JPH10313859A - 耐熱性アルカリセルラ−ゼ、それを生産する微生物及びその製造方法 - Google Patents
耐熱性アルカリセルラ−ゼ、それを生産する微生物及びその製造方法Info
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- JPH10313859A JPH10313859A JP12853597A JP12853597A JPH10313859A JP H10313859 A JPH10313859 A JP H10313859A JP 12853597 A JP12853597 A JP 12853597A JP 12853597 A JP12853597 A JP 12853597A JP H10313859 A JPH10313859 A JP H10313859A
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Abstract
保持し、かつ作用pHが7.5以上であるセルラーゼ、それ
を生産するバチルス・エスピー KSM-S237株(FERM P-16
067)、これを培養して培養物から耐熱性アルカリセル
ラーゼを採取する上記耐熱性アルカリセルラーゼの製造
方法、並びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物、繊維処
理剤及び脱墨剤。 【効果】 本発明のセルラーゼは、アルカリ領域に最適
反応pHを有すると共に、高い耐熱性を有し、衣料用洗浄
剤(特に高温域で洗濯を行う地域における)、繊維処理
等に有用である。
Description
ルラ−ゼ、それを生産する微生物及びその製造法に関す
るものであり、更に詳しくは、バチルス属(Bacillus)
に属する細菌が生産する、液体或いは粉末衣料用洗浄
剤、繊維処理剤等へ配合可能な耐熱性アルカリセルラー
ゼ、それを生産する微生物及びその製造法に関する。
ースは、地球上で最も豊富に存在するバイオマス資源で
あり、従来、バイオマス資源の有効利用の一環として、
セルラーゼによるセルロースの分解に関する研究が数多
くなされてきている。その一方で、セルラーゼの産業用
途として、衣料用洗剤への配合が行われている。このセ
ルラーゼの衣料用洗剤への配合は、洗浄力を向上させる
ばかりではなく、洗剤のコンパクト化にも貢献しており
(環境負荷が小さい)、最近では衣料用洗剤は従来と比
べ極めてコンパクトになっている。
分とする場合、アルカリ性で最高活性を示し、かつ安定
である、いわゆるアルカリセルラーゼである必要があ
る。また、50℃以上という高温で洗濯が行われるヨーロ
ッパ等の地域での使用や、造粒後あるいは製品配合後の
保存安定性を考慮すれば、耐熱性であることも望まれ
る。
とんどは、耐熱性が低く、かつ酸性から中性付近で活性
を有する、いわゆる酸性或いは中性セルラーゼと称され
るものであり、衣料用洗剤に安定的に配合するには適し
ないものであった。
は、例えば以下に示すようなものがある。すなわち、ク
ロストリジウム サーモセラム由来のセルラーゼは、75
℃、30分間の処理で約80%の残存活性を有する〔Biosc
i. Biotech. Biochem., 56, 1198-1203(1992)〕。ロド
サーマス マリナス由来のセルラーゼは、100℃、10分
間の処理で約30%の残存活性を有する〔G. O. Hreggvid
sson et al., Appl. Environ. Microbiol., 62, 3047-3
049(1996)〕。また、アシドマーマス セルロリティク
ス由来のセルラーゼはその粗酵素で、90℃、2時間の処
理で約20%の残存活性を有する(特公平7-2113号公
報)。しかし、これらのセルラーゼは、耐熱性は高いも
のの、その最適反応pHは、クロストリジウム サーモセ
ラム由来のものはpH6付近、ロドサーマス マリナス由
来のものはpH7、アシドマーマス セルロリティクス由
来のものはpH4と、酸性から中性領域にあり、いずれも
いわゆる中酸性セルラーゼである。更に、これら菌株は
いずれも高熱菌であり、育種に関する遺伝学的・生化学
的情報に乏しいとともに、その生育温度の至適範囲が55
℃〜60℃と高温で実際の工業的な規模での培養において
エネルギーコストがかかるという問題がある。
セルラーゼは、その最適反応pHを9に有するアルカリセ
ルラーゼであるが、60℃、10分間の処理で完全に失活す
る〔F. Fukumori et al., J. Gen. Microbiol., 131, 3
339-3345 (1985)〕。またバチルス エスピ−KSM-635由
来の粗酵素セルラ−ゼは、最適反応pHを9〜10に有する
アルカリセルラ−ゼであり、75℃、20分間の処理におい
て25%の残存活性を有する(特開昭63-109771号公報)
が、精製酵素は45℃、10分間の処理で失活する〔Yoshim
atsu et al., J. Gen. Microbiol., 136, 1973-1979(19
90)〕。
では、耐熱性を有し、かつ最適pHをアルカリ領域に有す
るものは存在しなかった。従って、衣料用洗剤への配合
に適し、工業的にも有利な、耐熱性アルカリセルラーゼ
の開発が望まれている。また、このような耐熱性セルラ
ーゼの開発は、繊維処理、脱墨剤等の応用開発において
も強く望まれている。
明者らは、鋭意研究を重ねた結果、バチルス属に属する
中温性の好アルカリ性細菌が新規な耐熱性アルカリセル
ラーゼを生産することを見出し、本発明を完成した。
40%以上の活性を保持し、かつ作用pHが7.5以上である
セルラーゼ、それを生産する微生物、その製造方法、並
びに当該酵素を含有する洗浄剤組成物、繊維処理剤及び
脱墨剤を提供するものである。
ゼの製造は、例えばバチルス属に属する耐熱性アルカリ
セルラーゼ生産菌を培養し、培養物から耐熱性アルカリ
セルラーゼを採取することにより行われる。
生産する微生物及びその菌学的性質 本発明の耐熱性アルカリセルラーゼを製造する際に用い
られる微生物は、バチルス属に属し、耐熱性アルカリセ
ルラーゼを生産する能力を有する微生物であれば、その
如何を問わない。かかるバチルス属細菌の好適な例とし
ては、バチルスエスピー KSM-S237株が挙げられる。本
菌株は、本発明者らが日本国内の土壌から新たに分離し
た菌株であって、下記に示す菌学的性質を有する。
位置(準端)、膨潤性有り 5.グラム染色:陽性又は弱陽性 6.抗酸性:無し
葉状或いは樹根状であり、色調は乳黄色である。 2.肉汁寒天斜面培地での生育:肉汁寒天平板培地での
生育と同様。 3.肉汁液体培地での生育:アルカリ性培地での生育は
良好である。 4.肉汁ゼラチン穿刺培養:生育しゼラチンを液化す
る。
チンゼン及びシモンズの培地は、アルカリ性のため判定
できず。 9.無機窒素源の利用:硝酸塩の利用、アンモニウム塩
の利用共に陽性 10.色素の生成:キングA培地、キングB培地共に生育
するが色素生産はしない。 11.ウレアーゼ:陰性 12.オキシダーゼ:陽性 13.カタラーゼ:陽性 14.OFテスト(Hugh Leifson法):醗酵 15.嫌気的生育:生育する。 16.リトマスミルク:ペプトン化する。 17.ONGP(o-ニトロフェニル-β-D-グルコピラノシ
ド):陽性 18.ゼラチンの液化:陽性 19.エスクリンの加水分解:陽性 20.含塩耐性(アルカリ性):0〜10%の範囲で生育で
きる。 21.糖の利用性 生育可能な糖源:D-ガラクトース、L-アラビノース、シ
ュークロース、D-グルコース、D-マンニトール、イノシ
ット、D-ソルビトール、トレハロース、ラクトース(乳
糖)、グリセリン、マルトース(麦芽糖)、D-フラクト
ース、ラフィノース、メリビオース、デンプン。 生育できない糖源:D-キシロース 22.生育温度:10〜40℃ 23.生育pH範囲:pH9〜12
マニュアル・オブ・ディタミネイティブ・バクテリオロ
ジー(Bergey's Manual of Determinative Bacteriolog
y)第8版を参照し、比較検討した結果、アルカリ菌と
してバチルス アルカロフィラス(Bacillus alcalophi
lus)があるが、このものは胞子膨潤性、嫌気培養での
生育、硝酸還元能及び塩化ナトリウム存在下での生育と
いう点において本菌株との類似性がない。一方、マイク
ロバイオロジー〔P. Nielsen et al., Microbiology, 1
41, 1745-1761(1995)〕によれば、本菌株は、有胞子桿
菌であるバチルス アガラドヘレンス(Bacillus agara
dhaerens)に近縁であるため、新規な好アルカリ性バチ
ルスとして工業技術院生命工学工業技術研究所に本菌株
の寄託を行った(FERM P-16067)。
生産に使用される培地 上記本発明菌株による耐熱性アルカリセルラーゼの生産
に際しては、資化し得る窒素源と炭素源を適宜組み合わ
せて培養培地に含有させることが好ましく、特に両栄養
源に限定はない。例えば、窒素源としては、無機の硝
安、硫安、塩安、リン酸アンモニウム、硝酸ソーダ等の
無機窒素源;コーングルテンミール、大豆粉、コーンス
チープリカー、カザミノ酸、酵母エキス、ファーマメデ
ィア、イワシミール、肉エキス、ペプトン、ハイプロ、
アジパワー、コーンソイビーンミール、コーヒー粕、綿
実油粕、カルチベータ、アミフレックス、アジプロン、
ゼスト、アジックス等の有機窒素源が挙げられる。また
炭素源としては、麸、濾紙、一般紙類、おが屑等の植物
繊維質、廃糖蜜、転化糖、カルボキシメチルセルロース
(CMC)、アビセル、セルロース綿、ペクチンに加え、
資化し得る炭素源、例えば、D-ガラクトース、L-アラビ
ノース、シュークロース、D-グルコース、D-マンニトー
ル、イノシット、D-ソルビトール、トレハロース、ラク
トース(乳糖)、グリセリンマルトース(麦芽糖)、D-
フラクトース、ラフィノース、メリビオース、デンプン
や、資化し得る有機酸、例えば、酢酸、クエン酸等が挙
げられる。その他、リン酸、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Zn2+、
Co2+、Na+、K+等の無機塩や、必要であれば、無機又は
有機微量栄養源を含有する培地を適宜選択して使用され
る。
生産、採取、精製 培養温度は、10〜40℃、特に25〜35℃が好ましく、培養
初発pHは9〜12、特に9〜11が好ましい。この条件下に
おいて、培養は通常2〜4日間で完了する。
である耐熱性アルカリセルラーゼの採取及び精製は、一
般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことができ
る。すなわち、培養物を遠心分離又はろ過等に付して菌
体を分離し、その菌体及び培養ろ液から通常の手段、例
えば塩析法、等電点沈殿法、溶媒沈殿法(メタノール、
エタノール、アセトン、イソプロピルアルコール等)に
よりタンパク質を沈殿させたり、また限外ろ過(例え
ば、ダイヤフローウルトラフィルターメンブレン;アミ
コン社製)により濃縮させることにより、耐熱性アルカ
リセルラーゼを得る。塩析法では、例えば、75%硫安中
で酵素を沈殿させた後、ろ過或いは遠心分離、脱塩する
ことによってこれを凍結乾燥粉末とすることも可能であ
る。脱塩の方法としては、透析又はセファデックスG-15
等を用いるゲルろ過法等の一般的方法が用いられる。更
に、酵素を精製するには、例えば、吸着クロマトグラフ
ィー;DEAE-トヨパール、DEAE-セファデックス、SUPER
Q-トヨパール、CM-トヨパール等によるイオン交換クロ
マトグラフィー;バイオゲル、セファクリル等による分
子篩ゲルクロマトグラフィーを適宜組み合わせて分別精
製すればよい。
(精製酵素)の理化学的性質 以上の如くして得られた耐熱性アルカリセルラーゼの酵
素学的性質の概要及び詳細を以下に示す。なお、以下に
おいて用いた酵素活性測定法は、次の通りである。
0.1Mグリシン−水酸化ナトリウム基質溶液(pH9)0.9
mlに、適当に希釈した酵素溶液0.1mlを加え、40℃で20
分間反応した。反応後、3,5-ジニトロサリチル酸(DN
S)法にて還元糖の定量を行った。すなわち、反応液1m
lにDNS溶液1mlを加えて沸騰湯浴中で5分間放置し、氷
水中で冷却した後、脱イオン水4mlを加え希釈した後、
535nmにおける吸光度を分光光度計で比色定量した。酵
素力価は、上記の条件下で1分間に1μmolのグルコー
スに相当する還元糖を生成する酵素量を1単位とした。
イオ・ラッド社製)を用いて、牛血清アルブミンを標準
タンパク質として算出した。
セルラーゼは、次の酵素学的性質を有するものである。 (1) 熱安定性 100℃、10分間の処理で20%以上の活性を保持する。 (2) 最適反応温度範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応温度範
囲は、40〜50℃である。 (3) pH安定性 5℃で3時間放置したときの安定pH範囲は、約5〜12で
ある。 (4) 最適反応pH範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応pH範囲
は、7.5〜9.5である。 (5) 基質特異性 カルボキシメチルセルロース及びリケナンに作用する。
のより詳細な酵素学的性質は、以下に示す通りである。
l、脱イオン水0.7ml及び精製酵素溶液0.1ml(5.6μg)
を混合し、20℃、30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60
℃、65℃、70℃、80℃、90℃及び100℃の各温度で10分
間処理した後、氷水中で冷却し、処理液1mlのうち0.1m
lを用いて、1%(w/v)CMC溶液(pH9.0)中、40℃で20分
間反応した後、DNS法により活性を測定した。また、処
理液中に5mMの塩化カルシウムを添加した系についても
同時に活性を測定した。未処理の場合の活性値を100と
した残存活性で示した(図1)。この結果、本酵素は、
10分間の処理において、カルシウムの有無に拘わらず45
℃まで80%以上の活性を保持し、100℃で約30%の活性
を保持した。
56μg)を加え、20℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50
℃、55℃、60℃及び70℃の各温度で20分間反応した後、
DNS法により活性を測定し、最も活性の高い50℃での値
を100とした相対値で示した(図2)。この結果、本発
明酵素のCMC分解活性の最適反応温度は、50℃であり、
5mM塩化カルシウムの存在下では、60℃であった。
溶液0.03ml(5.6μg)を1.5ml容のマイクロチューブに
入れ、5℃で3時間及び30℃で30分間処理後、氷水中に
移し冷却後、DNS法により活性を測定し、未処理の場合
の活性値を100とした残存活性で示した(図3)。この
結果、5℃で3時間放置した場合の安定pH範囲は、pH5
〜12であった。
の種類及びpHを下に示す。 酢酸緩衝液 :pH4.1,pH5.2,pH6.1 リン酸緩衝液 :pH6.2,pH7.2,pH8.1 トリス塩酸緩衝液 :pH7.1,pH8.1,pH9.0 グリシン−NaOH緩衝液:pH8.5,pH9.5,pH10.1,pH10.
5,pH11.0 リン酸−NaOH緩衝液 :pH11.0,pH12.1,pH12.3
各1.1%(w/v)CMC溶液(pH5.2, 6.1, 7.0, 7.5, 8.1, 8.
6, 9.0, 9.5, 10.1及び11.1)0.9mlと酵素溶液0.1ml
(9.3μg)を混合し、40℃で20分間反応した後、DNS法
により活性を測定し、最も活性が高かったpH8.6での活
性値を100とした相対値で示した(図4)。この結果、C
MC分解活性の最適反応pHは8.6近傍にあり、pH7.5〜9.5
の範囲で最大活性の85%以上の良好なCMC分解活性を示
した。またpH11でも最大活性の約40%の活性を有してい
た。
リン、カードラン、イヌリン、ペクチン、アビセル、リ
ン酸膨潤アビセル(ASA)及び還元型アルカリ膨潤アビ
セル(RALSA)を用いた。各種2.5%(w/v)基質溶液4m
l、0.5Mグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH10)2
ml及び脱イオン水3mlを混合し、酵素溶液0.1mlを加
え、40℃で20分間反応した後、DNS法により活性を測定
した。CMCを除き、いずれの基質も分光光度計による535
nmでの吸光度測定前に遠心分離(3,000rpm,20min,20
℃)して残査を除去した。各種20mMの合成基質溶液250
μl、250mMグリシン−水酸化ナトリウム緩衝液(pH9)
0.4ml及び脱イオン水0.15mlに酵素溶液0.2mlを加え、40
℃で20分間反応後、1M炭酸ナトリウム溶液0.4mlを加
えて反応を停止した。5分間室温で放置した後、400nm
における吸光度を測定した。CMCの分解活性を100とした
相対値で多糖基質及び合成基質の分解活性を示した(表
1)。この結果、本発明酵素は、CMC及びリケナンに良
好に作用した。
Mトリス塩酸緩衝液(pH7.2)0.5ml及び脱イオン水0.3m
lに酵素溶液0.1mlを加え、30℃で20分間処理した後氷冷
し、0.1mlを用いてDNS法によりCMC分解活性を測定し、
界面活性剤無添加の活性を100とした相対値で示した
(表2)。この結果、本発明酵素は、直鎖アルキルベン
ゼンスルホン酸塩、アルカンスルホン酸塩、α−オレフ
ィンスルホン酸塩、2-スルホ脂肪酸塩、アルキル硫酸
塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、ポリ
オキシエチレンアルキルエーテルにより活性をほとんど
阻害されなかった。
0)0.5ml及び脱イオン水0.3mlに酵素溶液0.1mlを加え、
30℃で20分間処理した後氷冷し、そのうち0.1mlを用い
てDNS法によりCMC分解活性を測定し、金属塩無添加の場
合の活性値を100とした相対値で示した(表3)。この
結果、本発明酵素は、Ca2+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Mg2+、
Mn2+、Zn2+、Fe3+、K+及びNa+により阻害を受けず、Pb
2+により若干阻害を受け、Fe2+により完全に失活した。
リス塩酸緩衝液(pH7.2)0.5ml及び脱イオン水0.3mlに
酵素溶液0.1mlを加え、30℃で20分間処理した後、氷水
中で冷却し0.1mlを用いてDNS法により活性を測定し、化
合物無添加時の活性を100とした相対値で示した(表
4)。この結果、本発明酵素は、モノヨ−ド酢酸により
若干阻害を受けた。
リルS200(ファルマシア社製)を用いた。予め10mMトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.5,2mM CaCl2及び0.1M NaCl含有)
で平衡化しておいたセファクリルS200カラム(1.5×80c
m)に精製酵素溶液1mlを掛け、同緩衝液で溶出した
(0.12ml/min・cm2)。この結果、本酵素の分子量は、8
6,000±2,000であった(図5)。
ラインPAGプレート及びキャリブレーションキット(い
ずれもファルマシア社製)を用いて等電点電気泳動を行
った。この結果、本発明酵素の等電点は、約3.8であっ
た。
用途 本発明の耐熱性アルカリセルラーゼは、衣料用洗浄剤、
特に高温域で洗濯を行う地域における衣料用洗浄剤への
添加酵素として好適に用いられるほか、ジーンズ等の木
綿製衣類の風合を改善するための繊維処理、脱墨剤、中
性からアルカリ性での含セルロース産業家庭廃棄物処
理、中性からアルカリ性でのセルロースの糖化などに有
用である。
カリセルラーゼの配合量は、0.05〜40U/g、特に0.1〜20
U/g、更に0.2〜10U/gが好ましい。
洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成
分としては、例えば次のものが挙げられる。
キル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、平
均炭素数10〜20の直鎖又は分岐鎖のアルキル基を有し、
1分子内に平均0.5〜8モルのエチレンオキサイドを付
加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均炭素数10〜20のア
ルキル基を有するアルキル硫酸塩、平均10〜20の炭素原
子を1分子中に有するオレフィンスルホン酸塩、平均10
〜20の炭素原子を1分子中に有するアルカンスルホン酸
塩、平均10〜20の炭素原子を1分子中に有するα−スル
ホ脂肪酸メチルあるいはエチルエステル塩、平均炭素数
8〜20の高級脂肪酸塩、平均炭素数10〜20の直鎖又は分
岐鎖のアルキル基を有し、1分子内に平均0.5〜8モル
のエチレンオキサイドを付加したアルキルエーテルカル
ボン酸塩などのアニオン性界面活性剤;平均炭素数10〜
20のアルキル基を有し、1〜20モルのエチレンオキシド
を付加したポリオキシエチレンアルキルエーテル、高級
脂肪酸アルカノールアミド又はそのアルキレンオキサイ
ド付加物、またプロピレンオキサイドとプロピレングリ
コールとの縮合物にエチレンオキサイドを付加させた、
プルロニックという名称で知られているものなどの非イ
オン性界面活性剤;その他ベタイン型両性界面活性剤;
スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エステル系界面活
性剤、アミノ酸型界面活性剤、カチオン性界面活性剤な
ど。
〜60重量%配合され、特に粉体状洗浄剤組成物について
は10〜45重量%、液体洗浄剤組成物については20〜50重
量%配合することが好ましい。また、本発明洗浄剤組成
物が衣料用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に1〜
10重量%、好ましくは1〜5重量%配合される。
酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸
塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶
性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢
酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカ
ルボン酸塩など。この二価金属イオン捕捉剤は、0〜50
重量%、好ましくは5〜40重量%配合される。また、リ
ンを含有しない二価金属イオン捕捉剤を用いることがよ
り好ましい。
酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、アルカノールアミンな
ど。これらは0〜80重量%配合される。
ル、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸コポリマー、ポ
リビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキ
シメチルセルロースなど。再汚染防止剤の一部は、二価
金属イオン捕捉剤としても使用できる。再汚染防止剤は
0〜10重量%、好ましくは1〜5重量%配合される。
ラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、ヘミセルラーゼ、β−
グリコシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロ
ールオキシダーゼ、プロテアーゼ等の酵素。
剤:有効塩素の捕捉剤として、硫酸アンモニウム、尿
素、塩酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸
グアニジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、
ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、又グリシ
ン、グルタミン酸ナトリウム等で代表されるアミノ酸及
び牛血清アルブミン、カゼインなどの蛋白質、更には蛋
白質の加水分解、肉エキス、魚肉エキスなどが挙げられ
る。還元剤としては、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、亜ニチオ
ン酸塩等のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等及び
ロンガリットC等が挙げられる。特に亜硫酸塩が好まし
く、洗濯液中の酵素を安定化させる。
ン化フタロシアニン亜鉛塩又はアルミニウム塩、過酸化
水素など。漂白洗浄剤とする場合は、特に過酸化ナトリ
ウムが効果的であり、配合量は1〜95重量%、更に5〜
95重量%、特に20〜95重量%とするのが好ましい。
光染料。
うな可溶化剤を用いることができる。エタノールなどの
低級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、p-トルエンス
ルホン酸塩などの低級アルキルベンゼンスルホン酸塩、
プロピレングリコールなどのポリオール類など。
料、ケーキング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、
防腐剤、色素、青味付け剤、漂白活性化剤、酵素安定化
剤、相調節剤等の洗剤に常用の成分を必要に応じて配合
することができる。
アルカリセルラーゼ及び上記公知の洗浄成分を適宜組み
合せて、常法に従って製造することができる。洗浄剤の
形態は、用途に応じて選択することができ、例えば液
体、粉末、顆粒等とすることができる。また、本発明洗
浄剤組成物は、特に衣料用洗浄剤、漂白洗浄剤等として
好適に使用することができる。
等の繊維処理による風合の改善に使用する場合、処理液
中への耐熱性アルカリセルラーゼの配合量は、500〜20
0,000U/l、特に1,000〜100,000U/l、更に2,000〜20,000
U/lが好ましい。また当該処理液のpHは、7.5〜10.5の範
囲に調整することが好ましい。衣類等は、上記処理液で
処理した後、通常、硫酸、リン酸、塩化亜鉛、水酸化ナ
トリウム等の膨潤剤又はセルロース加水分解剤によって
処理される。
剤として使用する場合、耐熱性アルカリセルラーゼの使
用量は、原料古紙1kgに対して50U以上、特に50〜100,
000U、更に100〜50,000Uが好ましい。
ルカリセルラーゼ以外に、脱墨剤に通常配合される成
分、例えば、アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル
硫酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、ジアルキルスル
ホサクシネート、高級脂肪酸塩等のアニオン性界面活性
剤;高級アルコールエチレンオキサイド付加物、アルキ
ルフェノールエチレンオキサイド付加物、脂肪酸エチレ
ンオキサイド付加物、脂肪酸アミドエチレンオキサイド
付加物、ポリプロピレングリコールエチレンオキサイド
付加物、油脂のエチレンオキサイド付加物、高級アルコ
ールエチレンオキサイドプロピレンオキサイド(ブロッ
ク又はランダム)付加物等の非イオン性界面活性剤;ア
ミンオキサイド等の両性界面活性剤;その他有機・無機
ビルダー、有機溶剤等を配合することができる。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
で30分間熱処理した。この熱処理液を適当に希釈してマ
スタープレート〔肉エキス(オキソイド社製)1%,バ
クトペプトン(ディフコ社製)1%,NaCl1%,KH2PO4
0.1%,Na2CO30.5%,寒天1.5%〕に塗抹し、30℃で3
日間培養し、集落を形成させた。レプリカ法により、マ
スタープレートと同じ組成の培地に2%CMCを加えた滅
菌寒天培地に移植し、30℃で3〜4日間培養して集落を
形成させた後、コンゴーレッド色素液を流し込み、寒天
が赤色化した中で周囲が染色されない集落を検出した。
該当する集落をマスタープレートから選出し、高力価CM
Cアーゼ生産菌をスクリーニングすることにより、本発
明のバチルス エスピー KSM-S237株を取得した。
(オキソイド社製)1%、ポリペプトンS(日本製薬社
製)2%、酵母エキス(ディフコ社製)0.1%、NaCl1
%、K2HPO4 0.1%、Na2CO3 0.5%にCMC1%を加えた液
体培地に摂取し、30℃で3日間振盪培養した。培養後、
菌体を遠心分離により除き、その上清についてCMC分解
活性を測定した結果、約1,000単位/lであった。
るように硫安粉末を添加し、撹拌しながら氷水中で2時
間放置した後、遠心分離(12,000rpm,15min,5℃)し
て上清を得た。この上清に60%飽和となるように硫安粉
末を添加し、撹拌しながら氷水中で30分間放置した後、
遠心分離(12,000rpm,15min,5℃)して上清を得た。
得られた上清に、90%飽和となるように硫安粉末を添加
し、撹拌しながら氷水中で60分間放置した後、遠心分離
(13,000rpm,15min,5℃)して得られた沈澱(60〜90
%飽和の硫安処理による沈澱)を10mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.5)20ml溶解した。この溶液を大過剰量の同緩衝
液に対し5℃で一晩透析した。得られた透析内液中に精
製開始時の67%のセルラーゼを回収した。0〜30%及び
30〜60%飽和の硫安処理による沈澱中のセルラーゼ活性
は認められなかった。透析内液を10mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.5)で予め平衡化したDEAE-トヨパール650Mカラム
(2.5cm×23cm)に添着し、目的のタンパク質を吸着さ
せた後、同緩衝液250mlでカラム内を洗浄後、10mMトリ
ス塩酸緩衝液(pH7.5)400ml及び10mMトリス塩酸緩衝液
(pH7.5,1M NaCl含有)400mlを用いてタンパク質の
0〜1MのNaClによる直線濃度勾配溶出(4ml/tube,
0.7ml/min・cm2)を行った後、1MのNaCl溶液で更に溶
出を行った。その結果、0.42MのNaCl付近にセルラーゼ
タンパク質が溶出した。このセルラーゼ画分を集め、2
倍容の10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)を加え、予め10m
Mトリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したDEAE-トヨパ
ール650Sカラム(1.5cm×20cm)に添着し、タンパク質
を吸着させた後、10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)300ml
及び10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5,0.6M NaCl含有)3
00mlを用いて0〜0.6MのNaClによる直線濃度勾配溶出
(2ml/tube,0.42ml/min・cm2)を行った。その結果、0.
25MのNaCl付近にセルラーゼが溶出した。得られたセル
ラーゼ画分を集め、限外ろ過(PM10膜,アミコン社製)
装置を用いて10mMトリス塩酸緩衝液(pH7.5)により約2
0倍に脱塩濃縮して最終的に4mlの精製酵素を得た。
た精製耐熱性セルラーゼをCMC活性で1000U/kgとなるよ
うに配合し、その洗浄力(泥汚れ除去作用)を調べた。
赤玉土を120±5℃で4時間乾燥後、十分粉砕し、150メ
ッシュ(100μm)の篩を通過したものを、更に120±5
℃で2時間乾燥後、150gを1リットルのパークレンに
分散した。金巾#2023布をこの液に接触し、ブラッシン
グして、分散液と過剰付着汚れを脱落させる。10cm×10
cmの試験片を調製し、洗浄力試験に供した。
°DHの水に洗剤を溶解し、0.133重量%洗剤水溶液1リ
ットルを調製する。試験布5枚を洗剤水溶液に添加し、
ターゴトメーターにて100rpm、30℃で、10分間攪拌洗浄
する。流水下で濯いだ後、アイロンプレスし反射率測定
に供した。洗浄前の原布及び洗浄前後の汚染布の460nm
における反射率を自記色彩計(島津製作所社製)にて測
定し、次式に従って洗浄率(%)を算出した。
洗剤による洗浄率(5枚の平均値)は64%であり、セル
ラーゼ無添加の洗剤の62%に比べ2ポイント向上した。
−水酸化ナトリウム緩衝液でpH9に調整し、この溶液1
リットルを30〜50℃に保持した。この溶液中に木綿製タ
オル20gを浸し、液を緩やかに攪拌しながら約2時間処
理した。次いでこの木綿製タオルを水洗し、よくしぼっ
た後、水酸化ナトリウム0.1〜0.3重量%及びチオ硫酸ナ
トリウム0.3〜0.7重量%を含有する水溶液(30〜50℃)
を用いて10〜30分浸漬処理した後、水洗し、脱水して乾
燥した。この結果、処理された木綿製タオルは風合が向
上した。
上離解機に入れ、その中に水酸化ナトリウム1.0重量%
(対原料古紙)、ケイ酸ナトリウム2.0重量%(対原料
古紙)、30重量%過酸化水素水1.0重量%(対原料古
紙)、古紙再生用脱墨剤0.3重量%及び本発明の耐熱性
セルラーゼ6U/原料古紙1gを加え、パルプ濃度6重
量%、45℃で20分間離解した後、45℃にて1時間熟成し
た。パルプ濃度15重量%まで濃縮した後、水を加えて1
重量%濃度に希釈しTAPPIシートマシン(熊谷理機工業
社製)にてパルプシートを作製した。パルプを濃縮した
際の脱水液を5℃で12時間保存し水溶液を一定量採取し
た。なお、脱墨性能の評価は、再生パルプシートを測色
色差計にて白色度を測定することにより行った。また、
脱水液のL値を測定するとともに加水分解により生成す
る還元糖の定性も行い、実際に酵素による加水分解反応
が起こっていることを確認した。その結果、パルプシー
トの白色度はセルラーゼ無添加の場合に比べ向上した。
また、脱水液のL値はセルラーゼ無添加の場合に比べ低
くなり脱色性が向上した。
ルラーゼは、アルカリ領域に最適反応pHを有し、かつ中
温菌による生産酵素でありながら高い耐熱性を有する。
また、種々の界面活性剤に対して極めて安定であり、キ
レート剤によってもほとんど阻害されないため、酵素造
粒工程における失活の程度も低く、衣料用洗浄剤への添
加酵素(特に高温域で洗濯を行う地域における)を初
め、繊維処理、脱墨剤、中性からアルカリ性での含セル
ロース産業家庭廃棄物処理、中性からアルカリ性でのセ
ルロースの液化・糖化などに有用である。
示す図である。
温度を示す図である。
を示す図である。
pHを示す図である。
リルS200によるゲルクロマトグラフィー法における溶出
画分とセルラーゼ活性の関係を示す図である。
等の繊維処理による風合の改善に使用する場合、処理液
中への耐熱性アルカリセルラーゼの配合量は、500〜
200,000U/l、特に1,000〜100,00
0U/l、更に2,000〜20,000U/lが好ま
しい。また当該処理液のpHは、7.5〜10.5の範
囲に調整することが好ましい。衣類等は、上記処理液で
処理した後、通常、硫酸、リン酸、塩化亜鉛、水酸化ナ
トリウム等の膨潤剤によって処理される。
キス(オキソイド社製)1%、ポリペプトンS(日本製
薬社製)2%、酵母エキス(ディフコ社製)0.1%、
NaCl1%、K2HPO40.1%、Na2CO
30.5%にCMC1%を加えた液体培地に接種し、3
0℃で3日間振盪培養した。培養後、菌体を遠心分離に
より除き、その上清についてCMC分解活性を測定した
結果、約1,000単位/lであった。
Claims (9)
- 【請求項1】 80℃、10分間の処理で40%以上の活性を
保持し、かつ作用pHが7.5以上であるセルラーゼ。 - 【請求項2】 次の性質を有するものである請求項1記
載のセルラーゼ。 (1) 熱安定性 100℃、10分間の処理で20%以上の活性を保持する。 (2) 最適反応温度範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応温度範
囲は、40〜50℃である。 (3) pH安定性 5℃で3時間放置したときの安定pH範囲は、約5〜12で
ある。 (4) 最適反応pH範囲 カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応pH範囲
は、7.5〜9.5である。 (5) 基質特異性 カルボキシメチルセルロース及びリケナンに作用する。 - 【請求項3】 次の性質を有するものである請求項1又
は2記載のセルラーゼ。 (1) 熱安定性 カルシウムの有無に拘わらず、100℃、10分間の処理に
おいて約30%の活性を保持する。 (2) 最適反応温度 カルボキシメチルセルロ−ス分解活性の最適反応温度
は、50℃であり、5mM塩化カルシウムの存在下では、60
℃である。 (3) pH安定性 5℃で3時間放置したときの安定pH範囲は、pH5〜pH12
である。 (4) 最適反応pH カルボキシメチルセルロース分解活性の最適反応pHは、
8.6近傍にあり、pH7.5〜9.5の範囲で85%以上、pH11で
も約40%のCMC分解活性を有する。 (5) 基質特異性 カルボキシメチルセルロース及びリケナンに良好に作用
する。 (6) 界面活性剤に対する安定性 直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルカンスルホン
酸塩、α−オレフィンスルホン酸塩、2-スルホ脂肪酸
塩、アルキル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエー
テル硫酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテルは、
活性をほとんど阻害しない。 (7) 金属塩の影響 Ca2+、Cd2+、Co2+、Hg2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+、Fe3+、K
+及びNa+では阻害を受けず、Pb2+により若干の阻害を受
ける。Fe2+により完全に失活する。 (8) 阻害剤の影響 モノヨ−ド酢酸により若干阻害を受ける。 (9) 分子量 ゲルろ過法による分子量は86,000±2,000である。 (10) 等電点 3.8近傍にある。 - 【請求項4】 バチルス エスピー KSM-S237株と命名
され、FERM P-16067として寄託された請求項1〜3のい
ずれかに記載のセルラーゼを生産する微生物。 - 【請求項5】 バチルス属に属する耐熱性アルカリセル
ラーゼ生産菌を培養し、培養物から耐熱性アルカリセル
ラーゼを採取することを特徴とする請求項1〜3のいず
れかに記載のセルラーゼの製造方法。 - 【請求項6】 バチルス属に属する耐熱性アルカリセル
ラーゼ生産菌が、バチルス エスピー KSM-S237株(FER
M P-16067)である請求項5記載の製造方法。 - 【請求項7】 請求項1〜3のいずれかに記載のセルラ
ーゼを含有する洗浄剤組成物。 - 【請求項8】 請求項1〜3のいずれかに記載のセルラ
ーゼを含有する繊維処理剤。 - 【請求項9】 請求項1〜3のいずれかに記載のセルラ
ーゼを含有する脱墨剤。
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