【発明の詳細な説明】
新規脂肪分解酵素
技術分野
本発明は、新規な脂肪分解酵素に関する。より詳しくは、本発明は菌株フサリ
ウム クルモラム（Fusarium culmorum）CBS 513.94産生のリパーゼの性質を有
するか、又は菌株フサリウム クルモラムCBS 513.94産生のリパーゼの性質を同
一又は部分的同一を有する新規な脂肪分解酵素を提供する。
背景技術
脂肪分解酵素は、多くの産業上の適用分野を見出している。アルカリプロテア
ーゼは、洗剤組成物中において特に使用に対し興味がある。
微生物起源のアルカリプロテアーゼは、フサリウムから得られるリパーゼを含
めて、記載されてきた。しかし、フサリウム クルモラムから得られるリパーゼ
は、これまで全く開示されてきていない。
発明の要約
本発明の目的は、新規なアルカリ脂肪分解酵素(EC3.1.1.3)を提供することに
ある。
従って、その第一の面において、本発明は菌株フサリウム クルモラムCBS 51
3.94から得られるリパーゼの性質と同一又は部分的同一の免疫化学的性質を有す
る脂肪分解酵素を提供する。
その第二の面において、本発明は脂肪分解酵素の製法を提供し、
この製法は、炭素および窒素源並びに他の無機塩を含有する適当な普通培地中で
フサリウム クルモラムのリパーゼ生産菌株を培養し、次いで脂肪分解酵素を回
収することを含んでなる。
その第三の面において、本発明は脂肪分解酵素の製造方法であって、脂肪分解
酵素をコードするDNA 断片を単離し；DNA 断片を、適当なプラスミドベクター中
の適当な発現シグナルと結合させ；自律複製プラスミドとして又は染色体に組込
まれて、該プラスミドベクターを適当な宿主に導入し；脂肪分解酵素の発現を到
らしめる条件下で宿主生物体を培養し；次いで培養基から酵素を回収することを
含んでなる。
更に別の面において、本発明は、本発明の脂肪分解酵素を含んでなる、洗剤組
成物並びに洗剤添加剤を提供する。
最後に、本発明は菌株フサリウム クルモラムCBS 513.94の生物学的に純粋な
培養物を提供する。
発明の詳細な開示
本発明は、菌株フサリウム クルモラムCBS 513.94の産生するリパーゼの性質
を有する新規な脂肪分解酵素に関する。
微生物
本発明は、菌類フサリウム クルモラムの菌株から由来する脂肪分解酵素を提
供する。フサリウム クルモラムは、公知の種でありそしてフサリウム クルモ
ラムの菌株は、寄託されそして寄託機関、例えばドイッチェ ザムムルク フオ
ン マイクロオルガニズメン ウント ツエルクレツレン GmbH(DSM)、ドイツ
およびアメリカンタイプカルチュアコレクションCATCC1．米国から公衆に入手可
能である。
本発明の好ましい態様において、本発明は、菌株フサリウム ク
ルモラム（Fusarium culmorum）DSM 1094、フサリウム クルモラム（Fusarium
culmorum）DSM、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）62184、フサリ
ウム クルモラム（Fusarium culmorum）DSM 62188、フサリウム クルモラム（
Fusarium culmorum）DSM 6219、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）
DSM 62223、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 12656、フサリ
ウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 15620、フサリウム クルモラム
（Fusarium culmorum）ATCC 16430、フサリウムクルモラム（Fusarium culmorum
）ATCC 16551、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 26556、フ
サリウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 34910、フサリウム クルモ
ラム（Fusarium culmorum）ATCC 34913、フサリウム クルモラム（Fusarium cu
lmorum）ATCC 36017、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 3687
9、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 36881、フサリウム ク
ルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 36886、フサリウム クルモラム（Fusariu
m culmorum）ATCC 44417、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC
46040、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 56088、フサリウム
クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 56089、フサリウム クルモラム（Fus
arium culmorum）ATCC 60275、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）A
TCC 60362、フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 62214、フサリ
ウム クルモラム（Fusarium culmorum）ATCC 62215、又は(Fusarium culmorum)
フサリウム クルモラムATCC 64075、又はそれらの突然変異株又は変異株から由
来される脂肪分解酵素を提供する。
本発明のその最も好ましい態様において、本発明はフサリウムクルモラムCBS
513.94、又はその突然変異株又は変異株から由来す
る酵素を提供する。この菌株は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関す
るブダペスト条約に従がい、セントラルビューローフォール ジーメルカルチュ
ア(CBS)、（オランダ国，NL-3740AGバーン、ポストブス 273）に、1994年10月25
日に寄託された。
別の面において、本発明は菌株フサリウム クルモラムCBS 513.94の生物学的
に純粋な培養物を提供する。
物理化学的性質
好ましい態様において、本発明の脂肪分解酵素は、次の１種以上の物理化学的
性質を有することにより特徴づけられている。
酵素は、基質としてトリブチリンを用い30℃で測定したとき、約７〜約９の範
囲内、より詳しくは約pH８に最適pHを有する。
酵素は次のＮ末端アミノ酸配列（注 配列番号：１）：
Ala-Val-Ser-Val-Ser-Thr-Thr-Asp-Phe-Gly-Asn-Phe-Lys-Phe-Tyr-Ile-Gln-His-
Gly-Ala-Ala-Ala-Tyr-Xaa-Asn-
酵素は、質量分析装置により測定した場合、28.4kDa の分子量を有する。
免疫化学的性質
他の好ましい態様において、本発明の脂肪分解酵素は、菌株フサリウム クル
モラム（Fusarium culmorum）CBS 513.94 から得られるリパーゼの免疫化学的性
質と同一又は部分的同一（すなわち、部分的同一）の免疫化学的性質を有するこ
とを特徴とする。
免疫化学的性質は、免疫交差反応同一性試験によって測定できる。同一性試験
は、I.M．Roitt; Immunology，Gower Medical Publishing（1985）or N.H．Axel
sen; Handbook of Immunoprecipitation-in-Gel Techniques; Blackwell Scient
ific Publications（1983）、第５章および第14章に従って、周知のオクテルロ
ニー二重免疫拡散法により又は双頭交差免疫電気泳動によって行うことができる
。
語句「免疫化学的同一性（抗原同一性）」は、Axelsen（同上）、第５，19，20
章およびM．Roitt（同上）、第６章に記載されている。
免疫学的試験において使用するための単一特異性抗血清は、例えばN.H．Axels
enの第１章、同上、又はN.H．Axelsen et al.，A Manual of Quantitative Immu
noelectrophoresis の第23章、Blackwell Scientific Publications(1973)に記
載される如く、本発明の精製リパーゼに対し、例えば免において生起せしめるこ
とができる。
脂肪分解酵素の製造
本発明の脂肪分解酵素は、炭素源および窒素源並びに無機塩を含有する好適な
普通培地内でフサリウム クルモラム(Fusarium culmorum)のリパーゼ生産菌株
を培養し、次いでリパーゼを回収することによって得られる。好ましい態様にお
いて、リパーゼ生産菌株は、菌株フサリウム クルモラムCBS 513.94又はその突
然変異株又は変異株である。
脂肪分解酵素は、当業者に公知の方法、例えばリパーゼをコードするDNA 断片
を単離し、DNA 断片を、適当なプラスミドベクター中の適当な発現シグナルと結
合させ；自律複製プラスミドとして又は染色体に組込まれて、該ベクター又はそ
の一部を適当な宿主に導入し、リパーゼの発現を到らしめる条件下で宿主生物体
を培養し、次いで培養基から酵素を回収することを含んでなる組換えDNA 工学に
よって得ることができる。
本発明の好ましい態様において、宿主生物体は、エシェリチアコリー（Escher
ichia coli）の菌株、又はバシラス（Bacillus）の菌株、又はストレプトマイセ
ス（Streptomyces）の菌株、又は菌類起源、好ましくはアスペルギルス(Aspergi
llus)の菌株、ニューロスポラ（Neurospora）の菌株、又はフサリウム（Fusariu
m）の菌株
、又はトリコデルマ（Trichoderm）の菌株、又は酵素細胞、好ましくはサッカロ
マイセス(Saccharomyces)の菌株、又はクルベロマイセス(Kluyveromyces)の菌株
、又はハンセンヌラ(Hansenula)又はピチア（Pichia）の菌株に属する。
培養後、脂肪分解酵素は、回収されそして常法、例えば疎水性クロマトグラフ
ィー、イオン交換クロマトグラフィー又はそれらの組合せにより精製できる。
脂肪分解活性
脂肪分解活性は、基質としてトリブチリンを用いて測定できる。この方法は、
酵素によりトリブチリンの加水分解を基礎にしており、そしてアルカリ消費が時
間の関数として記録される。
リパーゼ単位（LU）は、標準条件下（すなわち、30℃；pH7.0；および基質と
してトリブチリン）で、毎分１μmol の適定可能な酪酸を放出する酵素の量とし
て定義される。
この分析方法をより詳しく述べた２つ折り小冊子AF95/5は、ノボノルディスク
A/S に要求することにより入手可能であり、この小冊子はその番号を引用して本
発明に加えられる。
洗剤組成物
本発明の脂肪分解酵素は、典型的には洗剤組成物の成分であってよい。該脂肪
分解酵素はそのまゝ、無粉塵性粒質物、安定化液体、又は保護された酵素の形で
洗剤組成物内に含めることができる。
無粉塵性粒質物は、例えば米国特許4,106,991 および 4,661,452（双方ともノ
ボノルディスクA/S に付与）に記載の如く製造されそして所望により当業者に公
知の方法でコートされ得る。
ろうのコーティング材料の例は、100〜20000 の分子量を有するポリ（酸化エ
チレン）製品（ポリエチレングリコール、PEG）；16〜50個の酸化エチレン単位
を有するエトキシル化ノニルフェノール；
アルコールが12〜20個の炭素原子を有しそして15〜80個の酸化エチル単位が存在
するエトキシル化脂肪アルコール；脂肪酸；並びに脂肪酸のモノ−およびジ−お
よびトリ−グリセリドである。流動床法により適用に好都合なフィルム−形成コ
ーティング材料の例は、英国特許1483591 に示される。液体酵素製剤は、例えば
確立された方法に従がい、ポリオール例えばプロピレングリコール、糖又は糖ア
ルコール、乳酸又はホウ酸を加えることにより安定化できる。他の酵素安定化剤
は、当業者に周知である。保護された酵素は、ヨーロッパ特許 238,216に記載さ
れる方法に従って製造できる。
本発明の洗剤組成は、全ての好都合の形、例えば粉末、粒質物、ペースト又は
液体として存在し得る。液体洗剤は、水性であり、典型的には70％までの水およ
び０−30％の有機溶剤を含有するか、又は非水性である。
洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤を含んでなり、これらの各々はアニオン
、非イオン、カチオン又は双性イオンを含んでなる。洗剤は、通常０−50％の非
イオン界面活性剤、例えば直鎖アルキルベンゼンスルホナート(LAS)、α−オレ
フィンスルフェート（AEOS又はAES)、第二級アルカンスルホナート(SAS)、α−
スルホ脂肪酸メチルエステル、アルキル−又はアルケニルコハク酸、又は石けん
を含有するであろう。洗剤はまた、０−40％の非イオン界面活性剤、例えばアル
コールエトキシレート（AEO 又はAE）、カルボキシル化アルコールエトキシレー
ト、ノニルフェノールエトキシレート、アルキルポリグリコシド、アルキルジメ
チルアミンオキシド、エトキシル化脂肪酸アミド（例えばWO 92/06154 に記載の
如く）を含有できる。
洗剤組成物は、追加的に洗剤組成物中で好都合に用いられる１以上の他の酵素
、例えばアミラーゼ、クチナーゼ、プロテアーゼ、セ
ルラーゼ、ペルオキシダーゼ、および／又はオキシダーゼを含んでいてもよい。
洗剤は、１−65％の洗剤ビルダー又は錯化剤、例えばビルダー、ジホスフェー
ト、トリホスフェート、ホスホナート、シトラート、ニトリロトリ酢酸(NTA)、
エチレンジアミントリ酢酸（EDTA）、ジエチレントリアミンペンタ酢酸(DTMPA)
、アルキル−又はアルケニルコハク酸、可溶性シリケート又は加層シリケート(
例えばヘキストからのSKS-6)を含有できる。
洗剤はビルドされていなくともよく、すなわち、本質的に洗剤ビルダーを有し
なくともよい。
洗剤は、１以上のポリマーを含有する。その例は、カルボキシメチルセルロー
ス(CMC)、ポリ(ビニルピロリドン）(PVP)、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリ
(ビニルアルコール)(PVA)、ポリカルボキシレート例えばポリアクリレート、マ
レイン酸／アクリル酸コポリマーおよびラウリルメタアクリレート／アクリル酸
コポリマーである。
洗剤は、漂白系を含有でき、この系はH2O2源、例えばパボラート又はパカーボ
ナートを含んでなり、そしてこれらは過酸形成漂白活性剤、例えば、テトラアセ
チルエチレンジアミン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホナート（NO
BS）と組合せることができる。択一的に、漂白系は、例えば、アミド、イミド又
はスルホンタイプのペルオキシ酸を含んでいてもよい。
本発明の洗剤組成物の酵素は、通常の安定化剤、例えばポリオール例えばプロ
ピレングリコール又はグリセロール、糖又は糖アルコール、乳酸、ホウ酸、又は
ホウ酸誘導体例えば芳香族ボラートエステルを用いて安定化できそして組成物は
例えばWO 92/19709 および92/19708に記載の如く製剤化できる。
洗剤はまた他の通常の洗剤成分、例えば粘土、起泡増進剤、石けん水の泡抑制
剤、抗腐蝕剤、土壌懸濁化剤、抗土壌再付着剤、染料、殺菌剤、螢光増白剤又は
香料を含有できる。
pH（使用濃度で水性溶液中で測定した）は、中性又はアルカリ、例えば７−11
の範囲内に通常存在するであろう。
本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態には以下のものが含まれる。
１）以下の成分を含んでなる少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物とし
て製剤化された洗剤組成物：
２）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と
して製剤化された洗剤組成物：
３）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と
して製剤化された洗剤組成物：
４）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と
して製剤化された洗剤組成物：
５）以下の成分を含んでなる水性液体洗剤
６）以下の成分を含んでなる、粒質物として製剤化された洗剤組成物：
７）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と
して製剤化された洗剤組成物：
８）以下の成分を含んでなる、粒質物として製剤化された洗剤組成物：
９）以下の成分を含んでなる、粒質物として製剤化された洗剤組成物：
10）以下の成分を含んでなる、水性液体製剤：
11）以下の成分を含んでなる水性液体洗剤：
12）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と
して製剤化された洗剤組成物：
13）１）−12）で記載されているような洗剤製剤であって、ここにおいて直鎖ア
ルキルベンゼンスルホネートの全て又は一部は、（Ｃ12−Ｃ18）アルキルスルフ
ェートにより置換されている。
14）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と
して製剤化された洗剤組成物：
15）以下の成分を含んでなる、少なくとも 600ｇ／ｌの嵩密度を有する粒質物と
して製剤化された洗剤組成物：
16）１）−15）で記載される如き洗剤配合物であって、この配合物は追加の成分
として又は既に言及された漂白系に対する置換物として安定化され又は封入され
た過酸を含有する。
17）１），３），７），９）および12）で記載される如く洗剤組成物であって、
ここにおいてパボラートがパカーボナートにより置換されている。
18）１），３），７），９），12），14）および15）で記載される如き洗剤組成
物であって、この組成物は追加的にマンガン触媒を含有する。マンガン触媒は、
例えば“Efficient manganese catalysts for lowtemperature bleaching”，Na ture
369 ，1994，pp.637-639に記載される化合物の一つであってよい。
19）液体非イオン界面活性剤、例えば直鎖アルコキシ第一アルコール、ビルダ系
（例えばホスフェート）、酵素およびアルカリを含んでなる非水性洗剤液体とし
て製剤化された洗剤組成物。
本発明の脂肪分解酵素は、洗剤中に通常用いられる濃度で配合される。今日、
以下のように考えられている；すなわち、本発明の洗剤組成物において、リパー
ゼは洗液１ｌ当たり 0.001−100mg に相当する量で添加される。
実施例
本発明を、次の例を参照しつつ更に説明するが、本発明はいかなる場合も請求
の範囲に記載される如き本発明の範囲を制限するものではない。
例 １
培養例
菌株フサリウム クルモラム（Fusarium culmorum）CBS 513.94の種培養物を
、100mlの次の成分：
コーンスティープリカー（乾燥） 12ｇ／ｌ
グルコース 24ｇ／ｌ
を含有する500mlの振とうフラスコ中で生産した：
各フラスコに、0.5ｇのCaCO3および 0.5mlのオイルを加える。オートクレーブ
処理前にpHを 5.5に調節する。
26℃および250rpmで３日後、５mlの各種培養物を、100mlの以下の培地を含有
する振とうフラスコ中に接種した：
ペプトン，Difco 0118 ６ｇ／ｌ
ペプチカーゼ，シエフフィールド製品 ４ｇ／ｌ
酵母エキス，Difco 0127 ３ｇ／ｌ
肉エキス，Difco 0126 1.5ｇ／ｌ
デキストース，Roquette 101-0441 １ｇ／ｌ
オリーブ，Sigma 10ｇ／ｌ
オートクレーブ処理前に、pHを 7.3−7.4 に調節する。
培養を、26℃でかつ250rpmで９日間行った。ブロスを遠心分離しそして上澄み
を疎水性マトリックス（トーソー（日本）から入手可能な、TSK ゲルブチルトー
ヨーパール 650Ｃカラム）で精製し、次いで更に研究のために適用した。
例 ２
特徴化例
最適pH
例１に従って得られた上澄みを、前記のリパーゼ活性を測定するためのLU法に
委ね、次いで本発明の脂肪分解酵素のリパーゼ活性とpHと間の関係を、30℃でpH
６〜pH10の範囲内で測定した。
この特徴化の結果を図１に示す。脂肪分解酵素は、その最適pHを、約pH７〜約
pH９の範囲内に、より特に約pH８に有する。
分子量の測定
質量分析を、VGアナリカル TofSpec内のマトリックスアシストレーザーデソー
プションイオン化オイフオフフライト(MALDI-TOF)マススペクトロメトリーを用
いて行った。マススペクトロメトリに対し、例１に従って得られた２μｌのサン
プルを、２μｌの飽和マトリックス溶液(0.1％FFA：アセトニトリル(70：30))に
溶解したα−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸と混合し次いで２μｌの混合物を
ターゲットプレート上にスポットした。質量分析器に導入する前に溶剤を蒸発に
より除去した。サンプルを脱着させ次いで閾レーザー力で４usレーザーパルス(3
37nm)によりイオン化しそして25kVの加速電圧によりフィールドフリーフライト
管内に促進させた。スペクトルを公知質量のタンパク質を用いて外的に補正した
。
28.4kDa の質量を測定した。
Ｎ末端アミノ酸配列
ペプチドを得そして配列決定するための標準法[Findlay & Geisow(Eds.)(1989
); Protein sequencing-a practical approach; IRL Press]を用い、脂肪分解酵
素の次の25個のＮ末端アミノ酸残基を、配列番号：１（ここでXaa は未知のアミ
ノ酸残基を示す）：
Ala-Val-Ser-Val-Ser-Thr-Thr-Asp-Phe-Gly-Asn-Phe-Lys-Phe-Tyr-Ile-Gln-His-
Gly-Ala-Ala-Ala-Tyr-Xaa-Asn-
により表わされる如く同定された。
例 ３
脂肪分解活性
単層装置（KSV-5000，KSV インストラメント、フィンランド）を用い、以下の
内容を実施した；すなわち、フサリウム クルモラム由来の脂肪分解酵素は長鎖
のアルコールエトキシラーゼの存在下、ジカピンに対する活性を相当に増加せし
めた。
ジグリセリド基質および単成分アルコールエトキラート(AEO：ヘプタエチレン
グリコール モノオクタデシル エーテル)から造られる、良好に定義された全
体的組成物を、水性サブ相上に散布する（10mMグリシン、pH10.0，0.1mM EDTA，
25℃）。表面圧力を所望値に調整し、そして十分に調節された量の酵素（10LU：
前に定義された如きリパーゼ単位）を、サブ相に注入する。脂肪分解作用は、一
定の表面力を維持するために単層を圧縮する可動性バリヤの速度により明らかに
なる、何故なら、不溶性基質分子は、加水分解されより多くの水溶性反応生成物
を維持するからである。この分析を用い、脂肪分解酵素は、脂肪分解活性が停止
するので酵素により未加水分解されて残った基質（ジカピン）の最終領域一分画
を示すパラメーターβにより区別される。
このようにして、本発明のリパーゼは、洗剤中で通常用いられるアスペルギル
スリパーゼ（リパーゼ（商標）、ノボノルディスクA/S より入手可能、デンマー
ク）と比較した。結果を表１に示す。
これらの結果は次の内容を示す；すなわち、リポラーゼ（商標）と比較すると
、フサリウム クルモラムから得られる脂肪分解酵素は、アルコールエトキシラ
ーゼが基質相内に存在する場合、相当により有効である。
例 ４
基質親和性
水性相内に非イオン界面活性剤ドボノール25−７(2500ppm)の存在下そしてア
ルカリpHで基質相（オリーブ油）上／内にたまるべき脂肪分解酵素の能力を簡単
に比較する目的で手順を開発した。手 順
１．２つの同一の緩衝溶液（５ml）を、20mlの封止可能バイアル中に調製する(
「サンプル」（Ｓ）および対照(γ))。
２．酵素を「サンプル」および「対照」に加え次いでリパーゼ濃度を測定する（
XLU／ml）。
３．オリーブ油を「サンプル」上に加え次いで双方のリパーゼ溶液を激しく振と
うする。４℃で一夜インキュベーションする。
４．水性相内の残存リパーゼ濃度を、インキュベーション後に測定
する(YLU／ml；ｉ＝ｒ，ｓ)。
インキュベーション条件の要約
緩衝液 100mMのグリシン(５ml).
pH 9.0.
基質 オリーブ油(５ml).
温度 ４℃．
リパーゼ活性 ５−I0LU／ml．
インキュベーション 一夜(24−26時間).
データの評価
インキュベーションによるオリーブ油と接触する水性相内での活性損失を、オ
リーブ油の不存在下での損性損失と比較することにより結果を、計算する：
α＝Ｙs／Ｙs（上記参照）
結果を下記の表２に示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ
Ｃ１２Ｒ 1:77）
(81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，
ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ
Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ
，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，
ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ
Ｇ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，Ｂ
Ｙ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ
，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，
ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，Ｌ
Ｖ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ
，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，
ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ
Ｎ
(72)発明者 パトカオ，シャムカント，アナント
デンマーク国，デーコー−2880 バグスバ
エルト，ノボ アレ，ノボ ノルディスク
アクティーゼルスカブ（番地なし)