JP2022060158A - α－アミラーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

【課題】低温下で機能することが可能であり、同時に安定性及び／又は洗浄性能が維持又は向上したα－アミラーゼを提供する。【解決手段】配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体。【選択図】なし

Description

本発明は、α－アミラーゼの変異体に関する。

α－アミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗浄剤への配合適性が知られており、デンプン質の汚れを除去する成分として自動食器洗浄機用の食器洗浄剤や衣料用洗剤等へ配合されている。

洗浄剤用として有用なα－アミラーゼとしては、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ－１３７８（ＦＥＲＭ ＢＰ－３０４８）株由来のα－アミラーゼＡＰ１３７８（特許文献１）、バチルス リケニフォルミス由来のα－アミラーゼであるターマミルやデュラミル（登録商標）の他、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＤＳＭ１２６４９株由来のα－アミラーゼＡＡ５６０（特許文献２）、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＳＰ７２２株由来のα－アミラーゼＳＰ７２２（特許文献３の配列番号４）、サイトファーガ属由来のα－アミラーゼＣｓｐＡｍｙ２（特許文献４）等が知られている。また、これらのα－アミラーゼについては、特定の用途に向けて機能が改善するように改変され、例えば洗剤中における安定性が向上した変異体等が報告されている（特許文献５）。

近年では、環境保護や洗浄コスト軽減の観点から、食器洗浄や洗濯洗浄、特にランドリーでの洗濯洗浄の際の温度を下げることが重要とされ、また洗浄時間の短縮化も望まれている。しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素の至適温度は、低温洗浄において通常設定される温度よりも高く、このため、多くのデンプン質の汚れは完全に除去することが困難となっている。
したがって、低温においても、洗浄性能やデンプン分解活性が保持され、汚れ除去効果が高いα－アミラーゼを見出すことが重要である。

国際公開第９４／２６８８１号 国際公開第００／６００６０号 国際公開第０６／００２６４３号 国際公開第２０１４／１６４７７７号 国際公開第９８／０４４１２６号

本発明は、低温下で機能することが可能であり、同時に安定性及び／又は洗浄性能が維持又は向上したα－アミラーゼを提供することに関する。

本発明者らは、低温下で機能するα－アミラーゼを親として、当該親α－アミラーゼと比して向上した洗浄性能及び／又は安定性を有するα－アミラーゼ変異体を得ることに成功した。

すなわち、本発明は、以下に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体。
２）１）の変異体をコードするポリヌクレオチド。
３）２）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
４）３）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
５）１）の変異体を含む洗浄剤組成物。

本発明によれば、親α－アミラーゼと比して向上した洗浄性能及び／又は安定性を有するα－アミラーゼ変異体を提供することができる。斯かるα－アミラーゼ変異体を用いることにより、低温でも優れたデンプン汚れ除去効果を発揮する洗浄が可能となる。

２アミノ酸欠失変異体の安定性評価。

本明細書において、「アミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．１；α－Ｄ－（１→４）－グルカングルカノヒドロラーゼ）とは、デンプンならびに他の直鎖又は分岐１，４－グリコシドオリゴ糖若しくは多糖類の加水分解を触媒する酵素群を意味する。α－アミラーゼ活性は、デンプンの酵素的分解による還元末端の生成量を測定することによって決定することができる。また、これに限定されず、例えばＰｈａｄｅｂａｓのような色素架橋デンプンの酵素的分解による色素の遊離を測定することによっても決定することができる（Soininen, K., M. Ceska, and H. Adlercreutz. "Comparison between a new chromogenic α-amylase test (Phadebas) and the Wohlgemuth amyloclastic method in urine." Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation 30.3 (1972): 291-297.）。

本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。

本明細書において、アミノ酸の位置及び変異体の記載は、公認されているＩＵＰＡＣの１文字のアミノ酸略記を用いて、以下のように表記される。
所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記される。例えば位置２２６のスレオニンは、「Ｔ２２６」と示される。
アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記される。例えば位置２２６のスレオニンのアラニンへの置換は、「Ｔ２２６Ａ」と示される。
アミノ酸の「欠失」に関しては、[元のアミノ酸、位置、Δ]で表記される。例えば、位置１８１でのセリンの欠失は「Ｓ１８１Δ」と示される。
アミノ酸の「挿入」に関しては、[元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸]で表記される。例えば位置１９５のグリシンの後へのリシンの挿入は、「Ｇ１９５ＧＫ」と示される。複数のアミノ酸の挿入は、［元のアミノ酸、位置、元のアミノ酸、挿入されたアミノ酸１番、挿入されたアミノ酸２番；等］で表記される。例えば、位置１９５のグリシンの後へのリシン及びアラニンの挿入は、「Ｇ１９５ＧＫＡ」と示される。
複数の改変を含む変異体は、加算記号（「＋」）によって表記される。例えば、「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、位置１７０のアルギニンのチロシンへの置換と位置１９５のグリシンのグルタミン酸への置換を表す。
１つの位置で異なる改変を導入可能である場合、異なる改変はスラッシュ（「／」）によって分けられ、例えば、「Ｒ１７０Ｙ／Ｅ」は、位置１７０のアルギニンのチロシン又はグルタミン酸への置換を表す。

本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。

本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。

本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。

＜変異体＞
本発明の変異体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体である。
すなわち、「変異体」は、親α－アミラーゼを構成するアミノ酸において、１又は複数箇所の所定位置のアミノ酸残基が改変されたα－アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。斯かる所定位置のアミノ酸残基が改変は、洗浄性能及び／又は洗剤中での安定性を高めるための改変であり、したがって、当該変異体は、親α－アミラーゼと比して向上した洗浄性能及び／又は安定性を有する。

本発明の変異体において、アミノ酸残基の改変部位（変異位置）は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置である。
ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列は、α－アミラーゼＹＲ２８８を構成するアミノ酸配列であり、本発明の変異体における変異位置は、当該アミノ酸配列のアミノ酸番号に基づいて番号付けされる。
ＹＲ２８８は、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにおいて、ＷＰ＿１００３４６３６２．１として登録されているタンパク質であり、本出願人によって、低温でのデンプン分解活性及び洗浄性能が高いα－アミラーゼとして特定されたタンパク質である（特願２０２０－１２１６２６）。

アミノ酸配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（本発明においては配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。

当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとスレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。

本発明において、「親α－アミラーゼ」とは、本発明の変異体をもたらすために改変が行われる基準α－アミラーゼを意味する。親は、天然（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。

本発明において、親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は、アミノ酸配列において、配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％、好ましくは少なくともは９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有する。
ここで、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼは、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼ（ＹＲ２８８）において、Ｒ１７８及びＴ１８０に対応するアミノ酸残基が欠失した（Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ）α－アミラーゼ変異体である。後述する実施例に示すとおり、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置に相当する位置の２箇所におけるアミノ酸残基の欠失を含む、ＹＲ２８８を親α－アミラーゼとする変異体は、洗剤中での安定性がＹＲ２８８よりも飛躍的に向上される。したがって、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくともは９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置に相当する位置の２箇所以上のアミノ酸残基を欠失させたα－アミラーゼ変異体は、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼを含め、いずれも本発明の変異体の親α－アミラーゼとなり得る。
ここで、２箇所以上のアミノ酸残基を欠失としては、好ましくはＲ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１７９Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１８１Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｇ１８１Δ等が挙げられ、Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δがより好ましい。

配列番号４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるα－アミラーゼとしては、この他に、バチルス フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｆｌｅｘｕｓ）由来のα－アミラーゼであるＤＥ０１７８や、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来のα－アミラーゼであるＲＵ２Ｃなどが挙げられる（特願２０２０－１２１６２６）。

上記所定位置の１又は複数箇所で行われるアミノ酸残基の改変は、アミノ酸残基の置換、挿入及び／又は欠失が挙げられる。ここで、「置換」はある位置にあるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味し、「欠失」はある位置にあるアミノ酸の除去を意味し、「挿入」はある位置にあるアミノ酸に隣接して、直接連続するようアミノ酸を付加することを意味する。

本発明において、変異箇所は１又は複数箇所であり得るが、２個所以上であるのが好ましくは、より好ましくは２～１５箇所、より好ましくは３～１５箇所、より好ましくは５～１０箇所が挙げられる。
なお、当該変異体は、洗浄性能又は安定性向上の点から、配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性を有するα－アミラーゼであるのが好ましい。また、変異体は、上記変異体としての性質を保持する限り、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。

配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置で示される変異箇所のうち、安定性向上の点から、好ましくは、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、の各位置に相当する位置が挙げられる。
このうち、好適な２箇所以上の改変としては、例えば、以下のａ）～ｆ）の改変の組み合わせが挙げられる。
ａ）Ｅ１８７、Ｆ２０５及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
ｂ）Ｅ１８７及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
ｃ）Ｆ２０５及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
ｄ）Ｆ２０５の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
ｅ）Ｈ２４０の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。
ｆ）Ｒ２１１の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変の組み合わせ。

Ｇ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変の好適な態様を以下に示す。
すなわち、Ｇ５は、Ｅ、Ｄ、Ｐ、Ｒ又はＫへの置換（Ｇ５Ｅ／Ｄ／Ｐ／Ｒ／Ｋ）が好ましく；
Ｓ３８は、Ｎへの置換（Ｓ３８Ｎ）が好ましく；
Ｔ４９は、Ｑへの置換（Ｔ４９Ｑ）が好ましく；
Ｑ９６は、Ｒ又はＫへの置換（Ｑ９６Ｒ／Ｋ）が好ましく；
Ｎ１２６は、Ｙへの置換（Ｎ１２６Ｙ）が好ましく；
Ｔ１２９は、Ｉへの置換（Ｔ１２９Ｉ）が好ましく；
Ｇ１４０は、Ｙ、Ｆ又はＷへの置換（Ｇ１４０Ｙ／Ｆ／Ｗ）が好ましく；
Ｆ１５３は、Ｗへの置換（Ｆ１５３Ｗ）が好ましく；
Ｑ１６７は、Ｅへの置換（Ｑ１６７Ｅ）が好ましく；
Ｇ１７９は、Ｄ又はＨへの置換（Ｇ１７９Ｄ／Ｈ）が好ましく；
Ｗ１８６は、Ｌへの置換（Ｗ１８６Ｌ）が好ましく；
Ｅ１８７は、Ｐへの置換（Ｅ１８７Ｐ）が好ましく；
Ｎ１９２は、Ｆへの置換（Ｎ１９２Ｆ）が好ましく；
Ｍ１９９は、Ｌ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｖ又はＩへの置換（Ｍ１９９Ｌ／Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｉ）が好ましく；
Ｙ２００は、Ｇへの置換（Ｙ２００Ｇ）が好ましく；
Ｌ２０３は、Ｙ、Ｍ又はＦへの置換（Ｌ２０３Ｙ／Ｍ／Ｆ）が好ましく；
Ｙ２０５は、Ｆへの置換（Ｙ２０５Ｆ）が好ましく；
Ｄ２０６は、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｔ又はＧへの置換（Ｄ２０６Ｒ／Ｅ／Ｎ／Ｔ／Ｇ）が好ましく；
Ｒ２１１は、Ｌ、Ｖ又はＩへの置換（Ｒ２１１Ｌ／Ｖ／Ｉ）が好ましく；
Ｋ２１５は、Ｆへの置換（Ｋ２１５Ｆ）が好ましく；
Ｈ２４０は、Ｆへの置換（Ｈ２４０Ｆ）が好ましく；
Ｓ２４１は、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｙ、Ｐ、Ｈへの置換（Ｓ２４１Ａ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｐ／Ｈ）が好ましく；
Ｙ２４２は、Ｆへの置換（Ｙ２４２Ｆ）が好ましく；
Ｇ２４４は、Ｋ、Ｗ、Ｌ又はＲへの置換（Ｇ２４４Ｋ／Ｗ／Ｌ／Ｒ）が好ましく；
Ｅ２５７は、Ｔへの置換（Ｅ２５７Ｔ）が好ましく；
Ｆ２５９は、Ｗへの置換（Ｆ２５９Ｗ）が好ましく；
Ｋ２７８は、Ｌ、Ｄ、Ｗ、Ｉ、Ｈ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、Ｖ、Ａ、Ｙ又はＦへの置換（Ｋ２７８Ｌ／Ｄ／Ｗ／Ｉ／Ｈ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ａ／Ｙ／Ｆ）が好ましく；
Ｈ２８３は、Ｑへの置換（Ｈ２８３Ｑ）が好ましく；
Ｓ２８４は、Ｗへの置換（Ｓ２８４Ｗ）が好ましく；
Ａ２８８は、Ｆへの置換（Ａ２８８Ｆ）が好ましく；
Ｈ２９５は、Ｙへの置換（Ｈ２９５Ｙ）が好ましく；
Ｙ２９６は、Ａへの置換（Ｙ２９６Ａ）が好ましく；
Ｎ３０３は、Ｒ、Ｅ、Ｓ、Ｇ、Ｖ、Ｄ、Ｔ又はＡへの置換（Ｎ３０３Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ｇ／Ｖ／Ｄ／Ｔ／Ａ）が好ましく；
Ｔ３２０は、Ｄ又はＥへの置換（Ｔ３２０Ｄ／Ｅ）が好ましく；
Ｓ３３１は、Ｔへの置換（Ｓ３３１Ｔ）が好ましく；
Ｌ３４８は、Ｉへの置換（Ｌ３４８Ｉ）が好ましく；
Ｙ３６０は、Ｃ、Ｍ、Ｌ又はＶへの置換（Ｙ３６０Ｃ／Ｍ／Ｌ／Ｖ）が好ましく；
Ｗ４０８位はＰへの置換（Ｗ４０８Ｐ）が好ましく；
Ｌ４２９は、Ｖへの置換（Ｌ４２９Ｖ）が好ましく；
Ｖ４３０は、Ｍへの置換（Ｖ４３０Ｍ）が好ましく；
Ｇ４３３は、Ｇの後へＳの挿入（Ｇ４３３ＧＳ）が好ましく；
Ａ４３４は、Ｖへの置換（Ａ４３４Ｖ）が好ましく；
Ｗ４３９は、Ｒへの置換（Ｗ４３９Ｒ）が好ましく；
Ｎ４７１は、Ｔへの置換（Ｎ４７１Ｔ）が好ましく；
Ｇ４７６は、Ａ、Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｆ、Ｒ又はＫへの置換（Ｇ４７６Ａ／Ｐ／Ｅ／Ｓ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）が好ましく；
Ｇ４７７は、Ｅへの置換（Ｇ４７７Ｅ）が好ましい。

次に、洗浄性能の向上に寄与する好適な変異の組み合わせを、下記表１－１～１－４に示す。したがって、当該組み合わせ変異を少なくとも有する変異体は、洗浄性能の向上に特に寄与する変異体である。

次に、安定性の向上に寄与する好適な変異の組み合わせを、下記表２－１～２－４に示す。したがって、当該組み合わせ変異を少なくとも有する変異体は、安定性の向上に特に寄与する変異体である。また、表１－１～１－４の組み合わせ変異と、表２－１～２－４の組み合わせ変異を組み合わせた変異も、洗浄性能及び安定性の向上を図る点から好ましい。

次に、洗浄性能及び安定性の向上に寄与する好適な変異の組み合わせを、下記表３に示す。したがって、当該組み合わせ変異を少なくとも有する変異体は、洗浄性能及び安定性の向上に特に寄与する変異体である。

＜本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド＞
本発明の変異体は、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して製造することができる。例えば、その基準アミノ酸配列をコードする親α－アミラーゼ遺伝子（基準α－アミラーゼ遺伝子）内の改変対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、改変後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子から変異体を発現させることにより、製造することができる。

本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。

本発明において、親α－アミラーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親α－アミラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。

親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。

親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。

親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したα－アミラーゼを産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親α－アミラーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼをコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号３に、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼ（ＹＲ２８８）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号１に示した。

変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。

当該本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。

＜ベクター又はＤＮＡ断片＞
得られた本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。

上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド（すなわち変異体遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。なお、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。

上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列等が挙げられる。

あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。

上記本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。

＜形質転換細胞＞
本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。

宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられる。

宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。

あるいは、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。

斯くして得られた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明の変異体が生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。

あるいは、本発明の変異体は、無細胞翻訳系を使用して本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。

上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明の変異体は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で本発明のα－アミラーゼ変異体をコードする遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたタンパク質は細胞外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。

斯くして得られる本発明の変異体は、親α－アミラーゼと比して向上した洗浄性能及び／又は安定性を有する。
ここで、「向上した洗浄性能」とは、親α－アミラーゼと比して向上した洗浄効果、例えば汚れの除去を洗濯又は洗浄工程においてもたらす能力を意味する。
洗浄性能は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、所定の大きさに裁断した汚染布を９６穴アッセイプレートのウェルに挿入し、洗剤溶液及び酵素溶液を添加して所定の条件で洗浄処理する。洗浄終了後の洗浄液について４８８ｎｍの吸光度を測定し、ブランクとの差分ΔＡ４８８を洗浄力として求める。変異体のΔＡ４８８を親α－アミラーゼのΔＡ４８８で割ることで相対洗浄力を求めることができる。

また、「向上した安定性」とは、親α－アミラーゼと比して向上した、洗浄剤存在下におけるα－アミラーゼ活性の維持能力を意味する。
安定性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、洗剤に酵素溶液を添加して、所定時間処理した後にα－アミラーゼ活性を測定し、当該処理による単位時間（ｈ）当たりの失活速度を算出して半減期（ｈ）を計算する。変異体の半減期（ｈ）を親α－アミラーゼの半減期（ｈ）で割ることで相対安定性を求めることができる。

本発明の変異体は、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に低温洗浄に適した洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。
ここで、「低温」としては、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下が挙げられ、また５℃以上、１０℃以上、１５℃以上が挙げられる。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃が挙げられる。

洗浄剤組成物中への本発明の変異体の配合量は、当該タンパク質が活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは５０ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また１～５０００ｍｇであるのが好ましく、１０～１０００ｍｇであるのがより好ましく、５０～５００ｍｇであるのがより好ましい。

洗浄剤組成物は、本発明の変異体以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明のタンパク質とは異なるアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
プロテアーゼとしては市販のＡｌｃａｌａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ｋａｎｎａｓｅ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｕｎｏ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標；ＢＡＳＦ社）、またＫＡＰ（花王）、等が挙げられる。
セルラーゼとしてはＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０－３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。
アミラーゼとしてはＴｅｒｍａｍｙｌ、Ｄｕｒａｍｙｌ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ Ｐｌｕｓ、Ａｍｐｌｉｆｙ Ｐｒｉｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、またＫＡＭ（花王）、等が挙げられる。
リパーゼとしてはＬｉｐｏｌａｓｅ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標；ノボザイムズ社）等が挙げられる。

洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。

（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５～６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０～４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０～９０質量％配合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。

洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。

陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８～２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、内部オレフィンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、α－スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０～１４の、より好ましくは１２～１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキレン鎖の炭素数が１２～２０の、より好ましくは１６～１８の内部オレフィンスルホンから選ばれる一種以上の陰イオン性界面活性剤が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。内部オレフィンスルホン酸は例えばＷＯ２０１７/０９８６３７を参照することができる。

非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４～２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５～１５．０、好ましくは１１．０～１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。

（２）二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は０．０１～５０質量％、好ましくは５～４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１～１０μｍ、特に０．１～５μｍのものが好適に使用される。

（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１～８０質量％、好ましくは１～４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。

（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千～１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。

（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１～１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１～１０質量％配合することができる。

（６）蛍光剤
洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１～２質量％配合するのが好ましい。

（７）その他の成分
洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル[商品名]、安息香酸など）、その他の添加剤を含有させることができる。

洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明のタンパク質及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。

斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられ、より好ましくはランドリー用衣料洗浄剤（ランドリー用洗濯洗剤）、手洗いによる食器洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤が挙げられる。
また、当該洗浄剤組成物は、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での使用に適する。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での使用に適する。

上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、α―アミラーゼ変異体。
２）前記Ｇ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変が、それぞれＧ５Ｅ／Ｄ／Ｐ／Ｒ／Ｋ、Ｓ３８Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｑ９６Ｒ／Ｋ、Ｎ１２６Ｙ、Ｔ１２９Ｉ、Ｇ１４０Ｙ／Ｆ／Ｗ、Ｆ１５３Ｗ、Ｑ１６７Ｅ、Ｇ１７９Ｄ／Ｈ、Ｗ１８６Ｌ、Ｅ１８７Ｐ、Ｎ１９２Ｆ、Ｍ１９９Ｌ／Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｉ、Ｙ２００Ｇ、Ｌ２０３Ｙ／Ｍ／Ｆ、Ｙ２０５Ｆ、Ｄ２０６Ｒ／Ｅ／Ｎ／Ｔ／Ｇ、Ｒ２１１Ｖ／Ｌ／Ｉ、Ｋ２１５Ｆ、Ｈ２４０Ｆ、Ｓ２４１Ａ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｐ／Ｈ、Ｙ２４２Ｆ、Ｇ２４４Ｋ／Ｗ／Ｌ／Ｒ、Ｅ２５７Ｔ、Ｆ２５９Ｗ、Ｋ２７８Ｌ／Ｄ／Ｗ／Ｉ／Ｈ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ａ／Ｙ／Ｆ、Ｈ２８３Ｑ、Ｓ２８４Ｗ、Ａ２８８Ｆ、Ｈ２９５Ｙ、Ｙ２９６Ａ、Ｎ３０３Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ｇ／Ｖ／Ｄ／Ｔ／Ａ、Ｔ３２０Ｄ／Ｅ、Ｓ３３１Ｔ、Ｌ３４８Ｉ、Ｙ３６０Ｃ／Ｍ／Ｌ／Ｖ、Ｗ４０８Ｐ、Ｌ４２９Ｖ、Ｖ４３０Ｍ、Ｇ４３３ＧＳ、Ａ４３４Ｖ、Ｗ４３９Ｒ、Ｎ４７１Ｔ、Ｇ４７６Ａ／Ｐ／Ｅ／Ｓ／Ｆ／Ｒ／Ｋ及びＧ４７７Ｅである、１）の変異体。
３）アミノ酸残基の改変が２箇所以上の改変である、１）又は２）の変異体。
４）前記アミノ酸残基の改変がＮ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変である、１）の変異体。
５）前記Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変が、それぞれＮ１２６Ｙ、Ｅ１８７Ｐ、Ｎ１９２Ｆ、Ｆ２０５Ｙ、Ｒ２１１Ｉ、Ｈ２４０Ｆ、Ｓ２４１Ｑ及びＹ２４２Ｆである、４）の変異体。
６）アミノ酸残基の改変が２箇所以上の改変である、４）又は５）の変異体。
７）Ｅ１８７、Ｆ２０５及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、１）又は２）の変異体。
８）Ｅ１８７及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、１）又は２）の変異体。
９）Ｆ２０５及びＨ２４０の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、１）又は２）の変異体。
１０）Ｆ２０５の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｒ２１１、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、１）又は２）の変異体。
１１）Ｈ２４０の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｒ２１１、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、１）又は２）の変異体。
１２）Ｒ２１１の位置に相当するアミノ酸残基における改変と、Ｎ１２６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｆ２０５、Ｈ２４０、Ｓ２４１及びＹ２４２の各位置に相当するアミノ酸残基から選択される少なくとも１つ以上のアミノ酸残基における改変とを含む、１）又は２）の変異体。
１３）親α－アミラーゼが、配列番号２で示されるアミノ酸配列においてＲ１７８及びＧ１７９におけるアミノ酸残基が欠失したα－アミラーゼ変異体である、１）又は２）の変異体。
１４）変異体が、前記表１－１～１－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、１）、２）又は１３）の変異体。
１５）変異体が、前記表２－１～２－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、１）、２）又は１３）の変異体。
１６）変異体が、前記表１－１～１－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異と、前記表２－１～２－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異とを含む、１）、２）又は１３）の変異体。
１７）変異体が、前記表３で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、１）、２）又は１３）の変異体。
１８）１）～１７）のいずれかに記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
１９）１８）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
２０）１９）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
２１）微生物である、２０）の形質転換細胞。
２２）１）～１７）の変異体を含む洗浄剤組成物。
２３）衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、２２）の洗浄剤組成物。
２４）粉末又は液体である、２３）の洗浄剤組成物。
２５）低温で使用される、２２）～２４）のいずれかの洗浄剤組成物。
２６）５～４０℃の温度で使用される、２５）の洗浄剤組成物。

（１）ＹＲ２８８変異体発現プラスミドの構築
下記の実施例に記載のＹＲ２８８変異体の構築方法を記す。５’末端にリバースプライマーとの相補配列を１５塩基有し変異配列を含むフォワードプライマー、及び変異配列の直前の塩基を５’末端とするリバースプライマーを変異導入用プライマー対として用いた。特願２０２０－１２１６２６の実施例に記載のＹＲ２８８発現プラスミドｐＨＹ－ＹＲ２８８又は本実施例にて作成したＹＲ２８８変異体発現プラスミドを鋳型として、変異導入用プライマー対を使用してＰＣＲを行った。複数断片を連結する場合、それぞれのＰＣＲ産物を用いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。ＰＣＲ産物又はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を枯草菌にプロトプラスト法により形質転換して目的のＹＲ２８８変異体発現プラスミドを保持する形質転換体を取得した。

（２）酵素生産培養
１５ｐｐｍテトラサイクリンを添加したＬＢ培地３００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに（１）で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、３０℃、２１０ｒｐｍで一晩培養した。翌日、培養液６μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）１００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに植菌し、３０℃、２１０ｒｐｍで２日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収し酵素溶液とした。

（３）培養上清のタンパク質濃度測定
培養上清のタンパク質濃度測定にはプロテインアッセイラピッドキット ワコーII（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いた。アミラーゼ発現カセットを持たないｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）導入株の培養上清のタンパク質濃度をブランクとすることで培養上清中のアミラーゼの濃度を算出した。

（４）活性測定
非還元末端を保護したエチリデン－パラニトロフェニル－α－Ｄ－マルトヘプタオシド（Ｅｔ－Ｇ７－ｐＮＰ）を基質として用いた。Ｅｔ－Ｇ７－ｐＮＰに対するα－アミラーゼの作用により生成するマルトオリゴ糖－ｐＮＰにα－グルコシダーゼを作用させてｐＮＰを遊離させ、ｐＮＰ生成に伴う吸光度の増加速度を測定することでα－アミラーゼ活性を求めることができる。Ｅｔ－Ｇ７－ｐＮＰとα－グルコシダーゼを含むα－アミラーゼ活性測定試薬であるＡＭＹ－ＥＬ（セロテック）のＲＩ液とＲＩＩ液を２：１で混合したものを基質溶液として用いた。基質溶液１００μＬと適宣希釈した酵素サンプル１０μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを活性値とした。

（５）１７８－１８１位における２アミノ酸欠失変異体の安定性評価
実施例（１）に記載の方法によりＹＲ２８８（配列番号２）を親ポリペプチドとして図１に記載の変異体を構築した。イオン交換水で１０％（ｖ／ｖ）に希釈した市販の液体衣料用洗剤（花王株式会社、アタック３Ｘ）に酵素溶液を添加し、５０℃で１５分間インキュベートした後に活性測定を行った。５０℃処理後のサンプルの活性値を５０℃処理前のサンプルの活性値で割り１００をかけることで残存活性（％）を算出した。Ｒ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０、Ｇ１８１のうち任意の２残基を欠失させることで安定性が大きく向上した（図１）。

（６）洗浄力評価
直径５．５ｍｍの円形に裁断したＣＳ－２６汚染布をＣＦＴ社から入手して使用した。９６穴アッセイプレートの各ウェルにＣＳ－２６円形汚染布を２枚ずつ挿入し、水道水で３０００倍に希釈した市販の液体衣料用洗剤（花王株式会社、アタックゼロ）を２００μＬずつ加えた。水道水で３ｐｐｍに希釈した酵素溶液を１０μＬずつ添加し、シールをして２０℃でキュートミキサーを用いて１２００ｒｐｍ、１５分間振盪した。洗浄終了後、１００μＬの洗浄液を新たな９６穴アッセイプレートに移し、４８８ｎｍの吸光度を測定した。酵素溶液のかわりに水道水を加えたものをブランクとし、ブランクとの差分ΔＡ４８８を洗浄力として求めた。各変異体のΔＡ４８８を親ポリペプチドのΔＡ４８８で割ることで相対洗浄力を求めた。

（７）安定性評価
イオン交換水で１０％（ｖ／ｖ）に希釈した市販の液体衣料用洗剤（花王株式会社、アタック３Ｘ又は花王株式会社、アタックゼロ）に酵素溶液を添加し、５０℃で３０分間～１８時間インキュベートした後に活性測定を行った。５０℃処理前のサンプルの活性値を初発活性として、５０℃処理による単位時間（ｈ）当たりの失活速度を算出し、そこから半減期（ｈ）を計算した。各変異体の半減期（ｈ）を親ポリペプチドの半減期（ｈ）で割ることで相対安定性を求めた。

（８）変異スクリーニング
実施例（１）に記載の方法によりＹＲ２８８ Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして様々な変異体を構築した。実施例（６）及び（７）に記載の方法によって変異体の性能を評価した。相対洗浄力及び／又は相対安定性が１．１以上である場合に性能が向上したとみなした。以下の変異体では性能が向上した。

Ｇ５Ｅ、Ｇ５Ｄ、Ｇ５Ｐ、Ｇ５Ｒ、Ｇ５Ｋ、Ｓ３８Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｑ９６Ｒ、Ｑ９６Ｋ、Ｎ１２６Ｙ、Ｔ１２９Ｉ、Ｇ１４０Ｙ、Ｇ１４０Ｆ、Ｇ１４０Ｗ、Ｆ１５３Ｗ、Ｑ１６７Ｅ、Ｇ１７９Ｄ、Ｇ１７９Ｈ、Ｗ１８６Ｌ、Ｅ１８７Ｐ、Ｎ１９２Ｆ、Ｍ１９９Ｌ、Ｍ１９９Ｔ、Ｍ１９９Ａ、Ｍ１９９Ｎ、Ｍ１９９Ｑ、Ｍ１９９Ｓ、Ｍ１９９Ｖ、Ｍ１９９Ｉ、Ｙ２００Ｇ、Ｌ２０３Ｙ、Ｌ２０３Ｍ、Ｌ２０３Ｆ、Ｙ２０５Ｆ、Ｄ２０６Ｒ、Ｄ２０６Ｅ、Ｄ２０６Ｎ、Ｄ２０６Ｔ、Ｄ２０６Ｇ、Ｒ２１１Ｖ、Ｒ２１１Ｌ、Ｒ２１１Ｉ、Ｋ２１５Ｆ、Ｈ２４０Ｆ、Ｓ２４１Ａ、Ｓ２４１Ｑ、Ｓ２４１Ｄ、Ｙ２４２Ｆ、Ｇ２４４Ｋ、Ｇ２４４Ｗ、Ｇ２４４Ｌ、Ｇ２４４Ｒ、Ｅ２５７Ｔ、Ｆ２５９Ｗ、Ｈ２８３Ｑ、Ｓ２８４Ｗ、Ａ２８８Ｆ、Ｈ２９５Ｙ、Ｙ２９６Ａ、Ｎ３０３Ｒ、Ｎ３０３Ｅ、Ｎ３０３Ｓ、Ｎ３０３Ｇ、Ｎ３０３Ｖ、Ｎ３０３Ｄ、Ｎ３０３Ｔ、Ｎ３０３Ａ、Ｔ３２０Ｄ、Ｔ３２０Ｅ、Ｓ３３１Ｔ、Ｌ３４８Ｉ、Ｙ３６０Ｃ、Ｙ３６０Ｍ、Ｙ３６０Ｌ、Ｙ３６０Ｖ、Ｗ４０８Ｐ、Ｌ４２９Ｖ、Ｖ４３０Ｍ、Ｇ４３３ＧＳ、Ａ４３４Ｖ、Ｗ４３９Ｒ、Ｎ４７１Ｔ、Ｇ４７６Ａ、Ｇ４７６Ｐ、Ｇ４７６Ｅ、Ｇ４７６Ｓ、Ｇ４７６Ｆ、Ｇ４７６Ｒ、Ｇ４７６Ｋ、Ｇ４７７Ｅ

（９）多重変異体の洗浄力評価
実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８ Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして実施例（８）で得られた変異を２つ以上含む様々な変異体を構築した。実施例（６）に記載の方法によって変異体の洗浄力を評価した。以下にその結果を示す。

（１０）多重変異体の安定性評価
実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８ Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして実施例（８）で得られた変異を２つ以上含む様々な変異体を構築した。実施例（７）に記載の方法によって変異体の安定性を評価した。以下にその結果を示す。

実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８ Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして様々な変異体を構築した。実施例（７）に記載の方法によって変異体の安定性を評価した。以下にその結果を示す。

（１１）多重変異体の洗浄力及び安定性の評価
実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８ Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号４）を親ポリペプチドとして実施例（９）で得られた多重変異及び実施例（１０）で得られた多重変異を含む様々な変異体を構築した。実施例（６）及び（７）に記載の方法によって変異体の性能を評価した。以下にその結果を示す。

（１２）多重変異体の洗浄力及び安定性の評価
実施例（１）に記載の方法により、ＹＲ２８８ Ｒ１７８Δ+Ｇ１７９Δを親ポリペプチドとして下記の変異体を構築した。実施例（６）及び（７）に記載の方法によって変異体の性能を評価した。以下にその結果を示す。

Claims (15)

1. 配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置の１又は複数箇所のアミノ酸残基の改変を含む、親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号４で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体。
2. 前記Ｇ５、Ｓ３８、Ｔ４９、Ｑ９６、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｇ１４０、Ｆ１５３、Ｑ１６７、Ｇ１７９、Ｗ１８６、Ｅ１８７、Ｎ１９２、Ｍ１９９、Ｙ２００、Ｌ２０３、Ｙ２０５、Ｄ２０６、Ｒ２１１、Ｋ２１５、Ｈ２４０、Ｓ２４１、Ｙ２４２、Ｇ２４４、Ｅ２５７、Ｆ２５９、Ｋ２７８、Ｈ２８３、Ｓ２８４、Ａ２８８、Ｈ２９５、Ｙ２９６、Ｎ３０３、Ｔ３２０、Ｓ３３１、Ｌ３４８、Ｙ３６０、Ｗ４０８、Ｌ４２９、Ｖ４３０、Ｇ４３３、Ａ４３４、Ｗ４３９、Ｎ４７１、Ｇ４７６及びＧ４７７の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の改変が、それぞれＧ５Ｅ／Ｄ／Ｐ／Ｒ／Ｋ、Ｓ３８Ｎ、Ｔ４９Ｑ、Ｑ９６Ｒ／Ｋ、Ｎ１２６Ｙ、Ｔ１２９Ｉ、Ｇ１４０Ｙ／Ｆ／Ｗ、Ｆ１５３Ｗ、Ｑ１６７Ｅ、Ｇ１７９Ｄ／Ｈ、Ｗ１８６Ｌ、Ｅ１８７Ｐ、Ｎ１９２Ｆ、Ｍ１９９Ｌ／Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｉ、Ｙ２００Ｇ、Ｌ２０３Ｙ／Ｍ／Ｆ、Ｙ２０５Ｆ、Ｄ２０６Ｒ／Ｅ／Ｎ／Ｔ／Ｇ、Ｒ２１１Ｖ／Ｌ／Ｉ、Ｋ２１５Ｆ、Ｈ２４０Ｆ、Ｓ２４１Ａ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｐ／Ｈ、Ｙ２４２Ｆ、Ｇ２４４Ｋ／Ｗ／Ｌ／Ｒ、Ｅ２５７Ｔ、Ｆ２５９Ｗ、Ｋ２７８Ｌ／Ｄ／Ｗ／Ｉ／Ｈ／Ｓ／Ｔ／Ｎ／Ｑ／Ｖ／Ａ／Ｙ／Ｆ、Ｈ２８３Ｑ、Ｓ２８４Ｗ、Ａ２８８Ｆ、Ｈ２９５Ｙ、Ｙ２９６Ａ、Ｎ３０３Ｒ／Ｅ／Ｓ／Ｇ／Ｖ／Ｄ／Ｔ／Ａ、Ｔ３２０Ｄ／Ｅ、Ｓ３３１Ｔ、Ｌ３４８Ｉ、Ｙ３６０Ｃ／Ｍ／Ｌ／Ｖ、Ｗ４０８Ｐ、Ｌ４２９Ｖ、Ｖ４３０Ｍ、Ｇ４３３ＧＳ、Ａ４３４Ｖ、Ｗ４３９Ｒ、Ｎ４７１Ｔ、Ｇ４７６Ａ／Ｐ／Ｅ／Ｓ／Ｆ／Ｒ／Ｋ及びＧ４７７Ｅである、請求項１に記載の変異体。
3. アミノ酸残基の改変が２箇所以上の改変である、請求項１又は２に記載の変異体。
4. 変異体が、下記表１－１～１－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、請求項１又は２に記載の変異体。
   

   

   
5. 変異体が、下記表２－１～２－４で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、請求項１又は２に記載の変異体。
   

   

   
6. 変異体が、下記表３で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、請求項１又は２に記載の変異体。
   

   
7. 請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
8. 請求項７に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
9. 請求項８に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
10. 微生物である、請求項９に記載の形質転換細胞。
11. 請求項１～６のいずれか１項に記載の変異体を含む洗浄剤組成物。
12. 衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項１１に記載の洗浄剤組成物。
13. 粉末又は液体である、請求項１２に記載の洗浄剤組成物。
14. 低温で使用される、請求項１２又は１３に記載の洗浄剤組成物。
15. ５～４０℃の温度で使用される、請求項１４に記載の洗浄剤組成物。

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