JP3309981B2 - 新規プロテアーゼ - Google Patents

新規プロテアーゼ

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はバシラス（Bacillus）sp.の菌株から由来す
る洗剤用プロテアーゼに関する。更に詳しくは、本発明
はバシラスsp.PD138の菌株から由来する新規アルカリプ
ロテアーゼに関する。更に、本発明はプロテアーゼの製
造方法、洗剤用酵素としてのプロテアーゼの使用、およ
び本発明のプロテアーゼを含んでなる洗剤組成物に関す
る。
背景技術 洗剤用酵素は20年以上にわたって市販されてきており
そして全世界にわたって粉末および液体洗剤において通
常の洗剤成分として十分に確立されている。より低温で
の洗浄の傾向にあり、洗剤用酵素の消費は近年増加して
いる。洗剤中で用いられる酵素は、プロテアーゼ、リバ
ーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ並びに他の酵素を含んで
なる。商業的に最も重要なものはプロテアーゼである。
洗剤用プロテアーゼは、天然に見出されるプロテアー
ゼを単離し次いで洗剤中で試験することにより開発され
てきた。最良の洗剤用プロテアーゼはバシラス属の構成
員から得られる。最近、新しいタイプのプロテアーゼが
市場に提供され、種々の言及された条件下で良好な原価
性能を与える可能性を提供する。
商業的プロテアーゼ製品の例は、アルカラーゼ（ALCA
LASETM）、エスペラーゼ（ESPERASETM）およびサビナー
ゼ（SAVINASE1TM）であり、これらは全てノボインダス
トリーA/S（デンマーク）から提供されている。他の商
業的起源のこれらのおよび他の類似の酵素製品は、洗剤
溶液中、すなわちpH8〜11でおよび金属イオン封鎖剤、
界面活性剤および漂白剤例えば硼酸ナトリウムの存在下
で活性である。アルカラーゼ（ALCALASETM）プロテアー
ゼは、種バシラスリケニフォルミスの菌株により生産さ
れる。エスペラーゼ（ESPERASETM）およびサビナーゼ
（SAVINASETM）プロテアーゼは、好アルカリ性バシリー
（Bacilli）の菌株を培養することによって得られる。
発明の要約 本発明の目的は、高pHおよび高イオン強度で改善され
た洗浄性能を有する新規プロテアーゼを提供することに
ある。
従って、第一の面によれば本発明は28kDの見かけ分子
量、9.5を超えるpI、pH11又はそれ以上に至適pH（25℃
で）、45〜55℃の範囲内に至適温度（pH9.5で）および
菌株バシラス（Bacillus）sp.PD138,NCIMB40338から由
来するプロテアーゼの免疫化学的性質と同一又は部分的
同一の免疫化学的性質を有するプロテアーゼを提供す
る。
第二の面において、本発明は菌株バシラス（Bacillu
s）sp.PD138により代表されるバシラスsp.の菌株の単離
された生物学的に純粋な培養物に関する。より詳しい面
において、本発明は菌株バシラス（Bacillus）sp.PD13
8,NCIMB40338、又はその突然変異体又は変異体に関す
る。
第三の面において、本発明はプロテアーゼの製造方法
を提供し、この方法はバシラス（Bacillus）sp.PD138の
プロテアーゼ生産株を、炭素および窒素源並びに無機塩
を含有する適当な栄養源培地中で培養し、次いで所望の
酵素を回収することを含んでなる。より詳しい面におい
て、バシラス（Bacillus）sp.PD138,NCIMB40338、又は
その突然変異体又は変異体、又はバシラスsp.PD138から
由来するプロテアーゼの免疫化学的性質と同一又は部分
的同一の免疫化学的性質を有するプロテアーゼをコード
する遺伝子を有する他の宿主生物を培養する。
第四の面において、洗剤用酵素としての酵素の使用が
権利要求される。より詳しい面において、本発明は洗剤
組成物およびプロテアーゼを含有する洗剤用添加剤を提
供する。
第五の面において、本発明はプロテアーゼを加えるこ
とを含んでなる洗浄方法を提供する。
図面の簡単な説明 本発明を更に添付の図面を参照して説明する。
図１は、本発明に係る酵素の温度と蛋白質分解活性と
温度の関係を示す（例１に従って得られる酵素調製品、
基質として２％のカゼインを用いそしてpH9.5での結
果；■緩衝剤、□緩衝剤＋0.1％のSTPP）。
図２は、本発明に係る酵素の蛋白質分解活性とpHの関
係を示す（例１に従って得られる酵素調製品、基質とし
て１％のサゼインを用いそして25℃での結果）。
発明の詳細な開示 微生物 ジャマイカの土壌のサンプルから単離された菌株によ
って代表される。本発明の酵素を生産できる、本発明の
新規微生物は、1990年12月３日に特許手続上の微生物の
寄託の国際的承認に関するブダペスト条約に従い、ナシ
ョナル コレックション オブ インダストリアル ア
ンド マリーン バクテリア（National Collection of
Industrial and Marine Bacteria）社（NCIMB）（英
国、スコットランド、アンダーソンAB2 1RY、マーチァ
ードライブ、23街）に、受託番号NCMB46338をもって寄
託された。
本発明の微生物は、バシラス（Bacillus）属に属する
好気性、胞子形成細菌である。形態学的には、この細菌
は直径0.7〜0.9ミクロンおよび長さ２〜３ミクロンを有
する自動性棒体である。胞子は球形から楕円形であり、
中心から終り近くまで胞子のうを膨張させていない。増
殖のための至適温度は25〜37℃内にあり、そして増殖の
ための至適pHは７〜９内であり、pH9.7では増殖せずそ
して50℃で増殖しない。微生物は、栄養源寒天斜面上で
帯黄色から黄色コロニー（丸形でかつ円滑）を形成し、
そして寒天内への色素の拡散は認められない。
微生物の培養 本発明の微生物は、同化性炭素および窒素並びに他の
必須栄養源を含有する栄養源培地中、好気性条件下で培
養することができ、培地は公知の原則に従って構成され
る。
適当な炭素源は炭水化物、例えばスクロース、グルコ
ースおよびデン粉、又は穀物、麦芽、米およびモロコシ
類の如き物質を含有する炭水化物である。培地中に導入
される炭水化物の濃度は、広く変化でき、例えば25％ま
でかつ１〜５％以下までであるが、通常８〜10％が適当
であろうし（パーセントはグルコースの当量として計算
される）。
普通培地中の窒素源は無機および／又は有機性のもの
であってよい。適当な無機窒素源は、ニトレートおよび
アンモニア塩である。有機窒素源の内、全く多数のもの
が細菌の培養を含む発酵プロセスにおいて通常用いられ
る。説明的例示は、大豆粉、綿実粉、ピーナッツ粉、カ
ゼイン、トウモロコシ、コーンスティープリカー（corn
steep liquor）、酵母エキス、尿素およびアルブミンで
ある。加えて、培地は又有用な微量物質を含有すべきで
ある。
本発明の新規バシラス種はわずかに好アルカリ性であ
る。従って培養は増殖培地の滅菌後、炭酸水素ナトリウ
ムの如き適当な緩衝剤を添加することによって得ること
のできる、わずかにアルカリ性pH値、pH9.0で好ましく
行うことができる。タンク発酵槽内の培養に対し、人工
通気を用いる必要がある。通気の速度は通常のタンク発
酵内で用いる速度に類似する。
発酵後、液体酵素濃縮物がブロスから粗い物質を除く
ことにより、又は所望により低温度で蒸発により又は逆
浸透により濃縮することにより製造できる。
固体酵素調製品は、塩、例えばNa2SO4、又は水混和性
溶剤、例えばエタノール又はアセトンを用いて沈殿させ
ることにより精製されたおよび／又は濃縮されたブロス
から製造できる。適当な乾燥方法、例えば噴霧乾燥によ
るブロス中の水の除去も又用いることができる。
蛋白質分解活性は、基質としてカゼインを用いて測定
される。カゼインプロテアーゼ単位（CPU）は、標準条
件下、すなわち25℃およびpH9.5で30分間インキュベー
ション下、（セリン標準と比較して測定された）１級ア
ミノ基の1mMを放出する酵素の量として定義される。
分析方法を記載した小冊子AF228は、ノボノルディス
クA/Sに要求により入手可能であり、この小冊子をその
番号を引用して本明細書に加入される。
酵 素 本発明の酵素は新規洗剤用プロテアーゼである。この
酵素は、炭素および窒素源並びに無機塩を含有する、適
当な普通接地中、本発明の微生物、好ましくはバシラス
（Bacillus）sp.PD138,NCIMB40338、又はそれらの突然
変異体又は変異体を培養することによって得ることので
きるアルカリプロテアーゼである。酵素は又組換DNA工
学によっても得ることができる。
本発明のプロテアーゼは次の特徴により記載すること
ができる。
物理化学的性質 SDS−PAGEにより測定された28kDの分子量。9.5を超え
るpIはLKBアムフォリン（Ampholine ）PAGプレート上
で等電点電気泳動によっては正確に測定できなかった。
プロテアーゼ活性は、PMSF、α−１−アンチトリプシン
およびターキー卵白（Turkey−egg−white）プロテアー
ゼにより阻害される。EDTAおよび大豆蛋白質阻害剤はプ
ロテアーゼ活性に影響しない。
温度と活性の関係を、0.1％のトリポリリン酸ナトリ
ウム（STPP、多くの商業的洗剤中で、普通の成分）の存
在下（白い四角形）および非存在下（黒い四角形）、pH
9.5でそして基質として２％のカゼインを用いて測定し
た。先に述べた蛋白質分解活性の分析は、インキュベー
ション温度を15℃から70℃の間隔内で変化させるという
変形でもって用いられた。
結果を図１に示す。図１から明らかなように、酵素は
15℃未満の温度から70℃超の温度までで蛋白質分解活性
を有し、そして45〜55℃の範囲内、50℃付近に至適温度
を有する。
pHに対する活性の依存性を、pH6〜11の範囲内の予じ
め定められたpH値に調節された緩衝液を用いる同じ手順
によって測定した。
結果を図２に示す。図２から明らかなように、酵素は
６未満ないし11を超えるpH値で蛋白質分解を有し、pH10
超に至適pHを有し、より詳しくは少なくともpH11に至適
pHを有する。
更に、本発明のプロテアーゼはヨーロッパタイプおよ
びアメリカタイプの洗剤中、洗浄条件下25℃で60分間安
定である。
本発明のプロテアーゼは、高いイオン強度および高い
pHを有する洗剤中で特に有望である。洗浄能試験から、
例えば例２より、９゜dH（ドイツ硬度）水中pH11で洗浄
中、洗浄性能はアルカリバシラスプロテアーゼサビナー
ゼ（SAVINASETM）（ノボノルディスクA/S、デンマー
ク）の洗浄性能よりもはるかに秀れていた。
免疫化学的性質 本発明のプロテアーゼは、菌株バシラスsp.PD138,NCI
MB40338から由来するプロテアーゼの免疫化学的性質と
同一又は部分的同一（すなわち、すくなくとも部分的同
一）を有する。
免疫化学的性質は、交差反応同一性試験により免疫学
的に測定できる。同一性試験は、周知のオクテルロニー
二重免疫拡散法又はN.H.アケルセン;Handbook of immun
o−precipitation−in−Gel Techniquess;ブラックウェ
ルサイエンティフィック社（1983）、５章および14章に
従い、双頭交差免疫電気泳動により行うことができる。
単一特異性抗血清が、本発明の精製プロテアーゼを用
い家兎を免疫することにより前記方法に従って発生し
た。免疫源をフロイドアジュバントと混合しそして二週
毎に家兎に皮下注入した。８週の総免疫化期間後、抗血
清を得、次いで免疫グロブリンを上記のN.H.アケルセン
により記載した如くそこから調節した。
オクチルロニー二重免疫試験は、本発明のプロテアー
ゼと公知のアルカリセリンプロテアーゼ、アルカラーゼ
（ALCALASETM）、サビナーゼ（SAVINASETM）、エスペラ
ーゼ（ESPERASETM）、ズブチリンNOVO（ノボノルディス
クA/Sより入手可能）、およびKAZUSASETM（昭和電工よ
り入手可能）．間で交差反応を示さなかった。
洗剤組成物 本発明に従い、プロテアーゼは洗剤組成物の一成分と
して典型的に添加できる。そのようなものとして、プロ
テアーゼは洗剤用添加剤の形で洗剤組成物中に含有でき
る。洗剤組成物並びに洗剤用添加剤は追加的に洗剤中で
通常用いられる１種又はそれ以上の他の酵素、例えばリ
パーゼ、アミラーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ又はペ
ルオキシダーゼを含有できる。
特異的面において、本発明は洗剤用添加剤を提供す
る。酵素は１種又はそれ以上の酵素を含有する別個の添
加剤を添加することにより、又は全てのこれらの酵素を
含んでなる組合された添加剤を添加することにより洗剤
組成物中に含ましめることができる。
好ましくは、洗剤用添加剤、すなわち別個の添加剤又
は組合された添加剤は、粒質物、好ましくは無粉塵性粒
質物、液体、特に安定化液体、スラリーの形態で、又は
保護された形態で提供される。
無粉塵性粒質物は、例えば米国特許4,106,991および
米国特許4,661,452（双方ともノボノルディスクA/Sに付
与）に開示される如く製造できそして所望により当業者
に公知の方法で被覆できる。洗剤用酵素は造粒前又は造
粒後に混合され得る。
液体酵素調製品は、例えば、ポリオール、例えばプロ
ピレングリコール、糖又は糖アルコール、乳酸又はホウ
酸を確立された方法に従って添加することにより安定化
され得る。他の酵素安定剤は、当業者に公知である。
保護された酵素は、ヨーロッパ特許公開238,216に記
載された方法に従って製造できる。
本発明の洗剤組成物は、如何なる通常の形態であって
よく、例えば粉末、顆粒又は液体である。液体洗剤は典
型的には90％までの水および０〜20％の有機溶剤を有す
る、水性であってよい。
洗剤組成物は、界面活性剤を含むことができ、これは
アニオン、非イオン、カチオン、両性又はこれらのタイ
プの混合物であってよい。洗剤は通常０〜50％のアニオ
ン界面活性剤、例えば直鎖アルキル、ベンゼン、スルホ
ネート（LAS）、α−オレフィン スルホネート（AO
S）、アルキル スルフェート（AS）、アルコキシ エ
トキシスルフェート（AES）又は石けんを含有するであ
ろう。また、洗剤はポリヒドロキシ脂肪酸アミド界面活
性剤（例えば、国際公開92/06154に記載の如き）を含有
できる。
pH（水性洗剤溶液中で測定）は、通常中性又はアルカ
リ性、例えば７〜11であろう。洗剤は１〜40％の洗剤用
ビルダー、例えばゼオライト、ホスフェート、ホスホネ
ート、シトレート、NTA,EDTA又はDTPAアルケニルコホク
酸無水物、又はシリケートを含有でき、又は洗剤はビル
ダー配合なしでもよい（すなわち本質的に洗剤用ビルダ
ーを有しない）。洗剤は又他の通常の洗剤成分、例えば
布帛柔軟剤、起泡増進剤、漂白剤、例えばパーボレー
ト、パーカーボネート、テトラアセチルエチレンジアミ
ン（TAED）又はノナノイルオキシベンゼンスルホネート
（NOBS）、耐蝕剤、土壌−沈殿防止剤、金属イオン封鎖
剤、抗土壌−再付着剤、酵素（１以上）に対する安定
剤、起泡抑制剤、染料、殺菌剤、螢光増白剤又は香料を
含有できる。
本発明の範囲内の洗剤組成物の特定の形態には次の
ａ）〜ｈ）が含まれる： ａ）ホスフェートビルダー、アニオン界面活性剤、非イ
オン界面活性剤、シリケート、使用において所望のpHに
調節すべきアルカリ、および天然無機塩を含有する洗剤
粉末として配合された粉末組成物、 ｂ）ゼオライトビルダー、アニオン界面活性剤、非イオ
ン界面活性剤、アクリル又は同等のポリマー、シリケー
ト、使用の際所望のpHに調節すべきアルカリ、および天
然無機塩を含有する洗剤粉末として配合される粉末組成
物。
ｃ）アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、保湿
剤、有機酸、苛性アルカリを含んでなる水性洗剤（使用
の際７〜10.5の値にpH調節される）として配合される組
成物。
線状アルコキシル化第一アルコールから本質的になる
液体非イオン界面活性剤、ホスフェートビルダー、苛性
アルカリを含んでなる非水性洗剤液体（使用の際約７〜
10.5の値にpH調節される）と配合される洗剤組成物。
ｅ）洗剤粉末として、アニオン界面活性剤および非イオ
ン界面剤低又は実質的に０の中性無機塩、ホスフェート
ビルダーおよびナトリウムシリケートを含有する、少な
くとも600g/の嵩密度を有する粒質物の形態で配合さ
れた洗剤組成物。
ｆ）洗剤粉末として、アニオン界面活性剤および非イオ
ン界面活性剤、低又は実質的に０の天然無機塩、ゼオラ
イトビルダーおよびナトリウムシリケートを含有する、
少なくとも600g/の嵩密度を有する粒質物の形態で配
合された洗剤組成物。
ｇ）アニオン界面活性剤、非イオン界面活性剤、アクリ
ルポリマー、脂肪酸石けん、炭酸ナトリウム、硫酸ナト
リウム、粘土粒子およびナトリウムシリケートを含有す
る洗剤粉末として配合された洗剤組成物。
ｈ）５〜65重量％の界面活性剤、０〜50重量％のビルダ
ーおよび０〜30重量％の電解質を含んでなる液体圧縮洗
剤組成物。
本発明の洗剤組成物において、（プロテアーゼ？）が
洗液１当たり（0.001〜100?）mgに相当する量で添加
されることが現在考えられている。
本発明を次の実施例（いかなる場合も請求の範囲で記
載される本発明の範囲を制限するものではない）により
更に説明する。
例１ バシラス（Bacillus）sp.PD138,NCIB40338を次の組成
（１当たり）の培地100mを含有する。500mのバッ
フル付エルレレマイカーフラスコ内で回転、振動テーブ
ル（300r.p.m.）上で25゜で培養した： ジャガイモデンプン 100 g 粉砕大麦 50 g 大豆粉 20 g Na2HPO4×12H2O 9 g プルロニック（Pluronic ） 0.1g ナトリウムカゼイネート 10 g 培地内のデンプンをα−アミラーゼで液化し、次いで
培地を120℃で45分間滅菌する。
滅菌後、培地のpHを炭酸水素ナトリウムの1M溶液10m
を添加して9.0に調節する。
４日間インキュベーション後、培養物の蛋白質分解活
性を前記方法を用いて測定した。
培養後、ブロスの酵素活性は20CPU/であった。
固体物質を分離後、プロテアーゼを通常のクロマトグ
ラフィー法により精製した。
１の培養ブロスからの収率は、100CPU/を有する5
0mであった。純度はSDS−PAGEにより判断する如く、9
0％以上であった。
この実施例に従って調製した調製品の特性は、この明
細書中の先の部分に記載されておりそして該部分を参照
される。
例２ 洗浄性能 洗浄性能試験を、40℃で等温的に10分間、草で汚れた
綿について行った。
試験は、１当たり酵素蛋白質0.01,0.025,0.05,0.1,
0.5および1.0mgの酵素濃度で行った。
5.0g/の商業上のヨーロッパの圧縮粉末洗剤を用い
た。洗剤を約９゜dH（ドイツ硬度）水に溶解し、次いで
pHを11に調節した。繊維／洗液比は洗液１当たり6gの
繊維であった。
洗浄に続き、布を水道水でフラッシュし次いで風乾し
た。460nmでの規約反射率（％Ｒ）を測定した。洗浄性
能の尺度として示差規約反射率ΔＲを用いたが、これは
添加された酵素で洗浄後の規約反射率引く酵素を添加し
ないで洗浄後の規約反射率に等しい。
これらの試験結果を表１に示す（２回の試験の平
均）。
示差規約反射率の値は、本発明のプロテアーゼが高イ
オン強度および高pHを有する洗剤中で特に可能性を有す
ることを示しており、同時に本発明のプロテアーゼは良
好な洗浄能力を有する。
フロントページの続き (72)発明者 アースリュング，ドリト アニタ デンマーク国，デーコー―4000 ロスキ ルゼ，スボイェスレイ，フュウレン ８ (72)発明者 リンデガールト，ポール デンマーク国，デーコー―2100 コペン ハーゲン エー．，オエステル セガゼ 52 (56)参考文献 特開 昭58−134990（ＪＰ，Ａ) 米国特許4764470（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/50 - 9/86 ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (13)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の特性： （ａ）28kDの見かけ分子量； （ｂ）9.5を超えるpI; （ｃ）pH10を超える至適pH（25℃でかつ基質としてカゼ
    インを用いて測定）； （ｄ）45〜55℃の範囲内に至適温度（pH9.5でかつ基質
    としてカゼインを用いて測定）； （ｅ）菌株バシラス（Bacillus）sp.PD138,NCIMB4033
    8、又はその突然変異株もしくは変異株から得られう
    る； を有するプロテアーゼ。
  2. 【請求項２】請求項１に記載のプロテアーゼを生産する
    能力を有する、バシラス（Bacillus）sp.PD138,NCIMB40
    338又はその突然変異株もしくは変異株。
  3. 【請求項３】バシラス（Bacillus）sp.PD138,NCIMB4033
    8である、請求項２に記載の微生物株。
  4. 【請求項４】請求項１に記載のプロテアーゼの製造方法
    であって、バシラス（Bacillus）属に属し、前記プロテ
    アーゼを生産することができるプロテアーゼ生産株を、
    炭素および窒素源並びに無機塩を含有する適当な栄養源
    培地中で培養し、次いで所望の酵素を回収することを含
    んでなる方法。
  5. 【請求項５】バシラス（Bacillus）sp.PD138,NCIMB4033
    8、又はその突然変異株もしくは変異株を培養する、請
    求項４に記載の方法。
  6. 【請求項６】請求項１に記載のプロテアーゼを含んでな
    る洗剤組成物。
  7. 【請求項７】更に１種又はそれ以上の他の酵素を含んで
    なる、請求項６に記載の洗剤組成物。
  8. 【請求項８】前記他の酵素がアミラーゼ、リパーゼ、セ
    ルラーゼ、ペルオキシダーゼおよびオキシダーゼから成
    る群から選択される、請求項７に記載の洗剤組成物。
  9. 【請求項９】無粉塵性粒質物、液体、スラリー又は保護
    された酵素の形態で提供される、請求項１に記載のプロ
    テアーゼを含んでなる洗剤用添加剤。
  10. 【請求項１０】前記液体が安定化された液体である、請
    求項９に記載の洗剤用添加剤。
  11. 【請求項１１】請求項１に記載のプロテアーゼを添加す
    ることを含んでなる洗浄方法。
  12. 【請求項１２】請求項６〜８のいずれか１項に記載の洗
    剤組成物を添加することを含んでなる、請求項11に記載
    の洗浄方法。
  13. 【請求項１３】請求項９又は10に記載の洗剤用添加剤を
    添加することを含んでなる、請求項11に記載の洗浄方
    法。
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