<Desc/Clms Page number 1>
"Protéase alcaline, sa préparation et son utilisation"
<Desc/Clms Page number 2>
"Protéase alcaline, sa préparation et son utilisation"
La présente invention est relative à une nouvelle protéase alcaline API-21 et au procédé de préparation de celle-ci. D'une manière plus spécifique, l'invention se rapporte à la protéase alcaline API-21 provenant d'une bactérie et ayant une activité enzymatique même à une température relativement basse (par exemple de la température ambiante jusqu'à environ 400C) sous des conditions alcalines et elle se rapporte également à un procédé de préparation de cette protéase à partir de la culture d'une nouvelle espèce de bactérie NKS-21 appartenant au genre Bacillus.
Les protéases alcalines sont largement utilisées dans lesdomaines teb que, par exemple, l'industrie du cuir, l'industrie alimentaire, l'industrie des fibres ou des matières textiles et l'industrie des produits médicinaux ou pharmaceutiques ; la raison de cela provient du fait que les protéases alcalines sont plutôt stables vis-à-vis de la chaleur comparativement aux protéases neutres. De plus, la demande sur le marché en enzymes comme additif de détergent s'est accrue récemment. Les enzymes utilisées ordinairement comme additif de détergent sont des protéases alcalines provenant de bactéries appartenant au genre Bacillus, qui montrent une activité
<Desc/Clms Page number 3>
maximale à un pH d'environ 9 à environ 10.
La plupart des enzymes susmentionnées montrent une activité maximale à une température relativement élevée, en particulier aux alentours des 60 C, mais sont inactives ou moins actives à une température relativement basse, en particulier aux alentours de la température ambiante. Ceci signifie que les caractéristiques des enzymes ne sont pas totalement utilisées dans des pays tels que le Japon, où les vêtements sont généralement lavés à la température ambiante. De plus, le développement d'enzymes ayant une activité enzymatique qui se'maintient même à une température relativement basse est nécessaire dû à l'utilisation accrue récente de vêtements en fibres chimiques ayant une stabilité à la chaleur relativement faible et également dû au récent mouvement d'économie d'énergie.
Par conséquent, le but de la présente invention consiste à palier aux inconvénients susmentionnés des protéases alcalines connues en prévoyant une nouvelle protéase alcaline ayant une activité enzymatique élevée à une température relativement basse.
Un autre but de la présente invention consiste à prévoir un procédé de préparation d'une nouvelle protéase alcaline ayant une activité enzymatique élevée à partir d'une nouvelle bactérie capable de produire celle-ci.
Les autres buts et avantages de la présente invention ressortiront de la description suivante.
Suivant la présente invention, on prévoit
<Desc/Clms Page number 4>
une protéase alcaline Api-21 ayant les propriétés physico-chimiques suivantes : (1) Activité : Elle hydrolyse la caséine sous des conditions alcalines, avec une gamme de pH
EMI4.1
optimale de 10 à 11, et a une gamme de températures optimale pour ce qui est de son activité de 450C à 50 C ; (2) Stabilité : Pas de diminution de l'activité enzymatique observée jusqu'à 40 C par chauffage sans substrat pendant 10 minutes à un pH de 10, mais diminution de 90% ou plus de l'activité enzymatique observée à 50 C pendant 10 minutes à un pH de 10.
Une désactivation apparatt à 50 C pendant 10 minutes à pH 8 et une désactivation complète se produit pratiquement à 60 C pendant 10 minutes à pH 8. La protéase est stable sous des conditions alcalines, en particulier dans une gamme de pH de 7 à 11, 5, et elle est stable vis-à-vis de la congélation et de la dessiccation par évaporation de la glace ou congélation ; (3) Molécule d'enzyme :
La protéase est une protéine ayant un poids moléculaire d'environ 22000 tel que déterminé par filtration sur gel sur Séphatex G-75 (marque déposée) à pH 10, un point isoélectrique de 7,4 tel que déterminé par une méthode d'électrofocalisation, un pic d'absorption de 275 à 282 nm dans un spectre d'absorption UV, les caractéristiques d'absorption dans l'infrarouge telles que représentées sur la figure 5, et un résidu de sérine dans le site actif de celle-ci.
On prévoit également, suivant la présente invention, un procédé de préparation de protéase alca-
<Desc/Clms Page number 5>
line API-21 comprenant les étapes suivantes : (a) la culture d'une espèce de NKS-21 du genre Bacillus capable de produire de la protéase alcaline API-21 dans un milieu de culture alcalin ; et (b) la récupération de la protéase alcaline API-21 du produit cultivé.
D'autres détails et particularités de l'invention ressortiront de la description ci-après, donnée à titre d'exemple non limitatif et en se référant aux dessins annexés, dans lesquels :
La figure 1 représente graphiquement la gamme de pH optimale de l'enzyme suivant la présente invention.
La figure 2 représente graphiquement la stabilité vis-à-vis du pH de l'enzyme sans substrat suivant la présente invention.
La figure 3 représente graphiquement la gamme de températures actives et la température optimale de l'enzyme suivant la présente invention.
La figure 4A et 4B représentent graphiquement les stabilités vis-à-vis des températures de l'enzyme sans substrat suivant la présente invention respectivement à des pH de 10 et 8.
La figure 5 représente le spectre infrarouge avec transformation de Fourier de l'enzyme suivant la présente invention.
La demanderesse a étudié les bactéries qui pouvaient produire une protéase alcaline ayant une activité élevée à une température relativement faible.
Suite à la classification et à la recherche d'un grand nombre de souches de bactéries isolées à partir de
<Desc/Clms Page number 6>
terre ou de sol naturel, la nouvelle bactérie appartenant au genre Bacillus sp. nov. NKS-21 (appelée ciaprès NKS-21 qui peut produire de la protéase alcaline ayant une activité élevée à une température relativement basse a été isolée des sols naturels à Fuchu-shi, Tokyo, Japon. On a constaté d'après les propriétés microbiologiques de cette bactérie qu'une souche NKS-21 capable de produire de la protéase alcaline API-21 suivant la présente invention est une nouvelle bactérie à sporanges aérobie appartenant au genre Bacillus.
Cette bactérie NKS-21 a été déposée le 3 février 1982 au Fermentation Research Institute (FRI) (Japon) sous la dénomination de Bacillus sp. FERM BP-93 conformément au Traité de Budapest sur la reconnaissance internationale du dépôt des micro-organismes aux fins de la procédure en matière de brevets.
Les propriétés microbiologiques de cette bactérie sont expliquées ci-après. Les réactifs et les méthodes d'isolement utilisés pour la détermination des propriétés microbiologiques de la bactérie NKS- 21 sont ceux décrits dans le"Bergey"s Manual of Determinative Bacteriology" (8ème édition) (1974).
L'isolement de la bactérie du sol est réalisé de la façon suivante ; on ajoute une petite quantité de sol ou de terre à un milieu à base de peptone et on réalise la culture en utilisant un dispositif de culture à secousses sous des conditions de pH de 7 à 10 et de températures de 10 à 40 C pendant 40 à 150 heures.
On étend une partie du produit cultivé sur des plaques d'agar et on isole la souche par une méthode d'isole-
<Desc/Clms Page number 7>
ment pure usuelle.
Propriétés microbiologiques de la bactérie
NKS-21 (a) Caractéristiques morphologiques.
(1) Dimension des cellules végétatives :
0,6-0, 8 um x 2,5-3, 5 pm (microns).
(2) Pléomorphisme cellulaire :
Les cellules grossissent quelque fois jusqu'à une taille de 0,6-1, 0 pm x
4,5 pm.
(3) Coloration au Gram :
Positive mais se décolore aisément.
(4) Motilité :
Mobile avec le peritrichous flagella.
(5) Spores :
Ovales à elliptiques, subterminales,
EMI7.1
0, 8 um x 2 um.
(6) Sporanges :
Légèrement gonflés.
(7) Résistance aux acides :
Négative.
(b) Caractéristiques culturales dans diffé- rents milieux
EMI7.2
.
(1) Bouillon de peptone : (i) pH de 9, 5 : bonne croissance à la fois à 200C et 30 C. pH de 7, 2 : croissance peu dévelop- pée à 200C et bonne croissance à 300C (ii) température de croissance à pH de 9,5
Croissance entre 14 C et 41 C
<Desc/Clms Page number 8>
Pas de croissance au-dessus de 43 C ou en dessous de 12 C.
(2) Autres milieux :
Culture couchée d'agar à la peptone- extrait de viande :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-extrait de viande contenant 7% de chlorure de sodium :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-extrait de viande :
Bonne croissance
Culture couchée d'agar à la peptone- extrait de viande-caséine :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-extrait de viande- caséine :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-amidon :
Bonne croissance
Bouillon de peptone-glucoce :
Bonne croissance
Plaque d'agar à l'extrait de levure- triptone :
Bonne croissance
Bouillon d'extrait de levure-amidon :
Croissance culture en colonne à base de gélatine- extrait de viande :
(i) pH de 10,0, 300C
Croissance et liquéfaction (ii) pH de 10,0, 20 C
Faible croissance superficielle et fai- ble liquéfaction
<Desc/Clms Page number 9>
(iii) pH de 7,2, 300C
Croissance et liquéfaction (iv) pH de 4,2, 200C
Faible croissance superficielle et faible liquéfaction (3) Croissance dans des conditions d'anaé- robie :
Pas de croissance dans des conditions d'anaérobie, mais croissance dans des conditions d'aérobie.
(c) Caractéristiques physiologiques (1) Réduction des nitrates en nitrites :
Pas de réduction (2) Production anaérobie de gaz à partir de nitrate :
Négative (3) Essai au rouge de méthyle (MR) :
Négatif (4) Essai de Voges-Proskauer (VP) :
Négatif (5) Production d'indole :
Aucune (6) Production de H2S :
Aucune (7) Hydrolyse d'amidon :
Positive (8) Utilisation de citrate :
Positive (9) Utilisation de source d'azote inorganique :
Utilise des nitrates et des sels d'am- monium
<Desc/Clms Page number 10>
(10) Production de pigment :
Aucune (11) Essai à l'uréase :
Négatif (12) Essai à la cytochrome oxydase :
Positif (13) Essai à la catalase :
Positif (14) Essai O-F (milieu de Hugh et
Leifson) :
Faible fermentation (15) Production d'acide et production de gaz à partir d'hydrates de carbone :
EMI10.1
<tb>
<tb> Production <SEP> Production
<tb> d'acide <SEP> de <SEP> gaz
<tb> L-arabinoseD-xylose-D-glucose-D-mannose-D-fructose-D-galactose <SEP> +Maltose <SEP> +Sucrose <SEP> +LactoseTréhalose <SEP> +D-sorbitol <SEP> +D-mannitol <SEP> +Inositol <SEP> +
<tb> Glycérol <SEP> +Amidon <SEP> +RiboseRaffinose <SEP> +Cellobiose <SEP> +-
<tb> (Remarques) <SEP> +: <SEP> positive, <SEP> -: <SEP> négative
<tb>
<Desc/Clms Page number 11>
(16) Autres (i) Désamination de la phénylalanine :
Positive (ii) Hydrolyse de la caséine :
Positive (iii) Décomposition de la tyrosine :
Positive
Comme indiqué ci-dessus, la souche NKS-21 de la présente invention est une bactérie à sporanges aérobie, qui comme on le croit fermement, appartient au genre Bacillus.
Les caractéristiques de cette souche résident dans le fait que la souche croît dans des milieux neutre à alcalin, et que la gamme de pH optimale pour la croissance s'étend de 8 à 10. Ces propriétés r. ticrobiologiques sont similaires à celles des souches connues Bacillus pasteurii et Bacillus alcalophilus. La souche NKS-21 de la présente invention se distingue toutefois nettement des deux souches susmentionnées par certaines propriétés microbiologiques, bien que certaines propriétés microbiologiques de la souche NKS-21 soient les mêmes que celles des souches connues susmentionnées. Par exemple, les souches Bacillus pasteurii et Bacillus alcalophilus se développent toutes deux dans une région de pH alcalins mais cette dernière ne peut pas se développer à un pH de 7.
Par contre, la souche NKS-21 se développe bien non seulement dans une région de pH alcalins mais également à un pH neutre. Par conséquent, la souche NKS-21 diffère de la souche Bacillus alcalophilus sous ce rapport. De plus, Bacillus pasteurii n'hydrolyse pas l'amidon, tandis que la souche NKS-21 hydrolyse d'amidon. La souche NKS-21 se distingue
<Desc/Clms Page number 12>
encore de Bacillus pasteurii sous les rapport suivants : (1) Bacillus pasteurii réduit les nitrates, tandis que la souche NKS-21 ne réduit pas les nitrates ; (2) Bacillus pasteurii comporte des endospores en forme de sphère ou presque ovales, tandis que les endospores de NKS-21 sont ovales à elliptiques ; et (3) Bacillus pasteurii décompose l'urée, tandis que la souche NKS-21 ne décompose pas l'urée.
Compte tenu des différences susmentionnées dans les propriétés microbiologiques, la souche NKS- 21 se différencie nettement de la souche Bacillus pasteurii.
Les résultats de classification de Bacillus alcalophilus ne sont pas décrits en détail dans le "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology"susmentionné. Etant donné que la souche standard de Bacillus alcalophilus n'était pas disponible, les propriétés microbiologiques de NKS-21 ont été comparées expérimentalement à celles des souches d'origine Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et NCIB 10438 citées dans le"Bergey's Manual of Determinative Bacteriology". Les souches NCIB 10436 et NCIB 10438 étaient toutes deux légèrement positives dans la réaction de coloration au Gram et étaient facilement décolorées. Ces propriétés sont similaires à celles de la souche NKS-21.
Pour ce qui est des caractéristiques morphologiques des cellules végétatives, de courtes baguettes ayant une dimension de 0,7 pm x 2,0 pm et de longues baguettes ayant une dimension de 0,8 um x 4,6 um ont été remarquées au mi-
<Desc/Clms Page number 13>
croscope électronique chez la souche NCIB 10436, et des cellules végétatives ayant une dimension de 0,7 pm x 1,5 pm ont été remarquées chez la souche NCIB 10438. Par contre, on a déterminé au moyen du microscope électronique que la dimension des cellules végétatives de la souche NKS-21 était de 0,6-0, 8 pm x 2, cm et que les endospores avaient une forme ovale à elliptique d'une dimension de 0,8 pm x 1,2 u. m. Aucune motilité n'a été observée chez les souches NCIB 10436 et 10438, tandis que la souche NKS- 21 est mobile.
De plus, les propriétés physiologiques de NKS-21 sont nettement différentes de celles des souches NCIB 10436 et NCIB 10438 sous les points suivants : (1) Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et NCIB 10438 ne se développent pas dans un milieu à base de mannitol, tandis que NKS-21 s'y développe ; et (2) NCIB 10436 ne se développe pas dans un bouillon de peptone-extrait de viande contenant 7% de chlorure de sodium, tandis que NCIB 10438 et NKS-21 s'y développent.
D'après les différences susmentionnées, la souche NKS-21 se distingue de Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et NCIB 10438, bien que certaines propriétés microbiologiques de NKS-21 soient similaires à celles des Bacillus alcalophilus.
De plus, la souche NKS-21 est similaire à Bacillus subtilis en ce sens que les cellule végétatives de Bacillus subtilis ont de 0,7 à 0,8 pm de largeur et de 2 à 3 pm de longueur et que Bacillus subtilis décompose l'amidon. Toutefois, la
<Desc/Clms Page number 14>
souche NKS-21 se différencie de Bacillus subtilis par les points suivants : (1) Bacillus subtilis se développe bien à un pH de 5,5 à 8,5, mais ne se développe pas à un pH de 9 à 10, pH auquel la souche NKS-21 se développe bien ; et (2) La température de croissance maximale de Bacillus subtilis est de 45 C à 55 C, tandis que la souche NKS-21 ne croît pas au-dessus de 430C.
Par conséquent, la souche NKS-21 se différencie nettement de Bacillus subtilis.
C'est ainsi que la souche NKS-21 se distingue nettement par ses propriétés microbiologiques des souches connues de Bacillus pasteurii, Bacillus alcalophilus et Bacillus subtilis et que toute souche ayant les mêmes propriétés microbiologiques que NKS-21 n'est pas décrite dans le "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology". Par conséquent, la souche NKS-21 est identifié comme étant une nouvelle souche appartenant au genre Bacillus.
Suivant la présente invention, on prépare la nouvelle protéase alcaline API-21 ayant une activité élevée à une température relativement basse en cultivant la nouvelle souche NKS-21 dans un milieu de culture alcalin, et en la récupérant du produit cultivé. Les micro-organismes utilisables dans la culture ne sont pas limités à NKS-21, et les microorganismes tels que des mutants naturels ou artificiels de NKS-21 peuvent également être utilisés pour autant qu'ils puissent produire de la protéase alcaline API-21. Ces micro-organismes entrent dans le
<Desc/Clms Page number 15>
cadre de la présente invention.
La nouvelle protéase alcaline API-21 obtenue en cultivant la souche NKS-21 suivant la présente invention sera expliquée en détail.
La souche NKS-21 peut être cultivée aérobiquement, par exemple dans un milieu de culture à base de peptone ayant un pH de 8 à 10, la culture étant soumise à des secousses ou à une agitation aérobie après inoculation de NKS-21 dans le milieu de culture à une température de 10 C à 400C pendant 40 à 150 heures. Après l'achèvement de la culture, les cellules microbiennes cultivées sont aisément séparées du produit cultivé et l'on obtient une solution surnageante de culture claire. La protéase alcaline API- 21 est aisément précipitée par l'addition d'un solvant organique, tel que le méthanol, à la solution surnageante. On soumet la protéase alcaline API-21 précipitée à une séparation centrifuge et on la sèche par congélation sous vide.
C'est ainsi que l'on peut obtenir l'enzyme désirée, à savoir la protéase alcaline API-21.
L'activité de la protéase alcaline API-21 ainsi obtenue est déterminée de la façon suivante.
On dilue d'une façon appropriée la solution claire cultivée ou la solution enzymatique avec une solution tampon de carbonate de sodium 0,1 M-acide borique 0, 1 M-chlorure de potassium (pH de 10, 0).
On ajoute à 0,5 ml de la solution résultante, 0,5 ml d'une solution à 2% de caséine de lait ayant un pH de 10,0 et, ensuite, on effectue une réaction enzymatique à 30 C pendant 10 minutes. Une fois
<Desc/Clms Page number 16>
la réaction achevée, on ajoute au mélange de réaction pour terminer la réaction 2 ml d'acide trichloroacétique 0,1 M contenant de l'acide acétique 0,2 M et de l'acétate de sodium 0,2 M. On laisse le mélange au repos pendant 10 minutes ou plus à 300C et, ensuite, on le filtre à travers du papier filtre. On ajoute à 1 ml du filtrat obtenu ci-dessus 1 ml de carbonate de sodium 0,4 M et cinq fois 1 ml de"phénol réactif"dilué et on laisse le mélange au repos à 300C pendant 20 minutes pour que la couleur apparaisse.
Ensuite, on mesure l'absorption du mélange coloré à 660 nm.
L'unité d'enzyme est déterminée conformément à la "Commission sur la Nomenclature Biochimique" (Comprehensive Biochemistry volume 13, pages 26 et 27,1973), selon laquelle la quantité de protéase alcaline qui libère des substances solubles dans l'acide trichloroacétique montrant une production de couleur à 660 nm correspondant à 1 mole de tyrosine à partir d'un substrat de caséine (1%) ayant un pH de 10,0 à 30 C pendant 1 seconde est définie comme étant de"1 katal".
Les propriétés physicochimiques de la protéase alcaline API-21 (appelée ci-après enzyme de la présente invention) seront à présent décrites en détail.
(1) Activité
Elle hydrolyse des protéines telles que la caséine, l'hémoglobine, l'albumine, la globuline, la protéine de viande, la protéine de poisson et la protéine de graines de soja.
(2) Effet du pH sur l'activité enzymatique
Comme indiqué sur la figure 1, le pH optimal est d'environ 10 à environ 11. L'activité relati-
<Desc/Clms Page number 17>
ve a été déterminée de la façon suivante.
Chaque solution tampon (0,5 ml) mentionnée ci-après contenant 2% de caséine de lait a été ajoutée à 50 ul de la solution d'enzyme de la présente invention pour préparer une solution d'essai. pH Solution tampon 6-9 phosphate de potassium 0,1 M-borate de sodium 0,05 M karbonate de sodium 0,1 M-acide borique O, lM- chlorure de potassium 11-12 hydrogénophosphate disodique 0,1 M-hydroxyde de sodium
L'activité enzymatique de la solution d'essai a été déterminée de la manière telle que décrite ci-dessus. On a calculé l'activité relative (%), l'activité enzymatique à pH 10,0 ayant été définie comme étant de 100%.
(3) Effet du pH sur la stabilité sans substrat
Comme indiqué sur la figure 2, l'enzyme de la présente invention est stable dans la gamme de pH d'environ 7 à environ 11, 5.
La stabilité de l'enzyme de la présente invention a été évaluée de la façon suivante.
Chaque solution tampon (0,5 ml) mentionnée
EMI17.1
ci-après a été ajoutée à 50 ul de la solution d'enzy- me de la présente invention dialysée et diluée de façon appropriée et le mélange a été incubé à 30 C pendant 10 minutes.
<Desc/Clms Page number 18>
pH Solution tampon 3-8 acide citrique 0,1 M-hydrogénophosphate disodique 0,2 M 8-11 carbonate de sodium 0,1 M-acide borique
0,1 M-chlorure de potassium 11-12 hydrogénophosphate disodique 0,15 M-hydroxy- de de sodium
Après incubation, on ajoute au mélange 9,5 ml d'une solution tampon de carbonate 0,1 M conte- nant 2% de caséine et ayant un pH de 10, 0. L'activi- té enzymatique du mélange a été déterminée de la ma- nière telle que décrite ci-dessus.
On a calculé l'activité relative (%), l'activité enzymatique à pH 10,0 ayant été définie comme étant de 100%.
Comme indiqué sur la figure 2, l'enzyme de la présente invention s'est révélés le plus stable à un pH d'environ 10 à environ 11. Dans cette ré- gion de pH, l'activité initiale de l'enzyme de la présente invention était totalement conservée. De plus, l'enzyme a montré 80% ou plus de l'activité res- tante dans la gamme de pH allant de 7 à 11, 5.
(4) Effet de la température sur l'activité enzymatique
Comme indiqué sur la figure 3, l'enzyme de la présente invention s'est révélée active vis-à-vis de la caséine âme température de 5 à 650C et à un pH de 10,0. La température optimale était de 45 à 50 C.
(5) Effet de la température sur la stabili- té sans substrat
Comme indiqué sur les figures 4A et 4B, l'ac- tivité de l'enzyme de la présente invention est tota- lement conservée jusqu'à 40 C par chauffage sans
<Desc/Clms Page number 19>
substrat à un pH de 10,0 pendant 10 minutes, mais la majeure partie de l'activité est : perdue à 50 C. De plus, l'activité de l'enzyme de la présente inven-
EMI19.1
tion est conservée jusqu'à 45 C à un pH de 8 pendant 10 minutes, mais une désactivation se produit à 50 C et l'enzyme est pratiquement désactivéeà 60 C.
(6) Stabilité à la conservation
L'enzyme de la présente invention est stable vis-à-vis de la congélation et du séchage par congélationou évaporation de la glace. On n'a pas observé de diminution importante de l'activité de l'échantillon séché par congélation lorsqu'on laisse celui-ci à l'abandon à la température ambiante pendant 2 semaines. Lorsque l'on conserve l'échantillon séché par congélation dans un dessiccateur à la température ambiante, l'activité de l'enzyme de la présente invention est totalement maintenue.
(7) Inhibition
L'enzyme de la présente invention a été inhibée, d'une manière singulière, par un inhibiteur de résidu de sérine actif, tel que l'acide diisopropylfluorophosphorique (DFP) et le fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF). Elle a également été inhibée par la benzyloxycarbonyl-phénylalanine-chlorométhyl cétone (ZPCK). Toutefois, l'enzyme de la présente invention n'a pas été inhibés par la tosyl-phénylalanine-chlorométhyl cétone (TPCK), qui est un inhibiteur d'une protéase de sérine animale, la chymotrypsine et la tosyl-lysine-chlorométhyl cétone (TLCK), qui est un inhibiteur de la trypsine.
De plus, l'activité de l'enzyme de la pré-
<Desc/Clms Page number 20>
sente invention n'a pas été modifiée d'une façon défavorable par l'addition de benzoate de p-chloromercure (PCMB) et d'éthylènediaminetétraacétate (EDTA). De plus, l'activité de l'enzyme de la présente invention n'a pas été modifiée d'une façon défavorable par l'addition de pepstatine. Suite aux essais d'inhibition susmentionnés, il est clair que l'enzyme de la présente invention est une protéase ayant un résidu de sérine dans le site actif.
(8) Méthode de détermination de l'activité enzymatique
Telle que mentionnée ci-dessus.
(9) Poids moléculaire
Le poids moléculaire de l'enzyme de la présente invention est d'environ 22000 tel que déterminé par une filtration sur gel sur Séphatex (marque déposée) G-75 à un pH de 10.
(10) Point isoélectrique
Le point isoélectrique de l'enzyme de la présente invention est de 7,4 tel que déterminé par une méthode d'électrofocalisation.
(11) Absorption dans l'ultraviolet (UV)
Le pic d'absorption est présent à 275-282 um dans le spectre d'absorption UV.
(12) Spectre d'absorption dans l'infrarouge (IR)
Comme indiqué sur la figure 5.
(13) Analyse élémentaire
A été omise pour la raison que les différences caractéristiques dans ce type de substances de poids moléculaire élevé, comme l'enzyme de la présente invention, ne peuvent pas être bien mises en évidence
<Desc/Clms Page number 21>
par la comparaison de leurs teneurs en éléments, tels que le carbone, l'azote ou l'hydrogène.
(14) Composition en aminoacides
La composition en aminoacides de la protéase API-21 calculée sur la base des résultats obtenus par une hydrolyse acide de l'enzyme à l'exception de la cystéine/cystine et du tryptophane, par une décomposition d'acide performique pour l'analyse concernant la cystéine/cystine et par une décomposition alcaline pour l'analyse concernent le tryptophane, suivant la méthode décrite dans la littérature ("Methods in Enzymology"volume II, 1967, Academic Press, New York) est indiquée dans le Tableau I, en même temps que les compositions d'autres protéases alcalines,
EMI21.1
1 dont les résultats sont cités dans la 2).
Comme indiqué dans le Tableau I, il y a de grandes différences entre l'enzyme API-21 et les autres enzymes citées dans les compositions en aminoacides, tels que la sérine, l'arginine, la lysine, la valine, l'alanine, le tryptophane, la proline, etc.
<Desc/Clms Page number 22>
TABLEAU I Comparaison des compositions en aminoacides entre API-21 et d'autres protéases alcalines
EMI22.1
<tb>
<tb> Aminoacide <SEP> API-21 <SEP> Subtilisin <SEP> Subtilisin
<tb> Novo <SEP> 1) <SEP> Carlsberg <SEP> 2)
<tb> Lysine <SEP> 4 <SEP> 11 <SEP> 9
<tb> Histidine <SEP> 8 <SEP> 6 <SEP> 5
<tb> Arginine <SEP> 8 <SEP> 2 <SEP> 4
<tb> Tryptophane <SEP> 0 <SEP> 3 <SEP> 1
<tb> Acide <SEP> aspartique/2711 <SEP> 9
<tb> asparagine <SEP> 17 <SEP> 19
<tb> Thréonine <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 19
<tb> Sérine <SEP> 17 <SEP> 37 <SEP> 32
<tb> Acide <SEP> glutamique/14 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP>
<tb> gultamine <SEP> 11 <SEP> 7
<tb> Proline <SEP> 7 <SEP> 14 <SEP> 9
<tb> Glycine <SEP> 30 <SEP> 33 <SEP> 35
<tb> Alanine <SEP> 26 <SEP> 37 <SEP> 41
<tb> Valine <SEP> 20 <SEP> 30 <SEP> 31
<tb> Isoleucine <SEP> 10 <SEP> 13 <SEP> 10
<tb> Leucine <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16
<tb> Tyrosine <SEP> 12 <SEP>
10 <SEP> 13
<tb> Phénylalannine <SEP> 4 <SEP> 3 <SEP> 4
<tb> Cystéine/0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP>
<tb> cystine
<tb>
*1) J. Biol. Chem., 243,5296 (1968) *2) J. Biol. Chem., 243,2134 (1968)
Comme on peut le voir d'après les résultats susmentionnés, l'enzyme de la présente invention, qui a un pH optimal de 10 à 11, conserve l'activité à une température relativement basse, mais est désactivée à
<Desc/Clms Page number 23>
une température relativement élevée (c'est-à-dire 500C ou plus). L'enzyme de la présente invention présentant ces propriétés physicochimiques sera à présent compara aux propriétés de protéases alcalines similaires connues.
Parmi les protéases alcalines extracellulaires provenant des bactéries Gram positives on connatt bien, par exemple, la protéase alcaline (subtilisine de Carlsberg) provenant de Bacillus licheniformis et la protéase alcaline (subtilisine de Novo) provenant de Bacillus subtilis.
Ces enzymes sont des protéases ayant un résidu de sérine dans le site actif, un poids moléculaire d'environ 27000 à 30000 et un point isoélectrique de 9 à 11. La plupart des autres protéases alcalines extracellulaires rapportées dérivées du genre Bacillus ont un poids moléculaire de 25000 à 30000 et un point isoélectrique de 9 à 11. La plupart des enzymes susmentionnées ne sont pas désactivée par chauffage à 50 C et à pH 10 pendant 10 minutes. Les protéases alcalines connues ayant un poids moléculaire inférieur provenant du genre Bacillus sont les protéases alcalines E-l et E-2 provenant de Bacillus nO D-6, toutes deux ayant un poids moléculaire de 20000, dont l'activité ne diminue pas du tout par
EMI23.1
chauffage à 50 C et à pH de 9, 0 (voir la demande de brevet japonais examinée nO 56-4236).
De plus, on connatt dans la technique comme protéase alcaline dérivée du genre Bacillus une protéase alcaline proverant de Bacillus alcalophilus NCIB 10436 et une protéase alcaline provenant de Bacillus alcalophilus NCIB 10438.
<Desc/Clms Page number 24>
Ces enzymes conservent toutefois environ 90% de l'activité par chauffage à 500C et à pH 10 pendant 10 minutes, comme indiqué dans le Tableau II. De même, également comme indiqué dans le Tableau II, les protéases alcalines provenant de Bacillus licheniformis et de Bacillus subtilis conservent 70 à 80% de l'activité par chauffage à 500C et à pH 10 pendant 10 minutes. C'est ainsi que les protéases alcalines provenant de bactéries appartenant au genre Bacillus telles que Bacillus subtilis sont stables dans une région de températures relativement élevées.
Contrairement à. eci, tel que mentionné ci-dessus, l'enzyme de la présente invention perd la majeure partie de son activité par chauffage à 500C et à pH 10 pendant 10 minutes, tout en étant stable par chauffage à une température allant jusqu'à 40 C et à pH 10 pendant 10 minutes. De plus, la désactivation de l'enzyme de la présente invention se produit par chauffage à
EMI24.1
environ 500C et à pH 8 pendant 10 minutes et la majeure partie de son activité est perdue à 600C sous les mêmes conditions.
Compte tenu des différences que l'on trouve dans la stabilité à la température, le poids moléculaire et le point isoélectrique, l'enzyme de la présente invention se distingue nettement des protéases alcalines connues provenant de bactéries appartenant au genre Bacillus et n'a pas été rapportée dans des publications. Par conséquent, l'enzyme de la présente invention doit être considérée comme étant une nouvelle enzyme et est désignée par l'expression"protéase alcaline API-21".
<Desc/Clms Page number 25>
TABLEAU II
EMI25.1
<tb>
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> Poids <SEP> mole-Point <SEP> iso-Activité <SEP> restante <SEP> (%) <SEP> après
<tb> culaire <SEP> électrique <SEP> chauffage <SEP> à <SEP> pH <SEP> 10 <SEP> pen. <SEP> dant <SEP>
<tb> 10 <SEP> minutes
<tb> 500C <SEP> 600C <SEP>
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant <SEP> *3) <SEP> *3)
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> licheniformis <SEP> 27.287 <SEP> 9,4 <SEP> 78 <SEP> < 2
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant <SEP> *4) <SEP> *4)
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> subtilis <SEP> 27.537**) <SEP> 9,1**) <SEP> 70 <SEP> < 2
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> alcalophilus
<tb> NCIB <SEP> 10436--94 <SEP> 73
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> alcalophilus
<tb> NCIB <SEP> 10438 <SEP> 25.
<SEP> 000-85 <SEP> 63
<tb> Protéase <SEP> alcaline <SEP> provenant
<tb> de <SEP> Bacillus <SEP> NKS-21 <SEP> 22. <SEP> 000 <SEP> 7,4 <SEP> 6 <SEP> 1
<tb>
*3) Fette Seiten Anstrichmittel. 75, p49 (1973) *4) The Enzymes, vol III, p564 (1971)
<Desc/Clms Page number 26>
On peut utiliser l'enzyme"API-21"de la présente invention avec une substance favorisant l'action de nettoyage des détergents et on peut donc l'utiliser comme additif de détergent, puisque cette enzyme est stable à un pH de 7 à 11, 5 et que l'activité enzymatique maximale est atteinte à un pH de 10 à 11, comme mentionné ci-dessus.
En particulier, l'enzyme de la présente invention conserve son activité élevée même à une température relativement basse (par exemple 200C à 300C), comparativement aux enzymes usuelles utilisés avec les détergents. Par conséquent, l'enzyme de la présente invention est un type de protéase alcaline particulièrement intéressante comme additif pour les détergents ménagers dans les pays où on lave les vêtements à la température ambiante comme le Japon. De plus, l'enzyme de la présente invention peut être utilisée d'une manière efficace dans le traitement des résidus et dans le traitement des eaux usées aux fins d'une décomposition rapide des protéines et d'une réutilisation des ressources d'azote, puisque les teneurs en protéines dans les résidus domestiques et dans les eaux usées domestiques ont récemment augmenté.
En outre, l'utilisation de la protéase de la présente invention dans les industrie alimentaires, telles que dans le traitement des matières alimentaires, s'avère avantageuse, puisque l'enzyme peut être aisément désactivée après utilisation par chauffage à une température relativement basse, par exemple 50 à 60 C.
C'est ainsi que l'utilisation de l'enzyme de la présente invention est efficace du point de vue du contrô-
<Desc/Clms Page number 27>
le de la qualité de la matière alimentaire traitée.
Dans le cas où l'enzyme"API-21"de la présente invention est incorporée dans une composition détergente, on utilise d'une manière générale l'enzyme"API-21"en une quantité de 5 à 500 nKatals (ou zo Katal), de préférence à raison de 10 à 100 nKatals par rapport à 1 g de la composition détergente, bien qu'il n'y ait pas de limitation à la quantité d'enzyme utilisée.
En plus de l'enzyme"API-21", la composition détergente contenant l'enzyme peut contenir n'importe quel ingrédient pour détergent usuel sans modifier sa quantité par rapport aux compositions détergentes ordinaires. Des exemples caractéristiques de tels ingrédients pour détergent sont les agents tensioactifs en des quantités de 10 à 50% en poids, les substances favorisant l'action de nettoyage en des quantités de 0 à 50% en poids, les agents alcalins ou électrolytes inorganiques à raison de 1% à 50% en poids, et les agents anti-redépôt, les enzymes, les agents de blanchiment, les colorants optiques (ou fluorescents), les agents empêchant la formation de gateau et les antioxydants. L'incorporation de l'enzyme"API-21"peut être réalisée d'une manière classique quelconque.
Toutefois, l'enzyme est combinée de préférence dans la composition détergente sous la forme d'une solution ou sous une forme telle que toute formation de poussière, pour ce qui est de la protection de l'environnement, en est empêchée.
La présente invention sera à présent illustrée d'une manière plus détaillée par les exemples non
<Desc/Clms Page number 28>
limitatifs suivants, dans lesquels tous les pourcentages sont exprimés en poids, sauf indications contraires.
Exemple 1
On cultive la nouvelle souche NKS-21 de la présente invention dans un milieu de culture couché.
On met en suspension le produit cultivé dans de l'eau stérilisée et on utilise 0,5 ml de cette suspension comme produit d'inoculation.
On ajuste un milieu de culture producteur d'enzyme contenant 1% de caséine, 1% d'extrait de viande, 1% de polypeptone et 1% de bicarbonate de sodium à un pH de 9,5 ou de 7,2 en y ajoutant de l'hydroxyde de sodium aqueux ou de l'acide chlorhydrique.
Dans un processus de culture à secousses (A) utilisant une secoueuse rotative, on ajoute 100 ml, 200 ml ou 300 ml du milieu préparé ci-dessus ayant un pH de 9,5 à un récipient d'Erlenmeyer de 1 litre. Après stérilisation, on inocule 0,5 ml de la suspension de NKS-21 préparée ci-dessus dans le milieu de culture et on réalise la culture à 20 C et sous des conditions d'agitation de 200 tours par minute pendant 41,65 ou 89 heures.
D'un autre côté, dans un processus de culture à secousses à mouvement de va-et-vient (B), on ajoute 100 ml du milieu de culture préparé ci-dessus ayant un pH de 9,5 ou de 7,2 à un récipient de Sakaguchi de 500 ml. Après stérilisation, on inocule 0,5 ml de la suspension de NKS-21 préparés ci-dessus dans le milieu de culture et on réalise le processus
<Desc/Clms Page number 29>
de culture à secousses à mouvement de va-et-vient sous des conditions d'agitation de 110 coups par minute à 300C pendant 66 ou 90 heures.
Après le processus de culture, on centrifuge le produit cultivé à 28000 x g pendant 15 minutes et on récupère la solution surnageante résultante. On détermine l'activité de-la protéase alcaline de cette solution de la manière telle que décrite ci-dessus.
Les résultats sont donnés dans les Tableaux III et IV.
TABLEAU III Résultats du processus de culture à secousses rotatif (A) (20 C, pH initial du milieu = 9, 5)
EMI29.1
<tb>
<tb> Quantité <SEP> de <SEP> Activité <SEP> enzymatique <SEP> (microkatal/litre)
<tb> milieu <SEP> (ml) <SEP> 41 <SEP> hres <SEP> 65 <SEP> hres <SEP> 89 <SEP> hres
<tb> 100 <SEP> 1,3 <SEP> 2,6 <SEP> 2,7
<tb> 200 <SEP> 2, <SEP> 0 <SEP> 4,3 <SEP> 4, <SEP> 0
<tb> 300 <SEP> 2,5 <SEP> 5,6 <SEP> 5,4
<tb>
TABLEAU IV Résultats du processus de culture à secousses à mouvement de va-et-vient (B) (300C)
EMI29.2
<tb>
<tb> pH <SEP> initial <SEP> Activité <SEP> enzymatique <SEP> (microkatal/litre
<tb> du <SEP> milieu <SEP> 66 <SEP> hres <SEP> 90 <SEP> hres
<tb> 9,6 <SEP> 4,5 <SEP> 3,0
<tb> 7,2 <SEP> 4,9 <SEP> 3,
4
<tb>
Lorsque l'on soumet la souche NKS-21 à une culture du type à secousses à mouvement de va-etvient à 30 C, la croissance de la souche NKS-21 est bonne non seulement à un pH de milieu initial de 9,5
<Desc/Clms Page number 30>
mais également à un pH de milieu initial de 7,2 et on obtient la protéase alcaline API-21 désirée à un taux élevé dans chaque cas. Comme dans le cas où l'on utilise un milieu initial avec un pH de 9,5, on obtient des résultats similaires lorsque l'on cultive la souche NKS-21 dans une secoueuse à mouvement de va-et-vient à 20 C et à un pH de milieu initial de 7, 2.
On refroidit jusqu'à 30C 7 litres de la solution surnageante après la séparation centrifuge du produit cultivé (NKS-21) obtenu ci-dessus.
Ensuite, on ajoute deux fois en volume d'alcool éthylique préalablement refroidi à 30C à la solution surnageante refroidie pour former des précipités. Les précipités résultants sont séparés par voie centrifuge à 11000 x g dans un dispositif de séparation centrifuge refroidi et" ensuite, les précipités séparés sont immédiatement séchés par congélation sous vide. C'est ainsi que l'on obtient 15,7 g de la poudre d'enzyme désirée.
L'activité spécifique de la protéase alcaline ainsi obtenue sur base de 1 kg de protéine est de 0,71 u. Katal (0,71 pKatal/kg de protéine) et le rendement de récupération est de 33%, la protéine étant déterminée suivant la méthode de Lowry.
L'échantillon d'enzyme séché par congélation ainsi obtenu est dissous dans une solution tampon de chlorure de potassium-acide bErique-carbona- te de sodium 0,01 M (pH de 10,0) contenant du chlorure de sodium 0,2 M. La solution enzymatique est filtrée sur gel sur une colonne (diamètre de 2 cm x
<Desc/Clms Page number 31>
74 cm) garnie de Séphadex G-75 (marque déposée de Pharmacia Fine Chemicals AB, Suède) préalablement équilibré avec la solution tampon susmentionnée et on récolte des fractions d'éluat de 3 ml. L'enzyme purifiée est obtenue à partir des fractions principales qui ont une activité enzymatique élevée.
L'enzyme ainsi obtenue a un poids moléculaire d'environ 22000 tel que mesuré par filtration sur gel sur Séphadex G-75 (marque déposée) à pH 10 et un point isoélectrique de 7,4 tel que mesuré par une méthode d'électrofocalisation. L'activité spécifique de l'enzyme ainsi obtenue a augmenté d'environ dix fois comparativement à celle sans filtration sur gel et l'activité spécifique obtenue sur base de 1 kg de protéine est de 7,0 pkatals. Le rendement de récupération est de 70%.
Exemple 2
La production de protéase alcaline dans un réservoir de fermentation de 500 litres et la production ultérieure de la préparation enzymatique sont réalisées en utilisant la souche NKS-21 productrice de protéase alcaline.
On ajuste à pH 9,5 un milieu de culture producteur d'enzyme contenant 1% de caséine, 1% d'extrait de viande, 1% de polypeptone et 1% de bicarbonate de sodium en y ajoutant ce l'hydroxyde de sodium aqueux. On ajoute une quantité de 300 ml du milieu préparé ci-dessus à un récipient d'Erlenmeyer de 1 litre. Après stérilisation, on inocule 0,5 ml de la suspension de NKS-21 préparée de la même manière que dans l'Exemple 1, dans le milieu de culture et on
<Desc/Clms Page number 32>
réalise la culture à 200C pendant 3 jours. On ajoute 300 ml du produit cultivé résultant à un récipient de fermentation de 30 litres stérilisé contenant 10 litres du milieu de culture préparé ci-dessus ayant un pH de 9,5.
Ensuite, on réalise une culture sous agitation aérobie à une température de 200C pendant 3 jours sous les conditions d'une vitesse d'agitation de 400 tours par minute et d'un taux d'aération de 12 litres/minute.
Après la culture dans le fermenteur de 30 litres pendant 3 jours, on transfère 10 litres du produit cultivé dans un réservoir de fermentation de 500 litres stérilisé contenant 220 litres du milieu de culture préparé ci-dessus ayant un pH de 9,5. Ensuite, on réalise une culture sous agitation aérobie à 200C pendant 4 jours sous les conditions d'une vitesse d'agitation de 400 tours par minute et d'un taux d'aération de 200 litres/minute.
Après le processus de culture, on centrifuge le produit cultivé à 11000 x g dans un séparateur centrifuge continu refroidi, et on obtient 200 litres d'une solution surnageante. On refroidit cette solution surnageante à 30C. Ensuite, on ajoute deux fois le volume d'alcool éthylique préalablement refroidi à 30C à la solution surnageante refroidie pour précipiter la protéase alcaline désirée. On sépare par voie centrifuge à environ 11000 x g la protéase alcaline API-21 précipitée dans un séparateur centrifuge continu refroidi et, ensuite, on sèche immédiatement par congélation sous vide la protéase alcaline API-21 séparée.
C'est ainsi que l'on obtient la préparation
<Desc/Clms Page number 33>
enzymatique à base de protéase alcaline API-21 séchée par congélation suivante :
Poids d'enzyme récupéré (g) 1230
Activité spécifique (microkatal/kg de protéine) 0,
Rendement de récupération (%) 70
L'enzyme ainsi obtenue est purifiée de la même manière que dans l'Exemple 1, pour obtenir une protéase alcaline ayant un poids moléculaire d'environ 22000 et un point isoélectrique de 7,4.
Exemple 3
La protéase alcaline"API-21"obtenue ci-dessus et, à titre d'exemple comparatif, une protéase alcaline disponible dans le commerce pour détergent sont examinées en les combinant dans différentes compositions détergentes. L'essai de blanchissage de tissus souillés par du sang est réalisé de la façon suivante :
A. Préparation de tissus de coton souillés par du sang entier
On trempe des échantillons de tissu, sous les conditions suivantes, dans un flot de sang entier de bovin frais et immédiatement après recueilli celui-ci, on ajoute. un volume d'une solution de citrate de sodium pour neuf volumes de sang de manière à empêcher la coagulation. Les échantillons de tissu souillés sont comprimés à 70% au moyen d'une essoreuse de manière à obtenir des tissus souillés uniformément.
Ensuite, les échantillons de tissu sont séchés à l'air dans une pièce sans être exposés directement à la lumière du soleil et sont ensuite conservés à une température de 0 C à 50C dans un endroit sombre au frais.
Après la préparation, les échantillons de tissu sont
<Desc/Clms Page number 34>
découpés à une dimension de 10 cm x 5 cm.
Echantillons de tissu : 10 cm x 15 cm
Liquide de souillure : 100 ml pour dix échantillons de tissu
Température de souillure : 10 20C
Temps de souillure : 5 minutes (le sens de l'agitation est changé toutes les 30 secondes)
B. Processus de lavage
On lave les échantillons de tissu et on les rince (trois fois) sous les conditions suivantes dans un Terg-O-Tomètre.
Conditions de lavage Tissus souillés : 5 cm x 10 cm Détergent : 0, 133% (0,7 nKat/ml d'enzyme Rapport de bain : 1/85 Agitation : 105 tpm Temps de lavage : 10 min.
Conditions de rinçage Tissus souillés : 5 cm x 10 cm Rapport de bain : 1/85 Agitation : 105 tpm Temps de rinçage : 3 min.
Après le rinçage, on sèche à l'air les échantillons de tissu dans une pièce sans les exposer directement à la lumière du soleil.
C. Détergent et enzyme utilisés
On utilise les six détergents phosphatés et non phosphatés suivants comme détergent.
<Desc/Clms Page number 35>
Compositions des détergents
EMI35.1
<tb>
<tb> Composition <SEP> Détergent <SEP> Détergent <SEP> non
<tb> phosphaté <SEP> phosphaté
<tb> Agent <SEP> tensio-actif <SEP> 15% <SEP> 15%
<tb> Tripolyphosphate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 17
<tb> Zéolite-17
<tb> Silicate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Carboxyméthylcellulose <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Eau <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> le <SEP> restant <SEP> le <SEP> restant
<tb>
Le pH de chaque détergent mesuré à une concentration de 0,133% à 250C est le suivant :
pH du détergent
EMI35.2
<tb>
<tb> Type <SEP> d'agent <SEP> tensio-actif <SEP> Détergent <SEP> Détergent <SEP> non
<tb> phosphaté <SEP> phosphaté
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> LAS <SEP> *1 <SEP> 10,18 <SEP> 10,18
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> SUDS <SEP> 2 <SEP> 9,76 <SEP> 9,86
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> AOS <SEP> *3 <SEP> 9,95 <SEP> 10, <SEP> 17
<tb>
EMI35.3
X 1 LAS : alkylbenzènesulfonate de sodium linéaire 2 SDS : dodécylsulfate de sodium 3 AOS : sulfonate d'alpha oléfine
L'enzyme utilisée est une protéase alcaline délivrée dans le commerce pour composition détergente ou la protéase alcaline"API-21"obtenue ci-dessus.
Les résultats sont donnés dans le Tableau V.
L'efficacité en tant que détergent des compositions à base de protéine est déterminée de la fa- çon suivante :
<Desc/Clms Page number 36>
Des échantillons de liquide sont obtenus en extrayant thermiquement des tissus souillés avant et après lavage avec 100 ml d'une solution de NaOH aqueuse 0,1 N à une température de 90 +2 C pendant 120 minutes. On colore chimiquement l'échantillon de liquide avec un réactif de Folin à base de cuivre et on mesure son absorption à une longueur d'onde de 750 nm. On calcule l'efficacité en tant que détergent (D) d'après l'équation suivante :
EMI36.1
où De représente l'absorption de l'extrait obtenu à partir de tissus de coton standard (lg).
Ds représente l'absorption de l'extrait obtenu à partir de tissus souillés (1 g) avant lavage.
Dw représente l'absorption de l'extrait obtenu à partir de tissus souillés (1 g) après lavage.
<Desc/Clms Page number 37>
tableauV
EMI37.1
<tb>
<tb> Présence <SEP> Temp. <SEP> Efficacité <SEP> en <SEP> tant <SEP> que <SEP> détergent <SEP> (%)
<tb> Détergent <SEP> de <SEP> de <SEP> Détergent <SEP> Incorporation <SEP> Protéase <SEP> alcaliné <SEP> du
<tb> phosphate <SEP> lavage <SEP> eau <SEP> uniquement <SEP> de <SEP> API-21 <SEP> commerce <SEP> pour <SEP> détergent
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Oui <SEP> 68, <SEP> 6 <SEP> 85, <SEP> 7 <SEP> 78, <SEP> 6 <SEP>
<tb> Non <SEP> 68,8 <SEP> 82,0 <SEP> 77,3
<tb> type <SEP> SDS <SEP> Oui <SEP> 100C <SEP> 35,0 <SEP> 68, <SEP> 0 <SEP> 85,6 <SEP> 77,7
<tb> Non <SEP> 70,2 <SEP> 85,8 <SEP> 80, <SEP> 9 <SEP>
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 69, <SEP> 4 <SEP> 87, <SEP> 0 <SEP> 80,4
<tb> Non <SEP> 68,0 <SEP> 86,9 <SEP> 80,
0
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Oui <SEP> 73,9 <SEP> 89, <SEP> 8 <SEP> 88,6
<tb> Non <SEP> 72,0 <SEP> 90,0 <SEP> 88,5
<tb> type <SEP> SDS <SEP> oui <SEP> 250C <SEP> 40, <SEP> 9 <SEP> 74, <SEP> 0 <SEP> 91, <SEP> 0 <SEP> 89, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Non <SEP> 69,4 <SEP> 91,3 <SEP> 87,7
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 75,9 <SEP> 91,6 <SEP> 91,6
<tb> Non <SEP> 74,5 <SEP> 90,0 <SEP> 91,6
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Oui <SEP> 73,8 <SEP> 91,7 <SEP> 90,0
<tb> Non <SEP> 74,8 <SEP> 94,3 <SEP> 92,1
<tb> type <SEP> SDS <SEP> Oui <SEP> 400C <SEP> 45,9 <SEP> 73, <SEP> 2 <SEP> 92, <SEP> 4 <SEP> 90, <SEP> 0 <SEP>
<tb> Non <SEP> 74,2 <SEP> 91,7 <SEP> 89,7
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 80, <SEP> 3 <SEP> 92,6 <SEP> 90, <SEP> 5 <SEP>
<tb> Non <SEP> 79,0 <SEP> 91,2 <SEP> 91,0
<tb>
<Desc/Clms Page number 38>
Exemple 4
On répète le processus d'essai de lavage de l'Exemple 3,
à l'exception que l'on modifie l'activité de la protéase dans la solution de lavage et la température de lavage dans le cas du détergent non phosphaté du type LAS contenant la protéase alcaline "API-21".
Les résultats sont donnés dans le Tableau VI.
TABLEAU VI : efficacité en tant que détergent (%)
EMI38.1
<tb>
<tb> Activité <SEP> de
<tb> la <SEP> protéase
<tb> dans <SEP> la <SEP> solu-Température <SEP> de <SEP> lavage
<tb> tion <SEP> de <SEP> lavage
<tb> (nKat/ml) <SEP> 10 C <SEP> 25 C <SEP> 40 C
<tb> 0 <SEP> 68,8 <SEP> 72,0 <SEP> 74,8
<tb> 0,7 <SEP> 78,2 <SEP> 87,8 <SEP> 89,4
<tb> 2,1 <SEP> 80,5 <SEP> 88,6 <SEP> 92,8
<tb> 3,5 <SEP> 80,8 <SEP> 89,4 <SEP> 92,8
<tb> 7 <SEP> 82,0 <SEP> 89,8 <SEP> 94,3
<tb>
Exemple 5
On réalise des essais de blanchissage de tissus de col en coton souillés en utilisant différents détergents contenant la protéase alcaline"API-21" obtenue ci-dessus ou une protéase alcaline disponible dans le commerce pour composition détergente de la façon suivante :
A.
Préparation de tissus de col souillés
On découpe 200 pièces de tissus de col de coton standard souillés pour des essais de détergence, d'une dimension de 7 cm x 37 cm en petits morceaux d'une dimension de 1 cm x 5 cm. Les tissus de col
<Desc/Clms Page number 39>
sont usés pendant 1 semaine suivant la méthode décrite dans Motoi Minagawa et Ikuko Okamoto"Seni Seihin Shohi Kagaku"19, 106-115 (1978). Les petits morceaux sont cousus par dix de manière à former des tissus d'essai ayant une dimension de 5 cm x 10 cm et sont conservés à une température de OOC à 50C dans un emplacement sombre et au frais.
B. Processus de lavage
Les échantillons de tissu sont lavés et rincés (trois fois) sous les conditions suivantes dans un dispositif Terg-O-Tomètre.
EMI39.1
<tb>
<tb>
Conditions <SEP> de <SEP> lavage
<tb> Tissus <SEP> souillés <SEP> : <SEP> 5 <SEP> cm <SEP> x <SEP> 10 <SEP> cm
<tb> Détergent <SEP> : <SEP> 0,133% <SEP> (0,7 <SEP> nKat/ml
<tb> d'enzyme)
<tb> Rapport <SEP> de <SEP> bain <SEP> : <SEP> 1/85
<tb> Agitation <SEP> : <SEP> 105 <SEP> tpm
<tb> Temps <SEP> de <SEP> lavage <SEP> : <SEP> 10 <SEP> minutes
<tb> Conditions <SEP> de <SEP> rinçage
<tb> Tissus <SEP> souillés <SEP> : <SEP> 5 <SEP> cm <SEP> x <SEP> 10 <SEP> cm
<tb> Rapport <SEP> de <SEP> bain <SEP> : <SEP> 1/85
<tb> Agitation <SEP> : <SEP> 105 <SEP> tpm
<tb> Temps <SEP> de <SEP> rinçage <SEP> : <SEP> 3 <SEP> min.
<tb>
Après le rinçage, les échantillons de tissu sont séchés à l'air dans une pièce sans être exposés directement à la lumière du soleil.
C. Détergent et enzyme utilisés
On utilise les quatre détergents phosphatés et non phosphatés suivants comme détergent.
<Desc/Clms Page number 40>
Composition du détergent
EMI40.1
<tb>
<tb> Composition <SEP> Détergent <SEP> Détergent <SEP> non
<tb> phosphaté <SEP> phosphaté
<tb> Agent <SEP> tensio-actif <SEP> 15% <SEP> 15%
<tb> Tripolyphosphate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 17Zéolite <SEP> (4A)-17
<tb> Silicate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 5 <SEP> 5
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> 3 <SEP> 3
<tb> Carboxyméthylcellulose <SEP> 1 <SEP> 1
<tb> Eau <SEP> 8 <SEP> 8
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> le <SEP> restant <SEP> le <SEP> restant
<tb>
Le pH de chaque détergent mesuré à une concentration de 0,133% à 25 C est le suivant :
pH du détergent
EMI40.2
<tb>
<tb> Type <SEP> d'agent <SEP> tensio-actif <SEP> Détergent <SEP> Détergent <SEP> non
<tb> phosphaté <SEP> phosphaté
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> LAS <SEP> xl <SEP> 10,18 <SEP> 10,18
<tb> Détergent <SEP> du <SEP> type <SEP> AOS <SEP> x2 <SEP> 9,95 <SEP> 10,17
<tb>
1 LAS : alkylbenzènesulfonate de sodium linéaire 2 AOS : sulfonate d'alpha-oléfine
L'enzyme utilisée est une protéase alcaline disponible dans le commerce pour composition détergente ou la protéase alcaline"API-21"obtenue ci-dessus.
Les résultats sont donnés dans le Tableau VII ciaprès.
<Desc/Clms Page number 41>
Tableau VII
EMI41.1
<tb>
<tb> Efficacité <SEP> en <SEP> tant <SEP> que <SEP> détergent <SEP> (%) <SEP>
<tb> Présence <SEP> Temp.
<tb>
Détergent <SEP> de <SEP> de <SEP> Détergent <SEP> Incorporation <SEP> Protéase <SEP> alcaline <SEP> du
<tb> Détergent <SEP> Phosphate <SEP> lavage <SEP> Eau <SEP> uniquement <SEP> de <SEP> API-21 <SEP> commerce <SEP> pour <SEP> détergent
<tb> type <SEP> LAS <SEP> oui <SEP> 70, <SEP> 1 <SEP> 82, <SEP> 0 <SEP> 77, <SEP> 9 <SEP>
<tb> Non <SEP> 100C <SEP> 49,3 <SEP> 66, <SEP> 7 <SEP> 82, <SEP> 1 <SEP> 73, <SEP> 6 <SEP>
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 80, <SEP> 4 <SEP> 87,4 <SEP> 86,4
<tb> Non <SEP> 75,0 <SEP> 86,8 <SEP> 83,3
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Oui <SEP> 78, <SEP> 7 <SEP> 85, <SEP> 7 <SEP> 79,0
<tb> Non <SEP> 250C <SEP> 52, <SEP> 1 <SEP> 78,0 <SEP> 80,1 <SEP> 74,2
<tb> Oui <SEP> 80,4 <SEP> 89,6 <SEP> 87,3
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Non <SEP> 80, <SEP> 2 <SEP> 91, <SEP> 2 <SEP> 88, <SEP> 1 <SEP>
<tb> Oui <SEP> 80,3 <SEP> 86,8 <SEP> 86,
8
<tb> type <SEP> LAS <SEP> Non <SEP> 40 C <SEP> 58,3 <SEP> 81,0 <SEP> 91,2 <SEP> 89,7
<tb> type <SEP> AOS <SEP> Oui <SEP> 82,6 <SEP> 90, <SEP> 1 <SEP> 89,0
<tb> Non <SEP> 86,1 <SEP> 89,1 <SEP> 90,4
<tb>
<Desc/Clms Page number 42>
Il doit être entendu que la présente invention n'est en aucune façon limitée aux formes de réalisation ci-dessus et que bien des modifications peuvent y être apportées sans sortir du cadre du présent brevet.