WO2022014428A1 - アミラーゼ配合洗浄剤組成物 - Google Patents

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貴大 日置
彰人 川原
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花王株式会社
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    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds

Definitions

  • the present invention relates to a detergent composition containing ⁇ -amylase.
  • ⁇ -Amylase is used in a wide range of industrial fields such as starch industry, brewing industry, textile industry, pharmaceutical industry and food industry, and is known to be suitable for use in detergents as a component for removing starchy stains. It is used in dishwashing agents for automatic dishwashers and detergents for clothing.
  • ⁇ -amylase AP1378 derived from Bacillus sp. KSM-1378 (FERM BP-3048) strain and ⁇ -amylase derived from Bacillus likeniformis.
  • ⁇ -amylase AA560 Patent Document 2 derived from Bacillus sp. DSM12649 strain, ⁇ -amylase SP722 derived from Bacillus sp. 722 strain (Patent Document 3). 4
  • ⁇ -amylase CspAmy2 derived from the genus Cytopherga (Patent Document 4) and the like are known.
  • Patent Document 5 discloses that starch adsorptivity can be reduced by introducing mutations into known starch-binding residues and their adjacent residues.
  • Patent Document 1 International Publication No. 94/26881
  • Patent Document 2 International Publication No. 00/60060
  • Patent Document 3 International Publication No. 06/002643
  • Patent Document 4 International Publication No. 2014/1647777
  • Patent Document 3 Document 5] Japanese Patent No. 6339499
  • the present invention relates to the following 1) to 2).
  • Protein consisting of a sex amino acid sequence and having ⁇ -amylase activity A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having ⁇ -amylase activity
  • A' A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having ⁇ -amylase activity, and having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, R178, G179.
  • T180 and G181 a protein lacking two or more amino acid residues selected from each position (B') consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and ⁇ -A protein having amylase activity and lacking two or more amino acid residues selected from the positions R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (C') SEQ ID NO: Each of R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, which is a protein having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in 6 and having ⁇ -amylase activity.
  • Protein in which two or more amino acid residues selected from positions are deleted A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having ⁇ -amylase activity. A protein lacking two or more amino acid residues selected from the R178, G179, T180 and G181 positions of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • Starch-degrading activity of each amylase at 20 ° C and 30 ° C. A molecular phylogenetic tree showing the evolutionary relationship between the amylase of the present invention and the existing amylase for detergents. Detergency of each amylase at 20 ° C. Starch-degrading activity of the amylase of the present invention (mutant of YR288) at 20 ° C. Detergency of the amylase of the present invention (mutant of YR288) at 20 ° C. Starch-degrading activity of the amylase (variant of BCGAmy) of the present invention at 20 ° C. Cleaning performance of a cleaning composition containing a protease (detergency against CS-26 contaminated cloth). Cleaning performance of a cleaning composition containing a protease (detergency against EMPA117 contaminated cloth).
  • Maintaining starch-degrading activity at low temperature and low starch adsorption are considered to be particularly important for achieving high cleaning performance at low temperature, but on the other hand, maintaining starch-degrading activity at low temperature is not easy.
  • any existing detergent amylase does not sufficiently maintain starch-degrading activity at low temperatures, although the strength of activity is considered to be part of the selection index. Therefore, in order to develop an amylase that exhibits high detergency as compared with existing cleaning amylase at low temperature, it is important to newly find an amylase that retains high starch degrading activity at low temperature.
  • the present invention relates to providing a detergent composition containing ⁇ -amylase, which exhibits high specific activity (starch decomposing activity) at low temperatures.
  • the present inventors have formulated a specific ⁇ -amylase found in the putative ⁇ -amylase sequence contained in the NCBI protein sequence database, which has high starch degrading activity at a low temperature of 20 to 30 ° C. It has been found that the above-mentioned detergent composition is useful as a detergent composition suitable for low-temperature cleaning.
  • the sequence information of the protein of the present invention can be used as an index on the sequence for selecting ⁇ -amylase having high starch degrading activity at low temperature. It was
  • the identity of the nucleotide sequence and the amino acid sequence is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis with Unit size to homology (ktup) set to 2 using a homology analysis (Search homology) program of the genetic information processing software Genetyx-Win.
  • amino acid sequence or nucleotide sequence is 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 97% or more, still more preferably 98% or more, still more preferably 99%.
  • Amino acid sequences having at least 90% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted or added.
  • amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted or added includes 1 or more and 30 or less, preferably 20 or less, more preferably 10 or less, and further preferably 5 or less. Examples include amino acid sequences in which the amino acid of is deleted, inserted, substituted or added.
  • the protein contained in the detergent composition of the present invention is one or more proteins selected from the following (A), (B), (C) and (D).
  • a protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having ⁇ -amylase activity (B) At least 90% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Protein consisting of an amino acid sequence having sex and having ⁇ -amylase activity C
  • D A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having ⁇ -amylase activity.
  • Such proteins have excellent ⁇ -amylase activity at 20-30 ° C.
  • the ⁇ -amylase activity means an activity that catalyzes the hydrolysis of starch and other linear or branched 1,4-glycoside oligosaccharides or polysaccharides.
  • the ⁇ -amylase activity can be determined by measuring the amount of reduced terminal produced by enzymatic decomposition of starch. It is not limited to this, and can also be determined by measuring the release of the dye due to the enzymatic decomposition of the dye-crosslinked starch such as Phadebas (Soininen, K., M. Ceska, and H. Adlercreutz. "Comparison. between a new chromagenic ⁇ -amylase test (Phadebas) and the Wohlgemuth amyloclastic method in urine. "Scandinavian journal of clinical and laboratory investment 30.3 (1972): 291-297.). There is a correlation between the ⁇ -amylase activity measured by Phadebas and the cleaning performance when used as a cleaning agent.
  • the protein consisting of the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and 8 is a protein estimated as ⁇ -amylase in the NCBI protein sequence database. That is, the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 is designated as accession number WP_138117433.1. In the present invention, the protein consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 6 as "RU2C") is designated as WP_110114708.1 (referred to as "BCGAmy” in the present invention) and the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 8.
  • SEQ ID NOs: 2, 4 , 6 and 8 include a protein variant consisting of an amino acid sequence in which one or several amino acids have been substituted, deleted, inserted or added and having ⁇ -amylase activity.
  • the number is, for example, 2 to 10, preferably 2 to 5, and more preferably 2 to 3.
  • arginine (R178), 179, at position 178 is preferable in the amino acid sequences represented by SEQ ID NOs: 2, 4, 6 and 8, from the viewpoint of starch degrading activity and / or detergency at low temperature.
  • Variants lacking amino acid residues at two or more sites selected from glycine at position (G179), threonine at position 180 (T180) and glycine at position 181 (G181) are preferred, of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 8.
  • Variants lacking amino acid residues at two or more sites selected from the R178, G179, T180 and G181 positions are more preferred.
  • R178 ⁇ + T180 ⁇ , G179 ⁇ + T180 ⁇ , R178 ⁇ + G179 ⁇ , R178 ⁇ + G181 ⁇ , G179 ⁇ + G181 ⁇ and the like are preferable, and R178 ⁇ + T180 ⁇ is more preferable.
  • the present invention includes, as one embodiment, a protein selected from the following (A'), (B'), (C') and (D'), and a detergent composition containing the protein.
  • A' A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 and having ⁇ -amylase activity, and having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2, R178, G179.
  • T180 and G181 a protein lacking two or more amino acid residues selected from each position (B') consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4, and ⁇ -A protein having amylase activity and lacking two or more amino acid residues selected from the positions R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4 (C') SEQ ID NO: Each of R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, which is a protein having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in 6 and having ⁇ -amylase activity.
  • Protein in which two or more amino acid residues selected from positions are deleted A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having ⁇ -amylase activity. A protein lacking two or more amino acid residues selected from the R178, G179, T180 and G181 positions of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8.
  • the protein of the present invention can be produced, for example, by expressing the gene encoding the protein of the present invention.
  • the protein of the invention can be produced from a transformant into which a polynucleotide encoding the protein of the invention has been introduced.
  • a polynucleotide encoding the protein of the present invention or a vector containing the same is introduced into a host to obtain a transformant, and then the transformant is cultured in an appropriate medium to introduce the transformant into the transformant.
  • the protein of the present invention is produced from the polynucleotide encoding the protein of the present invention.
  • the protein of the present invention can be obtained by isolating or purifying the produced protein from the culture.
  • the polynucleotide encoding the protein of the invention can be in the form of single-stranded or double-stranded DNA, RNA, or artificial nucleic acid, or can be cDNA, or chemically synthesized DNA without introns.
  • Preferred examples of the polynucleotide encoding the protein of the present invention include the polynucleotides represented by the following (a), (b), (c) or (d).
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention can be chemically or genetically engineered based on the amino acid sequence of the protein.
  • the polynucleotide can be chemically synthesized based on the amino acid sequence of the protein of the invention described above.
  • a nucleic acid synthesis contract service for example, provided by Medical & Biological Laboratories, Inc., Genscript, etc.
  • the synthesized polynucleotide can be amplified by PCR, cloning or the like.
  • a polynucleotide encoding a protein that is a mutant is produced using various mutation-introducing techniques known in the art. Mutation can be introduced by using various site-specific mutagenesis methods well known to those skilled in the art. The site-specific mutagenesis method can be performed by any method such as an inverse PCR method or an annealing method.
  • a commercially available site-directed mutagentage kit (for example, a QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit from Stratagene, a QuickChange Multi Site-Directed Mutagesis Kit, etc.) can also be used.
  • Site-specific mutagenesis can most generally be performed using a mutagenizing primer containing the nucleotide mutation to be introduced.
  • the mutation primer is annealed to a region containing a nucleotide sequence encoding an amino acid residue to be mutated in a polynucleotide encoding a parent protein, and is replaced with a nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated. It may be designed to include a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding an amino acid residue after mutation.
  • Nucleotide sequences (codons) encoding amino acid residues before and after mutation can be appropriately recognized and selected by those skilled in the art based on ordinary textbooks and the like.
  • SOE splicing by overflow extension
  • -A method of linking to one by PCR can also be used.
  • the type of vector containing the polynucleotide encoding the protein of the present invention is not particularly limited, and may be any vector such as a plasmid, phage, phagemid, cosmid, virus, YAC vector, shuttle vector and the like.
  • the vector is not limited, but is preferably a vector that can be amplified in a bacterium, preferably a Bacillus bacterium (for example, Bacillus subtilis or a mutant strain thereof), and more preferably a introduced gene in a Bacillus bacterium. It is an expression vector capable of inducing the expression of.
  • the shuttle vector which is a vector that can be replicated by any of Bacillus bacteria and other organisms, can be suitably used for recombinant production of the mutant of the present invention.
  • preferred vectors are, but are not limited to, pHA3040SP64, pHSP64R or pASP64 (Patent No. 34929935), pHY300PLK (expression vector capable of transforming both E.
  • coli and Bacillus subtilis Jpn J Genet, 1985, 60: 235-243
  • shuttle vectors such as pAC3 (Nucleic Acids Res, 1988, 16:8732); pUB110 (J Bacteria, 1978, 134: 318-329), pTA10607 (Plasmid, 1987, 18: 8-15) and the like.
  • Examples include plasmid vectors that can be used for transformation of Bacillus bacteria.
  • plasmid vectors derived from Escherichia coli for example, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
  • Escherichia coli for example, pET22b (+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
  • the vector may include a DNA replication initiation region or a DNA region containing an origin of replication.
  • a promoter region, a terminator region, or an expressed protein for initiating transcription of the gene is extracellularly above the polynucleotide encoding the protein of the present invention (that is, the ⁇ -amylase gene).
  • Control sequences such as secretory signaling regions for secretion into may be operably linked.
  • "operably linked" to the gene and the control sequence means that the gene and the control region are arranged so that the gene can be expressed under the control of the control region.
  • control sequence such as the promoter region, terminator, and secretory signal region is not particularly limited, and a normally used promoter or secretory signal sequence can be appropriately selected and used depending on the host to be introduced.
  • a suitable example of a control sequence that can be incorporated into a vector is Baclls sp. Examples include the promoter of the cellulase gene of the KSM-S237 strain, the secretory signal sequence, and the like.
  • the vector of the present invention further incorporates a marker gene for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced (for example, a resistance gene for a drug such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol). May be.
  • a marker gene for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced for example, a resistance gene for a drug such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol. May be.
  • a marker gene for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced for example, a resistance gene for a drug such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol. May be.
  • a marker gene for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced for example, a resistance gene for a drug such as ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol. May be.
  • a gene encoding a synthase of the required nutrient may be incorporated into the
  • the linkage between the polynucleotide encoding the protein of the present invention and the control sequence and the marker gene is known in the art such as SOE (splicing by overflow extension) -PCR method (Gene, 1989, 77: 61-68). It can be done by the method. Procedures for introducing the ligated fragments into the vector are well known in the art.
  • Examples of the host of the transformant into which the above vector is introduced include microorganisms such as bacteria and filamentous fungi.
  • bacteria include Escherichia coli, Staphylococcus, Enterococcus, Listeria, Bacillus, and the like.
  • Bacteria of the genus Bacillus for example, Bacillus subtilis Marbulg No. 168 (Enterococcus 168 strain) or a mutant strain thereof) are preferable.
  • Examples of Bacillus subtilis mutants include J. Biosci. Bioeng. , 2007, 104 (2): Protease 9-fold deficient strain KA8AX according to 135-143, and Biotechnol. Let.
  • filamentous fungi include the genus Trichoderma, the genus Aspergillus, the genus Rizhopus, and the like.
  • a method for introducing the vector into the host a method usually used in the art such as a protoplast method and an electroporation method can be used. By selecting a strain that has been appropriately introduced using the expression of the marker gene, auxotrophy, etc. as indicators, the target transformant into which the vector has been introduced can be obtained.
  • a fragment in which a polynucleotide encoding a protein of the present invention, a control sequence and a marker gene are ligated can be directly introduced into the genome of the host.
  • a DNA fragment in which a sequence complementary to the host genome is added to both ends of the linking fragment is constructed, and this is introduced into the host to be introduced between the host genome and the DNA fragment.
  • the polynucleotide encoding the protein of the present invention is introduced into the genome of the host.
  • the transformant thus obtained into which the polynucleotide encoding the protein of the present invention or the vector containing the same is introduced is cultured in an appropriate medium, the gene encoding the protein on the vector is expressed.
  • the protein of the invention is produced.
  • the medium used for culturing the transformant can be appropriately selected by those skilled in the art according to the type of microorganism of the transformant.
  • the protein of the present invention may be expressed from a polynucleotide encoding the protein of the present invention or a transcript thereof using a cell-free translation system.
  • the "cell-free translation system” is an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which a reagent such as an amino acid necessary for protein translation is added to a suspension obtained by mechanically destroying a host cell. It is composed of.
  • the protein of the present invention produced by the above culture or cell-free translation system can be used in general methods used for protein purification, such as centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography and the like. Can be isolated or purified by using alone or in combination as appropriate. At this time, when the gene encoding the protein of the present invention and the secretory signal sequence are operably linked on the vector in the transformant, the produced protein is secreted extracellularly, so that the culture is easier. Can be recovered from. The protein recovered from the culture may be further purified by known means.
  • the protein of the present invention thus obtained exhibits significantly higher starch degrading activity at 20 ° C. and 30 ° C. as compared with previously reported detergent amylases (AP1378, AA560, SP722, CspAmy2).
  • the protein of the present invention has excellent cleaning performance as compared with existing detergent amylase.
  • the relative cleaning performance with respect to AA560 is 1 or more, preferably 1.1 or more, more preferably. Is 1.2 or more, more preferably 1.3 or more, more preferably 1.5 or more, more preferably 1.7 or more, and even more preferably 1.9 or more.
  • the relative cleaning performance with respect to AA560 is calculated by ( ⁇ A488 of test amylase) / ( ⁇ A488 of AA560).
  • the protein of the present invention is useful as an enzyme for blending various detergent compositions, and is particularly useful as an enzyme for blending detergent compositions suitable for low-temperature cleaning.
  • the "low temperature” include 40 ° C. or lower, 35 ° C. or lower, 30 ° C. or lower, 25 ° C. or lower, and 5 ° C. or higher, 10 ° C. or higher, and 15 ° C. or higher. Further, 5 to 40 ° C., 10 to 35 ° C., 15 to 30 ° C., and 15 to 25 ° C. may be mentioned.
  • the amount of the protein of the present invention to be blended in the detergent composition is not particularly limited as long as the protein exhibits activity, but for example, it is preferably 1 mg or more, more preferably 10 mg or more, per 1 kg of the detergent composition. It is more preferably 50 mg or more, and preferably 5000 mg or less, more preferably 1000 mg or less, and even more preferably 500 mg or less. Further, it is preferably 1 to 5000 mg, more preferably 10 to 1000 mg, and even more preferably 50 to 500 mg.
  • the detergent composition of the present invention can also be used in combination with various enzymes in addition to the protein of the present invention.
  • enzymes for example, hydrolases, oxidoreductases, reductases, transferases, lyases, isomerases, ligases, synthetases and the like.
  • amylase protease, cellulase, keratinase, esterase, cutinase, lipase, pullulanase, pectinase, mannanase, glucosidase, glucanase, cholesterol oxidase, peroxidase, lacquerase and the like, which are different from the proteins of the present invention, are preferable, and protease, cellulase and amylase are particularly preferable.
  • Lipase is preferred.
  • the protease may be, for example, at least 70%, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and more preferably 95 with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45, 46, 47 or 48.
  • Examples include proteins having a% or higher identity and protease activity.
  • the protease consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 42 is the protease Savinase derived from Bacillus clausii (International Publication No. 2011/306263)
  • the protease consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 43 is the protease BPN'derived from Bacillus amyloliquefaciens. (International Publication No.
  • the protease consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 44 is a protease derived from Bacillus lentus DSM 5483 (International Publication No. 92/21760), and the protease has the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 45.
  • the protease consisting of Bacillus sp. A protease derived from KSM-KP43 (International Publication No. 99/18218), wherein the protease consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 46 is Bacillus sp. Derived protease TY145 (Japanese Patent Laid-Open No.
  • the protease consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 47 is the protease Neutrase derived from Bacillus amyloliquefacility
  • the protease consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 48 is the metallote derived from Bacillus subtilis. It is a protease.
  • the proteases are commercially available Alcalase, Esperase, Everlase, Kannase, Progress Uno (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ, EFFECTENZ, EXCELLENZ (registered trademark; DuPont), Lavery (registered trademark; BASF) and the like. Is also good.
  • Examples of the cellulase include Cellulase, Carezyme (registered trademark; Novozymes), KAC, an alkaline cellulase produced by Bacillus sp. KSM-S237 strain described in JP-A No. 10-313859, and a variant described in JP-A-2003-313592. Alkaline cellulase (above, Kao) and the like can be mentioned.
  • Examples of the amylase include Termamyl, Duramyl, Steinzyme, Steinzyme Plus, Amplify Prime (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ (registered trademark; DuPont), and KAM (Kao).
  • Examples of the lipase include Lipase and Lipex (registered trademark; Novozymes).
  • a known cleaning agent component can be blended in the cleaning agent composition of the present invention, and examples of the known cleaning agent component include the following.
  • the surfactant is blended in an amount of 0.5 to 60% by mass in the detergent composition, particularly 10 to 45% by mass for the powder detergent composition and 20 to 90% for the liquid detergent composition. It is preferable to add by mass%.
  • the surfactant is generally 1 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
  • surfactant used in the cleaning agent composition of the present invention include one or a combination of anionic surfactants, nonionic surfactants, amphoteric surfactants and cationic surfactants. However, it is preferably an anionic surfactant or a nonionic surfactant.
  • anionic surfactant examples include sulfate ester salts of alcohols having 10 to 18 carbon atoms, sulfate ester salts of alkoxylated alcoholic acids having 8 to 20 carbon atoms, alkylbenzene sulfonates, paraffin sulfonates, and ⁇ -olefin sulfonates. Preference is given to acid salts, internal olefin sulfonates, ⁇ -sulfo fatty acid salts, ⁇ -sulfo fatty acid alkyl ester salts or fatty acid salts.
  • a linear alkylbenzene sulfonate having 10 to 14 carbon atoms in an alkyl chain, more preferably 12 to 14 carbon atoms, and an internal olefin having 12 to 20 carbon atoms in an alkylene chain, more preferably 16 to 18 carbon atoms.
  • One or more anionic surfactants selected from sulfones are preferable, and as counterions, alkali metal salts and amines are preferable, and sodium and / or potassium, monoethanolamine and diethanolamine are particularly preferable.
  • WO2017 / 098637 can be referred to.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) ether, alkyl polyglycoside, polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) phenyl ether, and polyoxyalkylene sorbitan fatty acid (8 to 20 carbon atoms). 22) Esters, polyoxyalkylene glycol fatty acid (8 to 22 carbon atoms) esters, and polyoxyethylene polyoxypropylene block polymers are preferable.
  • 4 to 20 mol of an alkylene oxide such as ethylene oxide or propylene oxide is added to an alcohol having 10 to 18 carbon atoms
  • HLB value calculated by the Griffin method
  • polyoxyalkylene alkyl ethers are preferred.
  • the divalent metal ion scavenger is blended in an amount of 0.01 to 50% by mass, preferably 5 to 40% by mass.
  • the divalent metal ion trapping agent used in the cleaning agent composition of the present invention includes condensed phosphates such as tripolyphosphate, pyrophosphate and orthophosphate, aluminosilicates such as zeolite, and synthetic layered crystalline silicates. , Nitrilo triacetate, ethylenediamine tetraacetate, citrate, isocitrate, polyacetal carboxylate and the like.
  • crystalline aluminosilicate is particularly preferable, and among A-type, X-type, and P-type zeolites, A-type is particularly preferable.
  • synthetic zeolite one having an average primary particle size of 0.1 to 10 ⁇ m, particularly 0.1 to 5 ⁇ m, is preferably used.
  • Alkaline agent is blended in an amount of 0.01 to 80% by mass, preferably 1 to 40% by mass.
  • alkali metal carbonates such as sodium carbonate collectively referred to as dense ash and light ash, and amorphous alkali metal silicates such as JIS No. 1, No. 2, No. 3 and the like can be mentioned.
  • These inorganic alkaline agents are effective in forming the skeleton of particles when the detergent is dried, and a detergent that is relatively hard and has excellent fluidity can be obtained.
  • alkalis other than these include sodium sesquicarbonate, sodium hydrogencarbonate and the like, and phosphates such as tripolyphosphate also have an action as an alkaline agent.
  • sodium hydroxide and mono, di or triethanolamine can be used in addition to the above alkaline agent, and can also be used as a counterion of the activator.
  • the anti-recontamination agent is blended in an amount of 0.001 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
  • the anti-recontamination agent used in the cleaning agent composition of the present invention include polyethylene glycol, carboxylic acid-based polymers, polyvinyl alcohol, polyvinylpyrrolidone and the like.
  • the carboxylic acid polymer has the ability to prevent recontamination, the function of capturing metal ions, and the function of dispersing solid particle stains from clothing into the washing bath.
  • the carboxylic acid polymer is a homopolymer or copolymer such as acrylic acid, methacrylic acid, and itaconic acid, and the copolymer is preferably a copolymer of the above-mentioned monomer and maleic acid, and has a molecular weight of several thousand to 100,000. preferable.
  • polymers such as polyglycidylate, cellulose derivatives such as carboxymethyl cellulose, and aminocarboxylic acid-based polymers such as polyaspartic acid also have metal ion trapping agents, dispersants, and anti-recontamination ability. Therefore, it is preferable.
  • Bleaching agent For example, it is preferable to add 1 to 10% by mass of a bleaching agent such as hydrogen peroxide and percarbonate.
  • a bleaching activator such as tetraacetylethylenediamine (TAED) or JP-A-6-316700 can be blended in an amount of 0.01 to 10% by mass.
  • Fluorescent agent examples include a biphenyl type fluorescent agent (for example, Tinopearl CBS-X) and a stilbene type fluorescent agent (for example, DM type fluorescent dye).
  • the fluorescent agent is preferably blended in an amount of 0.001 to 2% by mass.
  • the cleaning composition of the present invention includes builders known in the field of laundry detergents, softeners, reducing agents (sulfites, etc.), defoamers (silicone, etc.), fragrances, and fungicides.
  • Antifungal agents proxel [trade name], benzoic acid, etc.
  • other additives can be contained.
  • the detergent composition of the present invention can be produced according to a conventional method by combining the protein of the present invention obtained by the above method and the above known cleaning components.
  • the form of the detergent can be selected according to the application, and can be, for example, liquid, powder, granule, paste, solid or the like.
  • the detergent composition of the present invention can be used as a laundry detergent, a dishwashing agent, a bleaching agent, a hard surface cleaning detergent, a drainage pipe cleaning agent, a artificial tooth cleaning agent, a sterilizing cleaning agent for medical instruments, and the like.
  • a laundry detergent and a dishwashing agent are mentioned, and more preferably, a laundry detergent (washing detergent for laundry), a dishwashing detergent by hand washing, and a cleaning agent for an automatic dishwashing machine are mentioned. Be done.
  • the detergent composition is suitable for use at 40 ° C. or lower, 35 ° C. or lower, 30 ° C. or lower, 25 ° C. or lower, and 5 ° C. or higher, 10 ° C.
  • Preferred uses include use in low temperature (15-30 ° C) washing in laundry and low temperature (15-30 ° C) washing in an automatic dishwasher.
  • B At least 90% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Protein consisting of a sex amino acid sequence and having ⁇ -amylase activity A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having ⁇ -amylase activity (C)
  • the protein is the following (A'), (B'), ( The cleaning agent composition according to ⁇ 1>, which is one or more selected from C') and (D').
  • C' SEQ ID NO: Each of R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, which is a protein having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in 6 and having ⁇ -amylase activity.
  • Protein in which two or more amino acid residues selected from positions are deleted A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having ⁇ -amylase activity.
  • the protein ⁇ 3> protein lacking two or more amino acid residues selected from the positions of R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is shown in SEQ ID NO: 12.
  • Relative cleaning performance against amylase consisting of amino acid sequence is 1 or more, preferably 1.1 or more, more preferably 1.2 or more, more preferably 1.3 or more, more preferably 1.5 or more, more preferably 1.7.
  • the cleaning agent composition according to ⁇ 1> which is more preferably a protein of 1.9 or more.
  • the detergent composition according to any one of ⁇ 1> to ⁇ 3> which is a laundry detergent or a dishwashing agent.
  • the detergent composition according to ⁇ 4> which is a laundry detergent or a dishwashing agent for hand washing or an automatic dishwashing machine.
  • the detergent composition according to ⁇ 4> or ⁇ 5> which is a powder or a liquid.
  • ⁇ 8> Used at 40 ° C or lower, 35 ° C or lower, 30 ° C or lower, 25 ° C or lower, and 5 ° C or higher, 10 ° C or higher, 15 ° C or higher, or 5 to 40 ° C, 10 to 35 ° C, 15
  • the cleaning agent composition according to ⁇ 7> which is used at ⁇ 30 ° C. and 15 to 25 ° C.
  • the detergent composition according to ⁇ 4> which is used in low temperature (15 to 30 ° C.) washing in laundry or in low temperature (15 to 30 ° C.) washing by an automatic dishwasher.
  • C' SEQ ID NO: Each of R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, which is a protein having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in 6 and having ⁇ -amylase activity.
  • Protein in which two or more amino acid residues selected from positions are deleted A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having ⁇ -amylase activity. A protein lacking two or more amino acid residues selected from the positions of R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 ⁇ 11> From the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the relative cleaning performance with respect to the amylas is 1 or more, preferably 1.1 or more, more preferably 1.2 or more, more preferably 1.3 or more, more preferably 1.5 or more, more preferably 1.7 or more, and more.
  • ⁇ 12> Deletions of two or more amino acid residues selected from the positions of R178, G179, T180 and G181 are R178 ⁇ + T180 ⁇ , G179 ⁇ + T180 ⁇ , R178 ⁇ + G179 ⁇ , R178 ⁇ + G181 ⁇ , or G179 ⁇ + G181 ⁇ , preferably R178 ⁇ + T180 ⁇ .
  • B At least 90% identical to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • Protein consisting of a sex amino acid sequence and having ⁇ -amylase activity A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6 and having ⁇ -amylase activity (C) D) A protein having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having ⁇ -amylase activity ⁇ 14>
  • a protein having ⁇ -amylase activity is described in (A') below.
  • the cleaning agent composition according to ⁇ 13> which is one or more selected from (B'), (C') and (D').
  • C' SEQ ID NO: Each of R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 6, which is a protein having an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in 6 and having ⁇ -amylase activity.
  • Protein in which two or more amino acid residues selected from positions are deleted A protein consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 and having ⁇ -amylase activity. A protein having two or more amino acid residues deleted from each position of R178, G179, T180 and G181 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 8 is deleted. ⁇ 15> A protein having ⁇ -amylase activity is a protein. Relative cleaning performance against amylase consisting of the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 12 is 1 or more, preferably 1.1 or more, more preferably 1.2 or more, more preferably 1.3 or more, still more preferably 1.5 or more.
  • the cleaning agent composition according to ⁇ 13> or ⁇ 14> which is a protein of 1.7 or more, more preferably 1.9 or more.
  • a protein having protease activity having at least 70% identity with respect to the amino acid sequence represented by SEQ ID NO: 42, 43, 44, 45, 46, 47 or 48 and having protease activity.
  • the cleaning agent composition according to ⁇ 17> which is a laundry detergent or a dishwashing agent for hand washing or an automatic dishwashing machine.
  • the detergent composition according to ⁇ 17> or ⁇ 18> which is a powder or liquid.
  • ⁇ 21> Used at 40 ° C or lower, 35 ° C or lower, 30 ° C or lower, 25 ° C or lower, and 5 ° C or higher, 10 ° C or higher, 15 ° C or higher, or 5 to 40 ° C, 10 to 35 ° C, 15
  • the cleaning agent composition according to ⁇ 20> which is used at ⁇ 30 ° C. and 15 to 25 ° C.
  • ⁇ 22> The detergent composition according to ⁇ 17>, which is used in low temperature (15 to 30 ° C.) washing in laundry or in low temperature (15 to 30 ° C.) washing by an automatic dishwasher.
  • Deletions of two or more amino acid residues selected from the positions of R178, G179, T180 and G181 are R178 ⁇ + T180 ⁇ , G179 ⁇ + T180 ⁇ , R178 ⁇ + G179 ⁇ , R178 ⁇ + G181 ⁇ , or G179 ⁇ + G181 ⁇ , preferably R178 ⁇ + T180 ⁇ .
  • the In-Fusion reaction solution was transformed into Bacillus subtilis to construct the plasmid pHY-DE0178.
  • the primer pair RU2C_fw / RU2C_rv was used as a template for artificially synthesized genes (SEQ ID NOS: 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15 respectively).
  • PCR and In-Fusion reactions were performed using / AA560_rv (SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 30), SP722_fw / SP722_rv (SEQ ID NO: 31 and SEQ ID NO: 32), and CspAmy2_fw / CspAmy2_rv (SEQ ID NO: 33 and SEQ ID NO: 34).
  • the In-Fusion reaction solution was transformed into Bacillus subtilis to construct plasmids pHY-RU2C, pHY-BCGAmy, pHY-YR288, pHY-AP1378, pHY-AA560, pHY-SP722, and pHY-CspAmy2, respectively.
  • Bacillus subtilis Marburg No. 168 strain (Nature, 390, 1997, p. 249) was used. A strain of Bacillus subtilis was inoculated into 1 mL of LB medium and cultured with shaking at 30 ° C. and 200 rpm overnight. 10 ⁇ L of this culture solution was inoculated into 1 mL of fresh LB medium and cultured at 37 ° C. and 200 rpm for 3 hours. The culture was centrifuged to collect pellets.
  • SMMP 0.5 M shoe cloth, 20 mM disodium maleate, 20 mM magnesium chloride hexahydrate, 35% (w / v) Antibiotic medium 3 (Difco)) containing 4 mg / mL lysozyme (SIGMA) to the pellet. And incubated at 37 ° C. for 1 hour. The pellet was then collected by centrifugation and suspended in 400 ⁇ L SMMP. 33 ⁇ L of the suspension and DNA were mixed, 100 ⁇ L of 40% PEG was further added and stirred, and 350 ⁇ L of SMMP was further added, and then the mixture was shaken at 30 ° C. for 1 hour.
  • SMMP 0.5 M shoe cloth, 20 mM disodium maleate, 20 mM magnesium chloride hexahydrate, 35% (w / v) Antibiotic medium 3 (Difco)
  • SIGMA lysozyme
  • yeast extract 0.5% yeast extract, 0.35% 1 potassium phosphate, 0.15% 2 potassium phosphate, 0.5% glucose, 0.4% magnesium chloride hexahydrate, 0.01% bovine serum Smear 30 with albumin (SIGMA), 0.5% carboxymethyl cellulose, 0.005% tripan blue (Merck) and amino acid mixture (10 ⁇ g / mL each of tryptophan, lysine and methionine;% is (w / v)%). Incubated at ° C for 3 days to obtain the formed colonies.
  • Japanese product, 15 ppm tetracycline;% is (w / v)%) Inoculated into a 96-well deep well plate dispensed with 100 ⁇ L, cultured at 30 ° C. and 210 rpm for 2 days, and then containing the enzyme produced from the cells. The culture supernatant was collected by centrifugation.
  • Protein concentration measurement A protein assay rapid kit Wako II (Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) was used for protein concentration measurement. The concentration of amylase in the culture supernatant was calculated by using the protein concentration of the culture supernatant of the pHY300PLK (Takara Bio) -introduced strain having no amylase expression cassette as a blank.
  • Phadebas is a tablet consisting of insoluble starch covalently bound to a blue dye. A water-soluble blue pigment is released as the starch is decomposed by ⁇ -amylase. The concentration of blue dye measured by absorbance at 620 nm is proportional to the amylase activity in the sample. 1 / 15M phosphate buffer (pH 7.4) 1 substrate tablet was suspended and used per 5 mL. 500 ⁇ L of substrate suspension was dispensed into a 96-well deep well plate.
  • DE0178, RU2C, BCGAmy, YR288 showed significantly higher starch degrading activity at 20 ° C and 30 ° C as compared to previously reported detergent amylases (AP1378, AA560, SP722, CspAmy2, Termamyl).
  • a blank was prepared by adding tap water instead of the enzyme solution, and the difference ⁇ A488 from the blank was determined as the detergency.
  • amylase mutant expression plasmid A forward primer having 15 bases complementary to the reverse primer at the 5'end and containing the mutant sequence, and a reverse primer having the base immediately preceding the mutant sequence at the 5'end are mutated. Used as a primer pair for use. Using the amylase expression plasmid prepared in Example (1) as a template, PCR was performed using a primer pair for mutagenesis. The PCR product was transformed into Bacillus subtilis by the protoplast method to obtain a transformant carrying the desired mutant expression plasmid.
  • Each enzyme solution shown in Table 1 diluted to 4 ppm with ion-exchanged water was added in an amount of 10 ⁇ L, sealed, and shaken at 20 ° C. using a cute mixer (CUTE MIXER CM-1000, EYELA) at 1200 rpm for 15 minutes. After the washing was completed, 100 ⁇ L of the washing solution was transferred to a new 96-well assay plate, and the absorbance at 488 nm was measured. A blank was prepared by adding ion-exchanged water instead of the enzyme solution, and the difference ⁇ A488 from the blank was determined. The relative cleaning performance with respect to AA560 was determined by dividing ⁇ A488 of each enzyme by ⁇ A488 of AA560 (Table 1).
  • a blank was prepared by adding ion-exchanged water instead of the amylase solution, and the difference in absorbance ⁇ A488 from the blank was determined as the amylase detergency.
  • FIG. 7 shows the detergency of the CS-26 contaminated cloth
  • FIG. 8 shows the detergency of the EMPA117 contaminated cloth.
  • a cleaning composition containing amylase (YR288, YR288 R178 ⁇ T180 ⁇ ) and a protease that maintain high activity at low temperature exhibited excellent cleaning power at low temperature as compared with a conventional cleaning composition containing amylase and protease. ..

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Abstract

低温で高い特異活性を発揮するα－アミラーゼを配合した洗浄剤組成物を提供する。　下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）から選ばれる１種以上のタンパク質を含有する洗浄剤組成物。　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質　（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質　（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質　（Ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質

Description

アミラーゼ配合洗浄剤組成物
　本発明はα－アミラーゼを配合した洗浄剤組成物に関する。
　α－アミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗浄剤への配合適性が知られており、デンプン質の汚れを除去する成分として自動食器洗浄機用の食器洗浄剤や衣料用洗剤等へ配合されている。
　洗浄剤用として有用なα－アミラーゼとしては、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ－１３７８（ＦＥＲＭ ＢＰ－３０４８）株由来のα－アミラーゼＡＰ１３７８（特許文献１）、バチルス リケニフォルミス由来のα－アミラーゼであるターマミルやデュラミル（登録商標）の他、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＤＳＭ１２６４９株由来のα－アミラーゼＡＡ５６０（特許文献２）、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＳＰ７２２株由来のα－アミラーゼＳＰ７２２（特許文献３の配列番号４）、サイトファーガ属由来のα－アミラーゼＣｓｐＡｍｙ２（特許文献４）等が知られている。
　一方、近年では、環境保護や洗浄コスト軽減の観点から、食器洗浄や洗濯洗浄、特にランドリーでの洗濯洗浄の際の温度を下げることが重要とされ、また洗浄時間の短縮化も望まれている。
　しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素の至適温度は、低温洗浄において通常設定される温度よりも高い。このため、多くのデンプン質の汚れは完全に除去することが困難となっており、低温においても、洗浄性能やデンプン分解活性が保持され、汚れ除去効果が高いα－アミラーゼを見出すことが重要である。
　低温でのα－アミラーゼの洗浄性能は、デンプンに対するアミラーゼの結合性（デンプン吸着性）と逆相関し、デンプン吸着性の低いアミラーゼが低温での洗浄性能が高いことが報告されている（特許文献５）。そして、特許文献５では、デンプン吸着性は既知のデンプン結合残基及びその隣接残基に変異を導入することで低減できることが開示されている。
　　〔特許文献１〕国際公開第９４／２６８８１号
　　〔特許文献２〕国際公開第００／６００６０号
　　〔特許文献３〕国際公開第０６／００２６４３号
　　〔特許文献４〕国際公開第２０１４／１６４７７７号
　　〔特許文献５〕特許第６３３９４９９号公報
発明の詳細な説明
　本発明は、以下の１）～２）に係るものである。
　１）下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）から選ばれる１種以上のタンパク質を含有する洗浄剤組成物。
　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　（Ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　２）下記（Ａ′）、（Ｂ′）、（Ｃ′）及び（Ｄ′）から選ばれるタンパク質。
　（Ａ′）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｂ′）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｃ′）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号６で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｄ′）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号８で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
各アミラーゼの２０℃及び３０℃におけるデンプン分解活性。 本発明のアミラーゼと既存の洗剤用アミラーゼの進化的関係を示す分子系統樹。 各アミラーゼの２０℃での洗浄力。 本発明のアミラーゼ（ＹＲ２８８の変異体）の２０℃でのデンプン分解活性。 本発明のアミラーゼ（ＹＲ２８８の変異体）の２０℃での洗浄力。 本発明のアミラーゼ（ＢＣＧＡｍｙの変異体）の２０℃でのデンプン分解活性。 プロテアーゼを含む洗浄組成物の洗浄性能（ＣＳ－２６汚染布に対する洗浄力）。 プロテアーゼを含む洗浄組成物の洗浄性能（ＥＭＰＡ１１７汚染布に対する洗浄力）。
　低温で高い洗浄性能を発現するには、低温におけるデンプン分解活性の維持、および低いデンプン吸着性の２点が特に重要であると考えられるが、一方で、低温におけるデンプン分解活性の維持は容易ではない。従来、既存のいかなる洗剤用途アミラーゼも、活性の強さが選抜指標の一部であったと考えられるにもかかわらず、低温におけるデンプン分解活性を十分に維持していない。
　したがって、低温において既存の洗浄用アミラーゼと比較して高い洗浄力を示すアミラーゼを開発するには、低温で高いデンプン分解活性を保持するアミラーゼを新たに見出すことが重要である。しかしながら、既存のアミラーゼよりも低温で高いデンプン分解活性を保持するアミラーゼを選抜する配列上の指標などは存在せず、その探索は容易ではない。
　また、デンプンを含む汚れの多くはさらにタンパク質成分も含むことから、α－アミラーゼとプロテアーゼを併用することで相加相乗的な洗浄効果が発現することが知られている。α－アミラーゼとプロテアーゼを含む洗浄剤は、洗浄力の低下が課題となる低温での洗浄では特に有用である。そのような洗浄剤においても低温におけるアミラーゼ活性の維持は依然として大きな課題であり、既存のいかなる洗剤用途アミラーゼも低温におけるデンプン分解活性を十分に維持していない。
　本発明は、低温で高い特異活性（デンプン分解活性）を発揮するα－アミラーゼを配合した洗浄剤組成物を提供することに関する。
　本発明者らは、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースに含まれる推定α－アミラーゼ配列の中から見出された特定のα－アミラーゼが、２０～３０℃という低温で高いデンプン分解活性を有し、これを配合した洗浄剤組成物が低温洗浄に適する洗浄剤組成物として有用であることを見出した。
　本発明によれば、低温洗浄に使用した場合でも優れたデンプン汚れ除去効果を発揮する洗浄剤組成物を提供することができる。また、本発明のタンパク質の配列情報は低温で高いデンプン分解活性を有するα－アミラーゼを選抜する配列上の指標として利用できる。　
　本発明において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本発明において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、なお好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列には、１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。「１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、１個以上３０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
　本発明の洗浄剤組成物に配合されるタンパク質は、下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）から選ばれる１種以上のタンパク質である。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
（Ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　斯かるタンパク質は、２０～３０℃において、優れたα－アミラーゼ活性を有する。
　ここで、α－アミラーゼ活性とは、デンプンならびに他の直鎖又は分岐１，４－グリコシドオリゴ糖若しくは多糖類の加水分解を触媒する活性を意味する。
　α－アミラーゼ活性は、デンプンの酵素的分解による還元末端の生成量を測定することによって決定することができる。これに限定されず、例えばＰｈａｄｅｂａｓのような色素架橋デンプンの酵素的分解による色素の遊離を測定することによっても決定することができる（Soininen, K., M. Ceska, and H. Adlercreutz. "Comparison between a new chromogenic α-amylase test (Phadebas) and the Wohlgemuth amyloclastic method in urine." Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation 30.3 (1972): 291-297.）。Ｐｈａｄｅｂａｓにより測定したα－アミラーゼ活性と、洗浄剤として用いた際の洗浄性能との間には相関が見られる。
　配列番号２、４、６及び８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質はＮＣＢＩタンパク質配列データベースにおいて、α－アミラーゼとして推定されたタンパク質である。すなわち、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質はアクセッション番号ＷＰ＿１３８１１７４３３．１（本発明においては、「ＤＥ０１７８」と称する）として、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質はＷＰ＿０７６５１２８６２．１（本発明においては、「ＲＵ２Ｃ」と称する）として、配列番号６で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質はＷＰ＿１１０１１４７０８．１（本発明においては、「ＢＣＧＡｍｙ」と称する）として、配列番号８で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質はＷＰ＿１００３４６３６２．１（本発明においては、「ＹＲ２８８」と称する）として、それぞれ当該データベースに登録されているが、その酵素学的性質はこれまでに全く報告されていない。
　斯かるＤＥ０１７８、ＲＵ２Ｃ、ＢＣＧＡｍｙ及びＹＲ２８８と、洗剤用アミラーゼとして知られているＡＰ１３７８（配列番号１０）、ＡＡ５６０（配列番号１２）、ＳＰ７２２（配列番号１４）、ＣｓｐＡｍｙ２（配列番号１６）、ＢＡＡ（配列番号３５）、ＢＬＡ（配列番号３６）、ＬＡＢＭ（配列番号３７）、ＳＰ７０７（配列番号３８）、ＴＳ２３（配列番号３９）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（配列番号４０）及びＡＡＩ１０（配列番号４１）の進化的関係を明らかにすべく、各アミラーゼの成熟領域のアミノ酸配列を用いて近隣結合法により分子系統樹を作成すると、本発明のＤＥ０１７８、ＲＵ２Ｃ、ＢＣＧＡｍｙ及びＹＲ２８８は、既存の洗剤用アミラーゼとは異なるグループに属することが示された（図２）。
　配列番号２、４、６及び８で示されるアミノ酸配列と、それぞれ少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質には、一態様として、配列番号２、４、６及び８で示されるアミノ酸配列において１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入又は付加されたアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質変異体が包含される。ここで、数個とは、例えば、２～１０個が挙げられ、好ましくは２～５個、より好ましくは２～３個が挙げられる。
　斯かる変異体のうち、低温におけるデンプン分解活性及び／又は洗浄性の点から、好ましくは、配列番号２、４、６及び８で示されるアミノ酸配列において、それぞれ１７８位のアルギニン（Ｒ１７８）、１７９位のグリシン（Ｇ１７９）、１８０位のスレオニン（Ｔ１８０）及び１８１位のグリシン（Ｇ１８１）から選ばれる２箇所以上におけるアミノ酸残基が欠失した変異体が好ましく、配列番号８で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上におけるアミノ酸残基が欠失した変異体がより好ましい。
　ここで、２箇所以上のアミノ酸残基の欠失（[元のアミノ酸、位置、Δ]で表記）としては、好ましくはＲ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１７９Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１８１Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｇ１８１Δ等が挙げられ、Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δがより好ましい。
　上記変異体は、文献未記載の新規なタンパク質である。したがって、本発明は、一態様として、下記（Ａ′）、（Ｂ′）、（Ｃ′）及び（Ｄ′）から選ばれるタンパク質、及び当該タンパク質を含有する洗浄剤組成物を包含する。
　（Ａ′）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｂ′）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｃ′）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号６で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｄ′）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号８で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　本発明のタンパク質は、例えば、上記本発明のタンパク質をコードする遺伝子を発現させることにより生産することができる。
　好ましくは、本発明のタンパク質は、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。例えば、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体を適切な培地で培養すれば、該形質転換体に導入した本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドから本発明のタンパク質が生産される。生産されたタンパク質を該培養物から単離又は精製することにより、本発明のタンパク質を取得することができる。
　本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
　本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの好ましい例としては、下記（ａ）、（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）で表されるポリヌクレオチドが挙げられる。
　（ａ）配列番号１で示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
　（ｂ）配列番号３で示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
　（ｃ）配列番号５で示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
　（ｄ）配列番号７で示される塩基配列と少なくとも９０％の同一性を有する塩基配列からなるポリヌクレオチド
　本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、該タンパク質のアミノ酸配列に基づいて、化学的又は遺伝子工学的に合成することができる。例えば、該ポリヌクレオチドは、上述した本発明のタンパク質のアミノ酸配列に基づいて、化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの化学合成には、核酸合成受託サービス（例えば、株式会社  医学生物学研究所、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社等より提供されている）を利用することができる。さらに、合成したポリヌクレオチドをＰＣＲ、クローニング等により増幅することもできる。
　変異体であるタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して変異後のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドが製造される。変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等）を使用することもできる。
　部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親タンパク質をコードするポリヌクレオチドにおける変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
　本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
　上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド（すなわちα－アミラーゼ遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。なお、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。
　上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ　ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列等が挙げられる。
　あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
　上記本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
　上記ベクターを導入する形質転換体の宿主の例としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｍａｒｂｕｒｇ  Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられる。
　宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
　あるいは、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
　斯くして得られた、本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明のタンパク質が生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
　あるいは、本発明のタンパク質は、無細胞翻訳系を使用して本発明のタンパク質をコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
　上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明のタンパク質は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で本発明のタンパク質をコードする遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたタンパク質は細胞外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
　斯くして得られる本発明のタンパク質は、これまで報告されている洗剤用アミラーゼ（ＡＰ１３７８、ＡＡ５６０、ＳＰ７２２、ＣｓｐＡｍｙ２）と比較して、２０℃及び３０℃において顕著に高いデンプン分解活性を示す。
　また、本発明のタンパク質は、既存の洗剤用アミラーゼと比較して優れた洗浄性能を有する。具体的には、下記の方法で洗浄性能を測定した場合に、ＡＡ５６０（配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるアミラーゼ）に対する相対洗浄性能が１以上であり、好ましくは１．１以上、より好ましくは１．２以上、より好ましくは１．３以上、より好ましくは１．５以上、より好ましくは１．７以上、より好ましくは１．９以上である。
＜洗浄性能の測定＞
　直径５．５ｍｍの円形に裁断したＣＳ－２６汚染布（ＣＦＴ社）を９６穴アッセイプレートの各ウェルに２枚ずつ挿入し、モデル洗浄液（２００ｐｐｍ直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム，２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ水溶液（ｐＨ７．５））を２００μLずつ加え、これに４ｐｐｍに希釈した試験アミラーゼ溶液を１０μＬずつ添加して、２０℃、１２００ｒｐｍ、１５分間振盪する。洗浄終了後、洗浄液の４８８ｎｍの吸光度を測定し、酵素溶液のかわりにイオン交換水を加えたものをブランクとして、ブランクとの差分ΔＡ４８８を洗浄性能とする。
　ＡＡ５６０に対する相対洗浄性能は、（試験アミラーゼのΔＡ４８８）／（ＡＡ５６０のΔＡ４８８）で計算される。
　従って、本発明のタンパク質は、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に低温洗浄に適した洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。
　ここで、「低温」としては、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下が挙げられ、また５℃以上、１０℃以上、１５℃以上が挙げられる。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃が挙げられる。
　洗浄剤組成物中への本発明のタンパク質の配合量は、当該タンパク質が活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは５０ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また１～５０００ｍｇであるのが好ましく、１０～１０００ｍｇであるのがより好ましく、５０～５００ｍｇであるのがより好ましい。
　本発明の洗浄剤組成物は、本発明のタンパク質以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明のタンパク質とは異なるアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
　プロテアーゼとしては、例えば、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７又は４８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有し、且つプロテアーゼ活性を有するタンパク質が挙げられる。
　ここで、配列番号４２で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｃｌａｕｓｉｉ由来プロテアーゼＳａｖｉｎａｓｅ（国際公開第２０１１／０３６２６３号）であり、配列番号４３で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ　ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ由来プロテアーゼＢＰＮ’（国際公開第２０１１／０３６２６３号）であり、配列番号４４で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｌｅｎｔｕｓ　ＤＳＭ　５４８３由来プロテアーゼ（国際公開第９２／２１７６０号）であり、配列番号４５で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．　ＫＳＭ－ＫＰ４３由来プロテアーゼ（国際公開第９９／１８２１８号）であり、配列番号４６で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．由来プロテアーゼＴＹ１４５（特表２０１９－５０３４０４号公報）であり、配列番号４７で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼはＢａｃｉｌｌｕｓａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｃｅ由来プロテアーゼＮｅｕｔｒａｓｅであり、配列番号４８で示されるアミノ酸配列からなるプロテアーゼはＢａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ由来メタロプロテアーゼである。
　また、プロテアーゼは、市販のＡｌｃａｌａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｋａｎｎａｓｅ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｕｎｏ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標；ＢＡＳＦ社）等であっても良い。
　セルラーゼとしてはＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０－３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。
　アミラーゼとしてはＴｅｒｍａｍｙｌ、Ｄｕｒａｍｙｌ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ　Ｐｌｕｓ、Ａｍｐｌｉｆｙ　Ｐｒｉｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、またＫＡＭ（花王）、等が挙げられる。
　リパーゼとしてはＬｉｐｏｌａｓｅ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標；ノボザイムズ社）等が挙げられる。
　本発明の洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
（１）界面活性剤
　界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５～６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０～４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０～９０質量％配合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。
　本発明洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種または組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
　陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８～２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、内部オレフィンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、α－スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０～１４の、より好ましくは１２～１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキレン鎖の炭素数が１２～２０の、より好ましくは１６～１８の内部オレフィンスルホンから選ばれる一種以上の陰イオン性界面活性剤が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。内部オレフィンスルホン酸は例えばＷＯ２０１７/０９８６３７を参照することができる。
　非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４～２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５～１５．０、好ましくは１１．０～１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
（２）二価金属イオン捕捉剤
　二価金属イオン捕捉剤は０．０１～５０質量％、好ましくは５～４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１～１０μｍ、特に０．１～５μｍのものが好適に使用される。
（３）アルカリ剤
　アルカリ剤は０．０１～８０質量％、好ましくは１～４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
（４）再汚染防止剤
　再汚染防止剤は０．００１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千～１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
（５）漂白剤
　例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１～１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１～１０質量％配合することができる。
（６）蛍光剤
　本発明の洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１～２質量％配合するのが好ましい。
（７）その他の成分
　本発明の洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル[商品名]、安息香酸など）、その他の添加剤を含有させることができる。
　本発明の洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明のタンパク質及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
　斯くして得られる本発明の洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられ、より好ましくはランドリー用衣料洗浄剤（ランドリー用洗濯洗剤）、手洗いによる食器洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤が挙げられる。
　また、当該洗浄剤組成物は、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での使用に適する。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での使用に適する。好ましい使用態様としては、ランドリーでの低温（１５～３０℃）洗浄における使用、自動食器洗浄機による低温（１５～３０℃）洗浄における使用が挙げられる。
　上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
　＜１＞下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）から選ばれる１種以上のタンパク質を含有する洗浄剤組成物。
　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　（Ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　＜２＞タンパク質が、下記（Ａ′）、（Ｂ′）、（Ｃ′）及び（Ｄ′）から選ばれる一種以上である、＜１＞に記載の洗浄剤組成物。
　（Ａ′）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｂ′）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｃ′）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号６で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｄ′）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号８で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　＜３＞タンパク質が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるアミラーゼに対する相対洗浄性能が１以上、好ましくは１．１以上、より好ましくは１．２以上、より好ましくは１．３以上、より好ましくは１．５以上、より好ましくは１．７以上、より好ましくは１．９以上のタンパク質である、＜１＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜４＞衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、＜１＞～＜３＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
　＜５＞ランドリー用衣料洗浄剤又は手洗い若しくは自動食器洗浄機用の食器洗浄剤である、＜４＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜６＞粉末又は液体である、＜４＞又は＜５＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜７＞低温で使用される、＜４＞～＜６＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
　＜８＞４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上で使用されるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃で使用される、＜７＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜９＞ランドリーでの低温（１５～３０℃）洗浄において使用されるか、又は自動食器洗浄機による低温（１５～３０℃）洗浄において使用される、＜４＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜１０＞下記（Ａ′）、（Ｂ′）、（Ｃ′）及び（Ｄ′）から選ばれるタンパク質。
　（Ａ′）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｂ′）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｃ′）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号６で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｄ′）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号８で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　＜１１＞配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるアミラーゼに対する相対洗浄性能が１以上、好ましくは１．１以上、より好ましくは１．２以上、より好ましくは１．３以上、より好ましくは１．５以上、より好ましくは１．７以上、より好ましくは１．９以上である、＜１０＞に記載のタンパク質。
　＜１２＞Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基の欠失が、Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１７９Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１８１Δ、又はＧ１７９Δ＋Ｇ１８１Δであり、好ましくはＲ１７８Δ＋Ｔ１８０Δである、＜１０＞若しくは＜１１＞のタンパク質又は＜２＞又は＜３＞の洗浄剤組成物。
　＜１３＞下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）から選ばれる１種以上のα－アミラーゼ活性を有するタンパク質と、プロテアーゼ活性を有するタンパク質とを含有する洗浄剤組成物。
　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　（Ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
　＜１４＞α－アミラーゼ活性を有するタンパク質が、下記（Ａ′）、（Ｂ′）、（Ｃ′）及び（Ｄ′）から選ばれる一種以上である、＜１３＞に記載の洗浄剤組成物。
　（Ａ′）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｂ′）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｃ′）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号６で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　（Ｄ′）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号８で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
　＜１５＞α－アミラーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるアミラーゼに対する相対洗浄性能が１以上、好ましくは１．１以上、より好ましくは１．２以上、より好ましくは１．３以上、より好ましくは１．５以上、より好ましくは１．７以上、より好ましくは１．９以上のタンパク質である、＜１３＞又は＜１４＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜１６＞プロテアーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７又は４８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、且つプロテアーゼ活性を有するタンパク質である、＜１３＞～＜１５＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
　＜１７＞衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、＜１３＞～＜１６＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
　＜１８＞ランドリー用衣料洗浄剤又は手洗い若しくは自動食器洗浄機用の食器洗浄剤である、＜１７＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜１９＞粉末又は液体である、＜１７＞又は＜１８＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜２０＞低温で使用される、＜１７＞～＜１９＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
　＜２１＞４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上で使用されるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃で使用される、＜２０＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜２２＞ランドリーでの低温（１５～３０℃）洗浄において使用されるか、又は自動食器洗浄機による低温（１５～３０℃）洗浄において使用される、＜１７＞に記載の洗浄剤組成物。
　＜２３＞Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基の欠失が、Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１７９Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１８１Δ、又はＧ１７９Δ＋Ｇ１８１Δであり、好ましくはＲ１７８Δ＋Ｔ１８０Δである、＜１４＞～＜２２＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
（１）アミラーゼ発現プラスミドの構築
　工遺伝子合成したＤＥ０１７８遺伝子（配列番号１）を鋳型としてプライマーペアＤＥ０１７８＿ｆｗ／ＤＥ０１７８＿ｒｖ（配列番号１９及び２０）及びＰｒｉｍｅＳＴＡＲ　Ｍａｘ　Ｐｒｅｍｉｘ（タカラバイオ）を使用してＰＣＲを行った。ＷＯ２００６／０６８１４８Ａ１の実施例７に記載のプラスミドｐＨＹ－Ｓ２３７を鋳型とし、プライマーペアＳ２３７ｔ＿ｆｗ／Ｓ２３７ｓ＿ｒｖ（配列番号１７及び１８）を使用して、同様にＰＣＲを行った。それぞれのＰＣＲ産物を用いて、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を枯草菌に形質転換してプラスミドｐＨＹ－ＤＥ０１７８を構築した。同様にＲＵ２Ｃ、ＢＣＧＡｍｙ、ＹＲ２８８、ＡＰ１３７８、ＡＡ５６０、ＳＰ７２２、ＣｓｐＡｍｙ２についても人工遺伝子合成した遺伝子（それぞれ配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５）を鋳型として、それぞれプライマーペアＲＵ２Ｃ＿ｆｗ／ＲＵ２Ｃ＿ｒｖ（配列番号２１及び配列番号２２）、ＢＣＧＡｍｙ＿ｆｗ／ＢＣＧＡｍｙ＿ｒｖ（配列番号２３及び配列番号２４）、ＹＲ２８８＿ｆｗ／ＹＲ２８８＿ｒｖ（配列番号２５及び配列番号２６）、ＡＰ１３７８＿ｆｗ／ＡＰ１３７８＿ｒｖ（配列番号２７及び配列番号２８）、ＡＡ５６０＿ｆｗ／ＡＡ５６０＿ｒｖ（配列番号２９及び配列番号３０）、ＳＰ７２２＿ｆｗ／ＳＰ７２２＿ｒｖ（配列番号３１及び配列番号３２）、ＣｓｐＡｍｙ２＿ｆｗ／ＣｓｐＡｍｙ２＿ｒｖ（配列番号３３及び配列番号３４）を用いてＰＣＲ及びＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を枯草菌に形質転換してそれぞれプラスミドｐＨＹ－ＲＵ２Ｃ、ｐＨＹ－ＢＣＧＡｍｙ、ｐＨＹ－ＹＲ２８８、ｐＨＹ－ＡＰ１３７８、ｐＨＹ－ＡＡ５６０、ｐＨＹ－ＳＰ７２２、ｐＨＹ－ＣｓｐＡｍｙ２を構築した。
（２）形質転換
　宿主には、枯草菌１６８株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｍａｒｂｕｒｇ　Ｎｏ．１６８株：Ｎａｔｕｒｅ，３９０，１９９７，ｐ．２４９）を使用した。１ｍＬのＬＢ培地に枯草菌１６８株を植菌し、３０℃、２００ｒｐｍで一晩振盪培養した。１ｍＬの新たなＬＢ培地にこの培養液を１０μＬ植菌して３７℃、２００ｒｐｍで３時間培養した。この培養液を遠心分離してペレットを回収した。ペレットに４ｍｇ／ｍＬのリゾチーム（ＳＩＧＭＡ）を含むＳＭＭＰ（０．５Ｍシュークロース、２０ｍＭマレイン酸二ナトリウム、２０ｍＭ塩化マグネシウム６水塩、３５％（ｗ／ｖ）Ａｎｔｉｂｉｏｔｉｃ　ｍｅｄｉｕｍ　３（Ｄｉｆｃｏ））を５００μＬ添加し、３７℃で１時間インキュベートした。次に遠心分離によりペレットを回収し、４００μＬのＳＭＭＰに懸濁した。懸濁液３３μＬ、ＤＮＡを混合し、さらに１００μＬの４０％ＰＥＧを加え攪拌し、さらにＳＭＭＰを３５０μＬ加えた後、３０℃で１時間振盪した。この液２００μＬをテトラサイクリン（１５μｇ／ｍＬ、ＳＩＧＭＡ）を含むＤＭ３再生寒天培地（０．８％寒天（和光純薬）、０．５％コハク酸２ナトリウム６水塩、０．５％カザミノ酸テクニカル（Ｄｉｆｃｏ）、０．５％酵母エキス、０．３５％リン酸１カリウム、０．１５％リン酸２カリウム、０．５％グルコース、０．４％塩化マグネシウム６水塩、０．０１％牛血清アルブミン（ＳＩＧＭＡ）、０．５％カルボキメチルセルロース、０．００５％トリパンブルー（Ｍｅｒｃｋ）及びアミノ酸混液（トリプトファン、リジン、メチオニン各１０μｇ／ｍＬ）；％は（ｗ／ｖ）％）に塗抹して３０℃で３日間インキュベートし、形成したコロニーを取得した。
（３）酵素生産培養
　１５ｐｐｍテトラサイクリンを添加したＬＢ培地３００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに（２）で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩培養した。翌日、培養液６μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）１００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで２日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収した。
（４）タンパク質濃度測定
　タンパク質濃度測定にはプロテインアッセイラピッドキット　ワコーII（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いた。アミラーゼ発現カセットを持たないｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）導入株の培養上清のタンパク質濃度をブランクとすることで培養上清中のアミラーゼの濃度を算出した。
（５）デンプン分解活性測定
　各培養上清及びＴｅｒｍａｍｙｌ（ＳＩＧＭＡ、Ａ４８６２）について、Ｐｈａｄｅｂａｓ（Ｐｈａｄｅｂａｓ　ＡＢ）を用いてデンプン分解活性を測定した。Ｐｈａｄｅｂａｓは青色色素と共有結合した不溶性デンプンから成る錠剤である。α－アミラーゼによるデンプン分解に伴って水溶性の青色色素が放出される。６２０ｎｍの吸光度により測定される青色色素の濃度はサンプル中のアミラーゼ活性に比例する。
　１／１５Ｍ　リン酸バッファー（ｐＨ７．４）　５ｍＬにつき１錠の基質錠剤を懸濁して用いた。９６穴ディープウェルプレートに５００μＬの基質懸濁液を分注した。１／１５Ｍ　リン酸バッファー（ｐＨ７．４）で適宣希釈した酵素溶液を添加して混合した。２０℃又は３０℃で３０分間静置した後、２５０μＬの１０％クエン酸水溶液を加えて反応を停止した。３０００ｒｐｍで２０分間遠心し上清１００μＬを新たな９６穴プレートに移し、吸光度を６２０ｎｍにおいて測定した。各測定値は活性測定の直線範囲内であることを確認した。ブランク（酵素非添加）の値を引くことでデンプン分解活性ΔＡ６２０を算出し、さらに加えたアミラーゼ濃度で割ることで比活性ΔＡ６２０／ｐｐｍを求めた（図１）。
　ＤＥ０１７８、ＲＵ２Ｃ、ＢＣＧＡｍｙ、ＹＲ２８８はこれまで報告されている洗剤用アミラーゼ（ＡＰ１３７８、ＡＡ５６０、ＳＰ７２２、ＣｓｐＡｍｙ２、Ｔｅｒｍａｍｙｌ）と比較して、２０℃及び３０℃において顕著に高いデンプン分解活性を示した。
（６）系統樹
　低温で高い活性を維持するアミラーゼＤＥ０１７８、ＲＵ２Ｃ、ＢＣＧＡｍｙ、ＹＲ２８８、及び既存の洗剤用アミラーゼＡＰ１３７８、ＡＡ５６０、ＳＰ７２２、ＣｓｐＡｍｙ２、ＢＡＡ（配列番号３５）、ＢＬＡ（配列番号３６）、ＬＡＢＭ（配列番号３７）、ＳＰ７０７（配列番号３８）、ＴＳ２３（配列番号３９）、Ｔｅｒｍａｍｙｌ（配列番号４０）、ＡＡＩ１０（配列番号４１）の成熟領域のアミノ酸配列を用いて系統樹を作成した。Ｇｅｎｅｔｙｘを用いてｃｌｕｓｔａｌＷによりマルチプルアライメントを行い、近隣結合法（Ｎｅｉｇｈｂｏｒ－Ｊｏｉｎｉｎｇ　ｍｅｔｈｏｄ：ＮＪ法）により系統樹を作成した。
　その結果、低温で高い活性を維持するアミラーゼＤＥ０１７８、ＲＵ２Ｃ、ＢＣＧＡｍｙ、ＹＲ２８８は既存の洗剤用アミラーゼとは異なるグループを形成した（図２）。
（７）洗浄力評価
　直径５．５ｍｍの円形に裁断したＣＳ－２６汚染布をＣＦＴ社から入手して使用した。９６穴アッセイプレートの各ウェルにＣＳ－２６円形汚染布を２枚ずつ挿入し、水道水で３０００倍に希釈したアタックゼロ（花王）を２００μＬずつ加えた。適宣希釈した酵素溶液を１０μＬずつ添加し、シールをして２０℃でキュートミキサーを用いて１２００ｒｐｍ、１５分間振盪した。洗浄終了後、１００μＬの洗浄液を新たな９６穴アッセイプレートに移し、４８８ｎｍの吸光度を測定した。酵素溶液のかわりに水道水を加えたものをブランクとし、ブランクとの差分ΔＡ４８８を洗浄力として求めた。
　低温で高い活性を維持するアミラーゼＹＲ２８８はこれまで報告されている洗剤用アミラーゼ（ＡＰ１３７８、ＡＡ５６０、ＳＰ７２２、ＣｓｐＡｍｙ２）と比較して、低温で顕著に高い洗浄力を示した（図３）。
（８）アミラーゼ変異体発現プラスミドの構築
　５’末端にリバースプライマーとの相補配列を１５塩基有し変異配列を含むフォワードプライマー、及び変異配列の直前の塩基を５’末端とするリバースプライマーを変異導入用プライマー対として用いた。実施例（１）にて作成したアミラーゼ発現プラスミドを鋳型として、変異導入用プライマー対を使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を枯草菌にプロトプラスト法により形質転換して目的の変異体発現プラスミドを保持する形質転換体を取得した。
（９）ＹＲ２８８の１７８－１８１位における２アミノ酸欠失変異体の評価
　実施例（８）に記載の方法によりＹＲ２８８（配列番号８）を親ポリペプチドとして図４に記載の変異体を構築した。
　実施例（５）に記載の方法で変異体の２０℃のデンプン分解比活性ΔＡ６２０／ｐｐｍを求め、野生型ＹＲ２８８の値で割ることで相対比活性を求めた（図４）。Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０、Ｇ１８１のうち任意の２残基を欠失させることでＹＲ２８８の低温におけるデンプン分解活性はさらに向上した。
　実施例（７）に記載の方法で変異体の洗浄力評価を行った。Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０、Ｇ１８１のうち任意の２残基を欠失させることでＹＲ２８８の洗浄力はさらに向上した（図５）。
（１０）ＢＣＧＡｍｙの１７８－１８１位における２アミノ酸欠失変異体の評価
　実施例（８）に記載の方法によりＢＣＧＡｍｙ（配列番号６）を親ポリペプチドとして図６に記載の変異体を構築した。
　実施例（５）に記載の方法で変異体の２０℃のデンプン分解比活性ΔＡ６２０／ｐｐｍを求め、野生型ＢＣＧＡｍｙの値で割ることで相対比活性を求めた（図６）。Ｒ１７８及びＧ１７９の２残基、またはＲ１７８及びＴ１８０の２残基を欠失させることでＢＣＧＡｍｙの低温におけるデンプン分解活性はさらに向上した。
（１１）ＡＡ５６０に対するＹＲ２８８及びＹＲ２８８の２アミノ酸欠失変異体の相対洗浄性能
　直径５．５ｍｍの円形に裁断したＣＳ－２６汚染布をＣＦＴ社から入手して使用した。９６穴アッセイプレート（３８８１－０９６、ＩＷＡＫＩ）の各ウェルにＣＳ－２６円形汚染布を２枚ずつ挿入し、モデル洗浄液（２００ｐｐｍ　直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（１９５－０７６８２、ｗａｋｏ），２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ水溶液（ｐＨ　７．５））を２００μＬずつ加えた。イオン交換水で４ｐｐｍに希釈した表１に記載の各酵素溶液を１０μＬずつ添加し、シールをして２０℃でキュートミキサー（ＣＵＴＥ　ＭＩＸＥＲ　ＣＭ－１０００、ＥＹＥＬＡ）を用いて１２００ｒｐｍ、１５分間振盪した。洗浄終了後、１００μＬの洗浄液を新たな９６穴アッセイプレートに移し、４８８ｎｍの吸光度を測定した。酵素溶液のかわりにイオン交換水を加えたものをブランクとし、ブランクとの差分ΔＡ４８８を求めた。各酵素のΔＡ４８８をＡＡ５６０のΔＡ４８８で割ることで、ＡＡ５６０に対する相対洗浄性能を求めた（表１）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
（１２）アミラーゼとプロテアーゼを含む洗浄組成物の洗浄性能
　直径５．５ｍｍの円形に裁断したＣＳ－２６汚染布をＣＦＴから、ＥＭＰＡ１１７汚染布をＥＭＰＡから入手して使用した。プロテアーゼとしてはＳａｖｉｎａｓｅ（ＳＩＧＭＡ、Ｐ３１１１）及びＫＡＰ８．０Ｑ－Ｌ（花王）を用いた。９６穴アッセイプレートの各ウェルにＣＳ－２６汚染布又はＥＭＰＡ１１７汚染布を挿入し、水道水で３０００倍に希釈したアタックゼロ（花王）（９０℃、５時間処理済み）又はモデル洗浄液（２００ｐｐｍ　直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム（１９５－０７６８２、ｗａｋｏ），２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＣｌ水溶液（ｐＨ　７．５））を２００μＬずつ加えた。４ｐｐｍに希釈したアミラーゼ溶液を１０μＬずつ、４ｐｐｍに希釈したプロテアーゼ溶液を１０μＬずつ添加し、シールをして２０℃でキュートミキサーを用いて１２００ｒｐｍ、１５分間振盪した。洗浄終了後、１００μＬの洗浄液を新たな９６穴アッセイプレートに移し、ＣＳ－２６汚染布では４８８ｎｍ、ＥＭＰＡ１１７汚染布では６６０ｎｍの吸光度を測定した。アミラーゼ溶液のかわりにイオン交換水を加えたものをブランクとし、ブランクとの吸光度の差分ΔＡ４８８をアミラーゼ洗浄力として求めた。
　図７にＣＳ－２６汚染布の洗浄力を、図８にＥＭＰＡ１１７汚染布の洗浄力を示す。低温で高い活性を維持するアミラーゼ（ＹＲ２８８、ＹＲ２８８　Ｒ１７８Δ　Ｔ１８０Δ）とプロテアーゼとを含む洗浄組成物は、従来のアミラーゼとプロテアーゼとを含む洗浄組成物と比較して、低温において優れた洗浄力を発揮した。

Claims (12)

  1. 　下記（Ａ）、（Ｂ）、（Ｃ）及び（Ｄ）から選ばれる１種以上のタンパク質を含有する洗浄剤組成物。
    　（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
    　（Ｂ）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
    　（Ｃ）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
    　（Ｄ）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質
  2. 　さらにプロテアーゼ活性を有するタンパク質を含有する、請求項１に記載の洗浄剤組成物。
  3. 　タンパク質が、下記（Ａ′）、（Ｂ′）、（Ｃ′）及び（Ｄ′）から選ばれる一種以上である、請求項１又は２に記載の洗浄剤組成物。
    　（Ａ′）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
    　（Ｂ′）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
    　（Ｃ′）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号６で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
    　（Ｄ′）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号８で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
  4. 　タンパク質が、配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるアミラーゼに対する相対洗浄性能が１以上のタンパク質である、請求項１～３のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
  5. 　プロテアーゼ活性を有するタンパク質が、配列番号４２、４３、４４、４５、４６、４７又は４８で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも７０％の同一性を有し、且つプロテアーゼ活性を有するタンパク質である、請求項２～４のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
  6. 　衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項１～５のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
  7. 　ランドリー用衣料洗浄剤又は手洗い若しくは自動食器洗浄機用の食器洗浄剤である、請求項６に記載の洗浄剤組成物。
  8. 　粉末又は液体である、請求項６又は７に記載の洗浄剤組成物。
  9. 　低温で使用される、請求項６～８のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。
  10. 　５～４０℃の温度で使用される、請求項９に記載の洗浄剤組成物。
  11. 　下記（Ａ′）、（Ｂ′）、（Ｃ′）及び（Ｄ′）から選ばれるタンパク質。
    　（Ａ′）配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
    　（Ｂ′）配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
    　（Ｃ′）配列番号６で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号６で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
    　（Ｄ′）配列番号８で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、且つα－アミラーゼ活性を有するタンパク質であって、配列番号８で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基が欠失したタンパク質
  12. 　配列番号１２で示されるアミノ酸配列からなるアミラーゼに対する相対洗浄性能が１以上である、請求項１１に記載のタンパク質。
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