JP3512981B2 - 耐熱性アルカリセルラ−ゼ、それを生産する微生物及びその製造方法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、耐熱性アルカリセ
ルラ−ゼ、それを生産する微生物及びその製造法に関す
るものであり、更に詳しくは、バチルス属（Bacillus）
に属する細菌が生産する、液体或いは粉末衣料用洗浄
剤、繊維処理剤等へ配合可能な耐熱性アルカリセルラー
ゼ、それを生産する微生物及びその製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】セルロ
ースは、地球上で最も豊富に存在するバイオマス資源で
あり、従来、バイオマス資源の有効利用の一環として、
セルラーゼによるセルロースの分解に関する研究が数多
くなされてきている。その一方で、セルラーゼの産業用
途として、衣料用洗剤への配合が行われている。このセ
ルラーゼの衣料用洗剤への配合は、洗浄力を向上させる
ばかりではなく、洗剤のコンパクト化にも貢献しており
（環境負荷が小さい）、最近では衣料用洗剤は従来と比
べ極めてコンパクトになっている。

【０００３】ここで、セルラーゼを衣料用洗剤の配合成
分とする場合、アルカリ性で最高活性を示し、かつ安定
である、いわゆるアルカリセルラーゼである必要があ
る。また、50℃以上という高温で洗濯が行われるヨーロ
ッパ等の地域での使用や、造粒後あるいは製品配合後の
保存安定性を考慮すれば、耐熱性であることも望まれ
る。

【０００４】しかし、従来知られているセルラーゼのほ
とんどは、耐熱性が低く、かつ酸性から中性付近で活性
を有する、いわゆる酸性或いは中性セルラーゼと称され
るものであり、衣料用洗剤に安定的に配合するには適し
ないものであった。

【０００５】従来知られている耐熱性セルラーゼとして
は、例えば以下に示すようなものがある。すなわち、ク
ロストリジウム サーモセラム由来のセルラーゼは、75
℃、30分間の処理で約80％の残存活性を有する〔Biosc
i. Biotech. Biochem., 56, 1198-1203(1992)〕。ロド
サーマス マリナス由来のセルラーゼは、100℃、10分
間の処理で約30％の残存活性を有する〔G. O. Hreggvid
sson et al., Appl. Environ. Microbiol., 62, 3047-3
049(1996)〕。また、アシドマーマス セルロリティク
ス由来のセルラーゼはその粗酵素で、90℃、２時間の処
理で約20％の残存活性を有する（特公平7-2113号公
報）。しかし、これらのセルラーゼは、耐熱性は高いも
のの、その最適反応pHは、クロストリジウム サーモセ
ラム由来のものはpH６付近、ロドサーマス マリナス由
来のものはpH７、アシドマーマス セルロリティクス由
来のものはpH４と、酸性から中性領域にあり、いずれも
いわゆる中酸性セルラーゼである。更に、これら菌株は
いずれも高熱菌であり、育種に関する遺伝学的・生化学
的情報に乏しいとともに、その生育温度の至適範囲が55
℃〜60℃と高温で実際の工業的な規模での培養において
エネルギーコストがかかるという問題がある。

【０００６】一方、バチルス エスピー No.1139由来の
セルラーゼは、その最適反応pHを９に有するアルカリセ
ルラーゼであるが、60℃、10分間の処理で完全に失活す
る〔F. Fukumori et al., J. Gen. Microbiol., 131, 3
339-3345 (1985)〕。またバチルス エスピ−KSM-635由
来の粗酵素セルラ−ゼは、最適反応pHを９〜10に有する
アルカリセルラ−ゼであり、75℃、20分間の処理におい
て25％の残存活性を有する（特開昭63-109771号公報）
が、精製酵素は45℃、10分間の処理で失活する〔Yoshim
atsu et al., J. Gen. Microbiol., 136, 1973-1979(19
90)〕。

【０００７】このように、従来知られているセルラーゼ
では、耐熱性を有し、かつ最適pHをアルカリ領域に有す
るものは存在しなかった。従って、衣料用洗剤への配合
に適し、工業的にも有利な、耐熱性アルカリセルラーゼ
の開発が望まれている。また、このような耐熱性セルラ
ーゼの開発は、繊維処理、脱墨剤等の応用開発において
も強く望まれている。

【０００８】

【課題を解決するための手段】かかる実情において本発
明者らは、鋭意研究を重ねた結果、バチルス属に属する
中温性の好アルカリ性細菌が新規な耐熱性アルカリセル
ラーゼを生産することを見出し、本発明を完成した。

【０００９】すなわち本発明は、次の（１）〜（６）の
性質を有するセルラーゼ、それを生産する微生物、その
製造方法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物、繊
維処理剤及び脱墨剤を提供するものである。 (1) 熱安定性 100℃、10分間の処理で20％以上の活性を保持する。 (2) 最適反応温度範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応温度範
囲は、40〜50℃である。 (3) pH安定性 ５℃で３時間放置したときの安定pH範囲は、約５〜12で
ある。 (4) 最適反応pH範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応pH範囲
は、7.5〜9.5である。 (5) 基質特異性 カルボキシメチルセルロース及びリケナンに作用する。 (6) 分子量 ゲルろ過法による分子量は86,000±2,000である。

【００１０】

【発明の実施の形態】本発明の耐熱性アルカリセルラー
ゼの製造は、例えばバチルス属に属する耐熱性アルカリ
セルラーゼ生産菌を培養し、培養物から耐熱性アルカリ
セルラーゼを採取することにより行われる。

【００１１】Ａ．本発明の耐熱性アルカリセルラーゼを
生産する微生物及びその菌学的性質 本発明の耐熱性アルカリセルラーゼを製造する際に用い
られる微生物は、バチルス属に属し、耐熱性アルカリセ
ルラーゼを生産する能力を有する微生物であれば、その
如何を問わない。かかるバチルス属細菌の好適な例とし
ては、バチルスエスピー KSM-S237株が挙げられる。本
菌株は、本発明者らが日本国内の土壌から新たに分離し
た菌株であって、下記に示す菌学的性質を有する。

【００１２】(a) 形態 １．形状：桿菌（0.6〜0.8×3.0〜5.0μm） ２．多形性：なし ３．運動性：周鞭毛で運動性有り ４．胞子形成能：大きさ（0.6〜0.8×0.8〜1.2μm）、
位置（準端）、膨潤性有り ５．グラム染色：陽性又は弱陽性 ６．抗酸性：無し

【００１３】(b) 生育状態 １．肉汁寒天平板培地での生育：生育は良好で、周縁は
葉状或いは樹根状であり、色調は乳黄色である。 ２．肉汁寒天斜面培地での生育：肉汁寒天平板培地での
生育と同様。 ３．肉汁液体培地での生育：アルカリ性培地での生育は
良好である。 ４．肉汁ゼラチン穿刺培養：生育しゼラチンを液化す
る。

【００１４】(c) 生理学的性質 １．硝酸塩の還元：陽性 ２．脱窒反応：陰性 ３．MRテスト：アルカリ性のため判定できず。 ４．VPテスト：アルカリ性のため判定できず。 ５．インドール生成：陰性 ６．硫化水素の発生：陰性 ７．デンプンの加水分解：陽性 ８．クエン酸の利用：陽性（コーサーの培地）、クリス
チンゼン及びシモンズの培地は、アルカリ性のため判定
できず。 ９．無機窒素源の利用：硝酸塩の利用、アンモニウム塩
の利用共に陽性 10．色素の生成：キングＡ培地、キングＢ培地共に生育
するが色素生産はしない。 11．ウレアーゼ：陰性 12．オキシダーゼ：陽性 13．カタラーゼ：陽性 14．OFテスト（Hugh Leifson法）：醗酵 15．嫌気的生育：生育する。 16．リトマスミルク：ペプトン化する。 17．ONGP（o-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシ
ド）：陽性 18．ゼラチンの液化：陽性 19．エスクリンの加水分解：陽性 20．含塩耐性（アルカリ性）：０〜10％の範囲で生育で
きる。 21．糖の利用性 生育可能な糖源：D-ガラクトース、L-アラビノース、シ
ュークロース、D-グルコース、D-マンニトール、イノシ
ット、D-ソルビトール、トレハロース、ラクトース（乳
糖）、グリセリン、マルトース（麦芽糖）、D-フラクト
ース、ラフィノース、メリビオース、デンプン。 生育できない糖源：D-キシロース 22．生育温度：10〜40℃ 23．生育pH範囲：pH９〜12

【００１５】以上の菌学的性質に基づき、バージーズ・
マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロ
ジー（Bergey's Manual of Determinative Bacteriolog
y）第８版を参照し、比較検討した結果、アルカリ菌と
してバチルス アルカロフィラス（Bacillus alcalophi
lus）があるが、このものは胞子膨潤性、嫌気培養での
生育、硝酸還元能及び塩化ナトリウム存在下での生育と
いう点において本菌株との類似性がない。一方、マイク
ロバイオロジー〔P. Nielsen et al., Microbiology, 1
41, 1745-1761(1995)〕によれば、本菌株は、有胞子桿
菌であるバチルス アガラドヘレンス（Bacillus agara
dhaerens）に近縁であるため、新規な好アルカリ性バチ
ルスとして工業技術院生命工学工業技術研究所に本菌株
の寄託を行った（FERM P-16067）。

【００１６】Ｂ．本発明の耐熱性アルカリセルラーゼの
生産に使用される培地 上記本発明菌株による耐熱性アルカリセルラーゼの生産
に際しては、資化し得る窒素源と炭素源を適宜組み合わ
せて培養培地に含有させることが好ましく、特に両栄養
源に限定はない。例えば、窒素源としては、無機の硝
安、硫安、塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダ等の
無機窒素源；コーングルテンミール、大豆粉、コーンス
チープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメデ
ィア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、
アジパワー、コーンソイビーンミール、コーヒー粕、綿
実油粕、カルチベータ、アミフレックス、アジプロン、
ゼスト、アジックス等の有機窒素源が挙げられる。また
炭素源としては、麸、濾紙、一般紙類、おが屑等の植物
繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセルロース
（CMC）、アビセル、セルロース綿、ペクチンに加え、
資化し得る炭素源、例えば、D-ガラクトース、L-アラビ
ノース、シュークロース、D-グルコース、D-マンニトー
ル、イノシット、D-ソルビトール、トレハロース、ラク
トース（乳糖）、グリセリンマルトース（麦芽糖）、D-
フラクトース、ラフィノース、メリビオース、デンプン
や、資化し得る有機酸、例えば、酢酸、クエン酸等が挙
げられる。その他、リン酸、Mg²⁺、Ca²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、
Co²⁺、Na⁺、Ｋ⁺等の無機塩や、必要であれば、無機又は
有機微量栄養源を含有する培地を適宜選択して使用され
る。

【００１７】Ｃ．本発明の耐熱性アルカリセルラーゼの
生産、採取、精製 培養温度は、10〜40℃、特に25〜35℃が好ましく、培養
初発pHは９〜12、特に９〜11が好ましい。この条件下に
おいて、培養は通常２〜４日間で完了する。

【００１８】かくして得られた培養物中からの目的物質
である耐熱性アルカリセルラーゼの採取及び精製は、一
般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことができ
る。すなわち、培養物を遠心分離又はろ過等に付して菌
体を分離し、その菌体及び培養ろ液から通常の手段、例
えば塩析法、等電点沈殿法、溶媒沈殿法（メタノール、
エタノール、アセトン、イソプロピルアルコール等）に
よりタンパク質を沈殿させたり、また限外ろ過（例え
ば、ダイヤフローウルトラフィルターメンブレン；アミ
コン社製）により濃縮させることにより、耐熱性アルカ
リセルラーゼを得る。塩析法では、例えば、75％硫安中
で酵素を沈殿させた後、ろ過或いは遠心分離、脱塩する
ことによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能であ
る。脱塩の方法としては、透析又はセファデックスG-15
等を用いるゲルろ過法等の一般的方法が用いられる。更
に、酵素を精製するには、例えば、吸着クロマトグラフ
ィー；DEAE-トヨパール、DEAE-セファデックス、SUPER
Q-トヨパール、CM-トヨパール等によるイオン交換クロ
マトグラフィー；バイオゲル、セファクリル等による分
子篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精
製すればよい。

【００１９】Ｄ．本発明の耐熱性アルカリセルラーゼ
（精製酵素）の理化学的性質 以上の如くして得られた耐熱性アルカリセルラーゼの酵
素学的性質の概要及び詳細を以下に示す。なお、以下に
おいて用いた酵素活性測定法は、次の通りである。

【００２０】〔酵素活性測定法〕 (a) CMCアーゼ活性 終濃度１％(w/v)のCMC（日本製紙社製）を含有せしめた
0.1Ｍグリシン−水酸化ナトリウム基質溶液（pH９）0.9
mlに、適当に希釈した酵素溶液0.1mlを加え、40℃で20
分間反応した。反応後、3,5-ジニトロサリチル酸（DN
S）法にて還元糖の定量を行った。すなわち、反応液１m
lにDNS溶液１mlを加えて沸騰湯浴中で５分間放置し、氷
水中で冷却した後、脱イオン水４mlを加え希釈した後、
535nmにおける吸光度を分光光度計で比色定量した。酵
素力価は、上記の条件下で１分間に１μmolのグルコー
スに相当する還元糖を生成する酵素量を１単位とした。

【００２１】(b) タンパク質定量 タンパク質定量法は、DCプロテインアッセイキット（バ
イオ・ラッド社製）を用いて、牛血清アルブミンを標準
タンパク質として算出した。

【００２２】〔酵素学的性質〕本発明の耐熱性アルカリ
セルラーゼは、次の酵素学的性質を有するものである。 (1) 熱安定性 100℃、10分間の処理で20％以上の活性を保持する。 (2) 最適反応温度範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応温度範
囲は、40〜50℃である。 (3) pH安定性 ５℃で３時間放置したときの安定pH範囲は、約５〜12で
ある。 (4) 最適反応pH範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応pH範囲
は、7.5〜9.5である。 (5) 基質特異性 カルボキシメチルセルロース及びリケナンに作用する。

【００２３】なお、本発明の耐熱性アルカリセルラーゼ
のより詳細な酵素学的性質は、以下に示す通りである。

【００２４】(a) 熱安定性 0.5Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH9.0）0.2m
l、脱イオン水0.7ml及び精製酵素溶液0.1ml（5.6μg）
を混合し、20℃、30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60
℃、65℃、70℃、80℃、90℃及び100℃の各温度で10分
間処理した後、氷水中で冷却し、処理液１mlのうち0.1m
lを用いて、１％(w/v)CMC溶液（pH9.0）中、40℃で20分
間反応した後、DNS法により活性を測定した。また、処
理液中に５mMの塩化カルシウムを添加した系についても
同時に活性を測定した。未処理の場合の活性値を100と
した残存活性で示した（図１）。この結果、本酵素は、
10分間の処理において、カルシウムの有無に拘わらず45
℃まで80％以上の活性を保持し、100℃で約30％の活性
を保持した。

【００２５】(b) 最適反応温度 1.1％(w/v)CMC溶液（pH9.0）0.9mlに酵素溶液0.1ml（0.
56μg）を加え、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50
℃、55℃、60℃及び70℃の各温度で20分間反応した後、
DNS法により活性を測定し、最も活性の高い50℃での値
を100とした相対値で示した（図２）。この結果、本発
明酵素のCMC分解活性の最適反応温度は、50℃であり、
５mM塩化カルシウムの存在下では、60℃であった。

【００２６】(c) pH安定性 0.1Ｍの各種緩衝液0.06ml、脱イオン水0.21ml及び酵素
溶液0.03ml（5.6μg）を1.5ml容のマイクロチューブに
入れ、５℃で３時間及び30℃で30分間処理後、氷水中に
移し冷却後、DNS法により活性を測定し、未処理の場合
の活性値を100とした残存活性で示した（図３）。この
結果、５℃で３時間放置した場合の安定pH範囲は、pH５
〜12であった。

【００２７】なお、使用した緩衝液（いずれも0.1Ｍ）
の種類及びpHを下に示す。 酢酸緩衝液 ：pH4.1，pH5.2，pH6.1 リン酸緩衝液 ：pH6.2，pH7.2，pH8.1 トリス塩酸緩衝液 ：pH7.1，pH8.1，pH9.0 グリシン−NaOH緩衝液：pH8.5，pH9.5，pH10.1，pH10.
5，pH11.0 リン酸−NaOH緩衝液 ：pH11.0，pH12.1，pH12.3

【００２８】(d) 最適反応pH 40mMブリットン・ロビンソン広域緩衝液でpHを調整した
各1.1％(w/v)CMC溶液（pH5.2, 6.1, 7.0, 7.5, 8.1, 8.
6, 9.0, 9.5, 10.1及び11.1）0.9mlと酵素溶液0.1ml
（9.3μg）を混合し、40℃で20分間反応した後、DNS法
により活性を測定し、最も活性が高かったpH8.6での活
性値を100とした相対値で示した（図４）。この結果、C
MC分解活性の最適反応pHは8.6近傍にあり、pH7.5〜9.5
の範囲で最大活性の85％以上の良好なCMC分解活性を示
した。またpH11でも最大活性の約40％の活性を有してい
た。

【００２９】(e) 基質特異性 多糖基質としては、CMC、リケナン、キシラン、ラミナ
リン、カードラン、イヌリン、ペクチン、アビセル、リ
ン酸膨潤アビセル（ASA）及び還元型アルカリ膨潤アビ
セル（RALSA）を用いた。各種2.5％(w/v)基質溶液４m
l、0.5Ｍグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH10）２
ml及び脱イオン水３mlを混合し、酵素溶液0.1mlを加
え、40℃で20分間反応した後、DNS法により活性を測定
した。CMCを除き、いずれの基質も分光光度計による535
nmでの吸光度測定前に遠心分離（3,000rpm，20min，20
℃）して残査を除去した。各種20mMの合成基質溶液250
μl、250mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液（pH９）
0.4ml及び脱イオン水0.15mlに酵素溶液0.2mlを加え、40
℃で20分間反応後、１Ｍ炭酸ナトリウム溶液0.4mlを加
えて反応を停止した。５分間室温で放置した後、400nm
における吸光度を測定した。CMCの分解活性を100とした
相対値で多糖基質及び合成基質の分解活性を示した（表
１）。この結果、本発明酵素は、CMC及びリケナンに良
好に作用した。

【００３０】

【表１】

【００３１】(f) 界面活性剤に対する安定性 各種界面活性剤〔活性分として0.5％(w/v)〕0.1ml、0.1
Ｍトリス塩酸緩衝液（pH7.2）0.5ml及び脱イオン水0.3m
lに酵素溶液0.1mlを加え、30℃で20分間処理した後氷冷
し、0.1mlを用いてDNS法によりCMC分解活性を測定し、
界面活性剤無添加の活性を100とした相対値で示した
（表２）。この結果、本発明酵素は、直鎖アルキルベン
ゼンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、α−オレフ
ィンスルホン酸塩、2-スルホ脂肪酸塩、アルキル硫酸
塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテルにより活性をほとんど
阻害されなかった。

【００３２】

【表２】

【００３３】(g) 金属塩の影響 10mM金属塩溶液0.1ml、0.1Ｍトリス塩酸緩衝液（pH7.
0）0.5ml及び脱イオン水0.3mlに酵素溶液0.1mlを加え、
30℃で20分間処理した後氷冷し、そのうち0.1mlを用い
てDNS法によりCMC分解活性を測定し、金属塩無添加の場
合の活性値を100とした相対値で示した（表３）。この
結果、本発明酵素は、Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、
Mn²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ｋ⁺及びNa⁺により阻害を受けず、Pb
²⁺により若干阻害を受け、Fe²⁺により完全に失活した。

【００３４】

【表３】

【００３５】(h) 阻害剤の影響 適当な濃度に調整した各種化合物水溶液0.1ml、0.1Ｍト
リス塩酸緩衝液（pH7.2）0.5ml及び脱イオン水0.3mlに
酵素溶液0.1mlを加え、30℃で20分間処理した後、氷水
中で冷却し0.1mlを用いてDNS法により活性を測定し、化
合物無添加時の活性を100とした相対値で示した（表
４）。この結果、本発明酵素は、モノヨ−ド酢酸により
若干阻害を受けた。

【００３６】

【表４】

【００３７】(i) 分子量 ゲルろ過法により分子量を求めた。ゲル担体はセファク
リルS200（ファルマシア社製）を用いた。予め10mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.5，２mM CaCl₂及び0.1M NaCl含有）
で平衡化しておいたセファクリルS200カラム（1.5×80c
m）に精製酵素溶液１mlを掛け、同緩衝液で溶出した
（0.12ml/min・cm²）。この結果、本酵素の分子量は、8
6,000±2,000であった（図５）。

【００３８】(j) 等電点 ファルマシアLKB MultiphorII電気泳動装置、アンフォ
ラインPAGプレート及びキャリブレーションキット（い
ずれもファルマシア社製）を用いて等電点電気泳動を行
った。この結果、本発明酵素の等電点は、約3.8であっ
た。

【００３９】Ｅ．本発明の耐熱性アルカリセルラーゼの
用途 本発明の耐熱性アルカリセルラーゼは、衣料用洗浄剤、
特に高温域で洗濯を行う地域における衣料用洗浄剤への
添加酵素として好適に用いられるほか、ジーンズ等の木
綿製衣類の風合を改善するための繊維処理、脱墨剤、中
性からアルカリ性での含セルロース産業家庭廃棄物処
理、中性からアルカリ性でのセルロースの糖化などに有
用である。

【００４０】本発明の洗浄剤組成物への上記耐熱性アル
カリセルラーゼの配合量は、0.05〜40U/g、特に0.1〜20
U/g、更に0.2〜10U/gが好ましい。

【００４１】また、本発明の洗浄剤組成物には、公知の
洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成
分としては、例えば次のものが挙げられる。

【００４２】(1) 界面活性剤：平均炭素数10〜16のアル
キル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、平
均炭素数10〜20の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、
１分子内に平均0.5〜８モルのエチレンオキサイドを付
加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均炭素数10〜20のア
ルキル基を有するアルキル硫酸塩、平均10〜20の炭素原
子を１分子中に有するオレフィンスルホン酸塩、平均10
〜20の炭素原子を１分子中に有するアルカンスルホン酸
塩、平均10〜20の炭素原子を１分子中に有するα−スル
ホ脂肪酸メチルあるいはエチルエステル塩、平均炭素数
８〜20の高級脂肪酸塩、平均炭素数10〜20の直鎖又は分
岐鎖のアルキル基を有し、１分子内に平均0.5〜８モル
のエチレンオキサイドを付加したアルキルエーテルカル
ボン酸塩などのアニオン性界面活性剤；平均炭素数10〜
20のアルキル基を有し、１〜20モルのエチレンオキシド
を付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル、高級
脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキサイ
ド付加物、またプロピレンオキサイドとプロピレングリ
コールとの縮合物にエチレンオキサイドを付加させた、
プルロニックという名称で知られているものなどの非イ
オン性界面活性剤；その他ベタイン型両性界面活性剤；
スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル系界面活
性剤、アミノ酸型界面活性剤、カチオン性界面活性剤な
ど。

【００４３】これらの界面活性剤は洗浄剤組成物中0.5
〜60重量％配合され、特に粉体状洗浄剤組成物について
は10〜45重量％、液体洗浄剤組成物については20〜50重
量％配合することが好ましい。また、本発明洗浄剤組成
物が衣料用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１〜
10重量％、好ましくは１〜５重量％配合される。

【００４４】(2)二価金属イオン捕捉剤：トリポリリン
酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸
塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶
性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢
酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカ
ルボン酸塩など。この二価金属イオン捕捉剤は、０〜50
重量％、好ましくは５〜40重量％配合される。また、リ
ンを含有しない二価金属イオン捕捉剤を用いることがよ
り好ましい。

【００４５】(3)アルカリ剤及び無機塩：ケイ酸塩、炭
酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、アルカノールアミンな
ど。これらは０〜80重量％配合される。

【００４６】(4)再汚染防止剤：ポリエチレングリコー
ル、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸コポリマー、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキ
シメチルセルロースなど。再汚染防止剤の一部は、二価
金属イオン捕捉剤としても使用できる。再汚染防止剤は
０〜10重量％、好ましくは１〜５重量％配合される。

【００４７】(5)酵素：本発明のセルラーゼ以外のセル
ラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、β−
グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロ
ールオキシダーゼ、プロテアーゼ等の酵素。

【００４８】(6)水道水中の有効塩素の捕捉剤又は還元
剤：有効塩素の捕捉剤として、硫酸アンモニウム、尿
素、塩酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸
グアニジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、
ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、又グリシ
ン、グルタミン酸ナトリウム等で代表されるアミノ酸及
び牛血清アルブミン、カゼインなどの蛋白質、更には蛋
白質の加水分解、肉エキス、魚肉エキスなどが挙げられ
る。還元剤としては、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、亜ニチオ
ン酸塩等のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等及び
ロンガリットＣ等が挙げられる。特に亜硫酸塩が好まし
く、洗濯液中の酵素を安定化させる。

【００４９】(7)漂白剤：過炭酸塩、過硼酸塩、スルホ
ン化フタロシアニン亜鉛塩又はアルミニウム塩、過酸化
水素など。漂白洗浄剤とする場合は、特に過酸化ナトリ
ウムが効果的であり、配合量は１〜95重量％、更に５〜
95重量％、特に20〜95重量％とするのが好ましい。

【００５０】(8)蛍光染料：通常洗浄剤に用いられる蛍
光染料。

【００５１】(9)可溶化剤：液体洗剤の場合には次のよ
うな可溶化剤を用いることができる。エタノールなどの
低級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンス
ルホン酸塩などの低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、
プロピレングリコールなどのポリオール類など。

【００５２】(10)その他：上記以外に、従来公知の香
料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、
防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤、酵素安定化
剤、相調節剤等の洗剤に常用の成分を必要に応じて配合
することができる。

【００５３】本発明の洗浄剤組成物は、本発明の耐熱性
アルカリセルラーゼ及び上記公知の洗浄成分を適宜組み
合せて、常法に従って製造することができる。洗浄剤の
形態は、用途に応じて選択することができ、例えば液
体、粉末、顆粒等とすることができる。また、本発明洗
浄剤組成物は、特に衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤等として
好適に使用することができる。

【００５４】本発明の耐熱性アルカリセルラーゼを衣類
等の繊維処理による風合の改善に使用する場合、処理液
中への耐熱性アルカリセルラーゼの配合量は、５００〜
２００，０００Ｕ／ｌ、特に１，０００〜１００，００
０Ｕ／ｌ、更に２，０００〜２０，０００Ｕ／ｌが好ま
しい。また当該処理液のｐＨは、７．５〜１０．５の範
囲に調整することが好ましい。衣類等は、上記処理液で
処理した後、通常、硫酸、リン酸、塩化亜鉛、水酸化ナ
トリウム等の膨潤剤によって処理される。

【００５５】本発明の耐熱性アルカリセルラーゼを脱墨
剤として使用する場合、耐熱性アルカリセルラーゼの使
用量は、原料古紙１kgに対して50Ｕ以上、特に50〜100,
000Ｕ、更に100〜50,000Ｕが好ましい。

【００５６】本発明の脱墨剤中には、本発明の耐熱性ア
ルカリセルラーゼ以外に、脱墨剤に通常配合される成
分、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル
硫酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、ジアルキルスル
ホサクシネート、高級脂肪酸塩等のアニオン性界面活性
剤；高級アルコールエチレンオキサイド付加物、アルキ
ルフェノールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレ
ンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド
付加物、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド
付加物、油脂のエチレンオキサイド付加物、高級アルコ
ールエチレンオキサイドプロピレンオキサイド（ブロッ
ク又はランダム）付加物等の非イオン性界面活性剤；ア
ミンオキサイド等の両性界面活性剤；その他有機・無機
ビルダー、有機溶剤等を配合することができる。

【００５７】

【実施例】以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

【００５８】実施例１ 日本国内土壌１ｇを滅菌生理食塩水10mlに懸濁し、80℃
で30分間熱処理した。この熱処理液を適当に希釈してマ
スタープレート〔肉エキス（オキソイド社製）１％，バ
クトペプトン（ディフコ社製）１％，NaCl１％，KH₂PO₄
0.1％，Na₂CO₃0.5％，寒天1.5％〕に塗抹し、30℃で３
日間培養し、集落を形成させた。レプリカ法により、マ
スタープレートと同じ組成の培地に２％CMCを加えた滅
菌寒天培地に移植し、30℃で３〜４日間培養して集落を
形成させた後、コンゴーレッド色素液を流し込み、寒天
が赤色化した中で周囲が染色されない集落を検出した。
該当する集落をマスタープレートから選出し、高力価CM
Cアーゼ生産菌をスクリーニングすることにより、本発
明のバチルス エスピー KSM-S237株を取得した。

【００５９】実施例２ 実施例１で得たバチルス エスピーＳ２３７菌を、肉エ
キス（オキソイド社製）１％、ポリペプトンＳ（日本製
薬社製）２％、酵母エキス（ディフコ社製）０．１％、
ＮａＣｌ１％、Ｋ_２ＨＰＯ_４０．１％、Ｎａ_２ＣＯ
_３０．５％にＣＭＣ１％を加えた液体培地に接種し、３
０℃で３日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分離に
より除き、その上清についてＣＭＣ分解活性を測定した
結果、約１，０００単位／ｌであった。

【００６０】実施例３ 実施例２で得られたS237株の粗酵素液に、30％飽和とな
るように硫安粉末を添加し、撹拌しながら氷水中で２時
間放置した後、遠心分離（12,000rpm，15min，５℃）し
て上清を得た。この上清に60％飽和となるように硫安粉
末を添加し、撹拌しながら氷水中で30分間放置した後、
遠心分離（12,000rpm，15min，５℃）して上清を得た。
得られた上清に、90％飽和となるように硫安粉末を添加
し、撹拌しながら氷水中で60分間放置した後、遠心分離
（13,000rpm，15min，５℃）して得られた沈澱（60〜90
％飽和の硫安処理による沈澱）を10mMトリス塩酸緩衝液
（pH7.5）20mlに溶解した。この溶液を大過剰量の同緩
衝液に対し５℃で一晩透析した。得られた透析内液中に
精製開始時の67％のセルラーゼを回収した。０〜30％及
び30〜60％飽和の硫安処理による沈澱中のセルラーゼ活
性は認められなかった。透析内液を10mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.5）で予め平衡化したDEAE-トヨパール650Mカラ
ム（2.5cm×23cm）に添着し、目的のタンパク質を吸着
させた後、同緩衝液250mlでカラム内を洗浄後、10mMト
リス塩酸緩衝液（pH7.5）400ml及び10mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.5，１Ｍ NaCl含有）400mlを用いてタンパク質
の０〜１ＭのNaClによる直線濃度勾配溶出（４ml/tub
e，0.7ml/min・cm²）を行った後、１ＭのNaCl溶液で更
に溶出を行った。その結果、0.42ＭのNaCl付近にセルラ
ーゼタンパク質が溶出した。このセルラーゼ画分を集
め、２倍容の10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）を加え、
予め10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）で平衡化したDEAE-
トヨパール650Sカラム（1.5cm×20cm）に添着し、タン
パク質を吸着させた後、10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）300ml及び10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5，0.6Ｍ NaC
l含有）300mlを用いて０〜0.6ＭのNaClによる直線濃度
勾配溶出（２ml/tube，0.42ml/min・cm²）を行った。そ
の結果、0.25ＭのNaCl付近にセルラーゼが溶出した。得
られたセルラーゼ画分を集め、限外ろ過(PM10膜，アミ
コン社製)装置を用いて10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）
により約20倍に脱塩濃縮して最終的に４mlの精製酵素を
得た。

【００６１】実施例４ 以下に示す粉末洗剤を調製し、これに実施例３で得られ
た精製耐熱性セルラーゼをCMC活性で1000U/kgとなるよ
うに配合し、その洗浄力（泥汚れ除去作用）を調べた。

【００６２】 （成分） （重量％） 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム （アルキル基の平均炭素数＝12） 12 アルキル硫酸ナトリウム （Ｃ₁₆〜Ｃ₁₈） 4 ポリオキシエチレンアルキルエーテル （アルキル基の平均炭素数＝12.5，EO＝７） 4 硬化牛脂脂肪酸ナトリウム 2 ポリエチレングリコール（Mw＝12000） 2 ポリアクリル酸ナトリウム（Mw＝8000） 2 4A型ゼオライト 18 ケイ酸ナトリウム（JIS２号） 10 炭酸ナトリウム 10 芒硝 バランス 亜硫酸ナトリウム（無水） 1 プロテアーゼ 0.5 蛍光増白剤 0.2 水 4 合計 100

【００６３】（洗浄力測定方法） (イ) 泥んこ汚染布（人工汚染布）の調製：鹿沼園芸用
赤玉土を120±５℃で４時間乾燥後、十分粉砕し、150メ
ッシュ（100μm）の篩を通過したものを、更に120±５
℃で２時間乾燥後、150ｇを１リットルのパークレンに
分散した。金巾#2023布をこの液に接触し、ブラッシン
グして、分散液と過剰付着汚れを脱落させる。10cm×10
cmの試験片を調製し、洗浄力試験に供した。

【００６４】(ロ) 洗浄条件、洗浄方法及び評価法：４
°DHの水に洗剤を溶解し、0.133重量％洗剤水溶液１リ
ットルを調製する。試験布５枚を洗剤水溶液に添加し、
ターゴトメーターにて100rpm、30℃で、10分間攪拌洗浄
する。流水下で濯いだ後、アイロンプレスし反射率測定
に供した。洗浄前の原布及び洗浄前後の汚染布の460nm
における反射率を自記色彩計（島津製作所社製）にて測
定し、次式に従って洗浄率（％）を算出した。

【００６５】

【数１】

【００６６】この結果、本発明のセルラーゼを配合した
洗剤による洗浄率（５枚の平均値）は64％であり、セル
ラーゼ無添加の洗剤の62％に比べ２ポイント向上した。

【００６７】実施例５ 本発明の耐熱性セルラーゼ水溶液（6000Ｕ）をグリシン
−水酸化ナトリウム緩衝液でpH９に調整し、この溶液１
リットルを30〜50℃に保持した。この溶液中に木綿製タ
オル20ｇを浸し、液を緩やかに攪拌しながら約２時間処
理した。次いでこの木綿製タオルを水洗し、よくしぼっ
た後、水酸化ナトリウム0.1〜0.3重量％及びチオ硫酸ナ
トリウム0.3〜0.7重量％を含有する水溶液（30〜50℃）
を用いて10〜30分浸漬処理した後、水洗し、脱水して乾
燥した。この結果、処理された木綿製タオルは風合が向
上した。

【００６８】実施例６ 市中回収新聞古紙を２×５cmに裁断後、その一定量を卓
上離解機に入れ、その中に水酸化ナトリウム1.0重量％
（対原料古紙）、ケイ酸ナトリウム2.0重量％（対原料
古紙）、30重量％過酸化水素水1.0重量％（対原料古
紙）、古紙再生用脱墨剤0.3重量％及び本発明の耐熱性
セルラーゼ６Ｕ／原料古紙１ｇを加え、パルプ濃度６重
量％、45℃で20分間離解した後、45℃にて１時間熟成し
た。パルプ濃度15重量％まで濃縮した後、水を加えて１
重量％濃度に希釈しTAPPIシートマシン（熊谷理機工業
社製）にてパルプシートを作製した。パルプを濃縮した
際の脱水液を５℃で12時間保存し水溶液を一定量採取し
た。なお、脱墨性能の評価は、再生パルプシートを測色
色差計にて白色度を測定することにより行った。また、
脱水液のＬ値を測定するとともに加水分解により生成す
る還元糖の定性も行い、実際に酵素による加水分解反応
が起こっていることを確認した。その結果、パルプシー
トの白色度はセルラーゼ無添加の場合に比べ向上した。
また、脱水液のＬ値はセルラーゼ無添加の場合に比べ低
くなり脱色性が向上した。

【００６９】

【発明の効果】以上の如く、本発明の耐熱性アルカリセ
ルラーゼは、アルカリ領域に最適反応pHを有し、かつ中
温菌による生産酵素でありながら高い耐熱性を有する。
また、種々の界面活性剤に対して極めて安定であり、キ
レート剤によってもほとんど阻害されないため、酵素造
粒工程における失活の程度も低く、衣料用洗浄剤への添
加酵素（特に高温域で洗濯を行う地域における）を初
め、繊維処理、脱墨剤、中性からアルカリ性での含セル
ロース産業家庭廃棄物処理、中性からアルカリ性でのセ
ルロースの液化・糖化などに有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の耐熱性アルカリセルラーゼの耐熱性を
示す図である。

【図２】本発明の耐熱性アルカリセルラーゼの最適反応
温度を示す図である。

【図３】本発明の耐熱性アルカリセルラーゼのpH安定性
を示す図である。

【図４】本発明の耐熱性アルカリセルラーゼの最適反応
pHを示す図である。

【図５】本発明の耐熱性アルカリセルラーゼのセファク
リルS200によるゲルクロマトグラフィー法における溶出
画分とセルラーゼ活性の関係を示す図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 吉松 正 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (72)発明者 小林 徹 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (72)発明者 伊藤 進 栃木県芳賀郡市貝町赤羽2606 花王株式 会社研究所内 (56)参考文献 特開 昭52−134090（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 次の性質を有するセルラーゼ。(1) 熱安
   定性 100℃、10分間の処理で20％以上の活性を保持する。 (2) 最適反応温度範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応温度範
   囲は、40〜50℃である。 (3) pH安定性 ５℃で３時間放置したときの安定pH範囲は、約５〜12で
   ある。 (4) 最適反応pH範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応pH範囲
   は、7.5〜9.5である。 (5) 基質特異性 カルボキシメチルセルロース及びリケナンに作用する。 (6) 分子量 ゲルろ過法による分子量は86,000±2,000である。
2. 【請求項２】 次の性質を有するものである請求項１記
   載のセルラーゼ。(1) 熱安定性 カルシウムの有無に拘わらず、100℃、10分間の処理に
   おいて約30％の活性を保持する。 (2) 最適反応温度 カルボキシメチルセルロ−ス分解活性の最適反応温度
   は、50℃であり、５mM塩化カルシウムの存在下では、60
   ℃である。 (3) pH安定性 ５℃で３時間放置したときの安定pH範囲は、５〜12であ
   る。 (4) 最適反応pH カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応pHは、
   8.6近傍にあり、pH7.5〜9.5の範囲で85％以上、pH11で
   も約40％のカルボキシメチルセルロース分解活性を有す
   る。 (5) 基質特異性 カルボキシメチルセルロース及びリケナンに良好に作用
   する。 (6) 界面活性剤に対する安定性 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルカンスルホン
   酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、2-スルホ脂肪酸
   塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエー
   テル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、
   活性をほとんど阻害しない。 (7) 金属塩の影響 Ca²⁺、Cd²⁺、Co²⁺、Hg²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Zn²⁺、Fe³⁺、Ｋ
   ⁺及びNa⁺では阻害を受けず、Pb²⁺により若干の阻害を受
   ける。Fe²⁺により完全に失活する。 (8) 阻害剤の影響 モノヨ−ド酢酸により若干阻害を受ける。 (9) 分子量 ゲルろ過法による分子量は86,000±2,000である。 (10) 等電点 3.8近傍にある。
3. 【請求項３】 バチルス エスピー KSM-S237株と命名さ
   れ、FERM P-16067として寄託された請求項１又は２に記
   載のセルラーゼを生産する微生物。
4. 【請求項４】 バチルス属に属する耐熱性アルカリセル
   ラーゼ生産菌を培養し、培養物から耐熱性アルカリセル
   ラーゼを採取することを特徴とする請求項１又は２に記
   載のセルラーゼの製造方法。
5. 【請求項５】 バチルス属に属する耐熱性アルカリセル
   ラーゼ生産菌が、バチルス エスピー KSM-S237株（FERM
   P-16067）である請求項４記載の製造方法。
6. 【請求項６】 請求項１又は２に記載のセルラーゼを含
   有する洗浄剤組成物。
7. 【請求項７】 請求項１又は２に記載のセルラーゼを含
   有する繊維処理剤。
8. 【請求項８】 請求項１又は２に記載のセルラーゼを含
   有する脱墨剤。