
cantidad que está comprendida en el intervalo entre 0,1 y 1.000
unidades de enzima/kg de harina. Más preferentemente, la enzima se
añade en una cantidad que está comprendida en el intervalo entre 1
y 100 unidades de enzima/kg de harina.
Preferentemente, cuando la masa es una masa de
pan, el procedimiento comprende como una etapa adicional que la
masa esté horneada para obtener un producto de panadería. Una
propiedad particularmente deseada de los productos de pan horneados
es un volumen muy específico como el definido en los ejemplos. Por
consiguiente, la adición de la enzima de la invención produce
preferentemente un aumento del volumen específico del producto de
panadería que es por lo menos el 10%, con respecto a un producto de
panadería preparado en condiciones idénticas excepto que no se
añade la enzima. Más preferentemente, el aumento del volumen
específico es por lo menos del 20% tal como por lo menos el 30%, p.
ej., por lo menos el 40%. Alternativamente, la masa es una masa
seleccionada de entre el grupo constituido por masa para pasta, masa
para tallarines y una masa para pastel o mezcla para
panificación.
Preferentemente, la enzima se añade en una
cantidad que produzca un aumento del volumen específico del producto
de panadería que es por lo menos del 10%, con respecto a un
producto de panadería preparado en condiciones idénticas excepto
que no se añade la enzima.
La adición de la enzima de la invención produce
preferentemente un aumento en el índice de gluten en la masa de por
lo menos el 5%, con respecto a una masa sin adición de la enzima,
determinándose el índice de gluten mediante un aparato Glutomatic
2200.
El índice de gluten puede medirse mediante un
Glutomatic 2200 de Perten Instruments (Suecia) utilizando el
procedimiento detallado a continuación: inmediatamente después de la
impermeabilización, 15 g de masa deben pesarse y colocarse en el
Glutamatic 2200 y lavarse con 500 ml de solución de NaCl al 2%
durante 10 min. La masa lavada debe transferirse a continuación a
Gluten Index Centrifuge 2015 y las dos fracciones de gluten deben
pesarse y el índice de gluten calcularse según la siguiente
ecuación:
\text{Índice
de gluten} = (peso\ del\ gluten\ que\ queda\ en\ el\ tamiz\ \times
100)/peso\ total\ de\
gluten.
Se ha descubierto que la enzima de la invención
puede ser particularmente activa contra determinados glucolípidos
tales como por ejemplo galactolípidos incluyendo el
digalactodiglicérido (DGDG) que se transforma en
digalactomonoglicérido (DGMG) que es un tensioactivo eficaz.
Preferentemente, por lo menos el 25% de glucolípido inicialmente
presente en la masa se hidroliza y preferentemente por lo menos el
35% del glucolípido está hidrolizado, más preferentemente por lo
menos el 50%, por lo menos el 60% o por lo menos el 75% del
mismo.
Alternativamente o además de esto, se ha
descubierto que la enzima de la invención puede ser activa frente a
determinados fosfolípidos que se transforman en lisofosfolípidos.
Preferentemente, por lo menos el 25% de fosfolípido inicialmente
presente en la masa se hidroliza y preferentemente por lo menos el
35% del fosfolípido está hidrolizado, más preferentemente por lo
menos el 50%, por lo menos el 60% o por lo menos el 75% del
mismo.
La actividad de una lipasa sobre el triglicérido
puede depender del pH del sustrato. La enzima presenta actividad
hidrolítica frente a un fosfolípido y un glucolípido pero no
actividad hidrolítica frente a un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5.
Preferentemente, la enzima tal como se define en
la presente memoria es incapaz de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido.
Preferentemente, la enzima es incapaz de
hidrolizar tanto un triglicérido como un
1-monoglicérido. Preferentemente la enzima es
incapaz de hidrolizar tanto un triglicérido como un
1-monoglicérido. Alternativamente, la enzima puede
ser capaz de hidrolizar un triglicérido y un diglicérido, pero es
incapaz, o sustancialmente incapaz, de hidrolizar un
1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido
entre 4,5 y 6,5. Propiamente, la enzima es incapaz de hidrolizar un
1-monoglicérido.
Es conocido en la técnica que otras enzimas
aparte de las lipasas pueden contribuir a mejorar las propiedades
de la masa y la calidad de los productos de panadería. Dentro del
alcance de la invención está comprendido que, además de la enzima
de la invención, pueda añadirse a la masa por lo menos otra enzima o
pueda estar presente en la composición para la mejora de la masa.
Dichas otras enzimas incluyen las enzimas que degradan el almidón
tales como las endo- o exoamilasas, pululanasas, enzimas que
degradan el almidón, enzimas desramificadoras, hemicelulasas
incluyendo xilanasas, celulasas, lipoxigenasas y oxidorreductasas,
p. ej. glucosa oxidasa, fosfolipasas y hexosa oxidasa.
Preferentemente, el componente adicional de la
masa en la composición, cuando está presente, se selecciona de
entre el grupo constituido por harina de cereales, levadura, un
agente de fermentación químico, un agente para consistencia de la
masa, un emulsionante, un azúcar, un acilglicerol, un fosfolípido,
un glucolípido y una sal.
Propiamente, la masa puede ser una masa
reciente, opcionalmente envasada en una atmósfera controlada, la
masa puede estar congelada.
Propiamente, una o más enzimas según la presente
invención pueden añadirse a la masa y/o estar presentes en la
composición que mejora la masa y/o añadirse al aceite comestible.
Propiamente, dos o más, tres o más o cuatro o más, enzimas según la
presente invención pueden añadirse a la masa y/o estar presentes en
la composición que mejora la masa y/o añadirse al aceite
comestible.
Preferentemente, el procedimiento de selección
de enzimas según la presente invención puede comprender la
identificación de la actividad de las enzimas en placas con
agar-agar conteniendo cada una galactolípidos,
fosfolípidos, triglicéridos o 1-monoglicéridos como
sustrato. Se seleccionan las enzimas que son activas para con los
fosfolípidos y glucolípidos pero que no presentan ninguna, o
sustancialmente ninguna, actividad para con triglicéridos y/o
1-monoglicéridos.
Propiamente, la etapa (a) y/o (b) del
procedimiento de selección de una enzima según la presente invención
se realiza a un pH entre 4,5 y 6,5.
Preferentemente, la enzima probada por el
procedimiento que consiste en seleccionar una enzima según la
presente invención es una lipasa (E.C. 3.1.1.3) o una acil
hidrolasa lipídica (E.C. 3.1.1.26).
Preferentemente, en el procedimiento de
preparación o desarrollo de una enzima según la presente invención
la inserción, deleción o sustitución de por lo menos un aminoácido
está en la región externa y/o cerca del sitio activo y/o en el
terminal C de la secuencia de aminoácidos.
Preferentemente, se elimina la región
externa.
Pueden prepararse enzimas adecuadas modificando
las lipasas (E.C. 3.1.1.3) y las acil hidrolasas lipolíticas (E.C.
3.1.1.26) para producir enzimas que son activas para con los
fosfolípidos y glucolípidos pero que no presentan ninguna actividad
para con los triglicéridos y/o 1-monoglicéridos en
el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5.
Las sustituciones de aminoácidos adecuados
incluyen las sustituciones de aminoácidos en el sitio activo o
cerca del mismo que cambian las propiedades hidrófilas en torno al
sitio activo. A título de ejemplo únicamente, las sustituciones de
aminoácidos pueden aumentar el número de aminoácidos polares en el
sitio activo o cerca del mismo.
Preferentemente, se prepara una enzima según la
presente invención, la cual es capaz de hidrolizar un glucolípido y
un fosfolípido y en la que dicha enzima es incapaz, o
sustancialmente incapaz, de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el intervalo de pH entre 4,5 y
6,5.
Propiamente, la enzima según la presente
invención puede presentar una actividad mayor hacia los glucolípidos
en comparación con los fosfolípidos. Propiamente, la relación del %
de hidrólisis de los glucolípidos iniciales (es decir DGDG) en la
masa: el % de hidrólisis de los fosfolípidos iniciales (es decir,
fosfatidilcolina) en la masa debe ser superior a 10:1, por ejemplo,
superior a 15:1, superior a 20:1, superior a 30:1 o superior a
40:1.
Alternativamente, la enzima según la presente
invención puede presentar una actividad mayor hacia los fosfolípidos
en comparación con los glucolípidos. Por ejemplo, la relación del %
de hidrólisis de los glucolípidos iniciales (es decir DGDG) en la
masa: el % de hidrólisis de los fosfolípidos iniciales (es decir,
fosfatidilcolina) en la masa debe ser superior a 1:3, tal como,
superior a 1:5, superior a 1:8, superior a 1:10 o superior a 1:15,
por ejemplo.
La mayoría de las harinas de cereales contienen
lípidos no polares que incluyen triglicéridos y lípidos polares que
incluyen fosfolípidos y glucolípidos. Los lípidos polares pueden
servir como sustratos para la enzima de la invención. Por lo tanto,
en una forma de realización del procedimiento, por lo menos uno de
los glucolípidos, tal como un galactolípido, incluyendo el
digalactosildiglicérido (DGDG) y uno de los fosfolípidos, tal como
fosfatidilcolina (PC), es un componente lipídico natural (o
endógeno) que aparece en la harina utilizada para la masa.
Sin embargo, la masa de harina puede no contener
suficientes cantidades de estos sustratos lipídicos para la enzima
de la invención. Por lo tanto está comprendida en el alcance de la
invención para enriquecer la masa con por lo menos un glucolípido y
un fosfolípido que proporcione suficientes sustratos para la enzima.
Se apreciará que la expresión "suficiente sustrato" implica
que ninguno de estos sustratos lipídicos sea limitativo para
obtener una masa o un producto de panadería que mejore el efecto
descrito anteriormente.
Además o alternativamente a esto, puede añadirse
un lípido no polar complementario tal como un acilglicerol. Según
la invención puede utilizarse una variedad de dichos lípidos tales
como p. ej. aceites vegetales, grasas vegetales, aceites animales,
grasas animales, tales como por ejemplo mantequilla y manteca. En
relación con esto, un lípido especialmente útil es un aceite o un
derivado de grasa de cereales tales como aceite de avena. El aceite
de avena contiene típicamente, además de triglicéridos, 5 a 25% de
fosfolípidos y 5 a 12% de glucolípidos. El aceite de avena puede
fraccionarse para proporcionar fracciones con un gran contenido de
lípidos polares (E. G. Hammond en Lipid in Cereal Technology
editado por P. J. Barnes, Academic Press).
Por tanto un aspecto del procedimiento de la
invención consiste en que uno o más fosfolípidos pueden añadirse a
la masa. En relación con esto, los fosfolípidos útiles incluyen
fosfatilinositol (PI), fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilcolina
(PC), lecitina y fosfatidiletanolamina (PE).
Por lo menos uno de entre el triglicérido, el
1-monoglicérido, el glucolípido y el fosfolípido
pueden añadirse a la masa.
Sorprendentemente, se ha descubierto que la
adición de una cantidad eficaz de una enzima capaz de hidrolizar un
glucolípido y un fosfolípido, en el que dicha enzima es incapaz de
hidrolizar un triglicérido y/o un 1-monoglicérido
en el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5 junto con un
glucolípido, en particular digalactosildiglicérido (DGDG), produce
un volumen del pan y/o una estructura de la miga mejorados. Las
mejoras observadas con la enzima más el glucolípido son aún mayores
que las mejoras observadas con la enzima sola. Por tanto,
propiamente, una enzima con las propiedades específicas definidas
en la presente memoria puede utilizarse en combinación con un
glucolípido.
Los aceites comestibles, tales como los aceites
vegetales, por ejemplo aceite de soja o aceite de colza, comprenden
típicamente triglicéridos con un contenido inferior de lípidos
polares, tales como fosfolípidos y glucolípidos. Se desea con
frecuencia eliminar los lípidos polares del aceite vegetal con el
fin de proporcionar un producto de aceite transparente, de gran
calidad. El procedimiento para eliminar los lípidos polares se
denomina con frecuencia descrudecimiento. Por tanto, según el
decimoquinto aspecto de la presente invención el aceite comestible,
por ejemplo un aceite vegetal, puede descrudecerse utilizando una
enzima según la presente invención. El descrudecimiento es la
primera etapa del proceso de refino del aceite comestible que
elimina los lípidos polares, tales como fosfolípidos, procedentes
del aceite en bruto. Normalmente el descrudecimiento se realiza
mediante agua o un proceso en húmedo. Por ejemplo, los fosfolípidos
se transforman en liso-fosfolípidos solubles en agua
mediante una hidrólisis enzimática catalizada, los
liso-fosfolípidos solubles en agua se separan a
continuación del aceite por centrifugación. El contenido en fósforo
residual en el aceite descrudecimiento enzimático puede ser tan
bajo como 2 ppm de fósforo.
Preferentemente, el aceite comestible según los
aspectos decimocuarto y decimoquinto de la presente invención es un
aceite vegetal.
Una ventaja de la presente invención consiste en
que la enzima de la presente invención, que es activa frente a
glucolípidos y fosfolípidos, pero que es incapaz de hidrolizar
triglicéridos y/o 1-monoglicéridos en el intervalo
de pH comprendido entre 4,5 y 6,5, cuando se utiliza en una masa,
produce ácidos grasos poliinsaturados, debido a que los
glucolípidos y fosfolípidos de trigo endógenos contienen grandes
cantidades (>70%) de ácido linoleico (C18:2) y ácido linolénico
(C18:3). Estos ácidos grasos son sustratos para la lipoxigenasa y
contribuyen a aumentar la consistencia del gluten y una miga más
blanca.
Una ventaja adicional o alternativa de la
presente invención consiste en que los lípidos polares endógenos
pueden modificarse sin producción de ácidos grasos en exceso. Por
tanto, se evita que la masa se vuelva demasiado dura y/o el volumen
de pan resultante pueda aumentar y/o la producción de harinas en mal
estado pueda reducirse y/o los efectos negativos sobre la actividad
de la levadura puedan aliviarse o superarse. Una ventaja adicional
o alternativa todavía de la presente invención consiste en que la
manteca, el aceite o la grasa de la leche añadida a la masa no se
hidroliza.
Las enzimas que presentan las propiedades
definidas en la presente memoria pueden proceder de una variedad de
fuentes que incluye plantas, animales y microorganismos tales como
especies bacterianas y de hongos incluyendo especies de levaduras.
La enzima de la invención puede proceder de un organismo que produce
de forma natural la enzima o puede producirse de manera
recombinante transformando una célula hospedadora apropiada con un
gen que codifica la enzima. La enzima puede ser una enzima que
comprenda en sí misma zonas activas para todas las actividades
enzimáticas, pero también es posible construir enzimas híbridas con
actividades enzimáticas tal como se define en la presente memoria
por síntesis o utilizando tecnología de ADN recombinante.
Alternativamente, una enzima que no tenga,
inicialmente por lo menos, las propiedades específicas definidas en
la presente memoria puede modificarse, por ejemplo alterando la
secuencia de aminoácidos de la misma, para proporcionar una enzima
con las propiedades definidas en la presente memoria y con la
especificidad del sustrato deseada. Es conocido en la técnica el
modificar enzimas por mutagénesis al azar (US nº 4.814.331, WO
93/91285 y WO 95/22615) y el modificar enzimas lipolíticas por
mutagénesis específica al punto (patente WO 97/04079) para obtener
mejor rendimiento de la misma. El concepto generalmente utilizado ha
sido insertar, eliminar o sustituir los aminoácidos en la parte
estructural de la cadena de aminoácidos de una enzima lipolítica en
cuestión. Una enzima adecuada para la modificación es aquella que
puede hidrolizar enlaces éster. Dichas enzimas incluyen, por
ejemplo, lipasas, tales como triacilglicerol lipasa (E.C. 3.1.1.3),
lipoproteína lipasa (E.C. 3.1.1.34), monoglicérido lipasa (E.C.
3.1.1.23), lisofosfolipasa, ácido ferúlico esterasa y esterasa (E.C.
3.1.1.1, E.C. 3.1.1.2) y acil hidrolasas lipolíticas (E.C.
3.1.1.26) y fosfatidilinositol desacilasa (E.C. 3.1.1.52).
Las enzimas adecuadas para modificación pueden
proceder de una variedad de fuentes incluyendo plantas, animales y
microorganismos, tales como especies bacterianas y micóticas
incluyendo especies de levadura. Ejemplos de enzimas adecuadas para
modificación son las Pseudomonas lipasas, por ejemplo de
P. cepacia (patente US nº 5.290.694), P. glumae
(Frenken N. et al. (1992) Appl. Envir. Microbiol. 58
3787-3791), P. pseudoalcaligenes (EP 0 334
462) o Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720, EP 0 721
981, WO 96/27002, EP 0 812 910). Alternativamente, las enzimas
adecuadas para la modificación pueden ser por ejemplo enzimas
lipolíticas micóticas, tales como las enzimas lipolíticas de la
familia Humicola y de la familia Zygomycetes y
cutinasas micóticas. La familia Humicola de las enzimas
lipolíticas está constituida por la lipasa de la cepa DSM 4109 de
H. lanuginosa y lipasas con más del 50% de homología con esta
lipasa. La lipasa de H. lanuginosa (sinónimo de
Thermomyces lanuginosus) se describe en las patentes EP 0 258
068 y EP 0 305 216, y tiene la secuencia de aminoácidos mostrada en
las posiciones 1 a 269 de la SEC. ID nº: 2 de la patente US nº
5.869.438.
Withers-Martinez et al.
(Structure 1996, 4:1363-1374) estudiaron una
proteína 2 relacionada con la lipasa pancreática de cobaya (GPLRP2)
que tiene actividad sobre galactolípidos y fosfolípidos de actividad
reducida sobre triglicéridos. La estructura cristalina de esta
enzima se presenta y se compara con la lipasa pancreática humana
(HPL) con actividad únicamente sobre triglicéridos y un mutante
híbrido de la proteína 2 relacionada con lipasa (GPLRP2)
constituido por el dominio catalítico de GPLRP2 y el dominio
C-terminal de HPL (GPLRP2/HPL). El mutante
GPLRP2/HPL tiene actividad contra fosfolípidos y galactolípidos,
pero con actividad reducida adicional sobre triglicéridos en
comparación con la enzima GPLRP2. Asimismo se analizó el veneno
(PLA1) del avispón para comparación.
Withers-Martinez et al. (Structure 15
de nov. de 1996; 4(11): 1363-74) estudiaron
los bucles situados por encima del sitio activo de la proteína 2
relacionada con la lipasa pancreática de cobaya, la lipasa
pancreática humana y una fosfolipasa A1 del veneno del avispón y
encontraron una relación entre la configuración del bucle y la
actividad para el triglicérido y los fosfolípidos.
En GPLRP2 el dominio externo está reducido de
tamaño en comparación con HPL, y solamente se conserva el bucle
\beta 9 y por consiguiente se observa una superficie hidrófoba
menor alrededor del sitio activo. Esto puede explicar la actividad
reducida sobre el triglicérido de GPLRP2 y GPLRP2/HPL en comparación
con HPL.
Únicamente a título de ejemplo, una variante de
lipasa sin actividad sobre monoglicéridos puede obtenerse por
sustitución de los aminoácidos específicos en el punto catalítico o
alrededor del mismo de una lipasa. Por ejemplo, la lipasa de
Aspergillus tubingensis que presenta la secuencia de
aminoácidos mostrada en la SEC. ID nº: 3 y como se da a conocer en
la publicación de la patente europea nº 0 977 869, y que está
codificada por la secuencia nucleotídica mostrada en la SEC. ID nº:
4, puede alterarse al proporcionar dicha variante de lipasa para la
utilización según la presente invención.
La triada catalítica de SEC. ID nº: 3 es serina
173 (Ser173), ácido aspártico 228 (Asp228) e histidina 285
(His285). Propiamente, uno o más de estos aminoácidos de la triada
catalítica puede sustituirse para cambiar las propiedades
hidrófilas de la triada catalítica.
Uno o más de los siguientes aminoácidos en el
punto catalítico de la SEC. ID nº: 3 o alrededor del mismo puede
sustituirse para cambiar las propiedades hidrófilas en torno al
sitio activo: Phe107 - Phe123; Gly171 - Gly175; Tyr198 - Ile203;
Thr224 - Gly239; Ser270 - Leu297.
Por ejemplo, el procedimiento para mutar una
lipasa "precursora" para proporcionar una variante de lipasa
con actividad del sustrato alterada según la presente invención
puede incluir las etapas siguientes.
Un vector, por ejemplo pYEL, puede construirse
sustituyendo el activador inducible, Gall_{p}, con el
activador constitutivo, ADH_{p}, y un gen de lipasa (por
ejemplo el gen de lipasa de Aspergillus tubigensis como se
da a conocer en la patente EP 0 977 869) puede incorporarse por
recombinación in vivo en S. cerevisiae. La Figura 11
presenta dicho vector de expresión derivado de pYES2.
A continuación pueden crearse bancos de
mutagénesis al azar, utilizando, por ejemplo, dos procedimientos de
EP-PCR; kit de mutagénesis para PCR GeneMorph^{TM}
y kit para mutagénesis al azar por PCR Diversify^{TM}, referidos
a continuación como Genemorph y Diversify, respectivamente.
La frecuencia de la mutación puede utilizarse
para obtener 1 a 2 sustituciones de aminoácidos por gen de lipasa,
por ejemplo por el gen LipA. La optimización de la frecuencia
de la mutación puede realizarse variando las cantidades iniciales
de la plantilla de ADN (\sim0,65-40 ng) en el
procedimiento Genemorph de EP-PCR y variando las
concentraciones de MnSO_{4} (0-640 \muM) y dGTP
(40-120 \muM) en el procedimiento de
EP-PCR con Diversify. Los procedimientos de
EP-PCR optimizados pueden contener: 0,65 ng de
plantilla de ADN, 2,5 U de Mutazyme ADN polimerasa, 125 ng de cada
cebador, 1\timestampón de reacción Mutazyme y mezcla de dNTP 200
\muM en el procedimiento de EP-PCR con Genemorph.
En el procedimiento de EP-PCR con Diversify se
aplicaron 1 ng de plantilla de ADN, 2 U de Titanium^{TM}
Taq ADN polimerasa, 10 \muM de cada cebador, MgCl_{2}
3,5 mM, MnSO_{4} 480 \muM, mezcla de dNTP 200 \muM y dGTP 40
\muM. Ambos procedimientos de EP-PCR se
ejecutaron en un volumen total de 50 \mul.
Los cebadores diseñados para ambos
procedimientos EP-PCR se presentan en la tabla
siguiente. El cebador JOM1 introduce además tres A (subrayados)
corriente arriba del codón de iniciación.
La EP-PCR puede realizarse
utilizando un ciclador térmico programable en las siguientes
condiciones; kit para mutagénesis por PCR GeneMorph^{TM}: 94ºC
durante 30 segundos, seguido de 30 ciclos de 94ºC durante 30
segundos, 55ºC durante 30 segundos y 72ºC durante 2 minutos. Por
último se aplicó una prolongación adicional de 10 minutos a 72ºC.
Kit para mutagénesis al azar por PCR Diversify^{TM}: 94ºC durante
30 segundos, seguido de 25 ciclos de 94ºC durante 30 segundos y
68ºC durante 1 minuto.
Pueden prepararse células transformadas y
competentes mediante una modificación del procedimiento de
transformación descrito en el protocolo pYES2 (nº de catálogo
V825-20, Invitrogen, CA, USA), por ejemplo. Una
única colonia de CEN.PK113-5D de Saccharomyces
cerevisiae puede inocularse en 20 ml de YPD y se cultiva durante
la noche a 30ºC en agitación a 200 RPM. El cultivo de la noche
puede diluirse con YPD hasta una D.O_{600} entre 0,2 y 0,3 e
incubarse durante tres horas más a 30ºC y 200 RPM. Las células
pueden recogerse por centrifugación a 4.750 g y 20ºC durante
5 minutos. El sedimento puede lavarse por resuspensión en 1 ml de
1\timesTrisEDTA (1\timesTE), pH 8,0 y centrifugarse durante 5
minutos a 10.000 g. Las células resultan competentes
añadiendo 0,5 ml de 1\timesTE de acetato de litio 100 mM, pH
7,5.
La transformación puede realizarse mezclando
suavemente 100 \mug de ADN con 50 \mul de células competentes
de Saccharomyces cerevisiae, 5 \mul de Yeastmaker Carrier
DNA y 300 \mul de acetato de litio 100 mM, 40% de
polietilenglicol 3350 y 1\timesTE. La mezcla puede incubarse a
30ºC en agitación a 1.000 RPM durante 30 minutos seguido de
incubación a 42ºC durante 15 minutos. Después las células pueden
transferirse a hielo y a continuación sedimentarse a 11.300
g durante 5 segundos. El sedimento puede ponerse en
suspensión en 1 ml de YPD e incubarse durante 45 minutos a 30ºC y
200 RPM. Un volumen de suspensión de 150 \mul se transfirió a
placas que contenían SC-ura y se incubó durante 3
días a 30ºC. La transformación en células competentes de
Saccharomyces cerevisiae se continuó utilizando con fines de
clonación utilizando la recombinación in vivo, en la que 100
ng de la lipasa (por ejemplo LipA) o variantes de la misma
pueden cotransfectarse con 50 ng de pYEA linealizada con BamHI.
El ADN plásmido de Escherichia coli puede
aislarse por lisis alcalina utilizando el kit de aislamiento del
plásmido muy puro.
El ADN plásmido de Saccharomyces
cerevisiae puede aislarse de la forma siguiente: las células
pueden sedimentarse por centrifugación a 1.100 g durante 15
minutos y volverse a poner en suspensión en 1 ml de STET y 1,5 ml
de perlas de vidrio (425 a 600 micras). Además se añadió un volumen
de 1 ml de STET y la mezcla se incubó a 100ºC durante 5 minutos. La
solución puede centrifugarse a continuación durante 15 minutos a
6.500 g y el sobrenadante puede transfectarse en un tubo
eppendorf, que se centrifugó durante 15 minutos más a 27.000
g. El ADN puede extraerse y purificarse del sobrenadante
utilizando Qiagen-tip 20 del kit de purificación
Plasmid
Mini.
Mini.
Las variantes de lipasa (p. ej. LipA)
pueden secuenciarse según el procedimiento terminador de la cadena
didesoxi [Sanger et al., 1977]. El ADN plásmido para
secuenciado puede prepararse utilizando una modificación del kit de
purificación Plamid Mini. De esta forma puede realizarse una lisis
alcalina estándar en lugar de utilizar Qiagen-tip
20 a. Cuando se utilizó ADN ampliado por PCR para el secuenciado, se
aisló ADN por el sistema de purificación de ADN Wizard® PCR
Preps.
La reacción de secuenciado puede realizarse
utilizando el kit de secuenciado de ciclo ABI Prism® BigDye^{TM}
Terminators v3.0 (Danisco Biotechnology) o el kit ABI Prism^{TM}
dRhodamine Terminador Cycle Sequencing Ready Reaction (AAU) con
plantilla de ADN y concentraciones de cebador de 500 ng y 3,2
pmoles, respectivamente. Las reacciones de secuenciado pueden
realizarse utilizando un ciclador térmico programable en las
siguientes condiciones: 25 ciclos de 96ºC durante 30 segundos, 50ºC
durante 15 segundos y 60ºC durante 4 minutos. La purificación de
los productos de PCR puede realizarse mediante precipitación con
etanol y el sedimento puede volverse a poner en suspensión en 12
\mul de HIDI formamida (Danisco Biotechnology) o 12 \mul de
reactivo para supresión de la plantilla (AAU) y puede transferirse
a un tubo de muestra del analizador genético con tabiques. Las
muestras pueden introducirse en un analizador genético ABI Prism®
3100 (Danisco Biotechnology) o un analizador genético ABI Prism®
310 (AAU). Los cebadores adecuados para secuenciar una variante
LipA se presentan en la tabla a continuación. Estos
cebadores se hibridan internamente en Lip A.
Las variantes que presentan actividad de DGDG y
de fosfolipasa, pero no actividad de triglicéridos pueden
identificarse utilizando, por ejemplo, un tamiz plano de alto
rendimiento preliminar seguido de un tamiz cuantitativo, en el que
el incremento está verificado y cuantificado.
Una colonia aislada de variantes seleccionadas
puede inocularse en 50 ml de medio SC-ura e
incubarse a 30ºC y 250 rpm durante dos días, tras los cuales puede
transferirse 25 ml a 500 ml de medio YPD e incubarse durante dos
días más a 30ºC y 200 rpm. La lipasa producida puede separarse del
cultivo por centrifugación durante 15 min. El sobrenadante puede
almacenarse a -18ºC hasta su utilización posterior.
Un volumen de 250 ml de sobrenadante puede
equilibrarse con (NH_{4})_{2}SO_{4} para obtener una
concentración final de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,0 M. La
suspensión se inyectó en una columna SOURCE15PHE que contenía
ligandos hidrófobos de fenilo acoplados a una matriz de
poliestireno/divinilbenceno rígida monodispersada de 15 \mum. La
columna puede rellenarse hasta un volumen de lecho final de 5,1 ml.
La elución puede realizarse con tampón NaAc 20 mM pH 5,5 y un
gradiente decreciente lineal de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1,0
M - 0 M a una caudal de 5 ml/min durante 20 min.
La identificación de las fracciones que
contienen lipasa (por ejemplo lipasa 3) y variantes de la misma
según la presente invención puede realizarse aplicando 15 \mul de
cada fracción en los pocillos en una placa que contiene sustratos
adecuados para identificar la actividad de fosfolipasa, la actividad
de galactolipasa y la hidrólisis de triglicéridos.
Las fracciones seleccionadas pueden desalarse
utilizando columnas PD-10 de desalado que contienen
una matriz de Sephadex G-25 rellena hasta un
volumen de lecho final de 8,3 ml. La columna puede preequilibrarse
con tampón TEA 20 mM pH 7,3, tras lo cual se aplicó un volumen de
muestra de 2,5 ml. La elución puede realizarse aplicando 3,5 ml de
tampón TEA 20 mM pH 7,3.
Las fracciones seleccionadas pueden inyectarse
en una columna SOURCE15Q que contiene ligandos de amonio cuaternario
acoplados a una matriz de poliestireno/divinilbenceno rígida
monodispersada de 15 \mum. La columna puede rellenarse hasta un
volumen de lecho final de 5,1 ml. La elución puede realizarse con
tampón TEA 20 mM pH 7,3 y un gradiente creciente lineal de NaCl 0 M
- 1,0 M a un caudal de 2 ml/min durante 20 min.
Las proteínas pueden separarse por tamaño
mediante SDS-PAGE utilizando 1\timestampón de
serie, un gel de separación al 12% y un gel de acilamiento al 4%
preparados según Laemmli (1970).
Cantidades equivalentes de muestra y de tampón
de muestra SDS, que contienen 2-mercaptoetanol,
pueden incubarse a 95ºC durante 5 min. Como patrón se empleó un
marcador de bajo peso molecular que contenía 0,64 \mug de
fosforilasa b, 0,83 \mug de albúmina de suero bovino, 1,47 \mug
de ovoalbúmina, 0,83 \mug de anhidrasa carbónica, 0,88 \mug de
inhibidor tripsina de soja y 1,21 \mug de
\alpha-lactoalbúmina. Las bandas de proteína se
observaron utilizando tinción Coommasie® G250.
Para PAGE natural: las proteínas pueden
separarse según su movilidad por PAGE natural, en la que no se
aplicó SDS.
Las lipasas solamente con actividad frente a
galactolípidos y fosfolípidos no se han utilizado anteriormente
para soporte. Estos tipos de lipasas se mencionan raras veces en la
bibliografía. Sin embargo, Matos A. R. et al. (FEBS
Lett 2 de marzo de 2001; 491(3): 188-92)
aisló una proteína de 43 kDa de la judía de vaca estresada por la
sequía que se expresó en un sistema de baculovirus. Esta enzima
presentaba preferentemente actividad de galactolípido acil
hidrolasa y alguna actividad de fosfolípido pero ninguna actividad
sobre triacilglicerol (triglicérido). La secuencia de aminoácidos
de esta enzima se presenta en la SEC. ID. nº: 1 y la secuencia de
nucleótidos que codifica esta enzima se presenta en la SEC. ID. nº:
2. Estos tipos de enzimas son diferentes de las lipasas normales
(EC. 3.1.1.3) y la expresión acil hidrolasa lipolítica (LAH) (E.C.
3.1.1.26) se aplica habitualmente a estas enzimas, las cuales se
han descrito solamente en el reino vegetal. La galactolípido acil
hidrolasa descrita en Matos et al. es adecuada para su
utilización según la presente invención.
La enzima según la presente invención puede ser
lipasa (E.C. 3.1.1.3) o una acil hidrolasa lipolítica (E.C.
3.1.1.26), siempre que posea las propiedades especificadas.
Sahsah et al. (Biochem Biophys
Acta 17 nov.
1994;1215(1-2):66-73)
aislaron una acil hidrolasa lipolítica a partir del extracto
soluble de la hoja de la judía de vaca. La actividad hidrolítica de
esta enzima en diferentes sustratos presentó la actividad relativa
siguiente
digalactosildiglicérido>monogalactosildiglicérido>fosfatidilcolina>fosfatidilglicerol.
La enzima no presentó ninguna actividad sobre triacilglicerol
(triglicérido). La enzima dada a conocer en Sahsah et al. es
adecuada para su utilización según la presente invención.
O'Sullivan et al. (J. Plant
Physiol. vol. 131, págs. 393-404 1987) da a
conocer una galactolipasa unida a la membrana asociada con
tilacoides de las hojas del trigo.
Como ilustran anteriormente los ejemplos, las
lipasas o las acil hidrolasas lipolíticas con actividad sobre
fosfolípidos y galactolípidos solos, aunque aparentemente poco
frecuentes, existen en la naturaleza y pueden utilizarse según la
presente invención. Además o alternativamente existen otros medios
de preparación de una lipasa con actividad frente a fosfolípidos y
galactolípidos pero sin actividad frente a triglicéridos y/o
1-monoglicéridos.
Como se mencionó anteriormente,
Withers-Martinez (Structure 1996,
4:1363-1374) demostraron que una proteína 2
relacionada con la lipasa de cobaya (GPLRP 2) tenía actividad sobre
fosfolípidos y galactolípidos y reducía la actividad sobre el
triglicérido. Se indica también que la hidrofilia en torno a la zona
activa puede controlar la actividad en el triglicérido. Esto abre
la posibilidad de sustituciones de aminoácidos en la zona activa o
cerca de ella que reduciría más la actividad de triglicérido
cambiando las propiedades hidrofílicas alrededor de la zona
activa.
Es bien sabido que la actividad de las lipasas
puede alterarse cambiando los aminoácidos específicos en la enzima.
Cordle et al. (J. Lipid Res. septiembre de 1998 39
(9): 1759-67) sustituyó la tirosina con el ácido
aspártico más polar y obtuvo una actividad reducida en los ácidos
grasos de cadena larga.
Carriere et al. (Biochemistry 7
ene 1997 36(1): 239-48) eliminó el final de
una lipasa pancreática humana con el fin de eliminar la activación
interfacial y descubrió que su actividad específica para con los
triglicéridos se reducía drásticamente. Este artículo también
informa que el terminal C de una lipasa pancreática humana es
importante para la estabilidad interfacial.
Una lipasa preferida para soporte con actividad
sobre fosfolípidos y galactolípidos pero sin actividad sobre
triglicéridos puede obtenerse también modificando el pH óptimo de
actividad de triglicérido. En condiciones normales el pH en una
mezcla está comprendido en el intervalo entre 4,5 y 6,5. Ching T.
Hou (Journal of Industrial Microbiology, 13 (1994)
242-248) identificó numerosas lipasas diferentes y
descubrió numerosas lipasas con actividad de triglicérido a pH 7,5
pero sin actividad a pH 5,5.
Seleccionando una lipasa sin actividad es decir
a pH 5,5 y modificando el área en torno a la zona activa mediante
mutagénesis al azar dirigida a la zona o localizada para alterar las
propiedades hidrófilas de la superficie alrededor de la zona activa
y modificando la cubierta mediante mutagénesis al azar dirigida a la
zona o localizada, es posible obtener una lipasa con afinidad sobre
fosfolípidos y galactolípidos y siendo la actividad sobre el
triglicérido restante activa a pH 7,5 o superior, pero sin actividad
a pH 6,5 o inferior, tal como a pH 5,5.
Las lipasas pueden presentar diferentes tipos de
especificidad (informe vol. 8, nº 6 640-650). La
especificidad para graso acilo de una lipasa tendrá un impacto
sobre el tipo de ácido graso producido. Algunas lipasas son muy
específicas para los ácidos grasos insaturados, que en un sistema de
mezcla es preferido, ya que el ácido graso poliinsaturado es un
sustrato para la lipoxigenasa endógena o añadida. Preferentemente,
la enzima según la presente invención hidroliza de forma preferida
los ácidos grasos insaturados. Propiamente, en el procedimiento de
preparación o desarrollo de una enzima según la presente invención,
la inserción, deleción o sustitución altera la especificidad grasa
de acilo de la enzima, de modo que la enzima produce preferentemente
ácidos grasos poliinsaturados en el grupo lípido.
Se presentan ejemplos adecuados de enzimas con
actividad hidrolítica para con un fosfolípido y un glucolípido y
que no presentan, o sustancialmente no presentan, actividad
hidrolítica para con un triglicérido y/o un
1-monoglicérido en el apartado titulado Ejemplos a
continuación.
Una secuencia nucleotídica que codifica una
enzima que tiene propiedades específicas como las definidas en la
presente memoria o una enzima que es adecuada para la modificación
puede aislarse de cualquier célula u organismo que produzca dicha
enzima. Varios procedimientos son bien conocidos en la materia para
el aislamiento de secuencias nucleotídicas.
Por ejemplo, un ADN genómico y/o un banco de
ADNc pueden construirse utilizando ADN cromosómico o ARN mensajero
a partir del organismo que produce la enzima. Si la secuencia de
aminoácidos de la enzima es conocida, pueden sintetizarse sondas de
oligonucleótido marcadas y utilizarse para identificar clones que
codifican enzimas a partir del banco genómico preparado procedente
del organismo. Alternativamente, una sonda de oligonucleótidos
marcada que contiene secuencias homólogas con otro gen de enzima
conocido podría utilizarse para identificar los clones que
codifican la enzima. En este último caso, se utilizan las
condiciones de hibridación y lavado de severidad inferior.
Alternativamente, los clones que codifican
enzimas podrían identificarse insertando fragmentos de ADN genómico
en un vector de expresión, tal como un plásmido, bacterias negativas
para enzimas transformantes con el banco de ADN genómico
resultante, y a continuación colocando en placas las bacterias
transformadas sobre un sustrato que contiene
agar-agar para la enzima (es decir, fosfolípidos o
galactolípidos), permitiendo de este modo que los clones expresen
la enzima que ha de identificarse.
En una alternativa más todavía, la secuencia de
nucleótidos que codifica la enzima puede prepararse por síntesis
mediante los procedimientos normalizados establecidos, p. ej. el
procedimiento de la fosforoamidita descrito por Beucage S. L. et
al. (1981) Tetrahedron Letters 22, pág.
1859-1869, o el procedimiento descrito por Matthes
et al. (1984) EMBO J. 3, pág. 801-805.
En el procedimiento de la fosforoamidita, se sintetizan
oligonucleótidos, p. ej. en un sintetizador de ADN automático, se
purifican, se hibridan, se ligan y se clonan en vectores
apropiados.
La secuencia de nucleótidos puede ser de origen
genómico mixto y sintético, sintético mixto y de origen de ADNc o
genómico mixto y de origen de ADNc, preparada ligando fragmentos de
origen de ADNc sintético o genómico (como proceda) según técnicas
normalizadas. Cada fragmento ligado corresponde a varias partes de
la secuencia nucleotídica completa. La secuencia de ADN puede
prepararse también por reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
utilizando cebadores específicos, por ejemplo como los descritos en
la patente US nº 4.683.202 o en Saiki R. K. et al.
(Science (1988) 239, págs. 487-491).
La presente invención comprende asimismo las
secuencias nucleotídicas que codifican enzimas que presentan las
propiedades específicas definidas en la presente memoria. La
expresión "secuencia nucleotídica" tal como se utiliza en la
presente memoria se refiere a una secuencia de oligonucleótidos o a
una secuencia de polinucleótidos, y sus variantes, homólogos,
fragmentos y derivados (tales como partes de la misma). La secuencia
nucleotídica puede ser de origen genómico, sintético o
recombinante, la cual puede ser bicatenaria o monocatenaria, tanto
represente la cadena transcrita como la complementaria.
La expresión "secuencia nucleotídica" en
relación con la presente invención incluye ADN genómico, ADNc, ADN
sintético y ARN, preferentemente significa ADN, más preferentemente
ADNc para la secuencia de codificación de la presente
invención.
En una forma de realización preferida, la
secuencia de nucleótidos per se que codifica una enzima que
presenta las propiedades específicas definidas en la presente
memoria no comprende la secuencia nucleotídica natural en su medio
natural cuando está ligada a su(s) secuencia(s)
asociada(s) de forma natural que está(n) también en
su(s) medio(s)
natural(es). Para facilitar la referencia, los solicitantes denominarán a esta forma de realización preferida "secuencia nucleotídica no natural". A este respecto, la expresión "secuencia nucleotídica natural" significa una secuencia nucleotídica completa que está en su medio natural y cuando está ligada operativamente a su activador completo con el que está asociada de forma natural, cuyo activador está también en su medio natural. Así, la enzima de la presente invención puede ser expresada por una secuencia nucleotídica en su organismo natural pero en el que la secuencia nucleotídica no está bajo el control del activador con el que está asociada de forma natural en este
organismo.
natural(es). Para facilitar la referencia, los solicitantes denominarán a esta forma de realización preferida "secuencia nucleotídica no natural". A este respecto, la expresión "secuencia nucleotídica natural" significa una secuencia nucleotídica completa que está en su medio natural y cuando está ligada operativamente a su activador completo con el que está asociada de forma natural, cuyo activador está también en su medio natural. Así, la enzima de la presente invención puede ser expresada por una secuencia nucleotídica en su organismo natural pero en el que la secuencia nucleotídica no está bajo el control del activador con el que está asociada de forma natural en este
organismo.
Preferentemente la enzima no es una enzima
natural. A este respecto, la expresión "enzima natural"
significa una enzima completa que está en su medio natural y cuando
ha sido expresada por su secuencia nucleotídica
natural.
natural.
Típicamente, la secuencia nucleotídica que
codifican las enzimas que presentan las propiedades específicas
definidas en la presente memoria se prepara utilizando técnicas de
ADN recombinante (es decir ADN recombinante). Sin embargo, en una
forma de realización alternativa de la invención, la secuencia
nucleotídica podría sintetizarse, en conjunto o en parte,
utilizando procedimientos químicos bien conocidos en la materia
(véase Caruthers MH. Et al. (1980) Nuc. Acids Res. Symp.
Ser. 215-23 y Horn T. et al. (1980)
Nuc. Acids Res. Symp. Ser. 225-232).
La presente invención comprende asimismo
secuencias de aminoácidos de enzimas que presentan las propiedades
específicas definidas en la presente memoria.
Tal como se utiliza en la presente memoria, la
expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del término
"polipéptido" y/o del término "proteína". En algunos
casos, la expresión "secuencia de aminoácidos" es sinónimo del
término "enzima".
La secuencia de aminoácidos puede prepararse o
aislarse a partir de una fuente adecuada, o puede prepararse por
síntesis o puede prepararse mediante la utilización de técnicas de
ADN recombinante.
Propiamente, las secuencias de aminoácidos
pueden obtenerse a partir de las enzimas aisladas dadas a conocer
en la presente memoria por técnicas normalizadas.
Un procedimiento adecuado para determinar las
secuencias de aminoácidos de enzimas aisladas es el siguiente:
La enzima purificada puede liofilizarse y 100
\mug del material liofilizado pueden disolverse en 50 \mul de
una mezcla de urea 8 M y de bicarbonato amónico 0,4 M, pH 8,4. La
proteína disuelta puede desnaturalizarse y reducirse durante 15
minutos a 500ºC seguido de inertización con nitrógeno y adición de 5
\mul de ditiotreitol 45 mM. Tras el enfriamiento a temperatura
ambiente, pueden añadirse 5 \mul de yodoacetamida 100 mM para que
los restos de cisteína se modifiquen durante 15 minutos a
temperatura ambiente en la oscuridad bajo nitrógeno.
Pueden añadirse 135 \mul de agua y 5 \mug de
endoproteinasa Lys-C en 5 Hl de agua a la mezcla de
reacción anterior y la digestión puede realizarse a 37ºC en
nitrógeno durante 24 horas.
Los péptidos resultantes pueden separarse por
HPLC en fase inversa en una columna VYDAC C18 (0,46\times15 cm;
10ym; The Separation Group, California, USA) utilizando disolvente
A: 0,1 t de TFA en agua y disolvente B: 0,1 k de TFA en
acetonitrilo. Los péptidos seleccionados pueden volverse a
cromatografiar en una columna Develosil C18 utilizando el mismo
sistema disolvente, antes del secuenciado
N-terminal. El secuenciado puede realizarse
utilizando un secuenciador Applied Biosystems 476A que utiliza
ciclos rápidos de líquido pulsado según las instrucciones del
fabricante (Applied Biosystems, California, USA).
La presente invención comprende asimismo la
utilización de variantes, homólogos y derivados de cualquier
secuencia de aminoácidos de una enzima que presenta las propiedades
específicas definidas en la presente memoria o de cualquier
secuencia de nucleótidos que codifica dicha enzima. En esta memoria,
el término "homólogo" significa una entidad que presenta una
determinada homología con las presentes secuencias de aminoácidos y
las presentes secuencias nucleotídicas. En esta memoria, el término
"homología" puede ser sinónimo de "identidad".
La secuencia de aminoácidos yo secuencia de
nucleótidos variante, homóloga o derivada debería proporcionar y/o
codificar una enzima que conserve la actividad funcional y/o aumente
la actividad enzimática.
En el presente contexto, se toma una secuencia
homóloga para incluir una secuencia de aminoácidos que puede ser
por lo menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95
ó 98% idéntica a la presente secuencia. Típicamente, los homólogos
comprenderán las mismas zonas activas, etc. que la presente
secuencia de aminoácidos. Aunque la homología puede considerarse
también desde el punto de vista de la similitud (es decir, restos de
aminoácidos con propiedades/funciones químicas similares), en el
contexto de la presente invención es preferible expresar la
homología desde el punto de vista de identidad de secuencia.
En el presente contexto, se toma una secuencia
homóloga para incluir una secuencia de nucleótidos que puede ser
por lo menos 75, 85 ó 90% idéntica, preferentemente por lo menos 95
ó 98% idéntica a una secuencia de nucleótidos que codifica una
enzima de la presente invención (la secuencia sujeto). Típicamente,
los homólogos comprenderán las mismas secuencias que codifican
para los sitios activos, etc., como para la secuencia sujeto.
Aunque la homología puede considerarse asimismo desde el punto de
vista de la similitud (es decir, restos de aminoácidos con
propiedades/funciones químicas similares), en el contexto de la
presente invención se prefiere expresar la homología desde el punto
de vista de identidad de secuencia.
Las comparaciones de homologías pueden
realizarse a simple vista, o más frecuentemente, con la ayuda de
programas de comparación de secuencias fácilmente disponibles.
Estos programas informáticos disponibles en el mercado pueden
calcular el % de homología entre dos o más secuencias.
El % de homología puede calcularse en las
secuencias contiguas, es decir, se alinea una secuencia con otra
secuencia y cada aminoácido en una secuencia se compara directamente
con el aminoácido correspondiente en la otra secuencia, un resto
cada vez. Esto se denomina una alineación "sin huecos".
Típicamente, dichas alineaciones sin huecos se realizan únicamente
en un número relativamente corto de restos.
Aunque éste es un procedimiento muy sencillo y
consistente, falla al considerar que, por ejemplo, en un par de
secuencias de otro modo idénticas, una inserción o deleción dará
lugar a que los restos de aminoácidos siguientes se coloquen fuera
de la alineación, dando como resultado potencialmente de este modo
una gran reducción del % de homología cuando se realiza una
alineación global. Por consiguiente, la mayoría de procedimientos
de comparación de secuencias se diseñan para producir alineaciones
óptimas que tengan en cuenta posibles inserciones y deleciones sin
penalizar de forma indebida la puntuación de la homología global.
Esto se consigue insertando "huecos" en la secuencia de
alineamiento para tratar de maximizar la homología local.
Sin embargo, estos procedimientos más complejos
asignan "penalizaciones de huecos" a cada hueco que se produce
en la alineación de modo que, para el mismo número de aminoácidos
idénticos, una alineación de la secuencia con tan pocos huecos como
sea posible (reflejando mayor relevancia entre las dos secuencias
comparadas) conseguirá una puntuación mayor que la de muchos
huecos. Se utilizan típicamente "costes de huecos afines" que
cargan un coste relativamente alto para la existencia de un hueco y
una penalidad más pequeña para cada resto posterior en el hueco.
Éste es el sistema de puntuación de huecos utilizado más
frecuentemente. Las penalizaciones altas por hueco producirán desde
luego alineaciones optimizadas con menos huecos. La mayoría de los
programas de alineación permiten modificar las penalizaciones por
hueco. Sin embargo, se prefiere utilizar los valores por defecto
cuando se utiliza dicho programa informático para las comparaciones
de secuencias. Por ejemplo, cuando se utiliza el paquete GCG
Wisconsin Bestfit la penalización de hueco por defecto para las
secuencias de aminoácidos es -12 y para un hueco y -4 para cada
prolongación.
El cálculo del % de homología máximo por
consiguiente requiere en primer lugar la producción de una
alineación óptima, teniendo en cuenta las penalizaciones por hueco.
Un programa informático adecuado para realizar dicha alineación es
el paquete GCG Wisconsin Bestfit (Devereux et al. 1984
Nuc. Acids Research 12 pág. 387). Ejemplos de otro programa
informático que puede realizar comparaciones de secuencias incluyen,
pero no se limita, al paquete BLAST (véase Ausubel et al.
1999 Short Protocols in Molecular Biology, 4ª ed. - capítulo
18), FASTA (Altschul et al. 1990 J. Mol. Biol.
403-410) y el GENEWORKS continuación de las
herramientas de comparación. Tanto BLAST como FASTA están
disponibles para la investigación fuera de línea y en línea (véase
Ausubel et al., 1999, páginas 7-58 a
7-60). Sin embargo, para algunas aplicaciones,
resulta preferido utilizar el programa GCG Bestfit. Una nueva
herramienta, denominada secuencias de BLAST 2 está también
disponibles para comparar la secuencia de proteínas y nucleótidos
(véase FEMS Microbiol. Lett. 1999 174(2):
247-50; FEMS Microbiol. Lett. 1999
177(1): 187-8 y
tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
\newpage
Aunque el % de homología final puede medirse
desde el punto de vista de identidad, el propio procedimiento de
alineación no está basado típicamente en una comparación del par
todo o nada. En su lugar, se utiliza generalmente una matriz de
puntuación de similitud a escala para asignar puntuaciones a cada
comparación por pares basándose en la similitud química o en la
distancia progresiva. Un ejemplo de dicha matriz utilizada
normalmente es la matriz BLOSUM62, matriz por defecto para la
continuación BLAST de los programas. Los programas GCG Wisconsin
utilizan generalmente los valores publicados por defecto o una tabla
de comparación de símbolos habitual, si se suministra (véase manual
del usuario para más detalles). En algunas aplicaciones, resulta
preferido utilizar los valores publicados por defecto para el
paquete GCG, o en el caso de otro programa informático, la matriz
por defecto, tal como BLOSUM62.
Una vez el programa informático ha producido una
alineación óptima, es posible calcular el % de homología,
preferentemente el % de identidad de secuencia. El programa
informático típicamente realiza esto como parte de la comparación
de secuencias y genera un resultado numérico.
Las secuencias pueden presentar también
deleciones, inserciones o sustituciones de restos de aminoácidos que
producen un cambio imperceptible y dan como resultado una sustancia
operativamente equivalente. Las sustituciones deliberadas de
aminoácidos pueden realizarse basándose en la similitud de
polaridad, carga, solubilidad, hidrofobia, hidrofilia y/o la
naturaleza anfipática de los restos siempre que se conserve la
actividad de unión secundaria de la sustancia. Por ejemplo, los
aminoácidos con carga negativa comprenden el ácido aspártico y el
ácido glutámico. Los aminoácidos con carga positiva comprenden la
lisina y la arginina. Los aminoácidos con grupos polares
principales sin carga que presentan valores de hidrofilia similares
comprenden leucina, isoleucina, valina, glicina, alanina,
asparagina, glutamina, serina, treonina, fenilalanina y
tirosina.
Pueden realizarse sustituciones conservadoras,
por ejemplo según la Tabla siguiente. Los aminoácidos en el mismo
bloque en la segunda columna y preferentemente la misma línea en la
tercera columna pueden sustituirse entre sí:
La presente invención comprende asimismo la
sustitución homóloga (sustitución y reemplazamiento son utilizados
ambos en la presente memoria para significar el intercambio de un
resto de aminoácido existente, con un resto alternativo) que puede
tener lugar, es decir, sustitución semejante por semejante tal como
básico por básico, ácido por ácido, polar por polar, etc. La
sustitución no homóloga puede también producirse, es decir, de una
clase de resto a otra o alternativamente que implica la inclusión de
aminoácidos no naturales tales como ornitina (en lo sucesivo
denominada Z), ácido diaminobutírico ornitina (en lo sucesivo
denominado B), norleucina ornitina (en lo sucesivo denominado O),
piriilalanina, tienilalanina, naftilalanina y fenilglicina.
Los remplazamientos que pueden realizarse
también mediante aminoácidos no naturales incluyen; aminoácidos
alfa* y alfa-disustituidos*, aminoácidos
N-alquilo*, ácido láctico*, derivados de haluro de
aminoácidos naturales tales como trifluorotirosina*,
p-Cl-fenilalanina*,
p-Br-fenilalanina*,
p-I-fenilalanina*,
L-alil-glicina*,
\beta-alanina*, ácido
L-\alpha-amino butírico*, ácido
L-\gamma-amino butírico*, ácido
L-\alpha-amino isobutírico*,
ácido L-\varepsilon-amino
caproico^{#}, ácido 7-amino heptanoico*,
L-metionina sulfona^{#}*,
L-norleucina*, L-norvalina*,
p-nitro-L-fenilalanina*,
L-hidroxiprolina^{#},
L-tioprolina*, derivados metílicos de fenilalanina
(Phe) tal como 4-metil-Phe*,
pentametil-Phe*, L-PHe
(4-amino)^{#}, L-Tyr
(metil)*, L-Phe (4-isopropil)*,
L-Tic (ácido
1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico)*,
ácido L-diaminopro-
piónico^{#} y L-Phe (4-bencilo)*. La notación * se ha utilizado en aras de la exposición anterior (en relación con la sustitución homóloga o no homóloga), para indicar la naturaleza hidrófoba del derivado mientras que # se ha utilizado para indicar la naturaleza hidrófila del derivado, #* indica características anfipáticas.
piónico^{#} y L-Phe (4-bencilo)*. La notación * se ha utilizado en aras de la exposición anterior (en relación con la sustitución homóloga o no homóloga), para indicar la naturaleza hidrófoba del derivado mientras que # se ha utilizado para indicar la naturaleza hidrófila del derivado, #* indica características anfipáticas.
Las secuencias de variante aminoácido pueden
incluir grupos espaciadores adecuados que pueden estar insertados
entre cualquier restos de dos aminoácidos de la secuencia incluyendo
grupos alquilo tales como grupos metilo, etilo o propilo además de
espaciadores de aminoácidos tales como restos de glicina o
\beta-alanina. Una forma más de variación,
implica la presencia de uno o más restos de aminoácidos en forma
peptoide, serán bien comprendidos por los expertos en la materia.
Para evitar dudas, "la forma peptoide" se utiliza para
referirse a restos variantes de aminoácidos en los que el grupo
sustituyente carbono \alpha está en el átomo de nitrógeno el
resto en lugar de en el carbono \alpha. Los procedimientos para
preparar péptidos en la forma peptoide son conocidos en la materia,
por ejemplo Simon R. J. et al., PNAS (1992)
89(20), 9367-9371 y Horwell DC., Trends
Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
Las secuencias nucleotídicas que codifican una
enzima que presenta las propiedades específicas definidas en la
presente memoria puede incluir en ellas nucleótidos sintéticos o
modificados. Numerosos tipos diferentes de modificación para los
oligonucleótidos son reconocidos en la materia. Éstos comprenden los
ejes centrales de metilfosfonato y fosforotioato y/o la adición de
cadenas de acridina o polilisina en los extremos 3' y/o 5' de la
molécula. Para el objetivo de la presente invención, debe entenderse
que las secuencias nucleotídicas descritas en la presente memoria
pueden modificarse por cualquier procedimiento disponible en la
materia. Dichas modificaciones pueden realizarse a fin de aumentar
la actividad in vivo o la vida de las secuencias
nucleotídicas.
La presente invención comprende asimismo la
utilización de secuencias nucleotídicas que son complementarias con
las secuencias expuestas en la presente memoria, o cualquier
derivado, fragmento o modificación de las mismas. Si la secuencia
es complementaria con un fragmento de la misma entonces esta
secuencia puede utilizarse como sonda para identificar secuencias
de codificación similares en otros organismos, etc.
Los polinucleótidos que no son 100% homólogos
con las secuencias de la presente invención pero están comprendidos
en el alcance de la invención pueden obtenerse de numerosas formas.
Otras variantes de las secuencias descritas en la presente memoria
pueden obtenerse por ejemplo sondando bancos de ADN preparados a
partir de una gama de individuos, por ejemplo individuos de
diferentes poblaciones. Además, otros homólogos víricos, bacterianos
o celulares particularmente homólogos celulares conservados en
células de mamíferos (p. ej. células de rata, ratón, bovinas y de
primates), pueden obtenerse y dichos homólogos y sus fragmentos en
general serán capaces de hibridarse selectivamente con las
secuencias mostradas en el listado de secuencias en la presente
memoria. Dichas secuencias pueden obtenerse sondando bancos de ADNc
preparados a partir de bancos de ADN genómico de otras especies
animales y sondando dichos bancos con sondas que comprenden toda o
parte de cualquiera de las secuencias en los listados de secuencias
adjuntos en condiciones del medio de alta severidad. Consideraciones
similares se aplican a la obtención de especies homólogas y de
variantes alélicas de las secuencias polipeptídicas o nucleotídicas
de la
invención.
invención.
Pueden obtenerse también variantes y homólogos
de cepas/especies utilizando PCR degenerada que utilizará cebadores
diseñados para secuencias diana en las variantes y homólogos que
codifican secuencias de aminoácidos conservadas en las secuencias
de la presente invención. Pueden preverse secuencias conservadas,
por ejemplo, alineando las secuencias de aminoácidos de varios
variantes/homólogos. Las alineaciones de la secuencia pueden
realizarse utilizando programas informáticos conocidos en la
materia. Por ejemplo se utiliza ampliamente el programa GCG
Wisconsin PileUp.
Los cebadores utilizados en la PCR degenerada
contendrán una o más aposiciones degeneradas y se utilizarán en
condiciones de severidad inferiores a las utilizadas para las
secuencias de clonación con cebadores de una sola secuencia frente
a secuencias conocidas.
Alternativamente, dichos polinucleótidos pueden
obtenerse por mutagénesis dirigida al sitio de secuencias
caracterizadas. Esto puede ser útil cuando, por ejemplo, se
requieran cambios imperceptibles de la secuencia del codón para
optimizar las preferencias de codón para una célula hospedadora
concreta en la que las secuencias de polinucleótido se están
expresando. Otros cambios de secuencia pueden desearse para
introducir las secuencias de reconocimiento de la enzima de
restricción, o para alterar la propiedad o función de los
polipéptidos codificados por los
polinucleótidos.
polinucleótidos.
Los polinucleótidos (secuencias nucleotídicas)
de la invención pueden utilizarse para producir un cebador, p. ej.,
un cebador de PCR, un cebador para una reacción de ampliación
alternativa, una sonda p. ej. marcada con un marcador visible por
medios convencionales utilizando marcadores radioactivos o no
radiactivos, o los polinucleótidos pueden ser clonados en vectores.
Dichos cebadores, sondas y otros fragmentos serán por lo menos 15,
preferentemente por lo menos 20, por ejemplo por lo menos 25, 30 ó
40 nucleótidos de longitud, y están también comprendidos por el
término polinucleótidos de la invención como se utiliza en la
presente memoria.
Los polinucleótidos tales como los
polinucleótidos de ADN y las sondas según la invención pueden
producirse de manera recombinante, sintética, o por cualquier medio
disponible para los expertos en la materia. Pueden también clonarse
por técnicas normalizadas.
En general, los cebadores se producirán por
medios sintéticos, lo que implica una preparación por etapas de un
nucleótido a la vez de la secuencia de ácidos nucleicos deseadas.
Las técnicas para su realización que utilizan técnicas automáticas
están disponibles fácilmente en la materia.
Los polinucleótidos más largos generalmente se
producirán utilizando medios recombinantes, por ejemplo utilizando
técnicas de clonación por PCR (reacción en cadena de la polimerasa).
Esto implicará preparar un par de cebadores (p. ej., de
aproximadamente 15 a 30 nucleótidos) que flanquean una zona de la
secuencia de direccionamiento de lípidos que se desea clonar,
poniendo los cebadores en contacto con ARNm o ADNc obtenidos de un
animal o célula humana, realizando una reacción en cadena de la
polimerasa en condiciones que realicen la ampliación de la zona
deseada, el aislamiento del fragmento ampliado (p. ej. purificando
la mezcla de reacción en un gel de agarosa) y recuperando el ADN
ampliado. Los cebadores pueden diseñarse para que contengan zonas de
reconocimiento de la enzima de restricción adecuada de modo que el
ADN ampliado pueda clonarse en un vector de clonación
adecuado.
adecuado.
La presente invención comprende asimismo
secuencias que son complementarias con las secuencias de la presente
invención o secuencias que son capaces de hibridarse con las
secuencias de la presente invención o con secuencias que son
complementarias con éstas.
El término "hibridación" tal como se
utiliza en la presente memoria incluirá "el procedimiento mediante
el cual una cadena de ácido nucleico se une a una cadena
complementaria por emparejamiento de bases" así como el
procedimiento de ampliación realizado en las tecnologías de reacción
en cadena de polimerasa (PCR).
La presente invención comprende asimismo la
utilización de secuencias de nucleótidos que son capaces de
hibridarse con las secuencias que son complementarias con las
presentes secuencias expuestas en la presente memoria, o cualquier
derivado, fragmento o modificación de las mismas.
El término "variante" comprende asimismo
las secuencias que son complementarias con las secuencias que son
susceptibles de hibridarse con las secuencias de nucleótidos
expuestas en la presente memoria.
Las condiciones de hibridación se basan en la
temperatura de fusión (Tm) del complejo que se une al nucleótido,
tal como se da a conocer en Berger y Kimmel (1987, Guide to
Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, vol.
152, Academic Press, San Diego, CA), y proporcionan una
"severidad" definida como se explica a continuación.
La máxima severidad tiene lugar típicamente a
aproximadamente una Tm de -5ºC (5ºC inferior a la Tm de la sonda);
la alta severidad a aproximadamente 5ºC a 10ºC inferior a Tm; la
severidad intermedia a aproximadamente 10ºC a 20ºC inferior a Tm; y
la baja severidad a aproximadamente 20ºC a 25ºC inferior a Tm. Como
apreciarán los expertos en la materia, puede utilizarse una
hibridación a severidad máxima para identificar o detectar
secuencias nucleotídicas idénticas mientras que puede utilizarse
una hibridación a severidad intermedia (o baja) para identificar o
detectar secuencias de polinucleótidos similares o relacionadas.
Preferentemente, el término "variante"
comprende las secuencias que son complementarias con las secuencias
que son capaces de hibridarse en condiciones de alta severidad o en
condiciones de severidad intermedia con secuencias nucleotídicas
que codifican enzimas que presentan las propiedades específicas
definidas en la presente memoria.
Más preferentemente, el término "variante"
comprende las secuencias que son complementarias con las secuencias
que son capaces de hibridarse en condiciones de alta severidad (p.
ej. 65ºC y 0,1xSSC {1xSSC = NaCl 0,15 M. citrato-Na
0,015 M pH 7,0}) con secuencias nucleotídicas que codifican enzimas
que presentan las propiedades específicas definidas en la presente
memoria.
La presente invención se refiere asimismo a
secuencias de nucleótidos que pueden hibridarse con las secuencias
de nucleótidos expuestas en la presente memoria (incluyendo las
secuencias complementarias de las expuestas en la presente
memoria).
La presente invención se refiere asimismo a
secuencias de nucleótidos que son complementarias con las secuencias
que pueden hibridarse con las secuencias de nucleótidos expuestas
en la presente memoria (incluyendo las secuencias complementarias
de las expuestas en la presente memoria).
Asimismo están incluidas dentro del alcance de
la presente invención las secuencias de polinucleótidos que son
capaces de hibridarse con las secuencias de nucleótidos expuestas en
la presente memoria en condiciones de severidad intermedia a
máxima.
En un aspecto preferido, la presente invención
comprende secuencias nucleotídicas que son capaces de hibridarse
con las secuencias nucleotídicas expuestas en la presente memoria, o
con el complemento de las mismas, en condiciones de severidad (p.
ej. 50ºC y 0,2\timesSSC).
En un aspecto más preferido, la presente
invención comprende secuencias nucleotídicas que pueden hibridarse
con las secuencias nucleotídicas expuestas en la presente memoria, o
con el complemento de las mismas, en condiciones de alta severidad
(p. ej. 52ºC y 0,1\timesSSC).
Una vez se ha aislado una secuencia nucleotídica
que codifica enzimas y/o una secuencia de aminoácidos de la enzima,
puede ser deseable mutar la secuencia para preparar una enzima con
las propiedades deseadas de la presente invención o para mejorar
las propiedades naturales de la enzima.
Pueden introducirse mutaciones utilizando
oligonucleótidos sintéticos. Estos oligonucleótidos contienen
secuencias nucleotídicas que flanquean los puntos de mutación
deseados.
Un procedimiento adecuado se da a conocer en
Morinaga et al. (Biotechnology (1984) 2, pág.
646-649), en el que un hueco de ADN monocatenario,
la secuencia que codifica la enzima, se crea en un vector que lleva
el gen de la enzima. El nucleótido sintético, que lleva la mutación
deseada, se hibrida a continuación con una parte homóloga del ADN
monocatenario. El hueco restante se rellena a continuación con ADN
polimerasa I (fragmento de Klenow) y el montaje se liga utilizando
T4 ligasa. Otros procedimientos adecuados incluyen el procedimiento
de mega prima mutagénesis de Sarkar G. y Sommer S. S. (1990
BioTechniques I 8, 404-407) y el
procedimiento QuickChange de Papworth et al. (1985
Nucleic. Acids Res. 13: 8765-8785).
La patente US nº 4.760.025 da a conocer la
introducción de oligonucleótidos que codifican mutaciones múltiples
realizando alteraciones menores de la casete. Sin embargo, una
variedad aún mayor de variaciones puede introducirse en cualquier
momento mediante el procedimiento de Morinaga mencionado
anteriormente, debido a que puede introducirse una multitud de
oligonucleótidos de varias longitudes.
Otro procedimiento para introducir mutaciones en
las secuencias nucleotídicas que codifican enzimas se describe en
Nelson y Long (Analytical Biochemistry (1989), 180, pág.
147-151). Este procedimiento implica la generación
en 3 etapas de un fragmento de PCR que contiene la mutación deseada
introducida utilizando una cadena de ADN sintetizada químicamente
como uno de los cebadores en las reacciones de PCR. A partir del
fragmento generado por PCR, puede aislarse un fragmento de ADN que
lleva la mutación mediante escisión con endonucleasas de restricción
y reinsertarse en un plásmido de expresión.
Además, Sierks et al. (Protein
Eng. (1989) 2, 621-625 y Protein Eng.
(1990) 3, 193-198) describen la mutagénesis
dirigida al punto en glucoamilasa de Aspergillus.
Propiamente, una secuencia nucleotídica que
codifica una lipasa (E.C. 3.1.1.3) o una acil hidrolasa lipolítica
(E.C. 3.1.1.26) puede someterse a mutagénesis dirigida al sitio en
la región externa y/o cerca del sitio activo y/o en el terminal C
de la secuencia de aminoácidos.
Preferentemente, una secuencia nucleotídica que
codifica una lipasa (E.C. 3.1.1.3) o una acil hidrolasa lipolítica
(E.C. 3.1.1.26) puede someterse a mutagénesis dirigida al sitio
cerca del sitio activo para alterar las propiedades hidrófilas de
la superficie en torno al sitio activo.
La PCR propensa a error puede realizarse,
utilizando por ejemplo el kit de mutagénesis al azar por PCR
Diversify^{TM} de CLONTECH.
Puede sintetizarse un cebador mutágeno
(oligonucleótido) el cual corresponde a la parte de la secuencia de
ADN que debe mutarse excepto para el/los nucleótido(s)
correspondiente(s) a el/los codón o codones de los
aminoácidos que han de mutarse. El cebador contendrá, en el extremo
5' y 3', nucleótidos correspondientes a la secuencia que rodea la
secuencia que ha de mutarse. En los codones que deben mutarse
estarán presentes diferentes porcentajes de los cuatro nucleótidos
diferentes en cada posición, proporcionando la posibilidad de
codones para diferentes aminoácidos en las posiciones
seleccionadas.
Posteriormente, el cebador mutágeno resultante
puede utilizarse en una reacción de PCR con un cebador opuesto
adecuado. El fragmento de PCR resultante puede clonarse, quizás
después de alguna modificación adicional, en un vector adecuado,
que contiene el resto de la zona de codificación del gen de
interés.
Propiamente, una secuencia nucleotídica que
codifica una lipasa (E.C. 3.1.1.3) o una acil hidrolasa lipolítica
(E.C. 3.1.1.26) puede someterse a mutagénesis al azar localizada en
la región externa y/o cerca del sitio activo y/o en el terminal C
de la secuencia de aminoácidos.
Preferentemente, una secuencia nucleotídica que
codifica una lipasa (E.C. 3.1.1.3) o una acil hidrolasa lipolítica
(E.C. 3.1.1.26) puede someterse a mutagénesis dirigida al sitio
cerca del sitio activo para alterar las propiedades hidrófilas de
la superficie en torno al sitio activo.
Una secuencia nucleotídica que codifica una
enzima con las propiedades específicas definidas en la presente
memoria puede incorporarse en un vector recombinante replicable. El
vector puede utilizarse para replicar y expresar la secuencia
nucleotídica, en forma enzimática, en y/o desde una célula
hospedadora compatible. La expresión puede controlarse utilizando
secuencias de control que incluyen activadores/potenciadores y otras
señales de regulación de la expresión. Pueden utilizarse
activadores procarióticos y activadores funcionales en células
eucarióticas. Puede utilizarse tejido específico o activadores
específicos a los estímulos. Pueden utilizarse también activadores
híbridos que comprenden elementos de la secuencia de dos o más
activadores diferentes descritos anteriormen-
te.
te.
La enzima producida por una célula hospedadora
recombinante mediante la expresión de la secuencia nucleotídica
puede ser segregada o puede estar contenida intracelularmente
dependiendo de la secuencia y/o del vector utilizado. Pueden
diseñarse secuencias de diversificación con secuencias señal que
dirigen la secreción de las secuencias que codifican la sustancia a
través de una membrana de una célula procariótica o eucariótica
determinada.
La expresión "vector de expresión"
significa un montaje susceptible de expresión in vivo o in
vitro.
Preferentemente, el vector de expresión está
incorporado en el genoma del organismo. El término
"incorporado" comprende preferentemente la incorporación
estable en el genoma.
Preferentemente, el vector de la presente
invención comprende un montaje según la presente invención.
Expresado de otra forma, preferentemente una secuencia nucleotídica
que codifica una enzima con las propiedades específicas definidas
en la presente memoria está presente en un vector y en la que la
secuencia nucleotídica está operativamente unida a las secuencias
reguladoras de modo que las secuencias reguladoras son capaces de
proporcionar la expresión de la secuencia nucleotídica por un
organismo hospedador adecuado, es decir el vector es un vector de
expresión.
Los vectores de la presente invención pueden
transformarse en una célula hospedadora adecuada como se describe a
continuación para proporcionar la expresión de un polipéptido o
enzima con las propiedades específicas definidas en la presente
memoria. Así, en un aspecto adicional la invención proporciona un
procedimiento para preparar polipéptidos para su utilización
posterior según la presente invención que comprende cultivar una
célula hospedadora transformada o transfectada con un vector de
expresión tal como se describió anteriormente en condiciones que
proporcionen la expresión por el vector de una secuencia de
codificación que codifica los polipéptidos, y recuperando los
polipéptidos expresados.
Los vectores pueden ser por ejemplo, vectores de
plásmido, virus o fago provistos de un origen de replicación,
opcionalmente un activador de la expresión de dicho polinucleótido y
opcionalmente un regulador del activador. La selección del vector
dependerá con frecuencia de la célula hospedadora en la que debe
introducirse.
Los vectores pueden contener uno o más genes
marcadores seleccionables. Los sistemas de selección más adecuados
para los microorganismos industriales son los formados por el grupo
de marcadores de selección que no requieren una mutación en el
organismo hospedador. Los marcadores de selección adecuados pueden
ser los genes dal procedentes de B. subtilis o B.
licheniformis, o el que confiere resistencia a antibióticos
tales como resistencia a ampicilina, kanamicina, cloranfenicol o
tetraciclina. Los marcadores de selección alternativos pueden ser
los marcadores de selección de Aspergillus tales como amdS,
argB, niaD y sC, o un marcador que da lugar a resistencia a la
higromicina. Ejemplos de otros marcadores de selección micóticos son
los genes para ATP sintetasa, subunidad 9 (oliC),
orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa
(pvrA), resistencia a la fleomicina y benomilo (benA).
Ejemplos de marcadores de selección no micóticos son el gen con
resistencia a G418 bacteriano (éste puede utilizarse también en
levadura, pero no en hongos filamentosos), el gen con resistencia a
la ampicilina (E. coli), el gen con resistencia a la
neomicina (Bacillus) y el gen uidA de E. coli,
que codifican \beta-glucuronidasa (GUS). Los
marcadores de selección adecuados adicionales incluyen los genes
dal de B. subtilis o B. licheniformis.
Alternativamente, la selección puede realizarse por
cotransformación (como se describe en el documento WO 91/17243).
Los vectores pueden utilizarse in vitro,
por ejemplo para la producción de ARN o utilizarse para transfectar
o transformar una célula hospedadora.
Así, las enzimas que codifican secuencias
nucleotídicas con las propiedades específicas definidas en la
presente memoria pueden incorporarse en un vector recombinante
(típicamente un vector replicable) por ejemplo un vector de
clonación o expresión. El vector puede utilizarse para replicar el
ácido nucleico en una célula hospedadora compatible. Así en una
forma de realización adicional, la invención proporciona un
procedimiento de preparación de secuencias nucleotídicas que
codifican enzimas con las propiedades específicas definidas en la
presente memoria introduciendo una secuencia nucleotídica que
codifica dicha enzima en un vector replicable, introduciendo el
vector en una célula hospedadora compatible y cultivando la célula
hospedadora en condiciones que llevan a cabo la replicación del
vector. El vector puede recuperarse en la célula hospedadora. Las
células hospedadoras adecuadas son las descritas a continuación en
relación con los vectores de expresión.
Los procedimientos utilizados para ligar un
montaje de ADN de la invención que codifica una enzima que presenta
las propiedades específicas definidas en la presente memoria, y las
secuencias reguladoras, y para insertarlos en vectores adecuados
que contienen la información necesaria para la replicación, son bien
conocidos por los expertos en la materia (por ejemplo véase
Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory
Manual, 2ª ed. (1989)).
El vector puede comprender además una secuencia
nucleotídica que permite al vector replicarse en la célula
hospedadora en cuestión. Ejemplos de dichas secuencias son los
orígenes de replicación de los plásmidos pUC19, pACYC177, pUB110,
pE194, pAMB1 y pIJ702.
En algunas aplicaciones, una secuencia
nucleotídica que codifica una enzima con las propiedades específicas
definidas en la presente memoria puede estar operativamente unida a
una secuencia reguladora que es capaz de proporcionar la expresión
de la secuencia nucleotídica, tal como por la célula hospedadora
seleccionada. A título de ejemplo, la presente invención comprende
un vector que comprende la secuencia nucleotídica de la presente
invención operativamente unida a dicha secuencia reguladora, es
decir el vector es un vector de expresión.
La expresión "operativamente unida" se
refiere a la yuxtaposición en la que los componentes descritos están
en una relación que les permite funcionar de la manera deseada. Una
secuencia reguladora "operativamente unida" a una secuencia de
codificación está ligada de tal manera que la expresión de la
secuencia de codificación se consigue en condiciones compatibles
con las secuencias de referencia.
La expresión "secuencia reguladora"
comprende activadores y potenciadores y otras señales de regulación
de la expresión.
El término "activador" se utiliza en el
sentido normal de la técnica, p. ej. un punto de fijación de la ARN
polimerasa.
La expresión mejorada de la secuencia
nucleotídica que codifica la enzima con las propiedades específicas
definidas en la presente memoria puede conseguirse también mediante
la selección de zonas reguladoras heterólogas, p. ej. zonas del
activador, principal de secreción y terminadora, que sirven para
aumentar la expresión y, si se desea, niveles de secreción de la
proteína de interés procedentes del hospedador de expresión
seleccionado y/o proporcionar el control inducible de la expresión
de la enzima con las propiedades específicas definidas en la
presente memoria. En las eucariotas, las secuencias de
poliadenilación pueden estar conectadas operativamente a la
secuencia nucleotídica que codifica la enzima.
Preferentemente, la secuencia nucleotídica de la
presente invención puede estar operativamente ligada por lo menos a
un activador.
Aparte del activador natural para el gen que
codifica la secuencia nucleotídica que codifica una enzima con las
propiedades específicas definidas en la presente memoria, pueden
utilizarse otros parámetros para dirigir la expresión de la enzima.
El activador puede seleccionarse por su eficacia para dirigir la
expresión de la secuencia nucleotídica de la presente invención en
el hospedador de expresión deseado.
En otra forma de realización, puede
seleccionarse un activador constitutivo para dirigir la expresión de
la secuencia nucleotídica deseada. Dicho montaje de expresión puede
proporcionar ventajas adicionales ya que soslaya la necesidad de
cultivar los hospedadores de expresión en un medio que contiene un
sustrato de inducción.
Ejemplos de activadores potentes constitutivos
y/o inducibles que se prefieren para su utilización en hospedadores
de expresión micótica son los que se pueden obtener a partir de los
genes micóticos para los activadores de xilanasa (xlnA),
fitasa, ATP-sintetasa, subunidad 9 (oliC),
triosa fosfato isomerasa (tpi), alcohol deshidrogenasa
(AdhA), \alpha-amilasa (amy),
amiloglucosidasa (AG, del gen glaA), acetamidasa
(amdS) y
gliceraldehido-3-fosfato
deshidrogenasa (gpd). Otros ejemplos de activadores útiles
para la transcripción en un hospedador micótico son los derivados
del gen que codifica TAKA amilasa de A. oryzae, el activador
de TPI (triosa fosfato isomerasa) de S. cerevisiae (Alber
et al. (1982) J. Mol. Appl. Genet. 1, pág.
419-434), aspártico proteinasa de Rhizomucor
miehei, \alpha-amilasa neutra de A.
niger, \alpha-amilasa ácida estable de A.
niger, glucoamilasa de A. niger, lipasa de Rhizomucor
miehei, proteasa alcalina de A. oryzae, triosa fosfato
isomerasa de A. oryzae o acetamidasa de A.
nidulans.
Ejemplos de activadores potentes de levadura son
los que pueden obtenerse a partir de los genes para alcohol
deshidrogenasa, lactasa, 3-fosfoglicerato cinasa y
triosafosfato isomerasa.
Ejemplos de activadores bacterianos potentes son
los activadores de \alpha-amilasa y de SP02
así como los activadores de genes de proteasa extracelular.
Ejemplos de otros activadores adecuados para dirigir la
transcripción de la secuencia nucleotídica especialmente en un
hospedador bacteriano son los activadores del operón lac de
E. coli, los activadores del gen dagA de agarasa de
Streptomyces coelicolor, los activadores del gen de
\alpha-amilasa (amyL) de Bacillus
licheniformis, los activadores del gen de amilasa maltógeno
(amyM) de Bacillus starothermophilus, los activadores
de \alpha-amilasa (amyQ) de Bacillus
amyloliquefaciens, los activadores de xylA de Bacillus
subtilis y los genes
xylB.
xylB.
Pueden utilizarse también activadores híbridos
para mejorar la regulación inducible del montaje de expresión.
El activador puede incluir además propiedades
para asegurar o para aumentar la expresión en un hospedador
adecuado. Por ejemplo, las propiedades pueden ser zonas conservadas
tales como la secuencia de Pribnow o la secuencia TATA. El
activador puede incluso contener otras secuencias que afecten (tal
como que mantengan, aumenten, disminuyan) los niveles de expresión
de la secuencia nucleotídica de la presente invención. Por ejemplo,
otras secuencias adecuadas incluyen el intrón Sh1 o un intrón ADH.
Otras secuencias incluyen elementos inducibles, tal como
temperatura, producto químico, luz o elementos inducibles por
estrés. Asimismo, elementos adecuados para aumentar la
transcripción o traducción pueden estar presentes. Un ejemplo de
este último elemento es la secuencia señal TMV 5' (véase Sleat 1987
Gene 217, 217-225 y Dawson 1993 Plant Mol.
Biol. 23: 97).
El término "montaje", que es sinónimo de
los términos tales como "conjugado", "casete" e
"híbrido", incluye una secuencia nucleotídica que codifica una
enzima con las propiedades específicas definidas en la presente
memoria para su utilización según la presente invención directa o
indirectamente unido a un activador. Un ejemplo de un acoplamiento
indirecto es el aporte de un grupo espaciador adecuado tal como una
secuencia de intrón, tal como la Sh1-intrón o el
intrón ADH, intermedio del activador y la secuencia nucleotídica de
la presente invención. Lo mismo vale para el término
"fusionado" en relación con la presente invención que incluye
el acoplamiento directo o indirecto. En algunos casos, los términos
no comprenden la combinación natural de la secuencia nucleotídica
que codifica la proteína normalmente asociada al activador del gen
natural y cuando existen ambos en su medio natural.
El montaje puede contener o expresar incluso un
marcador que permita la selección del montaje genético, por
ejemplo, en una bacteria, preferentemente del género
Bacillus, tal como Bacillus subtilis, o plantas en
las que se haya transferido. Existen varios marcadores que pueden
utilizarse, tales como por ejemplo los que codifican la
manosa-6-fosfato isomerasa
(especialmente para plantas) o los marcadores que proporcionan
resistencia a antibióticos, p. ej. resistencia a G418, higromicina,
bleomicina, kanamicina y gentamicina.
Para algunas aplicaciones, el montaje comprende
preferentemente por lo menos una secuencia nucleotídica que
codifica una enzima con las propiedades específicas definidas en la
presente memoria operativamente unida a un activador.
La expresión "célula hospedadora", en
relación con la presente invención incluye cualquier célula que
comprenda una secuencia nucleotídica que codifica una enzima con
las propiedades específicas definidas en la presente memoria o un
vector de expresión tal como el descrito anteriormente y que se
utiliza en la producción recombinante de una enzima con las
propiedades específicas definidas en la presente memoria.
Así, una forma de realización adicional de la
presente invención proporciona células hospedadoras transformadas o
transfectadas con una secuencia nucleotídica que expresa una enzima
con las propiedades específicas definidas en la presente memoria.
Preferentemente dicha secuencia nucleotídica se lleva a cabo en un
vector para la replicación y expresión de la secuencia
nucleotídica. Las células se seleccionarán para que sean compatibles
con dicho vector y pueden ser por ejemplo células procarióticas
(por ejemplo bacterianas), micóticas, de levadura o vegetales.
La bacteria E. coli gram negativa se
utiliza ampliamente como hospedadora para la expresión del gen
heterólogo. Sin embargo, grandes cantidades de proteína heteróloga
tienden a acumularse dentro de la célula. La purificación posterior
de la proteína deseada procedente de del conjunto de proteínas
intracelulares de E. coli puede a veces ser difícil.
A diferencia de E. coli las bacterias
gram positivas del género Bacillus, tales como B. subtilis,
B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B.
stearothermophilus, B. alkalophilus, B.
amyloliquefaciens, B. coagulans, B. circulans,
B. lautus, B. megaterium, B. thuringiensis,
Streptomyces lividans o S. murinus, pueden ser
adecuadas como hospedadoras heterólogas debido a su capacidad para
segregar proteínas en el medio de cultivo. Otras bacterias que
pueden ser adecuadas como hospedadoras son las del género
Pseudomonas.
Dependiendo de la naturaleza de la secuencia
nucleotídica que codifica una enzima con las propiedades específicas
definidas en la presente memoria, y/o el deseo de procesar más la
proteína expresada, las hospedadoras eucarióticas tales como
levaduras u otros hongos pueden resultar preferidas. En general, se
prefieren células de levadura sobre células micóticas porque son
más fáciles de manipular. Sin embargo, algunas proteínas se segregan
muy poco en la célula de levadura, o en algunos casos no se
procesan apropiadamente (p. ej. hiperglucosilación en levaduras).
En estos casos, se debería seleccionar un organismo hospedador
micótico diferente.
Los organismos de levaduras adecuados pueden
seleccionarse de entre las especies de Kluyveromyces,
Saccharomyces o Schizosaccharomyces, p. ej.
Saccharomyces cerevisiae, o Hansenula (dadas a conocer
en la solicitud de patente UK nº 9927801.2).
Hongos filamentosos adecuados pueden ser por
ejemplo una cepa que pertenece a una especie de Aspergillus,
tal como Aspergillus oryzae o Aspergillus niger, o una
cepa de Fusarium oxysporium, Fusarium graminearum (en
estado perfecto denominada Gribberella zeae, anteriormente
Sphaeria zeae, con Gibberella roseum y Gibberella
roseum f. sp. Cerealis), o Fusarium sulphureum (en
estado perfecto denominada Gibberella puricaris, sinónimo de
Fusarium trichothercioides, Fusarium bactridioides,
Fusarium sambucium, Fusarium roseum y Fusarium
roseum var. graminearum), Fusarium cerealis (sinónimo de
Fusarium crokkwellnse) o Fusarium venenatum.
A título de ejemplo, los hospedadores de
expresión típica pueden seleccionarse de entre Aspergillus niger,
Aspergillus niger var. tubigensis, Aspergillus niger var. awamori,
Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus oryzae,
Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis,
Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis, Saccharomyces
cerevisiae y Hansenula polymorpha.
La utilización de células hospedadoras adecuadas
(tales como células de levadura, micóticas y vegetales) puede
proporcionar modificaciones después de la traducción (p. ej.
miristoilación, glucosilación, truncamiento, lapidación y
fosforilación de tirosina, serina o treonina) en la medida que pueda
ser necesario para proporcionar actividad biológica óptima en los
productos de expresión recombinante de la presente invención.
La célula hospedadora puede ser una cepa
insuficiente de proteasa o con menos proteasa. Ésta puede ser por
ejemplo la cepa insuficiente en proteasa JaL 125 de Aspergillus
oryzae que tiene el gen de la proteasa alcalina denominado
"alp" eliminado. Esta cepa se describe en el documento WO
97/35956.
El término "organismo" en relación con la
presente invención incluye cualquier organismo que pueda comprender
una secuencia nucleotídica que codifique una enzima con las
propiedades específicas definidas en la presente memoria y/o los
productos obtenidos de la misma.
Los organismos adecuados pueden incluir un
procariota, hongo, levadura o un vegetal.
El término "organismo transgénico" en
relación con la presente invención incluye cualquier organismo que
comprenda una secuencia nucleotídica que codifique una enzima con
las propiedades específicas definidas en la presente memoria y/o
los productos obtenidos de la misma y/o en el que un activador puede
permitir la expresión de la secuencia nucleotídica que codifica una
enzima con las propiedades específicas definidas en la presente
memoria dentro del organismo. Preferentemente la secuencia
nucleotídica se incorpora en el genoma del organismo.
La expresión "organismo transgénico" no
comprende las secuencias de codificación del nucleótido natural en
su medio natural cuando están bajo el control de su activador
natural que está también en su medio natural.
Por consiguiente, el organismo transgénico de la
presente invención incluye un organismo que comprende cualquiera de
entre una secuencia nucleotídica que codifica una enzima con las
propiedades específicas definidas en la presente memoria, montajes
como los definidos en la presente memoria, vectores como los
definidos en la presente memoria, plásmidos como los definidos en
la presente memoria, células como las definidas en la presente
memoria o las combinaciones o los productos de las mismas. Por
ejemplo el organismo transgénico puede comprender también una
secuencia nucleotídica que codifica una enzima con las propiedades
específicas definidas en la presente memoria bajo el control de un
activador heterólogo.
Como se indicó al principio, el organismo
hospedador puede ser un organismo procariótico o eucariótico.
Ejemplos de hospedadores procarióticos adecuados incluyen E.
coli y Bacillus subtilis. Las enseñanzas sobre la
transformación de hospedadores procarióticos están bien documentadas
en la técnica, por ejemplo véase Sambrook et al.
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª edición, 1989,
Cold Spring Harbor Laboratory Press) y Ausubel et al.,
Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley
& Sons, Inc.
Si se utiliza un hospedador procariótico
entonces puede ser necesario modificar propiamente la secuencia
nucleotídica antes de la transformación, tal como por eliminación
de intrones.
En otra forma de realización el organismo
transgénico puede ser una levadura. A este respecto, se han
utilizado ampliamente levaduras como vehículo para la expresión
génica heteróloga. La especie Saccharomyces cerevisiae tiene
un largo historial de utilización industrial, que incluye su
utilización para la expresión del gen heterólogo. La expresión de
genes heterólogos en Saccharomyces cerevisiae ha sido
estudiada por Goodey et al. (1987, Yeast Biotechnology, D.
R. Berry et al., eds., págs. 401-429, Allen y
Unwin, Londres) y por King et al. (1989, Molecular and
Cell Biology of Yeast, E. F. Walton y G. T. Yarronton, eds.,
págs. 107-133, Blackie, Glasgow).
Por varias razones, Saccharomyces
cerevisiae es muy aconsejable para la expresión génica
heteróloga. En primer lugar, no es patógena para el hombre y es
incapaz de producir determinadas endotoxinas. En segundo lugar,
tiene un largo historial de utilización segura después de siglos de
explotación comercial con varios fines. Esto ha conducido a una
amplia aceptación por el público. En tercer lugar, la gran
utilización comercial y la investigación dedicada al organismo ha
dado como resultado un gran conocimiento sobre la genética y la
fisiología así como de las características de la fermentación a gran
escala de Saccharomyces cerevisiae.
Un estudio de los principio de la expresión
génica heteróloga en Saccharomyces cerevisiae y de la
secreción de productos génicos se da en E. Hinchcliffe E. Kenny
(1993, "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous
genes", Yeasts, vol. 5, Anthony H. Rose y J. Stuart
Harrison, eds., 2ª edición, Academic Press Ltd.).
Varios tipos de vectores de levadura están
disponibles, incluyendo los vectores integradores, que requieren
combinación con el genoma del hospedador para su mantenimiento, y
vectores plásmido de replicación automática.
\newpage
A fin de preparar los Saccharomyces
transgénicos, se preparan montajes de expresión insertando la
secuencia nucleotídica de la presente invención en un montaje
diseñado para la expresión en levaduras. Se han desarrollado varios
tipos de montajes utilizados para la expresión heteróloga. Los
montajes contienen un activador activo en levadura fusionado con la
secuencia nucleotídica de la presente invención, normalmente se
utiliza un activador de origen levadura, tal como el activador
GAL1. Normalmente se utiliza una secuencia señal procedente de
levadura, tal como la secuencia que codifica el péptido señal SUC2.
Un terminador activo en la levadura finaliza el sistema de
expresión.
Para la transformación de varias levaduras se
han desarrollado protocolos de transformación. Por ejemplo, puede
prepararse un Saccharomyces transgénico según la presente
invención siguiendo las instrucciones de Hinnen et al.
(1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the
USA 75, 1929); Beggs, J. D. (1978, Nature, Londres, 275,
104); e Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology 153,
163-168).
Las células de levaduras transformadas se
seleccionan utilizando varios marcadores selectivos. Entre los
marcadores utilizados para la transformación existen numerosos
marcadores auxótropofos tales como LEU2, HIS4 y TRP1, y marcadores
con resistencia a antibióticos dominantes tales como marcadores de
antibióticos de aminoglucósido, p. ej. G418.
Las células de hongos filamentosos pueden
transformarse mediante un procedimiento que implica la formación de
protoplastos y la transformación de los protoplastos seguida de
regeneración de la pared celular de una manera conocida. La
utilización de Aspergillus como microorganismo hospedador se
describe en el documento EP 0 238 023.
Otro organismo hospedador es una planta. El
principio básico en la construcción de plantas modificadas
genéticamente consiste en insertar información genética en el
genoma de la planta para obtener un mantenimiento estable del
material genético insertado. Existen varias técnicas para insertar
la información genética, siendo los dos principios principales la
introducción directa de la información genética y la introducción de
la información genética mediante la utilización de un sistema de
vector. Un estudio de las técnicas generales puede encontrarse en
los artículos por Potrykus (Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant.
Mol. Biol. [1991] 42:205-225) y Christou
(Agro-Food-Industry
Hi-Tech marzo/abril de 1994
17-27). En el documento
EP-A-0449375 pueden encontrarse más
instrucciones sobre la transformación de plantas.
Las células huésped transformadas con la
secuencia nucleotídica pueden cultivarse en condiciones que
conduzcan a la producción de la enzima codificada y que faciliten
la recuperación de la enzima de las células y/o del medio de
cultivo.
El medio utilizado para cultivar las células
puede ser cualquier medio convencional adecuado para cultivar la
célula hospedadora en cuestión y obtener la expresión de la enzima.
Están disponibles medios adecuados en los proveedores comerciales o
pueden prepararse según las recetas publicadas (p. ej. las descritas
en los catálogos de la American Type Culture Collection).
La proteína producida por una célula
recombinante puede presentarse en la superficie de la célula. Si se
desea, y como deben apreciar los expertos en la materia, los
vectores de expresión que contienen las secuencias de codificación
pueden diseñarse con secuencias señal que dirigen la secreción de
las secuencias de codificación a través de una membrana de célula
procariótica o eucariótica determinada. Otras construcciones
recombinantes pueden unir la secuencia de codificación a la
secuencia nucleotídica que codifica un dominio de polipéptidos que
facilitará la purificación de las proteínas solubles (Kroll D. J.
et al. (1993) DNA Cell Biol.
12:441-53).
La enzima puede ser segregada en las células
hospedadoras y puede ser recuperada de manera conveniente del medio
de cultivo por procedimientos bien conocidos, que incluyen la
separación de las células del medio por centrifugación o
filtración, y que precipitan los componentes proteicos del medio
mediante una sal tal como sulfato amónico, seguido de la
utilización de procedimientos cromatográficos tales como
cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad o
similares.
Con frecuencia, es deseable que la enzima sea
segregada a partir del hospedador de expresión en el medio de
cultivo del que la enzima puede recuperarse más fácilmente. Según la
presente invención, la secuencia principal de secreción puede
seleccionarse basándose en el hospedador de expresión deseado. Las
secuencias señal híbridas pueden utilizarse también en el contexto
de la presente invención.
Ejemplos típicos de secuencias principales de
secreción heteróloga son los que se originan en el gen de
amiloglucosidasa (AG) micótica (glaA, ambas versiones de 18
y 24 aminoácidos, p. ej. de Aspergillus), el gen del factor
a (levaduras, p. ej. Saccharomyces, Kluyveromyces y
Hansenula) o el gen de \alpha-amilasa
(Bacillus).
Una enzima con las propiedades específicas
definidas en la presente memoria puede producirse como proteína de
fusión, por ejemplo para ayudar en la extracción y purificación de
la misma. Ejemplos de proteína de fusión asociada incluyen la
glutatión-S-transferasa (GST),
6\timesHis, GAL4 (dominios de fijación y/o activación de la
transcripción del ADN) y (\beta-galactosidasa).
Puede también ser conveniente incluir un punto de escisión
proteolítico entre la proteína de fusión asociada y la secuencia
proteica de interés para permitir la eliminación de las secuencias
de la proteína de fusión. Preferentemente la proteína de fusión no
ocultará la actividad de la secuencia proteica.
La proteína de fusión puede comprender un
antígeno o un determinante antigénico fusionado con la enzima. En
esta forma de realización, la proteína de fusión puede ser una
proteína de fusión no natural que comprenda una sustancia que puede
actuar como adyuvante en el sentido de proporcionar una estimulación
generalizada del sistema inmunitario. El antígeno o determinante
antigénico puede estar unido a ambos terminales amino o carboxi de
la enzima.
En otra forma de realización de la invención, la
secuencia de aminoácidos de una enzima con las propiedades
específicas definidas en la presente memoria puede estar ligada a
una secuencia heteróloga para codificar una proteína de fusión.
La presente invención se describe a
continuación, únicamente a título de ejemplo, haciendo referencia a
las figuras siguientes:
la Figura 1, que presenta un gel de PAGE
natural;
la Figura 2, que presenta un zimograma de
galactolípido (DGDG);
la Figura 3, que presenta un gel de
SDS-PAGE;
la Figura 4, que presenta un gráfico del efecto
de la LAH 1 de la judía de vaca en la masa;
la Figura 5, que presenta un gráfico del
análisis por HPLC de galactolípidos en la masa tratada con LAH de
judía de vaca;
la Figura 6, que presenta un gráfico del
análisis por HPLC de fosfolípidos en la masa tratada con LAH de
judía de vaca;
la Figura 7, que presenta un gráfico del
análisis por GLC de lípidos no polares en la masa tratada con LAH
de judía de vaca;
la Figura 8, que presenta una fotografía de
minipan en la que la barra 14 tenía 2% de aceite de soja y la barra
15 tenía 2% de aceite de soja + 1,07 unidades/kg de LAH de judía de
vaca añadida;
la Figura 9, que presenta una fotografía de
minipan en la que la barra 9 es la referencia; a la barra 10 se
había añadido 1,07 unidades/kg de LAH de judía de vaca; a la barra
11 se había añadido 1,07 unidades/kg de LAH de judía de vaca + 0,1%
de galactolípidos; a la barra 12 se había añadido 1,07 unidades/kg
de LAH de judía de vaca + 0,2% de galactolípido; y a la barra 13 se
había añadido 1,07 unidades/kg de LAH de judía de vaca + 0,4% de
galactolípido;
la Figura 10, que presenta una fotografía de
minipan en la que la barra 1 es la referencia; a la barra 2 se
había añadido 0,4% de DGDG; a la barra 3 se había añadido 0,4% de
DGDG + 0,4 unidades/g de LAH de judía de vaca y a la barra 4 se
había añadido 0,4 unidades/g de LAH de judía de vaca;
la Figura 11, que presenta un vector de
expresión que fue derivado del pYES2. El activador Gal1 de pYES2 se
eliminó y sustituyó por el activador ADH constitutivo. Se incorporó
LipA mediante recombinación in vivo en
Saccharomyces cerevisiae. Abreviaturas: Amp, gen resistente a
la ampicilina; ADH3', zona 3' de alcohol deshidrogenasa;
ADH_{p,} activador del gen de alcohol deshidrogenasa; bps,
pares de bases; CYC1, terminador de transcripción; f1
ori, origen de f1; Gal1p, activador del gen de
galactosa; LipA, gen de lipasa de Aspergillus
tubigensis; MCS, punto de clonación múltiple; pMB1 ori, origen
derivado de pUC, ura3, gen que codifica uracilo, 2 \mu
ori, origen de
2 \mu;
2 \mu;
la Figura 12, que presenta un perfil
Maldi-TOF de la enzima acil hidrolasa lipolítica de
la judía de vaca identificado utilizando el procedimiento detallado
en la presente memoria; y
la Figura 13, que presenta un perfil de péptido
para VUPAT 1 (Matos et al. FEBS Letters 491 (2001)
188-192).
Enzimas:
- Acil hidrolasa lipídica (LAH) purificada de judía de vaca
- Galactolipasa aislada unida a la membrana de tilacoides de trigo
Harina:
- Harina "S\diameterlvmel" de Danish nº 2001084
Sustrato:
- Digalactosildiglicérido, DGDG (pureza del 55%) lote KGL01013, de Lipid Technologies Provider, Karlshamn, Suecia.
Una acil hidrolasa lipolítica (LAH) capaz de
hidrolizar un glucolípido y un fosfolípido, pero incapaz, o
sustancialmente incapaz, de hidrolizar un triglicérido y/o un
1-monoglicérido, se aisló de la judía de vaca. Se
obtuvieron acil hidrolasas lipolíticas por un procedimiento basado
en el descrito en Sahsah et al. (Biochemica et Biophysica
Acta 1215 (1994) 66-73). Un procedimiento
adecuado alternativo puede ser el descrito en Matos et al.
(FEBS Letters 491 (2001) 188-192).
Se adquirieron judías de vaca de Morelos,
Méjico. Se cultivaron las plantas en piedras Leca y se regaron con
solución nutriente mineral según Ellfolk, Biochim. Biophys.
Acta 192 (1969) 486-493 (enriquecido con nitrato
de potasio 6 mM), en una cámara de cultivo, en vasijas de 35
\times 50 cm de dimensión (aprox. 50 plantas en cada vasija), en
condiciones controladas de temperatura y luz (16 horas a la luz del
día a 22ºC y 8 horas en la oscuridad a 18ºC con una humedad
relativa del aire del 72%). Se recogieron las hojas después de 21
días de cultivo. En el momento del cultivo las plantas tenían 4 a 7
hojas maduras totalmente abiertas y 3 a 8 hojas jóvenes.
Se homogeneizaron en un mezclador industrial 215
g de hojas frescas congeladas en nitrógeno líquido y se extrajeron
en 500 ml de tampón TRIS 5 mM (pH 7,0), utilizando un mezclador
industrial (3 minutos de mezclado). Los materiales insolubles se
eliminaron mediante centrifugación de 20 minutos a 15.000 g. El
sobrenadante resultante se filtró por último a través de un filtro
de 0,45 \mum (se recogieron 605 ml de extracto en bruto).
Etapa
1
Esta etapa se realizó, utilizando una unidad de
ultrafiltración Amicon de 50 kDa. Se recogieron 122 ml de extracto
en bruto concentrado.
Etapa
2
Se añadió sulfato amónico sólido (68,5 g) al
extracto en bruto hasta una concentración final del 80% de
saturación. Se dejó agitando la mezcla durante 60 minutos a
temperatura ambiente (25ºC). La proteína precipitada se recogió por
centrifugación a 15.000 g durante 20 minutos. Se redisolvió el
precipitante en 30 ml de tampón TEA 20 mM (pH 7,3). El material
insoluble se separó por centrifugación a 15.000 g durante 20
minutos.
Etapa
3
Se desaló el sobrenadante en una columna
Sephadex G-25 (5 \times 25 cm, Pharmacia, Suecia),
que se equilibró con TEA 20 mM (pH 7,3) a un caudal de 15 ml/min.
Las fracciones que contienen actividad de galactolipasa, (pico de
proteína) se mezclaron (100 ml).
Etapa
4
La muestra desalada se aplicó a continuación a
Q-Sepharose Fast Flow (5 \times 6 cm, Pharmacia,
Suecia), se equilibró con TEA 20 mM (pH 7,3) a un caudal de 16
ml/minuto. Para eliminar las proteínas no unidas, se lavó la
columna con 250 ml del mismo tampón, y las proteínas unidas se
eluyeron mediante un gradiente lineal de NaCl 0-0,6
M en el mismo tampón. Se recogieron fracciones de 16 ml y se analizó
la actividad de galactolipasa. Las fracciones que contenían
actividad de galactolipasa se mezclaron (128 ml).
Etapa
5
Esta etapa se realizó como se describe en la
etapa 1.
Se recogió una muestra desalada/concentrada de
16 ml (V_{máx}: 5,6 m D.O./min. o 0,010 U/ml).
Se realizaron pruebas de horneado con una
muestra procedente de esta etapa.
Etapa
6
La muestra desalada/concentrada (11 ml) se
aplicó a continuación a una Poros Q10 (0,5 \times 5 cm, Applied
Biosystem, USA), equilibrada con el mismo tampón utilizado en la
etapa 4, a un caudal de 1,5 ml/minuto. Las proteínas unidas se
eluyeron mediante un gradiente lineal de NaCl 0-0,65
M en el mismo tampón. Se recogieron fracciones de 1,5 ml y se
analizó la actividad de galactolipasa. Las fracciones que contenían
actividad de galactolipasa se mezclaron (6 ml).
Análisis SDS-PAGE, determinación
de la pureza y peso molecular:
Acil hidrolasa lipolítica purificada procedente
de IEC (etapa 6) se aplicó a un gel (NU-PAGE, 4 al
12%, tampón MES, Novex, USA) y el gel se tiñó a continuación con
coomassie. El gel puso de manifiesto la existencia de varias bandas
(véase Figura 1). Intentos para purificar más la acil hidrolasa
lipolítica utilizando varias técnicas cromatográficas tales como
filtración en gel, cromatografía, cromatografía con interacción
hidrófoba, cromatoenfoque, etc. no mejoraron la pureza de la acil
hidrolasa lipolítica.
Determinación del peso molecular y
electroelución de acil hidrolasa lipolítica después de PAGE
natural:
Se purificó acil hidrolasa lipolítica procedente
de judía de vaca (Vigna unguiculata) según Sahsah et
al. (Biochim. Biophys. Acta 1215 (1994)
66-73. La acil hidrolasa lipolítica eluida por
difusión se sometió a continuación a una SDS-PAGE
en gel. El gel se tiñó con coomassie. Este gel puso de manifiesto 2
bandas principales a 57 y 84 kDa (véase la Figura 3).
Esta preparación se sometió a digestión con
tripsina utilizando el protocolo siguiente:
- 1.
- Se añaden 50 \mul de urea 8 M en tampón de bicarbonato amónico 0,4 M pH 8,1 (24,04 g de urea, 1,581 g de bicarbonato amónico para 50 ml)
- 2.
- Se cubre con nitrógeno y se incuban a 50ºC durante 5 minutos.
- 3.
- Se añaden 5 \mul de DTT 50 mM (8 mg/ml de agua)
- 4.
- Se mezcla bien, se cubre con nitrógeno y se incuba a 50ºC durante 15 minutos.
- 5.
- Se enfría a temperatura ambiente.
- 6.
- Se añaden 5 \mul de yodoacetamida 100 mM (19 mg/ml de agua).
- 7.
- Se mezcla bien, se cubre con nitrógeno y se incuban en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 minutos.
- 8.
- Se añaden 140 \mul de agua, se mezcla bien y se añade tripsina a 1:25 (la tripsina se almacena a -20ºC a 1 \mug/\mul en TFA al 0,1%).
- 9.
- Se cubre con nitrógeno y se incuba durante la noche a 37ºC.
- 10.
- Se interrumpe la reacción por congelación a -20ºC.
- 11.
- Se recuperan los péptidos por HPLC en fase inversa utilizando una columna C18.
\newpage
Identificación del péptido después de la
digestión utilizando puntas de desalado C18 ZipTip^{TM}:
- A.
- Se humedece la punta aspirando en metanol 4 \times 10 \mul.
- B.
- Se equilibra la punta lavando con 5 \times 10 \mul con TFA al 0,1% en agua.
- C.
- Se unen los péptidos aspirando 20\times en la solución de digestión de la proteína.
- D.
- Se eliminan las sales lavando con 10 \times 10 \mul de TFA al 0,1% en agua.
- E.
- Se eluyen los péptidos directamente en una placa diana Maldi-TOF con 2 \mul de 10 mg/ml de ácido \alpha-ciano-4-hidroxicinnámico en TFA al 0,1% en 60% de acetonitrilo/agua.
- F.
- Se determina el peso molecular de los péptidos utilizando un espectrómetro de masas Voyage DE Maldi-TOF.
Los resultados del análisis
Maldi-TOF se representan en la Figura 12.
Una comparación entre el perfil del péptido
teórico (véase la Figura 13) para VUPAT 1 (como se da a conocer en
Matos et al. FEBS Letters 491 (2001)
188-192) y el perfil del péptido obtenido
experimentalmente para la acil hidrolasa lipolítica de la judía de
vaca obtenida en la presente memoria demuestra que la acil
hidrolasa lipolítica purificada en la presente memoria es una
proteína diferente de la dada a conocer en Matos et al. Esto
se confirma también mediante los pesos moleculares determinados por
SDS-PAGE. En este estudio se determina un peso
molecular de 57 y 84 kDa contrario a un peso molecular de 40 kDa
publicado por Sahsah et al.
Se adquirió trigo (Herward) en Pajbjergfonden,
Odder, Dinamarca. Se cultivaron los granos de trigo en papel a 25ºC
y se regaron regularmente. Después de una semana se recogieron las
hojas de trigo.
HEPES 50 mM, sorbitol 350 mM, EDTA 1 mM,
MgCl_{2} 1 mM, MnCl_{2} 1 mM de DTT 1 mM, pH 8,3/NaOH). El
tampón se mantuvo en hielo antes de su utilización.
Se cortaron 26 g de hojas de trigo en pequeñas
piezas (1/2 cm). Se añadieron 78 ml de tampón de homogeneización
enfriado en hielo. Se homogeneizaron las hojas en un Ultra Turrax
Mixer durante 12 segundos.
Se separaron las partículas grandes por
filtración a través de 3 capas de tejido Kleenex. Se centrifugó el
filtrado en 250 g durante 1 minuto y se aisló el sobrenadante.
Se aislaron los cloroplastos por centrifugación
durante 5 minutos a 1.000 g. Los sedimentos (que comprenden acil
hidrolasa lipolítica unida a la membrana) se volvieron a poner en
suspensión en 1 ml de tampón de homogeneización (el análisis al
microscopio mostró claramente los cloroplastos).
Se utilizaron los sedimentos para
experimentación en el sistema de masa del modelo de trigo.
Se añadieron los siguientes ingredientes a una
vasija de mezclado Brabender de 50 g y se amasaron durante 5
minutos a 30ºC: 50 g de harina, 1,0 g de levadura seca, 0,8 g de
azúcar, 0,8 g de sal, 70 ppm de ácido ascórbico y agua (hasta una
consistencia de la masa de 400 unidades Brabender). El tiempo
restante fue 10 min. a 34ºC. Se pesaron 15 g de masa por masa. A
continuación se moldearon en un dispositivo especial donde la masa
se aplanó entre una lámina de madera y un bastidor de Plexiglás.
Las masas se sumergieron en recipientes de aluminio durante 45 min.
a 34ºC, y se hornearon en un horno doméstico Voss durante 8 min. a
225ºC.
Tras el horneado se enfriaron los panes a
temperatura ambiente y después de 20 min. Se pesaron los panes y se
determinó el volumen por el procedimiento de desplazamiento de la
colza.
Se cortaron también los panes y se evaluó la
miga y la corteza.
\newpage
Se mezclaron 10 g de harina y 0,020 g de cloruro
sódico en una vasija de mezclado Farinograph de 10 g durante 1
minuto con o sin enzimas. Posteriormente se añadió agua (500
unidades Brabender) y se mezclaron durante 5 minutos a 30ºC. Tras
el mezclado se colocó la masa a 32ºC durante 1 hora, y a
continuación se congeló y se liofilizó antes del análisis
posterior.
1.500 g de harina, reforma danesa, 90 g de
levadura comprimida, 24 g de azúcar, 24 gramos de sal, 400 unidades
Brabender de agua + 2% se amasaron en un mezclador Hobart^{TM} con
gancho durante 2 minutos a baja velocidad y 9 minutos a alta
velocidad. La temperatura de la masa fue de 26ºC. Se pesaron 1.350
gramos de masa. Se dejaron en reposo 10 min. a 30ºC y se moldearon
en un moldeador Fortuna. Se sumergió la masa 45 min. a 34ºC. Se
horneó la masa en un horno Bago 18 min. a 220ºC y se coció al vapor
durante 12 s.
Después de enfriar los panecillos se pesaron y
se midió el volumen de los panecillos por el procedimiento de
desplazamiento de la colza.
\text{Volumen
específico} = \frac{\text{Volumen del pan, ml}}{\text{Peso del pan,
g}}
Se evaluaron también los parámetros de calidad
de la masa
| Elasticidad de la masa | 1-10 | |
| Adhesividad | 1-10 |
2.000 g de harina, reforma danesa, 30 g de
levadura seca, 30 g de azúcar, 30 gramos de sal, 400 unidades
Brabender de agua + 3% se amasaron en un mezclador Hobart^{TM}
con gancho durante 2 min a baja velocidad y 10 min a alta
velocidad. La temperatura de la masa tras el mezclado fue de 25ºC.
El tiempo de reposo fue de 10 min a 30ºC. Se pesaron 750 gramos de
masa. Se dejaron en reposo durante 5 min. a 33ºC y 85% HR. Se moldeó
la masa en un moldeador Glimik. Se sumergieron las masas en latas
durante 50 min. a 33ºC y se horneó en un horno Wachtel 40 min. a
220ºC e inyección de vapor durante 16 s.
Después de enfriar el pan se pesó y se midió el
volumen del pan por el procedimiento de desplazamiento de la
colza.
Asimismo se evaluó subjetivamente la miga en una
escala 1 a 10, en la que 1 = claramente no homogénea y 10 = muy
homogénea.
Tres panes horneados en latas con tapas se
almacenaron a 20ºC y se utilizaron para mediciones de
consistencia.
Se midió la consistencia del pan en un
Instron^{TM} M modelo 4301 conectado a un ordenador.
Condiciones para la medición de la consistencia
del pan:
| Celda cargada | 100 N máx. | |
| Diámetro del pistón | 50 mm | |
| Velocidad del cabezal cruzado | 200 mm/min. | |
| Compresión | 25% | |
| Espesor de la rebanada de pan | 11 mm |
La fuerza se convierte a N/dm^{2}.
El resultado fue una media de la medida en 10
rebanadas de pan para cada pan.
Se congeló inmediatamente 10 g de masa
totalmente sumergida y se liofilizó. La masa liofilizada se molió en
un molinillo de café y se pasó a través de un tamiz de 800 micras.
Se pesaron 1,5 g de masa liofilizada en un tubo de centrifugadora
de 15 ml con tapa superior de tornillo. Se añadieron 7,5 ml de
butanol saturado de agua (WSB). Se colocó el tubo de centrifugadora
en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Se colocaron los
tubos en un Rotamix y se dieron vueltas a 45 rpm durante 20 minutos
a temperatura ambiente y a continuación se colocaron en un baño de
agua hirviendo de nuevo durante 10 minutos más antes de darles
vueltas en el Rotamix durante 30 minutos más a temperatura
ambiente. Se centrifugaron los tubos a 3.500 g durante 5 minutos. Se
transfirieron 5 ml de sobrenadante a un vial y el WSB se evaporó a
sequedad bajo una corriente de nitrógeno.
Los ácidos grasos libres en el extracto se
analizaron como sales de Cu en isooctano medidos a 715 nm y
cuantificados según la curva de calibración basada en el ácido
oleico (Kwon D. Y. y Rhee J. S. (1986), A simple and rapid
Colourimetric Method for Determination of Free Fatty Acids for
Lipase Assay, JAOCS 63:89).
Se disolvió ILPS* patrón en
CHCl_{3}/CH_{3}OH (75/25) \sim2 mg/ml PC
Dilución de la solución madre: 0,7, 0,14 y
0,028,
\vskip1.000000\baselineskip
| * \begin{minipage}[t]{135mm} ILPS (International Lecithin and Phospholipid Society) patrón se adquiere en Spectral Service GmbH Colonia, Alemania. \end{minipage} |
\vskip1.000000\baselineskip
Se disolvieron las muestras en
CHCl_{3}/CH_{3}OH (75/25), se trataron con ultrasonidos y se
filtraron a través de un filtro 0,45 \mum.
Modelo de calibración: calibración lineal
log-log
Se utilizó la curva de calibración para PC para
calcular las cantidades de glucolípidos y fosfolípidos.
Cromatografía de gases capilar Perkin Elmer 8420
equipada con columna de sílice fundida WCOT 12,5 m \times 0,25 mm
DI \times fenil-metil-silicona al
5% de 0,1 \mum (CP Sil 8 CB de Crompack).
Preparación de la muestra: Se disolvieron 50 mg
de lípido de trigo en 12 ml de heptano:piridina 2:1 que contenía un
patrón interno de heptadecano, 2 mg/ml. Se transfirieron 500 \mul
de la muestra a un vial embutido. Se añadieron 100 \mul de MSTFA
(N-metil-N-trimetilsilil-trifluoroacetamida)
y se incubó la reacción durante 15 minutos a 90ºC.
Cálculo: se determinaron los factores de
respuesta para los
mono-di-triglicéridos y los ácidos
grasos libres a partir de las mezclas de referencia de estos
componentes. Basándose en estos factores de respuesta se calcularon
los mono-di-triglicéridos y los
ácidos grasos libres en los lípidos de trigo.
Solución
1
Se disolvieron 2 g de agarosa en 100 ml de agua
por calentamiento entre 90 y 100ºC.
Solución
2
Se dispersaron 1,2 g de galactolípido en 40 ml
de agua desmineralizada. Se añadieron 50 ml de tampón fosfato 0,1 M
pH 7, posteriormente se añadió también 0,6 ml de rodamina B al
0,2%.
Se enfrió la solución 1 a aprox. 70ºC y se
añadió la solución 2 en agitación. Se transfirieron 12 ml de la
mezcla final a una placa Petri de 7 cm.
Se almacenaron las placas a 5ºC hasta su
utilización.
Se punzaron pequeños agujeros de 1 mm de
diámetro del gel y se transfirieron 10 \mul de la solución
enzimática al orificio. Se hizo seguimiento de la formación de
halos en los geles de agarosa en función del tiempo.
Se añadió también un blanco sin enzima a uno de
los orificios para comparación.
Preparación del sustrato para el ensayo
enzimático: se disolvió el sustrato, pNP-caprato
(C10), en etanol y se diluyó en tampón de fosfato Na 100 mM (pH
6,3) hasta una concentración final de 0,1 mg/ml de sustrato y 30%
de etanol respectivamente, y se mantuvo a temperatura ambiente.
Procedimiento de ensayo: la mezcla de ensayo
enzimático contenía 30 \mul de muestra/blanco y 250 \mul de
sustrato. Se incubó la mezcla a 35ºC durante 30 minutos (420 nm)
mientras se realizaba simultáneamente un programa cinético
ELISA-lector (420 nm). El valor V_{máx} se utilizó
para el cálculo de la actividad enzimática (U/ml). Se convirtió
V_{máx} en \mumoles de una curva patrón para las soluciones de
pNP medidas en las mismas condiciones que la muestra. La actividad
enzimática se define como la cantidad de enzima que produce 1
\mumol de pNP por min. a 35ºC.
Bancos de enzimas obtenidos en mutagénesis
aleatoria o mutagénesis aleatoria localizada pueden extenderse
sobre filtros de acetato de celulosa en placas de
agar-agar que contienen medio de cultivo e
incubarse.
Los filtros de acetato de celulosa se
transfieren a continuación a las placas de selección y se incuban a
37ºC durante 2 a 6 horas. Las celdas que albergan enzima activa en
las condiciones dadas desarrollarán zonas claras alrededor de las
colonias. Las variantes positivas pueden purificarse y analizarse
más a continuación.
Ejemplo
1
En la primera serie de experimentos de la masa
se ensayó LAH de judía de vaca purificada en 10 g de masa a
diferentes concentraciones para probar la actividad de la enzima en
la masa y para encontrar una dosis adecuada para los experimentos
de horneado. Se midió la actividad de la enzima analizando la
concentración de ácido graso libre en la masa. En la Tabla 1 y en
la Fig. 4 se presentan los resultados.
Los resultados detallados en la Tabla 1 y en la
Fig. 4 demuestran claramente que LAH de judía de vaca es activa en
la masa durante la producción de ácidos grasos libres.
Los lípidos extraídos de la masa se continuaron
analizando por HPLC para estudiar el efecto sobre los lípidos
polares en la masa.
Los resultados de los análisis de HPLC de los
lípidos de la masa se presentan en la Tabla 2 y en las Figuras 5 y
6.
Los lípidos apolares se analizaron por GLC. En
la Fig. 7 se presentan los resultados de este análisis.
El análisis HPLC presenta claramente el efecto
de LAH de judía de vaca sobre los galactolípidos, y a una dosis
alta de enzima el digalactosildiglicérido (DGDG) está casi
completamente hidrolizado. Los resultados también presentan un
pequeño aumento en la concentración del correspondiente monoéster,
DGMG. A un aumento de concentración de LAH de judía de vaca, DGMG
está sin embargo también hidrolizado. En la misma fotografía se
observa también para fosfatidilcolina (PC) que está hidrolizada,
seguido de un pequeño aumento en la lisofosfatidilcolina
correspondiente. A un aumento de concentración de LAH de judía de
vaca, la lisofosfatidilcolina está también hidrolizada en la
masa.
En conclusión, se observa que tanto los
galactolípidos como los fosfolípidos en la masa son degradados por
LAH de la judía de vaca.
El análisis por GLC no indica ninguna actividad
de LAH de judía de vaca sobre el triglicérido en comparación con la
actividad sobre los lípidos polares y la formación de ácido graso
libre.
Es muy evidente que 3 unidades/kg de LAH de
judía de vaca es una sobredosis potente de esta enzima, que produce
la hidrólisis casi completa de todos los galactolípidos en la
masa.
Ejemplo
2
Se analizó LAH de judía de vaca en análisis de
minipan a dos concentraciones diferentes y se comparó con una
referencia (sin añadir LAH de judía de vaca). Se evaluó el volumen
del pan así como una evaluación de la estructura y aspecto de la
miga. La masa completamente sumergida de esta prueba se congeló y se
liofilizó y se extrajo el lípido de la masa. Los lípidos aislados
de la masa se analizaron por análisis HPLC y GLC.
Los resultados de la prueba de horneado se
muestran en la Tabla 3.
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\vskip1.000000\baselineskip
LAH de judía de vaca contribuyó claramente a
aumentar el volumen del pan horneado en comparación con la
referencia, y la enzima contribuyó asimismo a mejorar la miga, con
una estructura más homogénea y un aspecto mejor.
Los resultados del análisis de lípidos y de los
lípidos extraídos se presentan en la Tabla 4.
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\vskip1.000000\baselineskip
El análisis de los lípidos indica que LAH de
judía de vaca no hidroliza los lípidos apolares. La concentración
de triglicérido parece aumentar un poco, pero está dentro del error
experimental. Sin embargo, la enzima tiene claramente un efecto
sobre el galactolípido en la masa al degradar el
digalactolildiglicérido (DGDG). Se observa un aumento en la
concentración correspondiente de DGMG. El grado de hidrólisis del
galactolípido no es muy elevado, pero suficiente para explicar una
mejora de la calidad de la panificación de la enzima.
Ejemplo
3
Se evaluó la LAH aislada de la judía de vaca en
las pruebas de horneado de la manera siguiente. Se evaluó la LAH en
panecillos de corteza dura.
Se ensayó LAH a una dosis de 0, 0,25, 0,5, 1 ó
1,5 unidades de enzima/kg de harina. Los resultados iniciales
demuestran que la adición de 1,5 mg de LAH aumentó el volumen de la
barra de pan en más del 10% en comparación con el pan sin enzima y
mejoró las propiedades de manipulación de la masa.
\newpage
Ejemplo
4
Se ensayó LAH en el pan según el procedimiento
para pan danés tostado utilizando harina de reforma danesa. Se
determinó LAH a 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1 ó 1,5 unidades de enzima/kg de
harina. Como referencia se preparó una masa sin adición de enzima.
Después del horneado, se enfriaron las barras y se midió el volumen
de la barra. El pan panificado en lata con tapa se almacenó a
temperatura ambiente y se evaluó la blandura de la miga después de
1,3 y 7 días de almacenamiento a 22ºC envueltos en bolsas de
plástico dobles.
Los resultados iniciales demuestran que la
adición de 1 a 1,5 unidades de LAH aumenta el volumen de la
barra.
Los resultados iniciales de consistencia y
elasticidad demuestran que LAH proporciona miga significativamente
más blanda después de 7 días de almacenamiento en comparación con la
referencia (sin enzima).
Los resultados preliminares demuestran también
que LAH produce pan con una estructura de la miga muy buena y
homogénea.
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Ejemplo
5
Se analizó LAH de judía de vaca en minipanes a
diferentes concentraciones según la Tabla 5.
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LAH de judía de vaca contribuye claramente a
aumentar el volumen a baja concentración (hasta 0,239 unidades/kg).
A dosis mayores no hay ningún aumento de volumen pero la estructura
de la miga se hace más homogénea. Se extrajeron las masas de este
experimento y se aislaron los lípidos de la masa y se analizaron por
HPLC y GLC como se muestra en la Tabla 6.
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El análisis de lípidos confirma claramente que
LAH de judía de vaca no es activa en los lípidos apolares de la
masa (mono-di y triglicérido), pero la funcionalidad
se explica por el efecto sobre los lípidos polares como
digalactosildiglicérido (DGDG), que están claramente hidrolizados.
Los resultados indican algunas variaciones en la concentración de
di- y triglicérido, pero las variaciones son aleatorias y no existe
ninguna indicación de la actividad
enzimática.
enzimática.
\newpage
Ejemplo
6
Se evaluó la LAH de judía de vaca en análisis de
minipan. En este experimento se ensayó la enzima sola y también en
combinación con un galactolípido aislado de la avena. Los resultados
de la prueba de panificación y la determinación del ácido graso
libre se presentan en la Tabla 7.
En este experimento se demuestra que tanto LAH
de judía de vaca como el galactolípido (DGDG al 55%) tienen un
efecto positivo sobre el volumen del pan. Combinando los dos
ingredientes contribuyen a un efecto sinérgico claro como se
ilustra en la Tabla 7. Tanto el volumen del pan como la estructura
de la miga están significativamente mejorados cuando se añaden LAH
y DGDG.
La masa de este experimento de panificación se
congeló y se liofilizó y el lípido de la masa se extrajo con
butanol saturado de agua. Los lípidos aislados se expusieron a
análisis de GLC y HPLC. En la Tabla 8 se presentan los resultados
de estos análisis.
Cuando se añaden galactolípidos (prueba nº 2) a
la masa se detectan también más galactolípidos (DGDG) por análisis
HPLC. La LAH de judía de vaca presenta un fuerte efecto hidrolizante
sobre DGDG.
El efecto hidrolizante es muy claro tanto sin
DGDG añadido (prueba nº 3) como especialmente cuando se añade DGDG
(prueba nº 4). Se observa también que la concentración del producto
de la hidrólisis, es decir DGMG, aumenta cuando se añade LAH de
judía de vaca. Como se observa en los demás experimentos LAH de
judía de vaca no presenta ningún efecto hidrolizante sobre los
triglicéridos.
Ejemplo
7
Se evaluó LAH de judía de vaca en análisis de
minipanes en combinación con aceite de soja (Tabla 9).
En este experimento la LAH de judía de vaca no
contribuyó a mejorar el volumen de pan en comparación con el pan
horneado con aceite de soja solo, pero LAH de judía de vaca mejoró
claramente la estructura de la miga y el aspecto del pan (Fig.
8).
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Ejemplo
8
Se evaluó la LAH de judía de vaca por análisis
del minipan en combinación con diferentes concentraciones de
galactolípido (55% de pureza) (Tabla 10).
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La Tabla 10 demuestra que la adición de
galactolípido en combinación con 1,07 unidades/kg de galactolípido
contribuye a una fuerte mejora tanto en el volumen del pan como en
la estructura de la miga (Fig. 9).
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Ejemplo
9
Se ensayó LAH purificada de judía de vaca en
minipanes en combinación con galactolípido DGDG.
La adición de ingredientes de la masa se resume
en la Tabla 11, así como el volumen del pan de los panes de estos
experimentos de horneado.
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A partir de los resultados de la Tabla 11 se
demuestra claramente que DGDG presenta un efecto muy positivo sobre
el volumen del pan del pan horneado. LAH de judía de vaca contribuye
también al volumen mejorado del pan. La combinación de LAH de judía
de vaca y DGDG proporcionó una mejora adicional en el volumen del
pan y se observó una estructura mejor de la miga (Fig. 10).
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Ejemplo
10
En este experimento se ensayó LAH aislada unida
a la membrana de cloroplastos de la hoja de trigo en un sistema de
masa modelo de 10 gramos. La masa se dejó en reposo durante 1 hora a
26ºC y a continuación se congeló y se liofilizó.
\newpage
La masa liofilizada se extrajo con butanol
saturado con agua (WSB) y los lípidos de la masa aislados se
expusieron a análisis de GLC y HPLC. En la Tabla 12 se presentan
los resultados del análisis de lípidos.
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Los resultados de la Tabla 12 confirman la
actividad lipolítica de la enzima LAH unida a la membrana procedente
de los cloroplastos de trigo en la masa medida como un fuerte
aumento de ácido graso libre en la masa. Los resultados también han
demostrado que la enzima LAH unida a la membrana procedente de
cloroplastos de trigo casi no tiene efecto sobre los lípidos
apolares, y la concentración de triglicérido está inalterada. Los
resultados indican también un efecto hidrolítico potente de la
enzima LAH unida a la membrana procedente de cloroplastos de trigo
sobre la hidrólisis de galactolípidos como el galactosil diglicérido
(DGDG), que está completamente hidrolizado a dosis mayores de
enzima LAH unida a la membrana.
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Ejemplo
11
En este experimento una enzima LAH aislada que
comprende la secuencia mostrada en la SEC. ID. nº: 12 se ensayó en
un sistema de masa modelo de 10 gramos. La masa se dejó en reposo
durante 1 hora a 26ºC y a continuación se congeló y se
liofilizó.
Los resultados preliminares demuestran que la
enzima que comprende la secuencia presentada en la SEC. ID. nº: 12
reduce las cantidades de lípidos polares en el aceite mientras que
no afecta significativamente las concentraciones de triglicérido
del aceite.
Las enzimas LAH de judía de vaca se han aislado
y caracterizado y ensayado en el modelo de masa y en experimentos
de minihorneado. Esta enzima es activa en galactolípidos polares y
fosfolípidos en la masa pero no se observó ninguna actividad sobre
los triglicéridos en la masa. Una LAH unida al cloroplasto de las
hojas de trigo se ha aislado también y ensayado en la masa del
modelo. Esta enzima es también activa frente a galactolípidos y
fosfolípidos en la masa, pero no mostró ninguna actividad sobre los
triglicéridos.
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Ejemplo
12
Se trató aceite vegetal, en especial aceite de
colza, con LAH aislada de judía de vaca para efectuar el
descrudecimiento del aceite. El procedimiento utilizado fue
esencialmente como para el procedimiento de descrudecimiento
catalizado por enzimas de aceite vegetal dado a conocer
generalmente en Buchold, H. (Fat. Sci. Technol. 95 enero, nº
8, 1993, págs. 300-305), excepto que se utilizó
LAH.
Los resultados preliminares demuestran que LAH
reduce las cantidades de lípidos polares en el aceite aunque no
afecta significativamente las concentraciones de triglicérido del
aceite.
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Claims (37)
1. Procedimiento de preparación de una masa de
harina, comprendiendo dicho procedimiento añadir a los componentes
de la masa una cantidad eficaz de una enzima que en las condiciones
de la masa hidroliza un glucolípido y un fosfolípido, pero no
hidroliza un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en
el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5, y mezclar los
componentes de la masa para obtener la masa.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la cantidad eficaz de enzima no hidroliza tanto un
triglicérido como un 1-monoglicérido en el
intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5.
3. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que la cantidad eficaz de enzima hidroliza un triglicérido y un
diglicérido pero no hidroliza un 1-monoglicérido en
el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5.
4. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos uno de entre el
triglicérido, el 1-monoglicérido, el glucolípido y
el fosfolípido es un componente lipídico natural que se produce en
la harina utilizada para la masa.
5. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el fosfolípido es la
fosfatidilcolina (PC).
6. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el glucolípido es el
digalactosildiglicérido (DGDG).
7. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos uno de entre el
triglicérido, el 1-monoglicérido, el glucolípido y
el fosfolípido se añade a la masa.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el triglicérido se selecciona de entre el grupo constituido
por un aceite vegetal, una grasa vegetal, una grasa animal, una
manteca y grasa de leche.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el aceite vegetal es un aceite de cereal natural que
comprende el aceite de avena.
10. Procedimiento según la reivindicación 7, en
el que el líquido polar que se añade es un fosfolípido seleccionado
de entre el grupo constituido por fosfotidilinositol (PI),
fosfatidilglicerol (PG), fosfatidilcolina (PC) y
fosfatidiletanolamina (PE).
11. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la masa es una masa
fermentada con levadura.
12. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enzima se añade en una
cantidad que está comprendida en el intervalo entre 0,1 y 1.000
unidades de enzima/kg de harina.
13. Procedimiento según la reivindicación 12, en
el que la enzima se añade en una cantidad que está comprendida en
el intervalo entre 1 y 100 unidades de enzima/kg de harina.
14. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la masa es una masa de pan,
comprendiendo el procedimiento como etapa adicional que se hornee la
masa para obtener un producto de panadería.
15. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 13, en el que la masa es una masa seleccionada
de entre el grupo constituido por masa para pasta, masa para
tallarines y masa para pasteles o mezcla de masa.
16. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la enzima se añade en una
cantidad que produce un aumento del volumen específico del producto
de panadería que es por lo menos el 10%, con relación a un producto
de panadería preparado en condiciones idénticas con la excepción de
que no se añade la enzima.
17. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se añade una enzima adicional
a la masa.
18. Procedimiento según la reivindicación 17, en
el que la enzima adicional es seleccionado de entre el grupo
constituido por una lipasa, una enzima que degrada almidón, una
hemicelulasa, una celulasa, una lipoxigenasa y una
oxidorreductasa.
19. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se hidroliza por lo menos el
25% del glucolípido inicialmente presente en la masa.
20. Procedimiento según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que se hidroliza por lo menos el
25% del fosfolípido inicialmente presente en la masa.
21. Procedimiento de preparación de una masa o
producto de panadería preparado a partir de una masa que
comprende:
- (a)
- probar la actividad hidrolítica de por lo menos una enzima para con un triglicérido, un 1-monoglicérido, un fosfolípido y un glucolípido;
- (b)
- seleccionar una enzima que presenta actividad hidrolítica para con un fosfolípido y un glucolípido y que no presenta actividad hidrolítica para con un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5; y
- (c)
- añadir la enzima seleccionada a la masa.
22. Composición que mejora la masa que comprende
una cantidad eficaz de enzima, que en las condiciones de la masa,
hidroliza un glucolípido y un fosfolípido, pero no hidroliza un
triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo
de pH comprendido entre 4,5 y 6,5 y, opcionalmente, un componente de
la masa adicional.
23. Composición según la reivindicación 22, en
la que la cantidad eficaz de enzima no hidroliza tanto un
triglicérido como un 1-monoglicérido en el
intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5.
24. Composición según la reivindicación 22, en
la que la cantidad eficaz de enzima hidroliza un triglicérido y un
diglicérido, pero no hidroliza un 1-monoglicérido en
el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5.
25. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 24, en la que dicha composición comprende una
enzima adicional seleccionada de entre el grupo constituido por una
lipasa, una enzima que degrada almidón, una hemicelulasa, una
celulasa, una lipoxigenasa y una oxidorreductasa.
26. Composición según cualquiera de las
reivindicaciones 22 a 25, en la que dicho componente adicional de
la masa se selecciona de entre el grupo constituido por harina de
cereales, levadura, un agente de fermentación químico, un agente de
refuerzo de la masa, un emulsionante, un azúcar, un acilglicerol, un
fosfolípido, un glucolípido y una sal.
27. Masa que puede obtenerse por el
procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21.
28. Masa según la reivindicación 27, en la que
dicha masa se congela o se acondiciona en una atmósfera
controlada.
29. Producto de panadería que puede obtenerse
horneando una masa según las reivindicaciones 27 ó 28.
30. Producto de fideos preparado a partir de una
masa según las reivindicaciones 27 ó 28.
31. Producto de pasta preparado a partir de una
masa según las reivindicaciones 27 ó 28.
32. Procedimiento de preparación de una enzima
que presenta actividad hidrolítica para con un fosfolípido y un
glucolípido y que no presenta actividad hidrolítica para con un
triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo
de pH comprendido entre 4,5 y 6,5, que comprende:
- i)
- seleccionar una lipasa que presenta actividad hidrolítica para con un fosfolípido, un glucolípido y un triglicérido y/o un 1-monoglicérido,
- ii)
- modificar por inserción, deleción o sustitución de por lo menos un aminoácido en la secuencia de aminoácidos, con el fin de alterar la actividad de la lipasa de manera que la lipasa se modifica para no presentar actividad contra un triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo de pH comprendido entre 4,5 y 6,5.
33. Procedimiento según la reivindicación 32, en
el que la inserción, deleción o sustitución de por lo menos un
aminoácido está en la región externa de la secuencia de
aminoácidos.
34. Procedimiento según la reivindicación 32, en
el que la inserción, deleción o sustitución de por lo menos un
aminoácido está próxima al sitio activo de la secuencia de
aminoácidos.
35. Procedimiento según la reivindicación 32, en
el que la inserción, deleción o sustitución de por lo menos un
aminoácido está en el terminal C de la secuencia de aminoácidos.
36. Procedimiento según la reivindicación 33, en
el que se elimina la región externa.
37. Composición de masa que comprende una
cantidad eficaz de enzima, que en las condiciones de la masa,
hidroliza un glucolípido y un fosfolípido, pero que hidroliza un
triglicérido y/o un 1-monoglicérido en el intervalo
de pH comprendido entre 4,5 y 6,5 y, opcionalmente, un componente de
la masa adicional.
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