DK158523B - Alkalisk protease og fremgangsmaade til fremstilling deraf - Google Patents

Description

i

DK 158523B

Den foreliggende opfindelse angår en hidtil ukendt alkalisk protease betegnet API-21 og en fremgangsmåde til fremstilling deraf.

Alkalisk protease anvendes i betydeligt omfang inden for forskellige områder såsom læderindustrien, levnedsmiddelindustrien, fiber- eller 5 tekstilindustrien, eller lægemiddelindustrien eller den farmaceutiske industri, fordi alkalisk protease er temmelig stabil over for varme sammenlignet med neutral protease. Endvidere er efterspørgslen efter enzymer som tilsætningsstof til detergenter for nylig blevet forøget. Enzymer, som i praksis anvendes som tilsætningsstof til detergenter, 10 er alkaliske proteaser, som stammer fra bakterier tilhørende slægten Bacillus, der har en maksimumaktivitet ved en pH-værdi på ca. 9-10.

De fleste af de ovennævnte enzymer har en maksimumaktivitet ved en relativt høj temperatur, især ca. 60°C, men er inaktive eller mindre aktive ved en relativt lav temperatur, især ca. stuetemperatur. Dette 15 betyder, at enzymernes karakteristika ikke fuldt ud udnyttes i et land som Japan, hvor tøj sædvanligvis vaskes ved stuetemperatur. Endvidere er der behov for udviklingen af enzymer med bevaret enzymaktivitet selv ved en relativt lav temperatur som følge af den forøgede anvendelse af kemiske fibre til tøj med en relativt lav var-20 mestabilitet og som følge af den for nyligt opståede en ergi s parebevægelse.

Formålet med den foreliggende opfindelse er følgelig at eliminere de ovennævnte ulemper ved de kendte alkaliske proteaser ved at tilvejebringe en hidtil ukendt alkalisk protease med en høj enzymaktivitet 25 ved relativt lav temperatur og en fremgangsmåde til fremstilling heraf.

Den alkaliske protease API-21 ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, a) at den har en optimal proteolytisk aktivitet ved en pH-værdi på 10-11 og ved en temperatur på 45-50°C, idet aktiviteten måles over 30 for casein, b) at den er et protein med en molekylvægt på ca. 22.000 bedømt ved en gelfiltreringsmetode, et isoelektrisk punkt på 7,4, bedømt ved en

DK 158523 B

2 elektrofokuseringsmetode, en absorptionsspids på 275-282 nm i et UV-absorptionsspektrum, IR-absorptionskarakteristika som vist i fig.

5, og har en serinrest i det aktive sted, c) at den har folgende aminosyresammensætning: 5 lysin 4 histidin 8 arginin 8 tryptophan 0 asparaginsyre-'asparagin 27 10 threonin 10 serin 17 glutaminsyre/glutamin 14 prolin 7 glycin 30 15 alanin 26 valin 20 methionin 4 isoleucin 10 leucin 14 20 tyrosin 12 phenylalanin 4 cystein/cystin 0 og d) at den er identisk med den protease, der dannes ved aerob dyrkning af Bacillus-stammen deponeret under nr. FERM BP-93 25 i et egnet basisk dyrkningsmedium.

Fremgangsmåden ifolge opfindelsen er ejendommelig ved, at en stamme af arten NKS-21, for hvilken stammen Bacillus FERM BP-93 er typestammen, dyrkes i et egnet basisk dyrkningsmedium, hvorpå den alkaliske protease API-21 udvindes fra det dyrkede produkt.

Opfindelsen belyses nærmere under henvisning til tegningen, hvor . fig. 1 grafisk viser det optimale pH-område for enzymet ifølge opfindelsen, 30

DK 158523B

3 fig. 2 grafisk viser stabiliteten, hvad angår pH, af enzymet ifølge opfindelsen uden substrat, f*9- 3 grafisk viser det aktive temperaturområde og den optimale temperatur for enzymet ifølge opfindelsen, fig. 4A og 4B grafisk viser stabiliteten, hvad angår temperatur, af 5 enzymet ifolge opfindelsen uden substrat ved en pH-værdi på'henholdsvis 10 og 8, og fig. 5 viser Fourier-transformations infrarødt spektrum for enzymet ifølge opfindelsen.

Stammen Bacillus FERM BP-93, som tilhører arten Bacillus sp. nov.

NKS-21 (i det følgende benævnt NKS-21), der kan danne alkalisk protease med en høj aktivitet ved en relativt lav temperatur, blev isoleret fra en jordprøve ved Fuchu-shi, Tokyo, Japan. Ud fra de mikrobiologiske egenskaber har det vist sig, at den er en hidtil ukendt aerob sporangiumbakterie tilhørende slægten Bacillus.

Denne bakterie NKS-21 er den 3. februar 1982 blevet deponeret hos 15

Fermentation Research Institute (FRI) i Japan i henhold til Budapest-traktaten som Bacillus nr. FERM BP-93.

Denne bakteries mikrobiologiske egenskaber er angivet nedenfor. De reagenser og isolationsmetoder, der blev anvendt til bestemmelse af de mikrobiologiske egenskaber af bakterien NKS-21, var som beskrevet i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, 8. udgave, 1974.

Isolationen af bakterien fra jordprøven blev udført som følger: en lille mængde af en jordmasse blev sat til et peptonmedium, og dyrkningen blev udført i en rystedyrkningsbeholder ved en pH-værdi på 7-10 og 2^ en temperatur på 10-40°C i 40-150 timer. En portion af de dyrkede produkter blev udbredt på agarplader, og stammen blev isoleret ved en sædvanlig renisoleringsmetode.

Mikrobielle egenskaber af NKS-21 a) Morfologiske karakteristika 1) Størrelse af vegetative celler: 0,6-0,8 ym x 2,5-3,5 pm

DK 158523 B

4 2) Cellepleomorfisme:

Cellerne udvider sig undertiden til en størelse pi 0,6-1,0 μτη x 4,5 ym.

3) Gramfarvning 5 Positiv, men affarves let.

4) Bevægelighed:

Bevægelige med flageller fordelt over hele cellens overflade.

5) Sporer: 10 Ovale til ellipseformede, subterminale, 0,8 ym χ 1,2 ym.

6) Sporangier:

Lettere opsvulmede.

7) Syreresistens:

Negativ.

15 b) Dyrkningskarakteristika i forskellige medier 1) Pepton væske i) pH-værdi 9,5:

God vækst både ved 20°C og 30°C. pH-værdi 7,2: 20 Ringe vækst ved 20°C og god vækst ved 30°C.

ii) Væksttemperatur ved pH-værdi på 9,5: Vækst mellem 14°C og 41 °C.

Ingen vækst over 43°C eller under 12°C.

2) Andre medier: 25 Kødekstrakt/peptonskråagar: god vækst Kødekstrakt/pepton væske indeholdende 7% natnumchlorid: god vækst 5

DK 158523B

Kødekstrakt/peptonvæske: god vaskst

Casein/kødekstrakt/peptonskråagar: god vækst

Casein/kødekstrakt/peptonvæske: god vækst

Stivelse/peptonvæske: god vækst 5 Glucose/peptonvæske: god vækst

Trypton/gærekstrakt/agarplade: god vækst

Stivelse/gærekstraktvæske: vækst Kødekstrakt/gelatinestik: i) pH-værdi 10,0, 30°C: vækst og smeltning.

10 ii) pH-værdi 10,0, 20°C: svag overfladevækst og svag smelt ning.

iii) pH-værdi 7,2, 30°C: vækst og smeltning.

iv) pH-værdi 7,2, 20°C: svag overfladevækst og svag smelt ning.

15 3) Vækst under anaerobe betingelser:

Ingen vækst under anaerobe betingelser, men vækst under aerobe betingelser.

c) Fysiologiske karakteristika 1) Reduktion af nitrat til nitrit: 20 Ingen reduktion.

2) Anaerob dannelse af gas ud fra nitrat:

Negativ.

3) Methylrød (MR)-test:

Negativ.

DK 158523 B

6 4) Voges-Proskauer (VP)-test:

Negativ.

5) Dannelse af indol:

Ingen.

5 6) Dannelse af P^S:

Ingen.

7) Hydrolyse af stivelse:

Positiv.

8) Udnyttelse af citrat: 10 Positiv.

9) Udnyttelse af uorganisk nitrogenkilde:

Udnytter nitrater og ammoniumsalte.

10) Dannelse af pigment:

Ingen.

15 11) Ureasetest:

Negativ.

12) Cytochromoxidasetest:

Positiv.

13) Catalasetest: 20 Positiv.

14) O-F-test (Hugh og Leifson's medium):

Svag fermentering.

15) Syredannelse og gasdannelse udfra carbon hydrater:

Syredannelse Gasdannelse 25 L-Arabinose D-Xylose D-Glucose + D-Mannose + D-Fructose 30 D-Galactose +

Maltose +

Saccharose +

Lactose

Trehalose + 35 D-Sorbitol +

DK 158523 B

7 D-Mannitol 4

Inositol 4

Glycerol +

Stivelse + 5 Ribose

Raff i nose 4

Cellobiose 4 (Bemærkninger: 4: positiv, negativ) 16) Andre: 10 i) Deaminering af phenylalanin: positiv.

ii) Hydrolyse af casein: positiv.

iii) Nedbrydning af ty rosin: positiv.

Som vist ovenfor er stammen NKS-21 en aerob sporangiumbakterie, som klart tilhører slægten Bacillus. De karakteristiske træk ved denne 15 stamme er, at stammen vokser i et neutralt til basisk medium, og at det optimale pH-område for vækst er 8-10. Disse mikrobiologiske egenskaber ligner egenskaberne ved de kendte stammer Bacillus pasteurii og Bacillus alcalophllus. Stammen NKS-21 adskiller sig imidlertid klart fra de to ovennævnte stammer med hensyn til visse mikro-20 biologiske egenskaber, selv om nogle mikrobiologiske egenskaber ved stammen NKS-21 er de samme som for de ovennævnte kendte stammer.

Fx vokser både stammen Bacillus pasteurii og Bacillus alcalophilus i det basiske pH-område, men den sidstnævnte kan ikke vokse ved en pH-værdi på 7. I modsætning hertil vokser NKS-21 godt i det basiske 25 pH-område, men vokser stadigvæk godt ved neutral pH. NKS-21 adskiller sig således fra Bacillus alcalophilus på dette punkt. Endvidere hydrolyserer Bacillus pasteurii ikke stivelse, hvorimod NKS-21 hydrolyserer stivelse. Endvidere adskiller NKS-21 sig fra Bacillus pasteurii på følgende punkter: 30 1) Bacillus pasteurii reducerer nitrater, hvorimod NKS-21 ikke reducerer nitrater, 8 -

DK 158523B

2) Bacillus pasteurii har kugleformede eller næsten ovale endosporer, hvorimod NKS-21's endosporer er ovale til elliptiske, og 3) Bacillus pasteurii nedbryder urinstof, hvorimod NKS-21 5 ikke nedbryder urinstof.

NKS-21 adskiller sig tydeligt fra Bacillus pasteurii på grund af de ovennævnte forskelle i mikrobiologiske egenskaber.

Klassefikationsdata for Bacillus alcalophilus er ikke beskrevet detaljeret i ovennævnte Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Da 10 standardstammen af Bacillus alcalophilus ikke var tilgængelig, blev de mikrobiologiske egenskaber ved NKS-21 sammenlignet i forsøg med egenskaberne ved de oprindelige stammer Bacillus alcalophilus NCIB 10.436 og NCIB 10.438, der er indført i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. Både NCIB 10.436 og NCIB 10.438 var lettere 15 positive i gramfarvningsreaktionen og blev let affarvet. Disse egenskaber ligner egenskaberne ved NKS-21. Med hensyn til de morfologiske egenskaber for de vegetative celler blev korte stave med en størrelse på 0,7 ym χ 2,0 ym og lange stave med en størrelse på 0,8 ym χ 4,6 ym iagttaget i elektronmikroskop for NCIB 10.436, og 20 vegetative celler med en størrelse på 0,7 ym χ 1,5 ym blev iagttaget for NCIB 10.438. I modsætning hertil var størrelsen af de vegetative celler af NKS-21 0,6-0,8 ym χ 2,5-3,5 ym ved undersøgelse under elektronmikroskop, og deres endosporer har en oval til elliptisk form med en størrelse på 0,8 ym χ 1,2 ym. Bevægelighed blev ikke iagtta- 25 get for NCIB 10.436 og 10.438, hvorimod NKS-21 er bevægelig. End videre adskiller de fysiologiske egenskaber ved NKS-21 sig tydeligt fra egenskaberne ved NCIB 10.436 og NCIB 10.438 på følgende punkter: 1) Bacillus alcalophilus NCIB 10.436 og NCIB 10.438 voksede 30 ikke i et mannitolmedium, hvorimod NKS-21 voksede deri, og 9

DK 158523B

2) NCIB 10.436 voksede ikke i en kødekstrakt/peptonvæske indeholdende 7% natriumchlorid, hvorimod NCIB 10.438 og NKS-21 voksede deri.

På grund af de ovennævnte forskelle adskiller NKS-21 sig fra Bacillus 5 alcalophilus NCIB 10.436 og NCIB 10.438, selv om visse mikrobiologiske egenskaber ved NKS-21 ligner egenskaberne ved Bacillus alcalophilus.

Endvidere ligner NKS-21 Bacillus subtilis ved, at størrelsen af de vegetative celler af Bacillus subtilis er 0,7-0,8 ym i bredden, og 2-3 10 ym i længden, og at Bacillus subtilis nedbryder stivelse. Imidlertid adskiller NKS-21 sig fra Bacillus subtilis på følgende punkter: 1) Bacillus subtilis vokser godt ved en pH-værdi på 5,5-8,5, men vokser ikke ved en pH-værdi på 9-10, ved hvilken NKS-21 vokser godt, og 15 2) den maksimale væksttemperatur for Bacillus subtilis er 45-55°C, hvorimod NKS-21 ikke vokser ved en temperatur over 43°C.

Derfor adskiller NKS-21 sig tydeligt fra Bacillus subtilis.

NKS-21 adskiller sig således tydeligt, hvad angår mikrobiologiske 20 egenskaber, fra de kendte Bacillus pasteurii, Bacillus alcalophilus og Bacillus subtilis, og der er ikke beskrevet nogen art med de samme mikrobiologiske egenskaber som NKS-21 i Bergey's Manual of Determinative Bacteriology. NKS-21 identificeres derfor som en hidtil ukendt art tilhørende slægten Bacillus.

25 Som mikroorganisme ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan der ud over NKS-21 anvendes sådanne naturlige eller kunstige mutanter af NKS-21, som stadig har i det væsentlige samme egenskaber som denne og derfor kan henregnes til arten Bacillus sp. nov. NKS-21.

DK 158523B

ίο

Den hidtil ukendte alkaliske protease API-21, som fås ved dyrkning af NKS-21 ifølge opfindelsen, beskrives detaljeret i det følgende.

NKS-21 kan dyrkes aerobt, fx i peptondyrkningsmedium med en pH-værdi på 8-10 ved rystedyrkning eller aerob agiteringsdyrkning 5 efter inokulering af NKS-21 i dyrkningsmediet ved en temperatur på 10-40°C i 40-150 timer. Efter at dyrkningen er fuldført, adskilles de dyrkede mikrobielle celler let fra det dyrkede produkt, hvorved den klare dyrkningssupernatantopløsning kan udvindes. Den alkaliske protease API-21 udfældes let ved tilsætning af et organisk opløs-10 ningsmiddel såsom ethanol til supernatantopløsningen. Den udfældede alkaliske protease API-21 underkastes separation i centrifuge og frysetørres i vakuum. Herved fås det ønskede enzym, alkalisk protease API -21.

Aktiviteten af den således vundne alkaliske protease API-21 bestemmes 15 som følger:

Den dyrkede klare opløsning eller enzymopløsningen fortyndes hensigtsmæssigt med 0,1 M natriumcarbonat/0,1 M borsyre/kaliumchlorid-pufferopløsning (pH-værdi 10,0). Til 0,5 ml af den resulterende opløsning sættes 0,5 ml 2%'s mælkecaseinopløsning med en pH-værdi på 20 10,0, og derefter udføres en enzymreaktion ved 30°C i 10 minutter.

Efter at reaktionen er løbet til ende, sættes 2 ml 0,1 M trichloreddi- kesyre indeholdende 0,2 M eddikesyre/0,2 M natriumacetat til reaktionsblandingen for at standse reaktionen. Blandingen lades henstå i 10 minutter eller mere ved 30°C og filtreres derefter gennem filtrei— 25 papir. 5 ml 0,4 M natriumcarbonat og 1 ml 5 gange fortyndet "phen-olreagens" sættes til 1 ml af det ovenfor vundne filtrat, og blandingen lades henstå ved 30°C i 20 minutter for at udvikle farve. Derefter måles den farvede blandings absorbans ved 660 nm. Enzymenheden bestemmes i henhold til "Commission on Biochemical Nomenclature" 30 (Comprehensive Biochemistry, bind 13, 1973, s. 26-27), idet den mængde alkalisk protease, som frigiver trichloreddikesyreopløselige stoffer, der udviser farveudvikling ved 660 nm, svarende til 1 mol tyrosin fra 1% caseinsubstrat med en pH-værdi på 10,0 ved 30°C på 1 sekund, defineres som "1 katal".

11

DK 158523B

De fysisk-kemiske egenskaber ved den alkaliske protease API-21 (der i det følgende betegnes som nærværende enzym) beskrives detaljeret nedenfor.

1) Aktivitet 5 Hydrolyserer proteiner såsom casein, hæmoglobin, albumin, globulin, kødprotein, fiskeprotein og soyaprotein.

2) Indvirkning af pH på enzymaktivitet

Som vist i fig. 1 er den optimale pH fra ca. Ί0 - ca. Π. Den relative aktivitet blev bestemt som følger.

10 Hver pufferopløsning (0,5 ml), som er anført nedenfor og indeholder 2% mælkecasein, sattes til 50 yl af nærværende enzymopløsning til fremstilling af en testopløsning.

pH-værdi Pufferopløsning 15 6-9 0,1 M kaliumphosphat/0,05 M natriumborat 9-11 0,1 M natriumcarbonat/0,1 M borsyre/kalium- chlorid 11-12 0,1 M dinatriumhydrogenphosphat/natrium- hydroxid 20 _

Testopløsningens enzymaktivitet blev bestemt på den ovenfor beskrevne måde. Den relative aktivitet (%) blev beregnet, idet enzymaktiviteten ved en pH-værdi på 10,0 blev defineret som 100%.

DK 158523 B

12 3) Indvirkning af pH på stabilitet uden substrat

Som vist i fig. 2 er nærværende enzym stabilt i et pH-område på fra ca. 7 til ca. 11,5.

Nærværende enzyms stabilitet blev bedømt som følger.

5 Hver af de nedenfor anførte pufferopløsninger (0,5 ml) sattes til 50 μΙ af nærværende enzymopløsning, som var dialyseret og tilpas fortyndet, og blandingen blev inkuberet ved 30°C i 10 minutter.

pH-værdi Pufferopløsning 10 - 3-8 0,1 M citronsyre/0,2 M dinatriumhydrogenphos- phat 8-11 0,1 M natriumcarbonat/0,1 M borsyre/kali- umchlorid 15 11-12 0,15 M dinatriumhydrogenphosphat/natrium- hyd roxid

Efter inkubation sattes 9,5 ml af en 0,1 M carbonatpufferop-løsning indeholdende 2% casein og med en pH-værdi på 10,0 20 til blandingen. Blandingens enzymaktivitet blev bestemt på den ovenfor beskrevne måde. Den relative aktivitet (%) blev beregnet, idet enzymaktiviteten ved en pH-vaerdi på 10,0 blev defineret som 100%.

Som vist i fig. 2 var nærværende enzym mest stabilt ved en 25 pH-værdi på fra ca. 10 til ca. 11. I dette pH-område blev nærværende enzyms oprindelige aktivitet fuldstændig bibeholdt. Endvidere blev 80% eller mere af restaktiviteten udvist ved en pH-værdi på 7-11,5.

13

DK 158523B

4) Indvirkning af temperatur på enzymaktivitet

Som vist i fig. 3 var nærværende enzym aktivt over for casein ved en temperatur på 5-65°C og ved en pH-værdi på 10,0. Den optimale temperatur var 45-50°C.

5 5) Indvirkning af temperatur på stabilitet uden substrat

Som vist i fig. 4A og 4B bevares nærværende emzyms aktivitet fuldstændigt op til 40°C efter opvarmning uden substrat ved en pH-værdi på 10,0 i 10 minutter, men det meste af aktiviteten gik tabt ved 50°C. Endvidere bevares nærværende 10 enzyms aktivitet op til 45°C ved en pH-værdi på 8 i 10 minut ter, men deaktivering fandt sted ved 50°C, og enzymet var i det væsentlige deaktiveret ved 60°C.

6) Stabilitet ved lagring Nærværende enzym er stabilt over for frysning og frysetør-15 ring. Der jagttoges ingen væsentlig nedgang i aktiviteten af den frysetørrede prøve, når prøven lodes henstå ved stuetemperatur i 2 uger. Nærværende enzyms aktivitet blev fuldstændigt bibeholdt, når den frysetørrede prøve blev lagret i en desiccator ved stuetemperatur.

20 7) Inhibering Nærværende enzym blev inhiberet i bemærkelsesværdig grad af en aktiv serinrestinhibitor såsom diisopropylfluorphosphor-syre (DFP) og phenylmethansulfonylfluorid (PMSF). Det blev også inhiberet af benzyloxycarbonyl-phenylalanin-chlormeth-25 ylketon (ZPCK). Nærværende enzym blev imidlertid ikke inhi beret af tosyl-phenylalanin-chlormethylketon (TPCK), som er en inhibitor for en animalsk serinprotease, chymotrypsin, og tosyl-lysin-chlormethylketon (TLCK), som er en trypsininhi-bitor.

DK 158523 B

14

Endvidere blev nærværende enzyms aktivitet ikke ugunstigt påvirket af tilsætning af p-chlor-kviksølvbenzoat (PCMB) og ethylendiamintetraacetat (EDTA). Desuden blev nærværende enzyms aktivitet ikke ugunstigt påvirket af tilsætning af 5 pepstatin. Det fremgår af ovenstående inhiberingstest, at nærværende enzym er en protease med en serin rest i det aktive sted.

8) Bestemmelsesmetode for enzymaktivitet Som beskrevet ovenfor.

10 9) Molekylvægt Nærværende enzyms molekylvægt er ca. 22.000, bestemt ved gelfiltrering over Sephadex® G-75 ved en pH-værdi på 10.

10) Isoelektrisk punkt Nærværende enzyms isoelektriske punkt er 7,4 bestemt ved en 15 elektrofokuseringsmetode.

11) Ultraviolet (UV) absorption

Absorptionsspidsen er til stede ved 275-282 nm i et UV absorptionsspektrum.

12) Infrarød (IR) absorptionsspektrum 20 Som vist i fig. 5.

13) Grundstofanalyse

Udeladt, fordi de karakteristiske forskelle i disse typer højmolekylære stoffer såsom nærværende enzym ikke så godt kan udtrykkes ved sammenligning af indholdet af grundstoffer 25 deri, såsom carbon, nitrogen eller hydrogen.

15

DK 158523B

14) Aminosyresammensætning

Aminosyresammensætningen af API-21 blev tentativt bestemt på grundlag af resultaterne af syrehydrolyse af enzymet undtagen for cystein/cystin og tryptophan, på grundlag af 5 resultaterne af permyresyredekomponering for cystein/cystin- analyse og på grundlag af resultaterne af basisk dekompone-ring for tryptophananalyse i henhold til den i litteraturen beskrevne metode (Methods in Enzymoiogy, bind XI, 1967, Academic Press, New York) og er vist i tabel 1 sammen med 10 sammensætningen af andre alkaliske proteaser, hvis data er angivet i litteraturstederne *1 og *2.

Som vist i tabel 1 er der store forskelle mellem API-21 og de andre angivne enzymer med hensyn til aminosyresammensætning såsom serin, arginin, lysin, valin, alanin, tryptophan, 15 prolin, etc.

Tabel 1

Sammenligning af aminosyresammensætning mellem API-21 og andre alkaliske proteaser

Aminosyre API-21 subtilisin subtilisin 20 Novo *1 Carlsberg *2

Lysin 4 11 9

Histidin 8 6 5

Arginin 8 2 4 25 Tryptophan 0 3 1 11 9

Asparaginsyre/Asparagin 27 ^ -jg

Threonin 10 13 19

Serin 17 37 32 4 5

Glutaminsyre/Glutamin 14 ^ y 30 Prolin 7 14 9

Glycin 30 33 35

Alanin 26 37 41

DK 158523 B

16

Tabel 1 fortsat

Valin 20 30 31

Methionin 4 5 5

Isoleucin 10 13 10 5 Leucin 14 15 16

Tyrosin 12 10 13

Phenylalanin 4 3 4

Cystein/Cystin 0 0 0 10 *1 J. Bioi. Chem. 243, 1968, s. 5296 *2 J. Biol. Chem. 243, 1968, s. 2134

Det fremgår af ovennævnte resultater, at nærværende enzym, som har en optimal pH-værdi på 10-11, bevarer sin aktivitet ved en relativt lav temperatur, men deaktiveres ved en relativt høj temperatur (dvs.

15 50°C eller mere). Nærværende enzym med disse fysisk-kemiske egen skaber sammenlignes i det følgende med kendte tilsvarende alkaliske proteaser.

Nogle ekstracellulære alkaliske proteaser, som stammer fra grampositive bakterier, er velkendte, fx alkalisk protease (subtiiisin Carls-20 berg), som stammer fra Bacillus licheniformis, og alkalisk protease (subtiiisin Novo), som stammer fra Bacillus subtiUs.

Disse enzymer er proteaser med en serinrest i det aktive sted, en molekylvægt på ca. 27.000-30.000 og et isoelektrisk punkt på 9-11. De fleste af de andre beskrevne ekstracellulære alkaliske proteaser, som 25 stammer fra Bacillus, har en molekylvægt på 25.000-30.000 og et isoelektrisk punkt på 9-11. De fleste af de ovennævnte enzymer deaktiveres ikke ved opvarmning ved 50°C og pH 10 i 10 minutter.

Kendte alkaliske proteaser med en lavere molekylvægt, der stammer fra slægten Bacillus, er alkalisk protease E-l og E-2 fra Bacillus nr.

30 D-6, som begge har en molekylvægt på 20.000, og hvis aktivitet overhovedet ikke nedsættes ved opvarmning til 50°C og pH 9,0, (jfr.

17

DK 158523B

japansk fremlæggelsesskrift nr. 56-4236). Kendte inden for dette fagområde som en alkalisk protease fra slægten Bacillus er endvidere en alkalisk protease, som stammer fra Bacillus alcalophilus NCIB 10.436, og en alkalisk protease, som stammer fra Bacillus alcalophilus 5 NCIB 10.438. Disse enzymer bevarer imidlertid ca. 90% af deres aktivitet ved opvarmning til 50°C og pH 10 i 10 minutter som vist i tabel 2. Det fremgår også af tabel 2, at alkaliske proteaser, der stammer fra Bacillus licheniformis og Bacillus subtilis, bevarer 70-80% af deres aktivitet ved opvarmning til 50°C og pH 10 i 10 minutter.

10 Kendte alkaliske proteaser, som stammer fra bakterier tilhørende slægten Bacillus såsom Bacillus subtilis, er således stabile i et relativt højt temperaturområde. I modsætning hertil mister nærværende enzym som nævnt ovenfor det meste af sin aktivitet ved 50°C og pH 10 i 10 minutter, hvorimod det er stabilt ved opvarmning til en temperatur på 15 op til 40°C og pH 10 i 10 minutter. Endvidere finder deaktivering af nærværende enzym sted ved opvarmning til ca. 50°C og pH 8 i 10 minutter, og det meste af dets aktivitet går tabt ved 60°C under de samme betingelser. I betragtning af forskellene i egenskaberne med hensyn til temperaturstabilitet, molekylvægt og isoelektrisk punkt 20 adskiller nærværende enzym sig tydeligt fra de kendte alkaliske proteaser, som stammer fra bakterier tilhørende slægten Bacillus, og er ikke tidligere beskrevet. Som følge heraf bestemmes nærværende enzym som et hidtil ukendt enzym og betegnes "alkalisk protease API-21".

DK 158523 B

18

Tabel 2

Isoelek- Restaktivitet (%)

Molekyl- trisk ved opvarmning ved

Alkalisk protease vægt punkt pH 10 i 10 minutter

5 50°C 60°C

Alkalisk protease fra

Bacillus lichenlformis 27.287*^ 9,4 ^ 78 2

Alkalisk protease fra 10 Bacillus subtilis 27.537 ^ 9,1 ^ 70 1

Alkalisk protease fra Bacillus alcalophilus NCIB 10.436 - - 94 73

Alkalisk protease fra 15 Bacillus alcalophilus NCIB 10.438 25.000 85 63

Alkalisk protease fra

Bacillus NKS-21 22.000 7,4 6 1 20 *3 Fette Seiten Anstrichmittef. 75, 1973, s. 49.

*4 The Enzymes bind III, 1971, s. 564.

Nærværende enzym "API-21" kan anvendes med en detergentforstærker og er således nyttigt som tilsætningsstof til detergenter, eftersom det er stabilt ved en pH-værdi på 7-11,5, og den maksimale enzymak-25 tivitet opnås ved en pH-værdi på 10-11 som nævnt ovenfor. Nærværende enzym bevarer navnlig sin høje aktivitet selv ved en relativt lav temperatur (fx 20-30°C) sammenlignet med sædvanlige enzymer til detergenter. Nærværende enzym er derfor en særdeles ønskelig type alkalisk protease som tilsætningsstof til et husholdningsdetergent i et 30 land såsom Japan, hvor tøj vaskes ved stuetemperatur. Endvidere kan nærværende enzym også udnyttes effektivt til affaldsbehandling og spildevandsbehandling til hurtig nedbrydning af protein og genbrug af nitrogen ressourcer, da indholdet af protein i husholdningsaffald og husholdningsspildevand for nylig er blevet forøget. Desuden er an-35 vendeisen af nærværende protease i levnedsmiddelindustrien såsom til levnedsmiddelforarbejdning fordelagtig, da enzymet let kan deaktiveres

DK 158523 B

19 efter anvendelse ved opvarmning til en relativt lav temperatur, fx 50-60°C. Således er anvendelsen af nærværende enzym effektiv, hvad angår kvalitetskontrol af det forarbejdede levnedsmiddel.

I de tilfælde, hvor nærværende enzym "API-21" inkorporeres i en 5 detergentkomposition, anvendes enzymet "API-21" sædvanligvis i en -9 mængde på 5-500 nkatal (eller 10 katal), især 10-100 nkatal, pr.

1 g af detergentkompositionen, selv om der ikke er nogen begrænsninger i mængden af inkorporeret enzym.

Ud over enzymet "API-21" kan den enzymholdige detergentkomposition 10 indeholde en hvilken som helst sædvanlig detergentbestanddel, uden at de inkorporerede mængder deraf i sædvanlige detergentkompositioner ændres. Typiske eksempler på sådanne detergentbestanddele er 10-50 vægtprocent af et overfladeaktivt middel, 0-50 vægtprocent af en forstærker, 1-50 vægtprocent af et basisk middel eller en uorganisk 15 elektrolyt og 0,1-5 vægtprocent af et anti-genaflejringsmiddel, et enzym, et blegemiddel, et optisk (eller fluorescerende) farvestof, et middel, som forhindrer sammenbagning, og en antioxidant. Inkorporeringen af enzymet "API-21" kan udføres på en hvilken som helst sædvanlig måde. Det foretrækkes imidlertid, at enzymet inkorporeres i 20 detergentkompositionen i form af en opløsning eller i sådan form, at støvdannelse forhindres af miljøbeskyttelseshensyn.

Opfindelsen belyses nærmere ved nedenstående eksempler.

EKSEMPEL 1

Den her omhandlede hidtil ukendte stamme NKS-21 blev dyrket i et 25 skråkulturmedium. Det dyrkede produkt blev suspenderet i steriliseret vand, og 0,5 ml af denne suspension blev anvendt som podestof.

20

DK 158523B

Et enzymfrembringende dyrkningsmedium, som indeholdt 1% casein, 1% kødekstrakt, 1% polypepton og 1% natriumhydrogencarbonat, blev indstillet til en pH-værdi på 9,5 eller 7,2 ved tilsætning af vandig natriumhydroxid eller saltsyre.

5 Ved rystedyrkning (A) under anvendelse af en rotations ryster sattes 100, 200 eller 300 ml af det ovennævnte medium med en pH-værdi på 9,5 til en 1 I Erlenmeyer-kolbe. Efter sterilisering blev dyrkningsmediet podet med 0,5. ml af den ovenfor fremstillede NKS-21-suspension, og dyrkningen udførtes ved 20°C og under rystebetingelser på 200 10 rpm i 41, 65 eller 89 timer.

På den anden side sattes ved reciprok rystedyrkning (B) 100 ml af det ovenfor fremstillede dyrkningsmedium med en pH-værdi på 9,5 eller 7,2 til en 500 ml Sakaguchi-kolbe. Efter sterilisering podedes dyrkningsmediet med 0,5 ml af den ovenfor fremstillede NKS-21-sus-15 pension, og den reciprokke rystedyrkning udførtes under rystebetingelser på 110 cpm ved 30°C i 66 eller 90 timer.

Efter dyrkning blev det dyrkede produkt centrifugeret ved 28.000 χ g i 15 minutter, og den resulterende supernatantopløsning blev udvundet.

Denne opløsnings alkaliske proteaseaktivitet blev bestemt på den 20 ovenfor beskrevne måde.

Resultaterne er vist i tabel 3 og 4.

Tabel 3

Resultater af rotationsrystedyrkning (A) (20°C, mediets oprindelige pH s 9,5) 25 _ Mængde af Enzymaktivitet ykatal/l medium (ml) 41 timer 65 timer 89 timer 100 1,3 2,6 2,7 30 200 2,0 4,3 4,0 300 2,5 5,6 5,4 21

DK 158523B

Tabel 4

Resultater af reciprok rystedyrkning (B) (30°C)

Mediets oprinde- Enzymaktivitet ykatal/l 5 lige pH 66 timer 90 timer 9,6 4,5 3,0 7,2 4,9 3,4 10 Når NKS-21 blev udsat for reciprok rystedyrkning ved 30°C, var væksten af NKS-21 ikke alene god ved en oprindelig pH af mediet på 9,5, men også ved en oprindelig pH af mediet på 7,2, og den ønskede alkaliske protease af API-21 blev dannet i stor mængde i hvert tilfælde. Som i tilfældet med en oprindelig pH af mediet på 9,5 blev tilsva-15 rende resultater opnået, når NKS-21 blev dyrket i en reciprok ryster ved 20°C og en oprindelig pH af mediet på 7,2.

7 liter af supernatantopløsningen efter centrifugeseparationen af det af NKS-21 frembragte ovenfor vundne dyrkede produkt blev afkølet til 3°C. Derefter sattes 2 volumendele ethanol, som forinden var af-20 kølet til 3°C, til den afkølede supernatantopløsning til dannelse af bundfald. Det resulterende bundfald blev udskilt ved centrifugering i en afkølet centrifugeseparator ved 11.000 χ g, hvorefter det udskilte bundfald omgående blev frysetørret i vakuum. Herved vandtes 15,7 g af det ønskede enzympulver.

25 Den specifikke aktivitet af den således vundne alkaliske protease baseret på 1 kg af proteinet var 0,71 ykatal (0,71 ykatal/kg χ protein), og udbyttet var 33%, når proteinet blev bestemt i henhold til Lowry-metoden.

Den således vundne frysetørrede enzymprøve blev opløst i 0,01 M 30 natriumcarbonat/borsyre/kaliumchloridpufferopløsning (pH-værdi 10,0) indeholdende 0,2 M natriumchlorid. Enzymopløsningen blev gelfiltreret over en søjle (2 cm i diameter, længde 74 cm) pakket med Sephadex® 22

DK 158523B

G-75 (forhandles af Pharmacia Fine Chemicals AB, Sverige), som forinden var ækvilibreret med den ovennævnte pufferopløsning, hvorved vandtes eluatfraktioner på hver 3 ml. Det rensede enzym vandtes fra hovedfraktioner med en høj enzymaktivitet. Det således vundne 5 enzym havde en molekylvægt på ca. 22.000 bestemt ved gelfiltrering over Sephadex® G-75 ved en pH-værdi på 10 og et isoelektrisk punkt på 7,4 bestemt ved en elektrofokuseringsmetode. Den specifikke aktivitet af det således vundne enzym blev forøget ca. 10 gange sammenlignet med den specifikke aktivitet uden gelfiltrering, og den 10 specifikke aktivitet baseret på 1 kg protein var 7,0 ykatal. Udbyttet var 70%.

EKSEMPEL 2

Fremstillingen af alkalisk protease i en 500 liters fermenteringstank og den efterfølgende fremstilling af enzympræparatet blev udført under 15 anvendelse af stammen NKS-21, der danner alkalisk protease.

. Et enzymfrembringende dyrkningsmedium indeholdende 1% casein, 1% kødekstrakt, 1% polypepton og 1% natriumhydrogencarbOnat blev indstillet til en pH-værdi på 9,5 ved tilsætning af vandig natriumhydroxid. 300 ml af det ovennævnte medium sattes til en 1 liters Erlen-20 meyer-kolbe. Efter sterilisering blev dyrkningsmediet podet med 0,5 ml af NKS-21-suspensionen, der var fremstillet som beskrevet i eksempel 1, og dyrkningen blev udført ved 20°C i 3 dage. 300 ml af det resulterende dyrkede produkt sattes til en steriliseret 30 liters kruk-ke-fermentor indeholdende 10 liter af det ovennævnte dyrknings-25 medium med en pH-værdi på 9,5. Derefter udførtes aerob agiterings-dyrkning ved 20°C i 3 dage med en agiteringshastighed på 400 rpm og en luftningshastighed på 12 liter/min.

Efter dyrkning i 30 liters krukke-fermentor i 3 dage overflyttes 10 liter af det dyrkede produkt til en steriliseret 500 liters fermente-30 ringstank indeholdende 220 liter af det ovenfor fremstillede dyrkningsmedium med en pH-værdi på 9,5. Derefter udførtes aerob agite-ringsdyrkning ved 20°C i 4 dage med en agiteringshastighed på 400 rpm og en luftningshastighed på 200 liter/min.

DK 158523 B

23

Efter dyrkning blev det dyrkede produkt centrifugeret ved 11.000 χ g i en afkølet kontinuert centrifugeseparator, og der vandtes 200 I supernatantopløsning. Denne supernatantopløsning blev afkølet til 3°C. Derefter sattes 2 volumendele ethanol, som forinden var afkølet 5 til 3°C, til den afkølede supernatantopløsning for at udfælde den ønskede alkaliske protease. Den udfældede alkaliske protease API-21 blev udskilt i centrifuge ved ca. 11.000 χ g i en afkølet kontinuert centrifugeseparator, hvorefter den udskilte alkaliske protease API-21 med det samme blev frysetørret i vakuum. Herved vandtes følgende 10 frysetørrede alkaliske protease API-21 enzympræparat.

Udvundet enzymvægt 1230 g

Specifik aktivitet (ykatal/kg protein) 0,52

Udbytte 70%

Det således vundne enzym blev renset på samme måde som beskrevet i 15 eksempel 1, hvorved vandtes alkalisk protease med en molekylvægt på ca. 22.000 og et isoelektrisk punkt på 7,4.

EKSEMPEL 3

Den ovenfor vundne alkaliske protease "API-21" og en kommercielt tilgængelig alkalisk protease til et detergent, som blev anvendt som 20 sammenligningseksempel, blev bedømt ved at inkorporere enzymerne i forskellige detergentkompositioner. Vasketesten for af blod tilsmudsede tekstiler blev udført som følger: A. Fremstilling af bomuldstekstiler tilsmudset med helblod

Tekstilprøver blev dyppet i friskt bovint helblod umiddelbart efter 25 indsamling af dette, hvilket helblod indeholdt 1 volumen af en natri-umcitratopløsning pr. 9 volumen tilsat blod for at forhindre koagulering. 70% af væsken blev presset ud af de tilsmudsede tekstilprøver ved hjælp af en rulle for at opnå ensartet tilsmudsede tekstiler. Derefter blev tekstilprøverne lufttørret i et rum uden adgang til 30 direkte sollys og derefter opbevaret ved en temperatur på 0-5°C på 24

DK 158523B

et køligt, mørkt sted. Efter fremstilling blev tekstilprøverne klippet i stykker med en størrelse på 10 χ 15 cm.

Tekstilprøver: 10 cm χ 15 cm

Tilsmudsningsvaeske: 100 ml pr. 10 tekstilprøver 5 Tilsmudsningstemperatur: 10°C ±2°C.

Tilsmudsningstid: 5 minutter (agiteringsretningen blev ændret hvert 30. sekund).

B. Vaskeprocedure

Tekstilprøverne blev vasket og skyllet (3 gange) under nedenstående 10 betingelser i et Terg-O-Tometer.

Vaskebetingelser

Tilsmudsede tekstiler: 5 χ 10 cm

Detergent: 0,133% (0,7 nkatal/ml enzym)

Detergent/vandforhold: 1:85 15 Agitering: 105 rpm

Vasketid: 10 minutter.

Skyllebetingelser

Tilsmudsede tekstiler: 5 χ 10 cm

Skyllemiddel/vand forhold: 1:85 20 Agitering: 105 rpm

Skylletid: 3 min.

Efter skylning blev tekstilprøverne lufttørret i et rum uden adgang til direkte sollys.

C. Det anvendte detergent og enzym 25 Nedenstående 6 phosphat- og ikke-phosphatdetergenter blev anvendt som vaskemiddel.

Detergentsammensætning 25

DK 158523B

Phosphat- Ikke-phosphat

Sammensætning detergent detergent 5 Overfladeaktivt middel 15% 15%

Natriumtripolyphosphat 17

Zeolit - 17

Natriumsilicat 5 5

Natriumcarbonat 3 3 10 Carboxyrrtethylcellulose 1 1

Vand 8 8

Natriumsulfat balance balance pH-Værdien af hver detergent målt i en 0,133% koncentration ved 15 25°C var som følger:

Detergentets pH-værdi

Phosphat- Ikke-phosphat

Type overfladeaktivt middel detergent detergent 20 LAS-type detergent1 10,18 10,18 SDS-type detergent2 9,76 9,86 AOS-type detergent3 9,95 10,17 1 LAS: Natriumlinear alkylbenzensulfonat 25 2 SDS: Natriumdodecylsulfat 3 AOS: Alpha-olefinsulfonat

Det anvendte enzym var en kommercielt tilgængelig alkalisk protease til et detergentpræparat eller den ovenfor vundne alkaliske protease "API-21". Resultaterne er vist i tabel 5.

26

DK 158523B

Detergentets effektivitet mod proteintilsmudsning blev bestemt som følger:

Testvæskeprøver vandtes ved varmeekstraktion af tilsmudsede tekstiler før og efter vask med 100 ml af en 0,1 N vandig NaOH-opløsning 5 ved en temperatur på 90 ±2°C i 120 minutter. Testvæskep røven blev kemisk farvet med et kobber-fol in reagens, og dens absorbans blev målt ved en bølgelængde på 750 nm. Detergentets effektivitet (D) blev beregnet ud fra nedenstående ligning:

Ds - Dw 10 D (%) = - x 100

Ds - Dc hvor Dc = Absorbans af ekstrakt fra standardbomuldstekstiler (1 g)

Ds = Absorbans af ekstrakt fra tilsmudsede tekstiler (1 g) før vask 15 Dw = Absorbans af ekstrakt fra tilsmudsede tekstiler (1 g) efter vask

DK 158523 B

Detergentets effektivitet (%)

Tabel 5 27

Deter- Tilstede- Vaske- Vand Deter- Tilsat kom- 5 gent værelse tempe- gent Tilsat merciel alka- af phos- ratur alene API-21 lisk protease phat ti! detergen ter 10 LAS type Ja 68,6 85,7 78,6

Nej 68,8 82,0 77,3 SDS type Ja ' 68,0 85,6 77,7 10°C 35,0

Nej 70,2 85,8 80,9 15 AOS type Ja 69,4 87,0 80,4

Nej 68,0 86,9 80,0 LAS type Ja 73,9 89,8 88,6

Nej 72,0 90,0 88,5 SDS type Ja 74,0 91,0 89,1 20 25°C 40,9

Nej 69,4 91,3 87,7 AOS type Ja 75,9 91,6 91,6

Nej 74,5 90,0 91,6 LAS type Ja 73,8 91,7 90,0 25 Nej 74,8 94,3 92,1 SDS type Ja 73,2 92,4 90,0 40°C 45,9

Nej 74,2 91,7 89,7 AOS type Ja 80,3 92,6 90,5 30 Nej 79,0 91,2 91,0 EKSEMPEL 4

Den i eksempel 3 beskrevne vasketestprocedure blev gentaget med undtagelse af, at proteaseaktiviteten i vaskeopløsningen og vasketem-35 peraturen blev ændret, hvad angår det ikke-phosphatholdige detergent af LAS-typen indeholdende den alkaliske protease "API-21".

Resultaterne er vist i tabel 6.

28

DK 158523B

Tabel 6

Detergentets effektivitet 5 Protea seaktivitet Vasketemperaturer

i vaskeopløsningen 10°C 25°C 40°C

(nkatal/ml) 0 68,8 72,0 74,8 10 0,7 78,2 87,8 89,4 2,1 80,5 88,6 92,8 3,5 80,8 89,4 92,8 7 82,0 89,8 94,3 15 EKSEMPEL 5

Vasketests for snavsede kraver blev udført under anvendelse af forskellige detergenter, som indeholdt den ovenfor vundne alkaliske protease "API-21" eller en kommercielt tilgængelig, alkalisk protease til en detergentkomposition, pi følgende mide.

20 A. Fremstilling af snavsede kraver 200 stk. snavsede kraver fremstillet af standardbomuldstekstiler til vaskemiddeltestning med en størrelse på 7 χ 37 cm blev klippet i små stykker med en størrelse på 1 χ 5 cm. De anvendte kraver blev brugt en uge i henhold til den af Motoi Minagawa og I ku ko Okamoto, Seni 25 Seihrn Shohi Kagaku 19, 1978, s. 106-115, beskrevne metode. 10 vilkårligt udvalgte små stykker blev syet sammen til dannelse af testtekstiler med en størrelse på 5 χ 10 cm, som blev opbevaret ved en temperatur på 0-5°C på et koldt, mørkt sted.

DK 158523 B

29 B. Vaskeprocedure

Tekstilprøverne blev vasket og skyllet (3 gange) under nedenstående betingelser i et Terg-O-Tometer.

Vaskebetingelser 5 Tilsmudsede tekstiler: 5 χ 10 cm

Detergent: 0,133% (0,7 nkatal/ml enzym)

Detergent/vandforhold: 1:85

Agitering: 105 rpm

Vasketid: 10 minutter.

10 Skyllebetingelser

Tilsmudsede tekstiler: 5 * 10 cm

Skyllemiddel/vand forhold: 1:85 Agitering: 105 rpm

Skylletid: 3 min.

15 Efter skylning blev tekstilprøverne lufttørret i et rum uden adgang til direkte sollys.

C. Det anvendte detergent og enzym

Nedenstående 4 phosphatholdige og ikke-phosphatholdige detergenter blev anvendt som vaskemiddel.

Detergentsammen sætn i ng 30

DK 158523B

Phosphat- Ikke-phosphat

Sammensætning detergent detergent 5 Overfladeaktivt middel 15% 15%

Natriumtripolyphosphat 17

Zeolit (4A) - 17

Natriumsilicat 5 5

Natriumcarbonat 3 3 10 Carboxymethylcellulose 1 1

Vand 8 8

Natriumsulfat balance balance pH-Værdien af hver detergent målt i en 0,133% koncentration ved 25°C 15 var som følger:

Detergentets pH-værdi

Phosphat- Ikke-phosphat

Type overfladeaktivt middel detergent detergent 20 LAS-type detergent1 10,18 10,18 AOS-type detergent2 9,95 10,17 1 LAS; Natriumlinear alkylbenzensulfonat 2 AOS: Alpha-olefinsulfonat 25 Det anvendte enzym var en kommercielt tilgængelig alkalisk protease til et detergentpræparat eller den ovenfor vundne alkaliske protease "API-21". Resultaterne er vist i tabel 7.

Detergentets effektivitet (%)

Tabel 7 31

DK 158523B

Deter- Tilstede- Vaske- Vand Deter- Tilsat Tilsat kom- 5 gent værelse tempe- gent API-21 merciel alka- af phos- ratur alene lisk protease phat til detergen ter 10 Ja 70,1 82,0 77,9 LAS type

Nej 66,7 82,1 73,6 10°C 49,3

Ja 80,4 87,4 86,4 15 AOS type

Nej 75,0 86,8 83,3

Ja 78,7 85,7 79,0 LAS type

Nej 78,0 80,1 74,2 20 25°C 52,1

Ja 80,4 89,6 87,3 AOS type

Nej 80,2 91,2 88,1

Ja 80,3 86,8 86,8 25 LAS type

Nej 81,0 91,2 89,7 40°C 58,3

Ja 82,6 90,1 89,0 AOS type 30 Nej 86,1 89,1 90,4 Ό

Claims (2)

1. Alkalisk protease betegnet API-21, kendetegnet ved, at den har følgende fysisk-kemiske egenskaber: 5 a) at den har en optimal proteolytisk aktivitet ved en pH-værdi på 10-11 og ved en temperatur på 45-50°C, idet aktiviteten måles over for casein, b) at den er et protein med en molekylvægt på ca. 22.000 bedømt ved en gelfiltreringsmetode, et isoelektrisk punkt på 7,4, bedømt ved en 10 elektrofokuseringsmetode, en absorptionsspids på 275-282 nm i et UV-absorptionsspektrum, IR-absorptionskarakteristika som vist i fig. 5, og en serinrest i det aktive sted, c) at den har følgende aminosyresammensætning: lysin 4 15 histidin 8 arginin 8 tryptophan 0 asparaginsyre/asparagin 27 threonin 10 20 serin 17 glutaminsyre/glutamin 14 prolin 7 glycin 30 alanin 26 25 valin 20 methionin 4 isoleucin 10 leucin 14 tyrosin 12 30 phenylalanin 4 cystein/cystin 0 i DK 158523 B og d) at den er identisk med den protease, der dannes ved aerob dyrkning af Bacillus-stammen deponeret under nr. FERM BP-93 5 i et egnet basisk dyrkningsmedium.

2. Fremgangsmåde til fremstilling af den alkaliske protease ifølge krav 1, kendetegnet ved, at en stamme af arten NKS-21, for hvilken stammen Bacillus FERM BP-93 er typestammen, dyrkes i et egnet basisk dyrkningsmedium, hvorpå den alkaliske protease API-21 udvindes fra det dyrkede produkt.