WO2024024527A1 - 変異プロテアーゼ - Google Patents

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WO2024024527A1
WO2024024527A1 PCT/JP2023/025933 JP2023025933W WO2024024527A1 WO 2024024527 A1 WO2024024527 A1 WO 2024024527A1 JP 2023025933 W JP2023025933 W JP 2023025933W WO 2024024527 A1 WO2024024527 A1 WO 2024024527A1
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amino acid
seq
acid residue
arg
lys
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貴大 日置
早紀 高比良
彰人 川原
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花王株式会社
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    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione

Definitions

  • the present invention relates to mutant proteases.
  • proteases The purpose of incorporating protease into detergents is to promote the removal of protein stains derived from food, grime, sweat, etc. that adhere to clothing, tableware, etc. by decomposing them. Since the pH of detergents is generally on the alkaline side, proteases having an optimum pH on the alkaline side have been developed as proteases for detergents.
  • Patent Document 1 discloses a protease with a molecular weight of about 43,000 that has cleaning properties against complex stains containing a mixture of proteins and lipids.
  • Patent Documents 2 to 5 disclose mutant proteases obtained by introducing mutations that improve the protease's cleaning performance, stability in liquid detergents, solubility in liquid detergents, or stability under acidic conditions. has been done.
  • Patent Document 1 International Publication No. 99/18218 (Patent Document 2) JP 2008-212084 (Patent Document 3) JP 2010-273672 (Patent Document 4) JP 2013-233141 ( Patent document 5) Japanese Patent Application Publication No. 2020-145938
  • the present invention consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto, and has at least one amino acid residue selected from the group consisting of (a) to (g) below.
  • mutant protease (a) Arg or Lys at the position corresponding to position 191 of SEQ ID NO: 1; (b) Arg or Lys at the position corresponding to position 17 of SEQ ID NO: 1; (c) Ala or Phe at the position corresponding to position 141 of SEQ ID NO: 1; (d) Arg or Lys at the position corresponding to position 243 of SEQ ID NO: 1; (e) Arg or Lys at the position corresponding to position 300 of SEQ ID NO: 1; (f) Arg or Lys at the position corresponding to position 302 of SEQ ID NO: 1; (g) Arg or Lys at the position corresponding to position 311 of SEQ ID NO: 1; I will provide a.
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding the mutant protease.
  • the present invention also provides a vector containing the polynucleotide.
  • the present invention also provides a recombinant Bacillus bacterium containing the polynucleotide or the vector.
  • the present invention also provides a method for producing a mutant protease using the recombinant Bacillus bacterium.
  • the present invention also provides a detergent composition containing the mutant protease.
  • the present invention provides at least one protease selected from the group consisting of the following (A) to (G) for a parent protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto.
  • a method for producing a mutant protease including carrying out a mutation: (A) Substitution of the amino acid residue at position 191 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (B) Substitution of the amino acid residue at position 17 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding to this with Arg or Lys; (C) Substitution of the amino acid residue at position 141 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Ala or Phe; (D) Substitution of the amino acid residue at position 243 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (E) Substitution of the amino acid residue at position 300 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (F) Substitution of the amino acid residue at position 302 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (G) substitution of the amino acid residue at position 311 of SEQ ID NO: 1 or
  • the present invention provides a parent protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto, with at least one selected from the group consisting of (A) to (G).
  • a method for improving the cleaning performance against protein stains in a detergent solution with a high concentration of protease which method includes performing mutations.
  • amino acid residue refers to the 20 types of amino acid residues that make up proteins, alanine (Ala or A), arginine (Arg or R), asparagine (Asn or N), aspartic acid (Asp or D), cysteine (Cys or C), glutamine (Gln or Q), glutamic acid (Glu or E), glycine (Gly or G), histidine (His or H), isoleucine (Ile or I), leucine (Leu or L ), lysine (Lys or K), methionine (Met or M), phenylalanine (Phe or F), proline (Pro or P), serine (Ser or S), threonine (Thr or T), tryptophan (Trp or W) , tyrosine (Tyr or Y) and valine (Val or V).
  • amino acid sequences or nucleotide sequences refers to 90% or more, preferably 95% or more, more preferably 96% or more, even more preferably 97% or more, and even more preferably 98% or more. % or more, more preferably 99% or more.
  • nucleotide sequences and amino acid sequences are calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, it is calculated by performing an analysis using a search homology program of genetic information processing software Genetyx-Win with Unit size to compare (ktup) set to 2.
  • an amino acid sequence in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted, or added is preferably 1 or more and 10 or less, more preferably 1 or more and 5 or less, and even more preferably Examples include amino acid sequences in which one to three amino acids are deleted, inserted, substituted, or added.
  • a nucleotide sequence in which one or several nucleotides are deleted, inserted, substituted, or added preferably includes 1 to 30 nucleotides, more preferably 1 to 15 nucleotides, and Preferred examples include nucleotide sequences in which one to ten nucleotides are deleted, inserted, substituted, or added.
  • addition of amino acids or nucleotides includes addition of one or several amino acids or nucleotides to one or both ends of a sequence.
  • a "corresponding position" on an amino acid sequence or a nucleotide sequence is defined as aligning a target sequence and a reference sequence (e.g., the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1) to give maximum homology. It can be determined by Alignment of amino acid or nucleotide sequences can be performed using known algorithms and procedures are known to those skilled in the art. For example, alignment can be performed using the Clustal W multiple alignment program (Thompson, J.D. et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22:4673-4680) with default settings. Alternatively, Clustal W2 or Clustal omega, which are revised versions of Clustal W, can also be used.
  • Clustal W, Clustal W2 and Clustal omega are available on the Clustal website [www. clustal. org], the European Bioinformatics Institute (EBI [www.ebi.ac.uk/index.html]), or the DNA Data Bank of Japan (DDBJ [www.ddbj.nig]) operated by the National Institute of Genetics. .ac.jp]) website.
  • a position of the target sequence aligned to an arbitrary position of the reference sequence by the above-mentioned alignment is considered to be a "corresponding position" to the arbitrary position.
  • amino acid sequence alignment can further fine-tune the amino acid sequence alignment obtained above to optimize it.
  • Such optimal alignment is preferably determined by taking into consideration the similarity of amino acid sequences, the frequency of inserted gaps, and the like.
  • Amino acid sequence similarity here refers to the ratio (%) of the number of positions where identical or similar amino acid residues exist in both sequences to the total number of amino acid residues when two amino acid sequences are aligned.
  • Similar amino acid residues refer to amino acid residues that have similar properties to each other in terms of polarity and charge among the 20 types of amino acids that make up proteins, and that cause so-called conservative substitutions.
  • Such groups of similar amino acid residues are well known to those skilled in the art and are, for example, arginine and lysine or glutamine; glutamic acid and aspartic acid or glutamine; serine and threonine or alanine; glutamine and asparagine or arginine; leucine. and isoleucine, but are not limited to these.
  • the position of an amino acid residue in the target amino acid sequence that is aligned to a position corresponding to an arbitrary position in the reference sequence by the above alignment is considered to be a "corresponding position" to that arbitrary position; the amino acid residue at the position.
  • the "parent" polypeptide of a mutant polypeptide refers to a polypeptide that becomes the mutant polypeptide by making a predetermined mutation in its amino acid residues. In other words, a "parent” polypeptide is the polypeptide before the polypeptide variant is mutated.
  • the "parent" polynucleotide of a mutant polynucleotide refers to a polynucleotide that becomes the mutant polynucleotide when a predetermined mutation is made to its nucleotides. In other words, a "parent" polynucleotide is the polynucleotide before the mutant polynucleotide is mutated.
  • operable linkage between a control region such as a promoter and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region. means. Procedures for "operably linking" genes and control regions are well known to those skilled in the art.
  • upstream and downstream with respect to a gene refer to upstream and downstream of the gene in the direction of transcription.
  • a gene located downstream of a promoter means that the gene is located on the 3' side of the promoter in the DNA sense strand
  • upstream of the gene means that the gene is located on the 5' side of the promoter in the DNA sense strand. means the area on the side.
  • the term "inherent” used with respect to the function, property, or trait of a cell is used to indicate that the function, property, or trait originally exists in the cell.
  • the term “foreign” is used to describe a function, property, or trait that is not native to the cell but is introduced from outside.
  • a “foreign" gene or polynucleotide is a gene or polynucleotide that is introduced into a cell from outside.
  • the foreign gene or polynucleotide may be derived from the same type of organism as the cell into which it is introduced, or may be derived from a different type of organism (ie, a heterologous gene or polynucleotide).
  • the present invention relates to providing a mutant protease with improved cleaning performance against protein stains in a highly concentrated detergent solution.
  • undiluted liquid detergent is applied directly to the stain without diluting it with water.
  • Applying a liquid detergent containing protease is considered to be effective for stains containing protein, such as food spills and stains on collars and sleeves.
  • the undiluted solution of liquid detergent has a high concentration of detergent components such as surfactants, which creates harsh conditions for proteases. It is desired to improve the cleaning performance of proteases in solutions containing highly concentrated cleaning components, such as liquid detergent concentrates.
  • the present inventor has discovered that a mutant protease derived from protease KP43 (see Patent Document 1) with a molecular weight of 43,000 has improved cleaning performance against protein stains (hereinafter also simply referred to as cleaning performance) even in the undiluted solution of liquid detergent. I found out.
  • the mutant protease of the present invention has improved cleaning performance against protein stains in a highly concentrated detergent solution (for example, a liquid detergent stock solution).
  • the mutant protease of the present invention is effective as a protease used in cleaning with a high concentration detergent solution, such as cleaning by coating or cleaning by soaking.
  • the mutant protease of the present invention is effective as a protease to be added to a detergent for cleaning dirt by bringing the liquid detergent stock solution or high concentration detergent solution into direct contact with the dirt.
  • the mutant protease of the present invention has at least one selected from the group consisting of (A) to (G) below, relative to the parent protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto.
  • a mutant protease with one mutation (A) Substitution of the amino acid residue at position 191 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys, preferably Arg; (B) substitution of the amino acid residue at position 17 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys, preferably Arg; (C) substitution of the amino acid residue at position 141 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Ala or Phe, preferably Ala; (D) substitution of the amino acid residue at position 243 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys, preferably Lys; (E) substitution of the amino acid residue at position 300 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys, preferably Lys; (F) substitution of the amino acid residue at position 302 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys, preferably Arg; (G) Substitution of
  • the mutant protease of the present invention has the mutation (A) described above with respect to the parent protease.
  • the mutant protease of the present invention has the mutation (A) above and at least one mutation selected from the group consisting of (B) to (G) above, relative to the parent protease.
  • the mutant protease of the present invention has at least one mutation selected from the group consisting of the mutation (A) and the mutations (B) and (D) with respect to the parent protease. have In another embodiment, the mutant protease of the present invention has the mutation (A) and any one mutation selected from (B) and (D), relative to the parent protease.
  • the mutation (A) is a substitution of the amino acid residue at position 191 or a position corresponding thereto with Arg
  • the mutation (B) is a substitution of an amino acid residue at position 17 or a position corresponding thereto.
  • the mutation (D) is a substitution of an amino acid residue at position 243 or a position corresponding thereto with Lys.
  • the mutant protease of the present invention has the following mutation (H) in addition to at least one mutation selected from the group consisting of (A) to (G): (H) Substitution of the amino acid residue at position 82 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Gln.
  • the mutant protease of the present invention has the above mutation (A) and the above mutation (H).
  • the mutation (A) is a substitution of the amino acid residue at position 191 or a position corresponding thereto with Arg.
  • the mutant protease of the present invention may have at least one mutation selected from the group consisting of (B) to (G) above.
  • the mutant protease of the present invention has the mutation (E) and the mutation (F) relative to the parent protease.
  • the mutation (E) and (F) above the cleaning performance of the mutant protease of the present invention in a high concentration detergent solution is further improved.
  • the mutation (E) is a substitution of an amino acid residue at position 300 or a position corresponding to this with Lys
  • the mutation (F) is a substitution of an amino acid residue at position 302 or a position corresponding to this. Substitution of a group to Arg.
  • Examples of the parent protease of the mutant protease of the present invention include a protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, and a protease consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • proteases consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 include 95% or more identity, more preferably 96% or more identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1; More preferably, proteases have an identity of 97% or more, still more preferably 98% or more, and even more preferably 99% or more.
  • Another example of a protease consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is one in which one or several amino acids are deleted, inserted, substituted or Examples include proteases consisting of added amino acid sequences.
  • the protease consisting of an amino acid sequence having at least 90% identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, which is used as a parent protease in the present invention, may be a mutant protease derived from the protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid residue at position 30 of SEQ ID NO: 1 is aspartic acid
  • the amino acid residue at position 68 is histidine
  • the amino acid residue at position 255 is preferably aspartic acid.
  • the amino acid residue at the corresponding position is serine.
  • the parent protease has the amino acid residues listed in Table 1(ii) at positions corresponding to the positions listed in Table 1(i) below in SEQ ID NO:1.
  • Patent Document 1 The amino acid residues shown in Table 1 are highly conserved among protease KP43 (Patent Document 1), which is the origin of the parent protease, and mutant proteases derived therefrom (Saeki et al., Journal of bioscience and Bioengineering, 2007, 103:501-508).
  • the parent protease of the mutant of the present invention is a polypeptide that has proteolytic activity on the alkaline side (preferably at pH 8 or higher).
  • the parent protease is a polypeptide having an optimum pH on the alkaline side (preferably pH 8 or higher).
  • the parent protease has any of the following enzymatic properties possessed by the protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (see Patent Document 1): 1) has oxidant resistance, and has an alkaline side ( It works at pH 8 or higher) and is stable.
  • having oxidant resistance means that the remaining activity after leaving the protease in a 50mM hydrogen peroxide (containing 5mM calcium chloride) solution (20mM Britton-Robinson buffer, pH 10) at 20°C for 20 minutes ( (synthetic substrate method) is at least 50%; 2) shows a residual activity of 80% or more when treated at 50°C and pH 10 for 10 minutes; 3) diisopropylfluorophosphate (DFP) and phenylmethanesulfonyl Activity is inhibited by fluoride (PMSF); 4) Molecular weight by SDS-PAGE is 43,000 ⁇ 2,000. More preferably, the parent protease has all of the enzymatic properties 1) to 4) above.
  • the mutant protease of the present invention is produced by making at least one mutation selected from the group consisting of (A) to (G) of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to the amino acid sequence of the parent protease. Can be done.
  • the mutant protease of the present invention has the mutation (H) in addition to at least one mutation selected from the group consisting of (A) to (G) with respect to the amino acid sequence of the parent protease. It can be manufactured by applying
  • the mutant protease of the present invention has at least one amino acid residue selected from the group consisting of the following amino acid residues (a) to (g): (a) Arg or Lys at the position corresponding to position 191 of SEQ ID NO: 1, preferably Arg; (b) Arg or Lys at the position corresponding to position 17 of SEQ ID NO: 1, preferably Arg; (c) Ala or Phe, preferably Ala, at the position corresponding to position 141 of SEQ ID NO: 1; (d) Arg or Lys, preferably Lys, at the position corresponding to position 243 of SEQ ID NO: 1; (e) Arg or Lys, preferably Lys, at the position corresponding to position 300 of SEQ ID NO: 1; (f) Arg or Lys at the position corresponding to position 302 of SEQ ID NO: 1, preferably Arg; (g) Arg or Lys at the position corresponding to position 311 of SEQ ID NO: 1, preferably Arg.
  • the mutant protea amino acid residue
  • the mutant protease of the present invention has the above amino acid residue (a).
  • the mutant protease of the present invention has the amino acid residue (a) above and at least one amino acid residue selected from the group consisting of (b) to (g) above.
  • the mutant protease of the present invention has the amino acid residue (a) above and at least one amino acid residue selected from the group consisting of (b) and (d) above. In another embodiment, the mutant protease of the present invention has the amino acid residue of (a) above and any one of the amino acid residues of (b) and (d).
  • the (a) amino acid residue is Arg
  • the (b) amino acid residue is Arg
  • the (d) amino acid residue is Lys.
  • the mutant protease of the present invention has the following amino acid residue (h) in addition to at least one amino acid residue selected from the group consisting of (a) to (g): (h) Gln at a position corresponding to position 82 of SEQ ID NO:1.
  • the mutant protease of the present invention has the amino acid residues (a) and (h) above.
  • the amino acid residue (a) is Arg.
  • the mutant protease of the present invention may have at least one amino acid residue selected from the group consisting of (b) to (g) above.
  • the mutant protease of the present invention has the amino acid residues (e) and (f) above.
  • the (e) amino acid residue is Lys and the (f) amino acid residue is Arg.
  • the mutant protease of the present invention is a mutant protease that has improved cleaning performance against protein stains in a detergent solution containing a high concentration of surfactant (so-called high concentration detergent solution). More specifically, the mutant protease of the present invention can exhibit higher cleaning performance than the protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in a highly concentrated detergent solution. Preferably, the mutant protease of the present invention can exhibit higher cleaning performance than the protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in a concentrated liquid detergent stock solution.
  • the mutant protease of the present invention is at least equivalent to, or higher than, the protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 in a detergent solution diluted with water to the extent normally used for washing (so-called normal detergent solution). It can demonstrate the cleaning performance of Therefore, the mutant protease of the present invention can be used as an enzyme for detergents, and in particular, can be used as an enzyme for detergents for use in cleaning with a highly concentrated detergent solution (for example, application cleaning or soaking cleaning).
  • the mutant protease of the present invention is effective as a protease to be incorporated into a concentrated liquid detergent for cleaning dirt by directly applying the undiluted solution or a highly concentrated detergent solution to the dirt.
  • the mutant protease of the present invention is effective as a protease to be added to a concentrated liquid detergent for cleaning dirt by immersing the same in its stock solution or a highly concentrated detergent solution.
  • protein stains include, for example, stains caused by foods containing proteins, body-derived components containing proteins (for example, blood, urine, grime, sweat, sebum, etc.). More specific examples of “protein stains” include spilled food on clothing, stains on collars and sleeves, and the like.
  • detergent liquid includes a liquid detergent stock solution and an aqueous detergent solution obtained by diluting a liquid detergent or a solid detergent (for example, a powdered detergent) with water.
  • high concentration detergent solution refers to a detergent solution containing a surfactant at a high concentration, preferably 10% by mass or more, more preferably 20% by mass or more, for example 10% by mass or more, and more preferably 20% by mass or more, for example It refers to a detergent liquid containing up to 90% by mass, preferably 20 to 90% by mass, more preferably 20 to 75% by mass.
  • highly concentrated detergent solutions include concentrated liquid detergent stock solutions or aqueous solutions containing the same at high concentrations.
  • concentrated liquid detergent refers to a liquid containing 40% by mass or more of a surfactant, preferably 40 to 90% by mass, more preferably 45 to 90% by mass, even more preferably 50 to 75% by mass.
  • a surfactant preferably 40 to 90% by mass, more preferably 45 to 90% by mass, even more preferably 50 to 75% by mass.
  • Examples of the "concentrated liquid detergent” include liquid detergents for clothing whose standard usage amount per 30 L of water in a water tank type washing machine is indicated as 7 to 13 g or less.
  • cleaning with a highly concentrated detergent solution refers to directly contacting a highly concentrated detergent solution with stains on the object to be cleaned (for example, cloth and hard surfaces such as tableware and cooking utensils), as necessary.
  • a cleaning method in which the object to be cleaned is washed with water after being left for a predetermined period of time or washed.
  • cleaning with a high concentration detergent solution include coating cleaning and soaking cleaning.
  • Application cleaning refers to a cleaning method in which a highly concentrated detergent solution is directly applied to the dirt to be cleaned, left for a predetermined period of time or washed as necessary, and then washed with water.
  • Soak cleaning refers to a cleaning method in which the dirt to be cleaned is immersed in a highly concentrated detergent solution, left for a predetermined period of time as needed, or washed in the highly concentrated detergent solution, and then washed with water. say. Therefore, in cleaning with the high concentration detergent liquid, the means for bringing the high concentration detergent liquid into direct contact with the stain to be cleaned include applying the high concentration detergent liquid to the stain (for example, by roll-on, spraying, dripping, etc.), Examples include immersing dirt in the highly concentrated detergent solution.
  • the mutant protease of the present invention can maintain higher cleaning performance than the parent protease in the aforementioned high-concentration detergent solution.
  • the protease may have a mutation (eg, deletion, substitution, addition, or insertion) at any other position.
  • the mutation may be naturally occurring or artificially introduced.
  • the mutant protease of the present invention has the same amino acid residues at least at positions 30, 68, and 255 of SEQ ID NO: 1 as the parent protease. More preferably, in the mutant protease of the present invention, the amino acid residues at the positions corresponding to the positions listed in Table 1(i) in SEQ ID NO: 1 are the same as in the parent protease.
  • mutagenesis techniques known in the art can be used as means for mutating the amino acid residues of the parent protease.
  • a polynucleotide that encodes the amino acid sequence of a parent protease hereinafter also referred to as a parent polynucleotide
  • a nucleotide sequence that encodes an amino acid residue to be mutated is mutated into a nucleotide sequence that encodes the amino acid residue after the mutation.
  • the desired mutant protease can be obtained.
  • Introduction of a desired mutation into a parent polynucleotide is basically based on PCR amplification using the parent polynucleotide as a template DNA or a replication reaction using various DNA polymerases, and various site-specific mutations well known to those skilled in the art. This can be done using the introductory method.
  • the site-specific mutagenesis method can be performed by any method such as, for example, inverse PCR method or annealing method (edited by Muramatsu et al., "Revised 4th edition New Genetic Engineering Handbook", Yodosha, p. 82-88). .
  • Various commercially available site-directed mutagenesis kits can also be used.
  • Site-directed mutation introduction into a parent polynucleotide can most commonly be performed using a mutation primer containing the nucleotide mutation to be introduced.
  • the mutation primer anneals to a region of a parent polynucleotide containing a nucleotide sequence encoding an amino acid residue to be mutated, and replaces the nucleotide sequence (codon) encoding the amino acid residue to be mutated with the mutation primer. It may be designed to include a nucleotide sequence having a nucleotide sequence (codon) encoding an amino acid residue.
  • nucleotide sequences encoding the amino acid residues before and after mutation based on standard textbooks and the like.
  • site-directed mutagenesis can be performed by splicing by overlap extension (SOE), which amplifies DNA fragments on the upstream and downstream sides of the mutation site using two complementary primers containing the nucleotide mutation to be introduced, respectively.
  • SOE overlap extension
  • a method of linking together by PCR Horton et al, Gene, 1989, 77(1): p61-68
  • Horton et al, Gene, 1989, 77(1): p61-68 can also be used.
  • DNA containing the parent polynucleotide can be prepared by chemically synthesizing the corresponding nucleotide sequence based on the amino acid sequence of the parent protease.
  • DNA containing the parent polynucleotide can be extracted from a microbial strain harboring it by known means.
  • the mutation primer can be produced by a well-known oligonucleotide synthesis method such as the phosphoramidite method (Nucleic Acids Research, 1989, 17:7059-7071). Such primer synthesis can also be carried out using, for example, a commercially available oligonucleotide synthesizer (manufactured by ABI, etc.).
  • a polynucleotide encoding a mutant protease into which the desired mutation has been introduced is obtained by performing site-directed mutagenesis as described above using a primer set containing the mutation primer and using the parent polynucleotide as a template DNA. be able to.
  • the present invention also provides mutant protease genes.
  • the mutant protease gene of the present invention is a polynucleotide encoding the mutant protease of the present invention.
  • the polynucleotide of the invention may include single-stranded or double-stranded DNA, cDNA, RNA or other artificial nucleic acids.
  • the DNA, cDNA and RNA may be chemically synthesized.
  • the polynucleotide of the present invention may include an untranslated region (UTR) nucleotide sequence in addition to the open reading frame (ORF).
  • UTR untranslated region
  • the present invention also provides a vector containing a polynucleotide encoding the mutant protease of the present invention.
  • the vector can be constructed by inserting and ligating the polynucleotide of the present invention into any vector by a conventional method.
  • the type of the vector is not particularly limited, and it may be any vector such as a plasmid, phage, phagemid, cosmid, virus, YAC vector, or shuttle vector.
  • the vector is preferably, but not limited to, a vector that can be amplified in bacteria, particularly bacteria of the genus Bacillus, and more preferably an expression vector that can induce expression of a transgene in bacteria of the genus Bacillus. .
  • shuttle vectors which are vectors that can be replicated in both Bacillus bacteria and other organisms, can be suitably used for recombinant production of the mutant protease of the present invention.
  • preferred vectors include, but are not limited to, pHA3040SP64 (Japanese Patent Application Publication No. 2013-233141), pHSP64R or pASP64 (Patent No. 3492935), pHA64, pHY300PLK (capable of transforming both Escherichia coli and Bacillus subtilis).
  • Expression vectors Ishikawa and Shibahara, Jpn J Genet, 1985, 60: 235-243), pAC3 (Moriyama et al, Nucleic Acids Res, 1988, 16: 8732), etc. shuttle vector; pUB110 (Gryczan et al, J Bacteriol, 1978, 134: 318-329) and pTA10607 (Bron et al., Plasmid, 1987, 18: 8-15), which can be used for transformation of Bacillus bacteria; Examples include vectors (Yamane et al., "Fusion proteins using Bacillus subtilis secreted vectors," Starch Science, 34. (1987), 163-170). Furthermore, plasmids derived from E. coli (eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.) can also be used.
  • E. coli eg, p
  • the vector is preferably an expression vector.
  • Expression vectors contain various elements essential for expression in host organisms such as transcription promoters, terminators, and ribosome binding sites; cis elements such as polylinkers and enhancers; polyA addition signals; ribosome binding sequences (SD sequences); and drugs (e.g. ampicillin). , neomycin, kanamycin, tetracycline, chloramphenicol, etc.), a selection marker gene, such as a resistance gene, and the like, may optionally be included.
  • the present invention also provides a transformant comprising a polynucleotide encoding the mutant protease of the present invention or a vector containing the polynucleotide.
  • the transformant can be produced by introducing a polynucleotide encoding the mutant protease of the present invention or a vector (preferably a recombinant expression vector) containing the polynucleotide into a host. Therefore, the transformant contains a foreign polynucleotide encoding the mutant protease of the invention.
  • the host for the transformant examples include bacteria such as Escherichia coli and Bacillus subtilis, microorganisms such as yeast cells, as well as any cells such as insect cells, animal cells (e.g., mammalian cells), and plant cells.
  • the host is preferably a bacterium of the genus Bacillus, more preferably Bacillus subtilis or a mutant strain thereof. Therefore, the transformant of the present invention is preferably a recombinant Bacillus bacterium, more preferably a recombinant Bacillus subtilis or a mutant strain thereof.
  • transformation methods applicable to Bacillus bacteria include competent cell transformation method (J Bacteriol, 1967, 93: 1925-1937) and electroporation method (FEMS Microbiol Lett, 1990, 55: 135-138).
  • the protoplast transformation method Mol Gen Genet, 1979, 168: 111-115
  • the Tris-PEG method J Bacteriol, 1983, 156: 1130-1134
  • the mutant protease of the present invention can be produced by culturing the transformant of the present invention. Therefore, the present invention also provides a method for producing a mutant protease using the transformant of the present invention. Cultivation of the transformant for production of mutant protease can be carried out according to methods common to those skilled in the art.
  • a medium for culturing transformants based on a microbial host such as Escherichia coli or yeast cells contains carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, etc. that can be assimilated by the microbial host to efficiently culture transformants. Any medium that can be used can be used.
  • the medium may be either a natural medium or a synthetic medium.
  • LB medium, 2 ⁇ YT medium, 2 ⁇ L-maltose medium, CSL fermentation medium, etc. can be used for culturing Bacillus subtilis transformants for producing recombinant proteins.
  • a drug corresponding to the type of drug resistance gene (selectable marker gene) introduced into the transformant may be added to the medium.
  • an inducer may be added to the medium as necessary.
  • IAA indole acetic acid
  • the mutant protease of the present invention may be expressed from a polynucleotide encoding the mutant protease of the present invention or a transcription product thereof using a cell-free translation system.
  • Cell-free translation system is an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which reagents such as amino acids necessary for protein translation are added to a suspension obtained by mechanically disrupting host cells. It is composed of
  • the mutant protease of the present invention produced in the transformant or cell-free translation system can be purified by conventional methods used for protein purification, such as centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc.
  • a culture solution e.g., a cell disruption solution, a reaction solution of a cell-free translation system, etc.
  • a solution such as a culture supernatant or a lysate supernatant that has been separated or concentrated using centrifugation or an ultrafiltration type filter can be used as is as a crude enzyme solution. If the expressed mutant protease is not secreted from within the cell, the protein may be isolated and purified after disrupting the cell.
  • DNA extraction used in the present invention mRNA preparation, cDNA production, PCR, RT-PCR, library production, ligation into a vector, cell transformation, DNA base sequence determination, nucleic acid chemical synthesis, protein Procedures such as N-terminal amino acid sequencing, mutagenesis, protein extraction, etc. can be performed by methods described in standard laboratory textbooks. Examples of such experimental books include, for example, Sambrook et al., Molecular Cloning, A laboratory manual, 2001, 3rd Ed. , Sambrook, J. & Russell, DW. Cold Spring Harbor Laboratory Press can be mentioned.
  • the mutant protease obtained by the production method of the present invention has improved cleaning performance in a high concentration detergent solution compared to the parent protease, and is suitable for cleaning with a high concentration detergent solution (for example, application cleaning or soaking cleaning). It is useful as a protease in detergents. Therefore, another aspect of the present invention provides a protease comprising making at least one mutation selected from the group consisting of (A) to (G) to the amino acid sequence of the parent protease as described above. This can be a method for improving the cleaning performance against protein stains in a high concentration detergent solution.
  • the mutant protease of the present invention is useful as an enzyme for detergents, and is particularly suitable as an enzyme to be incorporated into detergents for cleaning with high concentration detergent solutions (for example, cleaning by application or cleaning by soaking). Accordingly, the invention also provides detergent compositions containing the mutant proteases of the invention.
  • the detergent composition may be a solid (eg powder) detergent composition, but is preferably a liquid detergent composition, more preferably a concentrated liquid detergent composition. Further, the detergent composition is preferably a detergent composition for application cleaning or soaking cleaning, and more preferably a detergent composition for application cleaning.
  • the content of the mutant protease of the present invention in the detergent composition of the present invention is not particularly limited as long as the protease exhibits activity, but is preferably 0.1 to 25,000 U per kg of the detergent composition, and 0.1 to 5,000 U per kg of the detergent composition. More preferably, 0.1 to 2500U is even more preferable.
  • the protease activity (U) in this specification is measured by the following method: 1/15M phosphate buffer (e.g.
  • 1 unit (U) of enzyme is defined as the amount that produces 1 ⁇ mol of p-nitroaniline per minute in the above reaction.
  • the detergent composition of the present invention contains a surfactant and water in addition to the mutant protease of the present invention.
  • the surfactant any surfactant such as nonionic surfactant, anionic surfactant, cationic surfactant, and amphoteric surfactant can be used alone or in combination of two or more. be able to.
  • the content of the surfactant in the detergent composition of the present invention is preferably 10 to 90% by mass, more preferably 10 to 80% by mass, and even more preferably 30 to 75% by mass.
  • the content of the surfactant in the detergent composition is preferably 40 to 90% by mass, more preferably 45 to 90% by mass, and even more preferably 50 to 75% by mass. Mass%.
  • nonionic surfactants include nonionic surfactants that have a C8 to C22 hydrocarbon group and have several moles or more of C2 oxyalkylene groups added to them, and are generally blended in liquid detergents.
  • R 1 O-(AO)m/(Gly)n-H and/or R 2 -COO-(AO)p/(Gly)q-H
  • R 1 C8-C22 hydrocarbon group
  • R 2 C7- C21 hydrocarbon group
  • AO C2-C3 oxyalkylene group
  • Gly glycerol group
  • m 0 to 5
  • n 2 to 10
  • p 0 to 5
  • q 2 to 10
  • AO and Gly are random or block combination
  • anionic surfactants include carboxylate type anionic surfactants, sulfonic acid type or sulfate ester type anionic surfactants, non-soap type anionic surfactants, linear alkylbenzenesulfonic acids, benzenesulfonic acids, and their like.
  • polyoxybenzenesulfonic acid or its salt polyoxyethylene alkyl sulfate ester salt, polyoxyalkylene alkyl ether sulfate ester salt, ⁇ -olefin sulfonate, alkylbenzene sulfonate, ⁇ -sulfo fatty acid salt, fatty acid soap, phosphorus
  • acid ester salt surfactants include acid ester salt surfactants, acylalaninates, acyl taurates, alkyl ether carboxylic acids, alcohol sulfuric esters, and the like.
  • cationic surfactants include quaternary ammonium salts having a long-chain alkyl group, tertiary amines having one long-chain alkyl group, alkyltrimethylammonium salts, dialkyldimethylammonium salts, alkylpyridinium salts, and the like.
  • Preferred examples include quaternary ammonium surfactants having one long chain alkyl group having 8 to 22 carbon atoms and tertiary amines having one long chain alkyl group having 8 to 22 carbon atoms.
  • Examples of the zwitterionic activator include alkyl acetate betaine, alkanolamide propyl acetate betaine, alkylimidazoline, alkylalanine, etc., alkyl betaine type, alkylamidobetaine type, imidazoline type, alkylaminosulfone type, alkylaminocarboxylic acid type, and alkyl amide.
  • Examples include carboxylic acid type, amide amino acid type or phosphoric acid type amphoteric surfactants.
  • Preferred examples include sulfobetaine or carbobetaine having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms.
  • the detergent composition of the present invention may further contain ingredients commonly used in detergent compositions, such as water-soluble polymers, water-miscible organic solvents, alkaline agents, organic acids or salts thereof, chelating agents, and other than the mutant protease of the present invention.
  • ingredients commonly used in detergent compositions such as water-soluble polymers, water-miscible organic solvents, alkaline agents, organic acids or salts thereof, chelating agents, and other than the mutant protease of the present invention.
  • the water-soluble polymer includes, for example, (i) a polyether chain portion comprising a polymerized unit derived from an epoxide having 2 to 5 carbon atoms, and (ii) one or more types selected from acrylic acid, methacrylic acid, and maleic acid. It has a polymer chain portion composed of polymerized units derived from unsaturated carboxylic acid monomers, and has a graft structure in which either (i) or (ii) is the main chain and the other is a branch chain.
  • a water-soluble polymer having an alkylene terephthalate unit and/or an alkylene isophthalate unit, and an oxyalkylene unit and/or a polyoxyalkylene unit Japanese Unexamined Patent Publication No. 2009-155606.
  • the content of the water-soluble polymer in the detergent composition of the present invention is preferably 0.2 to 10% by mass, more preferably 0.4 to 5% by mass.
  • water-miscible organic solvents include alkylene glycols of alkanols, glycerin, polyalkylene glycols, (poly)alkylene glycol (mono- or di)alkyl ethers, alkylglyceryl ethers, and aromatic aromas of (poly)alkylene glycols.
  • group ethers Preferred are alkylene glycols having 2 to 6 carbon atoms such as ethylene glycol, propylene glycol, butylene glycol, or hexylene glycol, glycerin, polyethylene glycol monophenyl ether, ethylene glycol monobenzyl ether, diethylene glycol monobenzyl ether, and the like.
  • the content of the water-miscible organic solvent in the detergent composition of the present invention is preferably 1 to 40% by weight, more preferably 1 to 35% by weight.
  • alkaline agents include alkanolamines having 1 to 3 C2-C4 alkanols, such as monoethanolamine, diethanolamine, triethanolamine, polyoxyalkyleneamine, and dimethylaminopropylamine. Monoethanolamine and triethanolamine are preferred.
  • the content of the alkaline agent in the detergent composition of the present invention is preferably 0 to 20% by mass, more preferably 0 to 10% by mass.
  • organic acids or salts thereof include saturated fatty acids, succinic acid, maleic acid, fumaric acid, and polyhydric carboxylic acids such as salts thereof; citric acid, malic acid, glycolic acid, p-hydroxybenzoic acid, and benzoic acid. or hydroxycarboxylic acids such as salts thereof, among which citric acid or a salt thereof is preferred.
  • the content of the organic acid or its salt in the detergent composition of the present invention is preferably 0 to 5% by mass, more preferably 0 to 3% by mass.
  • a chelating agent is a compound that can form a coordination bond with a metal ion.
  • the chelating agent added to the detergent composition has the effect of sequestering metal ions, such as calcium ions and magnesium ions, which adversely affect cleaning, in washing water or dirt.
  • Examples of chelating agents that may be included in the detergent compositions of the present invention include nitrilotriacetic acid, iminodiacetic acid, ethylenediamineacetic acid, diethylenetriaminepentaacetic acid, glycol etherdiaminetetraacetic acid, hydroxyethyliminodiacetic acid, triethylenetetraaminehexaacetic acid.
  • aminopolyacetic acids such as diencholic acid or their salts, diglycolic acid, oxydisuccinic acid, carboxymethyloxysuccinic acid, citric acid, lactic acid, tartaric acid, oxalic acid, malic acid, oxydisuccinic acid, gluconic acid, carboxymethylsuccinic acid, carboxylic acid
  • Organic acids such as methyltartaric acid or their salts, aminotri(methylenephosphonic acid), 1-hydroxyethylidene-1,1-diphosphonic acid, ethylenediaminetetra(methylenephosphonic acid), diethylenetriaminepenta(methylenephosphonic acid), and alkalis thereof Examples include metal or lower amine salts.
  • the content of the chelating agent in the detergent composition of the present invention is preferably 0.1 to 5% by mass, more preferably 0.1 to 4% by mass.
  • anti-restaining agents and dispersants examples include polyacrylic acid, polymaleic acid, carboxymethyl cellulose, polyethylene glycol having a weight average molecular weight of 5000 or more, maleic anhydride-diisobutylene copolymer, maleic anhydride-methyl vinyl ether copolymer, Maleic anhydride-vinyl acetate copolymer, naphthalene sulfonate formalin condensate, and claims 1 to 21 of JP-A-59-62614 (page 1, column 3, line 5 to page 3, column 4, line 14) Mention may be made of anti-resoiling agents and dispersants such as polymers.
  • the content of the re-staining prevention agent and dispersant in the detergent composition of the present invention is preferably 0.01 to 10% by mass, respectively.
  • color transfer inhibitor examples include polyvinylpyrrolidone, and the content is preferably 0.01 to 10% by mass.
  • the detergent composition contains a bleaching agent such as hydrogen peroxide, percarbonate, or perborate in an amount of 1 to 10% by mass.
  • a bleaching agent such as hydrogen peroxide, percarbonate, or perborate
  • the detergent composition should contain 0.01 to 10% by mass of a bleaching activator such as tetraacetylethylenediamine (TAED) or the one described in JP-A-6-316700. Can be done.
  • TAED tetraacetylethylenediamine
  • the fluorescent agent examples include biphenyl type fluorescent agents (Tinopal CBS-X, etc.) and stilbene type fluorescent agents (DM type fluorescent dye, etc.).
  • the content of the fluorescent agent in the detergent composition of the present invention is preferably 0.001 to 2% by mass.
  • enzymes other than the mutant protease of the present invention include other proteases, cellulases, ⁇ -glucanases, hemicellulases, lipases, peroxidases, laccases, ⁇ -amylases, glucoamylases, cutinases, pectinases, reductases, oxidases, and phenols.
  • oxidase Hydrolysis of oxidase, ligninase, pullulanase, pectate lyase, xyloglucanase, xylanase, pectin acetyl esterase, polygalacturonase, rhamnogalacturonase, pectin lyase, mannanase, pectin methylesterase, cellobiohydrolase, transglutaminase, etc. Included are enzymes, as well as mixtures of two or more thereof.
  • enzyme stabilizers include boron compounds, calcium ion sources (calcium ion supply compounds), hydroxy compounds, formic acid, etc.; examples of antioxidants include butylated hydroxytoluene, distyrenated cresol, sodium sulfite, and sodium bisulfite.
  • solubilizing agent include paratoluenesulfonic acid, cumenesulfonic acid, metaxylenesulfonic acid, and benzoate (also effective as a preservative).
  • the detergent composition of the present invention includes paraffins such as octane, decane, dodecane, and tridecane, olefins such as decene and dodecene, alkyl halides such as methylene chloride, 1,1,1-trichloroethane, and D-limonene. It may contain water-immiscible organic solvents such as terpenes such as, pigments, fragrances, antibacterial preservatives, antifoaming agents such as silica, BR>R, etc.
  • Preferred examples of detergent compositions in which the mutant protease of the present invention can be blended include liquid detergent compositions described in JP2017-008303A and liquid detergent compositions described in JP2013-129729A. compositions.
  • the detergent composition of the present invention can be prepared by blending the mutant protease of the present invention into these detergent compositions.
  • the detergent composition of the present invention include, but are not limited to, detergent compositions for cleaning clothing or fabric products (e.g., sheets, curtains, carpets, wall cloths, etc.), and detergent compositions for kitchen use (e.g., tableware). or for cooking utensils).
  • the detergent composition according to the present invention is a detergent composition for cleaning with a high concentration detergent liquid, more preferably a detergent composition for application cleaning or soaking cleaning, and still more preferably a detergent composition for application cleaning. It is a detergent composition for.
  • the present invention also includes the following substances, manufacturing methods, uses, methods, etc. as exemplary embodiments. However, the present invention is not limited to these embodiments.
  • the mutant protease according to [1] which preferably has the amino acid residue of (a) and at least one amino acid residue selected from the group consisting of (b) to (g).
  • the mutant protease according to [1] preferably having the amino acid residue (e) above and the amino acid residue (f) above.
  • the mutant protease according to [1] preferably having at least one amino acid residue selected from the group consisting of the above (a) to (g) and the following amino acid residue (h): (h) Gln at a position corresponding to position 82 of SEQ ID NO:1.
  • the mutant protease according to [4] which preferably has the amino acid residue of (a) above and the amino acid residue of (h) above.
  • [6] A polynucleotide encoding the mutant protease according to any one of [1] to [5].
  • [7] A vector containing the polynucleotide described in [6].
  • [8] A recombinant Bacillus bacterium comprising the polynucleotide according to [6] or the vector according to [7].
  • [9] A method for producing a mutant protease using the recombinant Bacillus bacterium described in [8].
  • the method according to [9] which comprises culturing the recombinant Bacillus bacterium.
  • [11] A detergent composition containing the mutant protease according to any one of [1] to [5].
  • a detergent composition for cleaning with a high concentration detergent liquid more preferably a detergent composition for application cleaning or soaking cleaning, and still more preferably a detergent composition for application cleaning.
  • At least one mutation selected from the group consisting of (A) to (G) below is added to the parent protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto.
  • a method for producing a mutant protease comprising: (A) Substitution of the amino acid residue at position 191 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (B) Substitution of the amino acid residue at position 17 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding to this with Arg or Lys; (C) Substitution of the amino acid residue at position 141 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Ala or Phe; (D) Substitution of the amino acid residue at position 243 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (E) Substitution of the amino acid residue at position 300 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (F) Substitution of the amino acid residue at position 302 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (G) Substitution of the amino acid residue at position 311 of SEQ ID NO: 1 or a position
  • At least one mutation selected from the group consisting of (A) to (G) below is added to the parent protease consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 or an amino acid sequence having at least 90% identity thereto.
  • a method for improving cleaning performance against protein stains in a detergent solution with a high concentration of protease including applying: (A) Substitution of the amino acid residue at position 191 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (B) Substitution of the amino acid residue at position 17 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding to this with Arg or Lys; (C) Substitution of the amino acid residue at position 141 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Ala or Phe; (D) Substitution of the amino acid residue at position 243 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Arg or Lys; (E) Substitution of the amino acid residue at position 300 of SEQ ID NO: 1 or a position a
  • the parent protease comprises the mutation (A) and at least one mutation selected from the group consisting of (B) to (G); [14] The method described. [16] The method according to [13] or [14], which preferably comprises subjecting the parent protease to the mutation (E) and the mutation (F). [17] Preferably, the parent protease comprises at least one mutation selected from the group consisting of (A) to (G) and the following mutation (H), [13] or [14] Method of description: (H) Substitution of the amino acid residue at position 82 of SEQ ID NO: 1 or a position corresponding thereto with Gln.
  • Example 1 Production of mutant protease
  • the wild type KP43 protease expression plasmid pHA64TSA described in Reference Example 1 of Patent Document 5 contains a tetracycline resistance gene and a promoter region derived from the alkaline cellulase K-64 gene of Bacillus sp. KSM-64 strain. Contains the full-length coding sequence of wild-type KP43 protease linked to.
  • pHA64TSA as a template, site-specific mutations were repeatedly introduced into the KP43 protease gene by PCR using a pair of complementary primers (see Nucleic Acids Research, 2004, 32 (14): e115).
  • a plasmid expressing protease number 1 was constructed.
  • the protease of SEQ ID NO: 1 T311R, N302R, Y300K, N243K, S191R, Y17R, Plasmids expressing mutant proteases having D141A, D141F, Y17R/S191R, S191R/N243K, Y300K/N302R, E82Q/S191R, or S191F were created.
  • mutant proteases expressed from these plasmids are referred to as T311R, N302R, Y300K, N243K, S191R, Y17R, D141A, D141F, Y17R/S191R, S191R/N243K, Y300K/N302R, E82Q/S191R, and S191F, respectively.
  • a host bacterium Bacillus sp. KSM9865 strain (FERM P-18566), was transformed using the prepared plasmid expressing the parent enzyme or mutant protease. Transformation was performed using the electroporation method, and the transformed cells were placed on an alkaline agar medium containing skim milk [1% skim milk (Difco), 1% Bactotryptone (Difco), 0.5% yeast extract (Difco), 1% sodium chloride, 1.5% agar, 0.05% sodium carbonate, 15 ppm tetracycline; % is (w/v)%] and cultured at 30°C for several days.
  • skim milk 1% skim milk (Difco), 1% Bactotryptone (Difco), 0.5% yeast extract (Difco), 1% sodium chloride, 1.5% agar, 0.05% sodium carbonate, 15 ppm tetracycline; % is (w/v)%
  • transformants into which the protease gene had been introduced.
  • the obtained transformants were transferred to 5 mL of seed medium [6.0% polypeptone S, 0.05% yeast extract, 1.0% maltose, 0.02% magnesium sulfate heptahydrate, 0.1% phosphoric acid dihydrate. Potassium hydrogen, 0.25% sodium carbonate, 30 ppm tetracycline; % is (w/v)%] and cultured with shaking at 30°C for 16 hours.
  • Example 2 Evaluation of application detergency of mutant protease
  • a commercially available concentrated liquid detergent (Attack ZERO Regular; Kao Corporation) was heated in a microwave oven to deactivate the enzyme in the product.
  • the culture supernatant containing each mutant protease obtained in Example 1 was added so that the protein concentration was 0.1 g/L, and the mixture was thoroughly stirred to prepare a liquid detergent composition containing mutant proteases. (Test composition) was prepared.
  • Test composition a liquid detergent composition containing the parent enzyme (control composition) was prepared using a similar procedure.
  • the brightness (L value) of the contaminated cloth before and after application and cleaning, and the original contaminated cloth prepared separately, was measured using a spectrophotometer cm-700d (Konica Minolta), and the cleaning of the contaminated cloth was performed using the following formula. The rate was calculated. Cleaning rate (%) (L 2 - L 1 )/(L 0 - L 1 ) ⁇ 100 (L 0 : L value of the original contaminated cloth, L 1 : L value of the contaminated cloth before cleaning, L 2 : L value of the contaminated cloth after cleaning).
  • the relative cleaning rate of each test composition with respect to the control composition was calculated, and the relative cleaning power of each mutant protease with respect to the parent protease in applied cleaning (relative applied cleaning power) was evaluated.
  • each mutant protease The relative application cleaning power of each mutant protease (relative cleaning rate of the test composition containing each mutant protease) is shown in Table 2 and FIG. 1. All of the mutant proteases except S191F had a relative application detergency of more than 1, indicating clearly higher application detergency than the parent enzyme.
  • Example 3 Stability evaluation of mutant protease A commercially available concentrated liquid detergent (Attack ZERO Regular; Kao Corporation) was heated in a microwave oven to deactivate the enzyme in the product. The culture supernatant containing the mutant protease E82Q/S191R obtained in Example 1 was added to this liquid detergent so that the protein concentration was 0.2 g/L, and the liquid detergent containing the mutant protease was stirred well. A composition (test sample) was prepared. As a control, a liquid detergent composition containing the parent enzyme (control sample) was prepared using a similar procedure. The protease activity of the test sample immediately after enzyme combination (0h) and after being stored at 40°C for 2 weeks (2w) was measured by the following method.
  • One tablet of Protazyme AK Tablets (Megazyme) was suspended in 1 mL of 0.1 M phosphate buffer to serve as a substrate solution.
  • the 0h and 2w test samples were each diluted 60 times with 0.1M phosphate buffer.
  • 1 mL of the diluted sample was added to the substrate solution and incubated at 40°C for 30 minutes.
  • the reaction was stopped by adding 10 mL of 2% trisodium phosphate aqueous solution, and after stirring, the reaction solution was fractionated into 1.5 mL tubes in 1 mL portions. The mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was collected, and the absorbance at 590 nm was measured.
  • the activity values of the 0h and 2w control samples were determined.
  • the residual activity rate after two weeks was determined by dividing the activity value of the 2w sample by the activity value of the 0h sample, and the daily activity maintenance rate by 40°C treatment was determined by raising that value to the 1/14th power. .
  • Relative stability was determined by dividing the half-life of the mutant protease by the half-life of the parent protease.
  • the relative stability of the mutant E82Q/S191R was 1.89, and the stability of the protease was greatly improved by introducing the mutations of E82Q and S191R.
  • Patent Document 3 describes that proteases having 82E or 82Q have high stability in liquid detergents.
  • the mutant E82Q/S191R of this example has improved stability compared to the parent protease having 82E, suggesting that the mutation of S191R further improves the stability of the protease.

Abstract

高濃度洗剤液中でのタンパク質汚れに対する洗浄性能が向上した変異プロテアー ゼの提供。配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ：（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ。

Description

変異プロテアーゼ
　本発明は、変異プロテアーゼに関する。
　洗剤中にプロテアーゼを配合する目的は、衣類や食器などに付着した食品や垢、汗などに由来するタンパク質汚れを分解して汚れの除去を促進することである。洗剤のｐＨは一般にアルカリ側にあるため、洗剤用プロテアーゼとしては、アルカリ側に至適ｐＨを有するプロテアーゼが開発されてきた。特許文献１には、タンパク質と脂質が混在する複合汚れに対して洗浄性を有する分子量約４３，０００のプロテアーゼが開示されている。特許文献２～５には、プロテアーゼの洗浄性能、液体洗剤中での安定性、液体洗剤に対する溶解性、又は酸性条件下での安定性を向上させる変異を導入して得られた変異プロテアーゼが開示されている。
（特許文献１）国際公開公報第９９／１８２１８号
（特許文献２）特開２００８－２１２０８４号公報
（特許文献３）特開２０１０－２７３６７２号公報
（特許文献４）特開２０１３－２３３１４１号公報
（特許文献５）特開２０２０－１４５９３８号公報
　本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ：
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、
を提供する。
　また本発明は、前記変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを提供する。
　また本発明は、前記ポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。
　また本発明は、前記ポリヌクレオチド又は前記ベクターを含有する組換えバチルス属細菌を提供する。
　また本発明は、前記組換えバチルス属細菌を用いる変異プロテアーゼの製造方法を提供する。
　また本発明は、前記変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供する。
　さらに本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、変異プロテアーゼの製造方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換、
を提供する。
　また本発明は、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法を提供する。
変異プロテアーゼの相対塗布洗浄力。 １９１位変異による塗布洗浄力の向上。
　本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列に関する「少なくとも９０％の同一性」とは、９０％以上、好ましくは９５％以上、より好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性をいう。
　本明細書において、ヌクレオチド配列及びアミノ酸配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧｅｎｅｔｙｘ－Ｗｉｎのホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、「１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、好ましくは１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、さらに好ましくは１個以上３個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。また本明細書において、「１又は数個のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列」としては、好ましくは１個以上３０個以下、より好ましくは１個以上１５個以下、さらに好ましくは１個以上１０個以下のヌクレオチドが欠失、挿入、置換若しくは付加されたヌクレオチド配列が挙げられる。また本明細書において、アミノ酸又はヌクレオチドの「付加」には、配列の一末端及び両末端への１又は数個のアミノ酸又はヌクレオチドの付加が含まれる。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（例えば、配列番号１のアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ　ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ　Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ　Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ　ｏｍｅｇａは、例えば、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ　Ｃｏｌｌｅｇｅ　Ｄｕｂｌｉｎが運営するＣｌｕｓｔａｌのウェブサイト［ｗｗｗ．ｃｌｕｓｔａｌ．ｏｒｇ］、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ　Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）、又は国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。
　当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリジン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとトレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。
　上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置に対応する位置にアラインされた目的アミノ酸配列のアミノ酸残基の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされ、当該アミノ酸残基は「相当する位置におけるアミノ酸残基」と称される。
　本明細書において、変異ポリペプチドの「親」ポリペプチドとは、そのアミノ酸残基に所定の変異がなされることにより、当該変異ポリペプチドとなるポリペプチドをいう。言い換えると、「親」ポリペプチドとは、ポリペプチド変異体が変異される前のポリペプチドである。同様に、変異ポリヌクレオチドの「親」ポリヌクレオチドとは、そのヌクレオチドに所定の変異がなされることにより、当該変異ポリヌクレオチドとなるポリヌクレオチドをいう。言い換えると、「親」ポリヌクレオチドとは、変異ポリヌクレオチドが変異される前のポリヌクレオチドである。
　本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３'側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５'側の領域を意味する。
　本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。
　本発明は、高濃度洗剤液中でのタンパク質汚れに対する洗浄性能が向上した変異プロテアーゼを提供することに関する。
　シミなどの落ちにくい汚れを除去するために、液体洗剤の原液を水で薄めずに汚れに直接塗布する場合がある。食べこぼしや襟袖汚れなどのタンパク質を含む汚れに対しては、プロテアーゼを含む液体洗剤の塗布が効果的であると考えられる。しかし、液体洗剤の原液は、界面活性剤などの洗浄成分の濃度が高いため、プロテアーゼにとって過酷な条件である。液体洗剤の原液のような高濃度の洗浄成分を含む溶液中でのプロテアーゼの洗浄性能を向上させることが望まれている。
　本発明者は、分子量４３，０００のプロテアーゼＫＰ４３（特許文献１参照）に由来する変異プロテアーゼが、液体洗剤の原液中でもタンパク質汚れに対する洗浄性能（以下、単に洗浄性能ともいう）が向上していることを見出した。
　本発明の変異プロテアーゼは、高濃度洗剤液（例えば、液体洗剤の原液）中でのタンパク質汚れに対する洗浄性能が向上している。本発明の変異プロテアーゼは、例えば塗布洗浄又は漬け置き洗浄のような、高濃度洗剤液による洗浄に用いるプロテアーゼとして有効である。例えば、本発明の変異プロテアーゼは、液体洗剤の原液又は高濃度洗剤液を汚れに直接接触させることでその汚れを洗浄するための洗剤に配合するプロテアーゼとして有効である。
　本発明の変異プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有する変異プロテアーゼである：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅ、好ましくはＡｌａへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇへの置換。
　好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異を有する。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異とを有する。
　一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）及び（Ｄ）の変異からなる群より選択される少なくとも１つの変異とを有する。別の一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）及び（Ｄ）から選択されるいずれか１つの変異とを有する。好ましくは、該（Ａ）の変異は、１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｒｇへの置換であり、該（Ｂ）の変異は、１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｒｇへの置換であり、該（Ｄ）の変異は、２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＬｙｓへの置換である。
　一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異に加えて、下記（Ｈ）の変異を有する：
（Ｈ）配列番号１の８２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＧｌｎへの置換。
　前記（Ａ）～（Ｇ）のいずれかの変異に加えて前記（Ｈ）の変異を有することで、本発明の変異プロテアーゼの高濃度洗剤液中での洗浄性能がより向上する。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（Ａ）の変異と前記（Ｈ）の変異とを有する。好ましくは、該（Ａ）の変異は、１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｒｇへの置換である。
　一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（Ｂ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を有するものであってもよい。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ｅ）の変異と、前記（Ｆ）の変異とを有する。前記（Ｅ）及び（Ｆ）の変異を有することで、本発明の変異プロテアーゼの高濃度洗剤液中での洗浄性能がより向上する。好ましくは、該（Ｅ）の変異は、３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＬｙｓへの置換であり、該（Ｆ）の変異は、３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＡｒｇへの置換である。
　本発明の変異プロテアーゼの親プロテアーゼとしては、配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ、及び配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。
　配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼの好ましい例としては、配列番号１のアミノ酸配列と９５％以上の同一性、より好ましくは９６％以上の同一性、さらに好ましくは９７％以上の同一性、さらに好ましくは９８％以上の同一性、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するプロテアーゼが挙げられる。配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼの別の例としては、配列番号１のアミノ酸配列に対して１又は数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるプロテアーゼが挙げられる。本発明で親プロテアーゼとして用いられる、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるプロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ由来の変異プロテアーゼであってもよい。
　好ましくは、前記親プロテアーゼのアミノ酸配列において、配列番号１の３０位に相当する位置のアミノ酸残基はアスパラギン酸であり、６８位に相当する位置のアミノ酸残基はヒスチジンであり、かつ２５５位に相当する位置のアミノ酸残基はセリンである。より好ましくは、前記親プロテアーゼは、配列番号１における下記表１（ｉ）に記載の各位置に相当する位置に、表１（ii）に記載のアミノ酸残基を有する。表１に示すアミノ酸残基は、前記親プロテアーゼの起源であるプロテアーゼＫＰ４３（特許文献１）、及びそれに由来する変異プロテアーゼの間で高度に保存されているアミノ酸残基である（Ｓａｅｋｉら，Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ　ａｎｄ　Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，２００７，１０３：５０１－５０８）。
　本発明の変異体の親プロテアーゼは、アルカリ側（好ましくはｐＨ８以上）でタンパク質分解活性を有するポリペプチドである。好ましくは、該親プロテアーゼは、アルカリ側（好ましくはｐＨ８以上）に至適ｐＨを有するポリペプチドである。より好ましくは、該親プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼ（特許文献１参照）が有する次の酵素学的性質のいずれかを有する：１）酸化剤耐性を有し、アルカリ側（ｐＨ８以上）で作用し、かつ安定である。ここで、酸化剤耐性を有するとは、当該プロテアーゼを５０ｍＭ過酸化水素（５ｍＭ塩化カルシウムを含有）溶液中（２０ｍＭブリットン・ロビンソン緩衝液、ｐＨ１０）で、２０℃２０分間放置した後の残存活性（合成基質法）が少なくとも５０％以上であることをいう；２）５０℃、ｐＨ１０で１０分間処理したとき８０％以上の残存活性を示す；３）ジイソプロピルフルオルリン酸（ＤＦＰ）及びフェニルメタンスルホニルフルオライド（ＰＭＳＦ）で活性が阻害される；４）ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分子量が４３，０００±２，０００である。より好ましくは、当該親プロテアーゼは、上記１）～４）の酵素学的性質を全て有する。
　本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼのアミノ酸配列に対して、配列番号１のアミノ酸配列の前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことによって製造することができる。好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、前記親プロテアーゼのアミノ酸配列に対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異に加えて、前記（Ｈ）の変異を施すことによって製造することができる。
　したがって、本発明の変異プロテアーゼは、下記（ａ）～（ｇ）のアミノ酸残基からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する：
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ、好ましくはＡｌａ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ、好ましくはＡｒｇ。
　好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する。
　好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）のアミノ酸残基を有する。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを有する。
　一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）及び（ｄ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを有する。別の一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）及び（ｄ）のうちのいずれか１つのアミノ酸残基とを有する。好ましくは、該（ａ）のアミノ酸残基はＡｒｇであり、該（ｂ）のアミノ酸残基はＡｒｇであり、該（ｄ）のアミノ酸残基はＬｙｓである。
　一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に加えて、下記（ｈ）のアミノ酸残基を有する：
（ｈ）配列番号１の８２位に相当する位置におけるＧｌｎ。
　好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ａ）及び（ｈ）のアミノ酸残基を有する。好ましくは、該（ａ）のアミノ酸残基はＡｒｇである。
　一実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ｂ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有するものであってもよい。好ましい実施形態において、本発明の変異プロテアーゼは、前記（ｅ）及び（ｆ）のアミノ酸残基を有する。好ましくは、該（ｅ）のアミノ酸残基はＬｙｓであり、該（ｆ）のアミノ酸残基はＡｒｇである。
　本発明の変異プロテアーゼは、界面活性剤を高濃度で含有する洗剤液（いわゆる高濃度洗剤液）中でのタンパク質汚れに対する洗浄性能が向上した変異プロテアーゼである。より詳細には、本発明の変異プロテアーゼは、高濃度洗剤液中において配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼよりも高い洗浄性能を発揮することができる。好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、濃縮液体洗剤の原液中において配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼよりも高い洗浄性能を発揮することができる。好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、通常洗浄に使用される程度に水で希釈した洗剤液（いわゆる通常の洗剤液）中では、配列番号１のアミノ酸配列からなるプロテアーゼと少なくとも同等、又はそれ以上の洗浄性能を発揮することができる。したがって、本発明の変異プロテアーゼは、洗剤用酵素として使用でき、特に、高濃度洗剤液による洗浄（例えば塗布洗浄又は漬け置き洗浄）に用いるための洗剤用の酵素として使用できる。例えば、本発明の変異プロテアーゼは、その原液又は高濃度洗剤液を汚れに直接塗布することでその汚れを洗浄するための濃縮液体洗剤に配合するプロテアーゼとして有効である。また例えば、本発明の変異プロテアーゼは、その原液又は高濃度洗剤液に汚れを浸漬することでその汚れを洗浄するための濃縮液体洗剤に配合するプロテアーゼとして有効である。
　本明細書における「タンパク質汚れ」としては、例えば、タンパク質を含む食品、タンパク質を含む身体由来成分（例えば血液、尿、垢、汗、皮脂等）などによる汚れが挙げられる。「タンパク質汚れ」のより具体的な例としては、衣類への食べこぼし、襟袖汚れなどが挙げられる。
　本明細書における「洗剤液」は、液体洗剤の原液、及び、液体洗剤又は固形洗剤（例えば粉末洗剤）を水で希釈して得られた洗剤水溶液を包含する。本明細書において、「高濃度洗剤液」とは、界面活性剤を高濃度で含有する洗剤液をいい、好ましくは、界面活性剤を１０質量％以上、より好ましくは２０質量％以上、例えば１０～９０質量％、好ましくは２０～９０質量％、より好ましくは２０～７５質量％含有する洗剤液をいう。高濃度洗剤液の例としては、濃縮液体洗剤の原液、またはそれを高濃度で含有する水溶液が挙げられる。本明細書において、「濃縮液体洗剤」とは、界面活性剤を４０質量％以上、好ましくは４０～９０質量％、より好ましくは４５～９０質量％、さらに好ましくは５０～７５質量％含有する液体洗剤をいう。該「濃縮液体洗剤」の例としては、衣料用液体洗剤であれば、水槽式洗濯機で水３０Ｌに対する標準使用量が７～１３ｇ又はそれ以下と表示されているものを挙げることができる。
　本明細書において、「高濃度洗剤液による洗浄」とは、洗浄対象（例えば、布、及び、食器や調理器具等の硬質表面）上の汚れに高濃度洗剤液を直接接触させ、必要に応じて所定時間放置又は洗浄した後に、該洗浄対象を水洗する洗浄方法をいう。「高濃度洗剤液による洗浄」の例としては、塗布洗浄、及び漬け置き洗浄が挙げられる。「塗布洗浄」とは、洗浄対象の汚れに高濃度洗剤液を直接塗布し、必要に応じて所定時間放置又は洗浄した後に、該洗浄対象を水洗する洗浄方法をいう。「漬け置き洗浄」とは、洗浄対象の汚れを高濃度洗剤液中に浸漬し、必要に応じて所定時間放置又は該高濃度洗剤液中で洗浄した後に、該洗浄対象を水洗する洗浄方法をいう。したがって、前記高濃度洗剤液による洗浄において、洗浄対象の汚れに高濃度洗剤液を直接接触させる手段としては、該汚れに対する該高濃度洗剤液の塗布（例えばロールオン、スプレー、滴下などによる）、該汚れの該高濃度洗剤液への浸漬、などが挙げられる。
　本発明の変異プロテアーゼは、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異に加えて、前述した高濃度洗剤液中で親プロテアーゼより高い洗浄性能を維持できる限り、親プロテアーゼに対して他の任意の位置における変異（例えば、欠失、置換、付加、挿入）を有するものであってもよい。当該変異は、天然に生じたものであっても、人工的に導入したものであってもよい。ただし、好ましくは本発明の変異プロテアーゼは、少なくとも配列番号１の３０位、６８位、及び２５５位におけるアミノ酸残基が親プロテアーゼと同じである。より好ましくは、本発明の変異プロテアーゼは、配列番号１における前記表１（ｉ）に記載の各位置に相当する位置におけるアミノ酸残基が、親プロテアーゼと同じである。
　本発明において、親プロテアーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当該技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親プロテアーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親ポリヌクレオチドともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させ、さらにその変異ポリヌクレオチドからタンパク質を発現させることにより、目的の変異プロテアーゼを得ることができる。
　親ポリヌクレオチドへの目的の変異の導入は、例えば基本的には、該親ポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲ増幅や各種ＤＮＡポリメラーゼによる複製反応に基づき、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版　新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ８２－８８）の任意の手法により行うことができる。Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔ等の各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
　親ポリヌクレオチドへの部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親ポリヌクレオチドにおける変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｈｏｒｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。
　親ポリヌクレオチドを含むＤＮＡは、親プロテアーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成することにより調製することができる。あるいは、親ポリヌクレオチドを含むＤＮＡは、それを保持する微生物株から公知の手段で抽出することができる。変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親ポリヌクレオチドを鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異が導入された、変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを得ることができる。
　したがって、本発明はまた、変異プロテアーゼ遺伝子を提供する。本発明の変異プロテアーゼ遺伝子は、当該本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドである。当該本発明のポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該本発明のポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。
　本発明はまた、当該本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するベクターを提供する。該ベクターは、該本発明のポリヌクレオチドを常法により任意のベクター中に挿入し連結することにより作製することができる。該ベクターの種類は特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、とりわけバチルス属細菌内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異プロテアーゼを組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４（特開２０１３－２３３１４１号公報）、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＡ６４、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｉｓｈｉｋａｗａ　ａｎｄ　Ｓｈｉｂａｈａｒａ，Ｊｐｎ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｍｏｒｉｙａｍａ　ｅｔ　ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｇｒｙｃｚａｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｂｒｏｎ　ｅｔ　ａｌ，Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミド；分泌シグナルを組換えタンパク質に付与可能な分泌ベクター（山根他，「枯草菌分泌ベクターによる融合タンパク質」澱粉科学，３４．（１９８７），１６３－１７０）等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミド（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。
　本発明の変異プロテアーゼを組換え生産する場合、前記ベクターは発現ベクターであることが好ましい。発現ベクターは、転写プロモーター、ターミネーター、リボソーム結合部位等の宿主生物における発現に必須な各種エレメント；ポリリンカー、エンハンサー等のシスエレメント；ポリＡ付加シグナル；リボソーム結合配列（ＳＤ配列）；薬剤（例えばアンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール等）耐性遺伝子等の選択マーカー遺伝子、などの有用な配列を必要に応じて含み得る。
　本発明はまた、本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド又は該ポリヌクレオチドを含有するベクターを含む、形質転換体を提供する。該形質転換体は、本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド、又は該ポリヌクレオチドを含有するベクター（好ましくは組換え発現ベクター）を宿主に導入することにより製造することができる。したがって、該形質転換体は、本発明の変異プロテアーゼをコードする外来のポリヌクレオチドを含む。
　前記形質転換体の宿主としては、大腸菌や枯草菌等の細菌、酵母細胞を始めとする微生物の他、昆虫細胞、動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）、植物細胞等の任意の細胞が挙げられる。該宿主は、好ましくはバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株である。したがって、本発明の形質転換体は、好ましくは組換えバチルス属細菌であり、より好ましくは枯草菌又はその変異株の組換え体である。
　宿主の形質転換には、例えば、リン酸カルシウム法、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、パーテイクルガン法、ＰＥＧ法等の周知の形質転換技術を適用することができる。例えばバチルス属細菌に適用可能な形質転換法としては、コンピテントセル形質転換法（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９６７，９３：１９２５－１９３７）、エレクトロポレーション法（ＦＥＭＳ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ　Ｌｅｔｔ，１９９０，５５：１３５－１３８）、プロトプラスト形質転換法（Ｍｏｌ　Ｇｅｎ　Ｇｅｎｅｔ，１９７９，１６８：１１１－１１５）、Ｔｒｉｓ－ＰＥＧ法（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９８３，１５６：１１３０－１１３４）などが挙げられる。
　前記本発明の形質転換体を培養することにより、本発明の変異プロテアーゼを製造することができる。したがって、本発明はまた、本発明の形質転換体を用いる変異プロテアーゼの製造方法を提供する。変異プロテアーゼ製造のための該形質転換体の培養は、当業者に一般的な方法に従って行うことができる。例えば、大腸菌や酵母細胞等の微生物宿主に基づく形質転換体を培養する培地としては、該微生物宿主が資化し得る炭素源、窒素源、無機塩類等を含有し、形質転換体の培養を効率的に行える培地であればよい。該培地は、天然培地及び合成培地のいずれを用いてもよい。例えば、組換えタンパク質を生産するための枯草菌形質転換体の培養には、ＬＢ培地、２×ＹＴ培地、２×Ｌ－マルトース培地、又はＣＳＬ発酵培地等を用いることができる。該培地には、形質転換体に導入した薬剤耐性遺伝子（選択マーカー遺伝子）の種類に対応した薬剤を添加してもよい。また、誘導性プロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養する場合は、必要に応じてインデューサーを培地に添加してもよい。例えば、Ｌａｃプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはイソプロピル－１－チオ－β－Ｄ－ガラクトシド（ＩＰＴＧ）等を、ｔｒｐプロモーターを用いた発現ベクターで形質転換した微生物を培養するときにはインドール酢酸（ＩＡＡ）等を培地に添加することができる。
　あるいは、本発明の変異プロテアーゼは、無細胞翻訳系を使用して、本発明の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
　当該形質転換体又は無細胞翻訳系で製造された本発明の変異プロテアーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、培養液、細胞破砕液、無細胞翻訳系の反応液などから分離又は精製することができる。あるいは、遠心分離や限外濾過型フィルター等を用いて分離又は濃縮した培養上清や溶菌液上清等の溶液を、粗酵素液としてそのまま使用することができる。発現された変異プロテアーゼが細胞内から分泌されない場合には、その細胞を破砕してからタンパク質の分離精製を行えばよい。
　本発明において用いるＤＮＡ抽出、ｍＲＮＡの調製、ｃＤＮＡの作製、ＰＣＲ、ＲＴ－ＰＣＲ、ライブラリーの作製、ベクター中へのライゲーション、細胞の形質転換、ＤＮＡの塩基配列の決定、核酸化学合成、タンパク質のＮ末端側のアミノ酸配列決定、突然変異誘発、タンパク質の抽出等の手順は、通常の実験書に記載の方法によって行うことができる。そのような実験書としては、例えば、ＳａｍｂｒｏｏｋらのＭｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ　ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｍａｎｕａｌ，２００１，３ｒｄ　Ｅｄ．，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．＆　Ｒｕｓｓｅｌｌ，ＤＷ．Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓｓを挙げることができる。さらに、枯草菌の遺伝子組換え実験については、例えば吉川博文著、“７．２　枯草菌系”「続生化学実験講座１．遺伝子研究法II」，１９８６，東京化学同人社（東京），ｐ１５０－１６９等の、枯草菌の遺伝子操作に関する一般的な実験書を参照することができる。
　本発明の製造方法により得られた変異プロテアーゼは、親プロテアーゼと比べて、高濃度洗剤液中での洗浄性能が向上しており、高濃度洗剤液による洗浄（例えば塗布洗浄又は漬け置き洗浄）用の洗剤に用いるプロテアーゼとして有用である。したがって、本発明の別の態様は、上述したとおりに親プロテアーゼのアミノ酸配列に対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法であり得る。
　本発明の変異プロテアーゼは、洗剤用酵素として有用であり、特に、高濃度洗剤液による洗浄（例えば塗布洗浄又は漬け置き洗浄）用の洗剤に配合する酵素としてより好適である。したがって、本発明はまた、本発明の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物を提供する。該洗剤組成物は、固形（例えば粉末）洗剤組成物であってもよいが、好ましくは液体洗剤組成物であり、より好ましくは濃縮液体洗剤である。また該洗剤組成物は、好ましくは塗布洗浄用又は漬け置き洗浄用の洗剤組成物であり、より好ましくは塗布洗浄用の洗剤組成物である。
　本発明の洗剤組成物における本発明の変異プロテアーゼの含有量は、プロテアーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、洗剤組成物１ｋｇ当たり０．１～２５０００Ｕが好ましく、０．１～５０００Ｕがより好ましく、０．１～２５００Ｕがさらに好ましい。本明細書におけるプロテアーゼの活性（Ｕ）は、以下の方法により測定される：１／１５Ｍリン酸緩衝液（例えばｐＨ７．４、和光純薬りん酸緩衝剤粉末（１６７－１４４９１）１包（１包中Ｎａ2ＨＰＯ4（無水）７．６ｇ。ＫＨ2ＰＯ4（無水）１．８ｇ含有）を１Ｌのイオン交換水に溶解した溶液）０．９ｍＬ、４０ｍＭＧｌｔ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｌｅｕ－ｐ－ニトロアニリド／ジメチルスルホキシド溶液０．０５ｍＬを試験管に採り、３０℃で５分間保温する。これに酵素液０．０５ｍＬを加えて３０℃で１０分間反応を行った後、５％（ｗ／ｖ）クエン酸水溶液２．０ｍＬを加えて反応を停止し、分光光度計を用いて４２０ｎｍにおける吸光度を測定する。ここで酵素１単位（Ｕ）は上記反応において１分間に１μｍｏｌのｐ－ニトロアニリンを生成する量とする。
　本発明の洗剤組成物は、本発明の変異プロテアーゼに加えて、界面活性剤及び水を含有する。界面活性剤としては、非イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤、及び両性界面活性剤等の任意の界面活性剤を１種で又は２種以上組み合わせて用いることができる。本発明の洗剤組成物における該界面活性剤の含有量は、好ましくは１０～９０質量％、より好ましくは１０～８０質量％、さらに好ましくは３０～７５質量％である。本発明の洗剤組成物が濃縮液体洗剤の場合、該洗剤組成物における該界面活性剤の含有量は、好ましくは４０～９０質量％、より好ましくは４５～９０質量％、さらに好ましくは５０～７５質量％である。
　非イオン性界面活性剤としては、一般的に液体洗剤に配合されているＣ８～Ｃ２２の炭化水素基を有し、Ｃ２オキシアルキレン基が数モル以上付加された非イオン性界面活性剤であればよいが、例えば、以下が挙げられる：
　Ｒ1Ｏ－（ＡＯ）ｍ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＡＯ＝Ｃ２－Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１６～３５）〔特開２０１０－２７５４６８号公報〕；
　Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｌ－（ＡＯ）ｍ－（ＥＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ１８炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝３～３０、ｍ＝１～５、ｌ＋ｎ＝１４～５０）〔特開２０１０－２６５４４５号公報、特開２０１１－６３７８４号公報〕；
　Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１０～３０、ｎ＝０～５、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－１８９５５１号公報〕；
　Ｒ1（ＣＯ）ｌＯ－（ＥＯ）ｍ／（ＡＯ）ｎ－Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｌ＝０～１、ｍ＝１４～５０、ｎ＝１～５、Ｒ2＝水素（ｌ＝０）又はＣ１－Ｃ３アルキル基、ＥＯ及びＡＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－２２９３８５号公報〕；
　Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｍ－（ＡＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＡＯ＝Ｃ３－Ｃ５オキシアルキレン基、ｍ＝１５～３０、ｎ＝１～５）〔特開２０１０－２２９３８７号公報〕；
　Ｒ1Ｏ－（ＡＯ）ｍ／（Ｇｌｙ）ｎ－Ｈ及び／又はＲ2－ＣＯＯ－（ＡＯ）ｐ／（Ｇｌｙ）ｑ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２２炭化水素基、Ｒ2＝Ｃ７－Ｃ２１炭化水素基、ＡＯ＝Ｃ２－Ｃ３オキシアルキレン基、Ｇｌｙ＝グリセロール基、ｍ＝０～５、ｎ＝２～１０、ｐ＝０～５、ｑ＝２～１０、ＡＯ及びＧｌｙはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－２５４８８１号公報〕；
　Ｒ1－ＣＯＯ－（ＰＯ）ｍ／（ＥＯ）ｎ－Ｒ2（Ｒ1＝Ｃ７－Ｃ２１炭化水素基，ＣＯＯ＝カルボニルオキシ基、Ｒ2＝Ｃ１－Ｃ３アルキル基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ＥＯ＝オキシエチレン基、ｍ＝０．３～５、ｎ＝８～２５、ＰＯ及びＥＯはランダム又はブロック結合）〔特開２０１０－２６５３３３号公報〕；
　Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｌ－（ＰＯ）ｍ－（ＥＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ８－Ｃ２０炭化水素、ＥＯ＝Ｃ２オキシアルキレン基、ＰＯ＝オキシプロピレン基、ｌ＞＝１、ｎ＞＝１、０＜ｍ＜ｌ＋ｎ、ＥＯ及びＰＯはブロック結合）〔ＷＯ９８／２４８６５〕；
　Ｒ1Ｏ－（ＥＯ）ｍ－（ＰＯ）ｎ－Ｈ（Ｒ1＝Ｃ１０－Ｃ１６のアルキル基又はアルケニル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ＰＯ＝プロピレンオキシド基、ｍ＝５～１５、ｎ＝１～３）〔特開平８－１５７８６７号公報〕；
　Ｒ1（ＣＯ）－（ＥＯ）ｍ－ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ１１－Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、Ｒ2＝Ｃ１－Ｃ３アルキル基、ＥＯ＝エチレンオキシド基、ｍ＝１０～２０）〔特開２００８－７７０６号公報、特開２００９－７４５１号公報、特開２００９－１５５５９４号公報、特開２００９－１５５６０６号公報〕；
　Ｒ1（ＣＯ）－（ＡＯ）ｍ－ＯＲ2（Ｒ1＝Ｃ９－Ｃ１３直鎖又は分岐状アルキル基又はアルケニル基、ＡＯ＝Ｃ２－Ｃ４オキシアルキレン基、Ｒ2＝Ｃ１－Ｃ３アルキル基、ｍ＝５～３０）〔特開２００９－１４４００２号公報、特開２００９－１７３８５８号公報、特開２０１０－１８９６１２号公報〕；ならびに、
　脂肪酸アルカノールアミド、脂肪酸アルカノールグルカミド、アルキルポリグルコシド等。
　陰イオン界面活性剤としては、例えばカルボキシレート型陰イオン界面活性剤、スルホン酸型又は硫酸エステル型陰イオン界面活性剤、非石鹸系アニオン界面活性剤、直鎖アルキルベンゼンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシベンゼンスルホン酸又はその塩、ポリオキシエチレンアルキル硫酸エステル塩、ポリオキシアルキレンアルキルエーテル硫酸エステル塩、α－オレフィンスルホン酸塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、脂肪酸石鹸、リン酸エステル塩系界面活性剤、アシルアラニネート、アシルタウレート、アルキルエーテルカルボン酸、アルコール硫酸エステル等が挙げられる。
　陽イオン界面活性剤としては、例えば長鎖アルキル基を有する第４級アンモニウム塩、長鎖アルキル基を１つ有する３級アミン、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルピリジニウム塩等が挙げられる。好ましくは炭素数８～２２の長鎖アルキル基を１つ有する第４級アンモニウム型界面活性剤、炭素数８～２２の長鎖アルキル基を１つ有する３級アミンが挙げられる。
　両性イオン活性剤としては、例えばアルキル酢酸ベタイン、アルカノールアミドプロピル酢酸ベタイン、アルキルイミダゾリン、アルキルアラニン等、アルキルベタイン型、アルキルアミドベタイン型、イミダゾリン型、アルキルアミノスルホン型、アルキルアミノカルボン酸型、アルキルアミドカルボン酸型、アミドアミノ酸型又はリン酸型の両性界面活性剤等が挙げられる。好ましくは炭素数１０～１８のアルキル基を有するスルホベタイン又はカルボベタインを挙げることができる。
　本発明の洗剤組成物は、さらに、洗剤組成物に通常使用される成分、例えば、水溶性ポリマー、水混和性有機溶剤、アルカリ剤、有機酸又はその塩、キレート剤、本発明の変異プロテアーゼ以外の他の酵素、酵素安定化剤、蛍光剤、再汚染防止剤、分散剤、色移り防止剤、仕上げ剤、漂白剤、酸化防止剤、可溶化剤、ｐＨ調製剤、緩衝剤、防腐剤、香料、塩、アルコール、糖類、などを含み得る。
　水溶性ポリマーとしては、例えば、（i）炭素数２～５のエポキシド由来の重合単位を含んで構成されるポリエーテル鎖部分と（ii）アクリル酸、メタクリル酸及びマレイン酸から選ばれる一種以上の不飽和カルボン酸単量体由来の重合単位を含んで構成されるポリマー鎖部分とを有し、（i）又は（ii）のいずれかが幹鎖となり、他方が枝鎖となったグラフト構造を有する高分子化合物（特開２０１０－２７５４６８号公報、特開平１０－０６０４９６号公報）；アルキレンテレフタレート単位及び／又はアルキレンイソフタレート単位と、オキシアルキレン単位及び／又はポリオキシアルキレン単位を有する水溶性ポリマー（特開２００９－１５５６０６号公報）、などが挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該水溶性ポリマーの含有量は、好ましくは０．２～１０質量％、より好ましくは０．４～５質量％である。
　水混和性有機溶剤としては、例えば、アルカノール類のアルキレングリコール類やグリセリン、ポリアルキレングリコール類、（ポリ）アルキレングリコール（モノ又はジ）アルキルエーテル類、アルキルグリセリルエーテル類、（ポリ）アルキレングリコールの芳香族エーテル類が挙げられる。エチレングリコール、プロピレングリコール、ブチレングリコール、又はヘキシレングリコールなどの炭素数２～６のアルキレングリコール類やグリセリン、又はポリエチレングリコールモノフェニルエーテル、エチレングリコールモノベンジルエーテル、ジエチレングリコールモノベンジルエーテル等が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該水混和性有機溶剤の含有量は、好ましくは１～４０質量％、より好ましくは１～３５質量％である。
　アルカリ剤としては、例えば、Ｃ２－Ｃ４のアルカノールを１～３個有するアルカノールアミンとして、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、ポリオキシアルキレンアミン、ジメチルアミノプロピルアミン等が挙げられる。モノエタノールアミン、トリエタノールアミンが好ましい。本発明の洗剤組成物における当該アルカリ剤の含有量は、好ましくは０～２０質量％、より好ましくは０～１０質量％である。
　有機酸又はその塩としては、例えば、飽和脂肪酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、又はそれらの塩等の多価カルボン酸類；クエン酸、リンゴ酸、グリコール酸、ｐ－ヒドロキシ安息香酸、安息香酸又はそれらの塩等のヒドロキシカルボン酸類、などが挙げられ、なかでもクエン酸又はその塩が好ましい。本発明の洗剤組成物における当該有機酸又はその塩の含有量は、好ましくは０～５質量％、より好ましくは０～３質量％である。
　キレート剤とは、金属イオンと配位結合をすることができる化合物をいう。洗剤組成物に添加されたキレート剤は、洗濯用水又は汚れの中のカルシウムイオン、マグネシウムイオン等の洗浄に悪影響を及ぼす金属イオンを封鎖する作用を有する。本発明の洗剤組成物に含まれ得るキレート剤の例としては、ニトリロ三酢酸、イミノ二酢酸、エチレンジアミン酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、グリコールエーテルジアミン四酢酸、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸、トリエチレンテトラアミン六酢酸、ジエンコル酸等のアミノポリ酢酸又はこれらの塩、ジグリコール酸、オキシジコハク酸、カルボキシメチルオキシコハク酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、シュウ酸、リンゴ酸、オキシジコハク酸、グルコン酸、カルボキシメチルコハク酸、カルボキシメチル酒石酸等の有機酸又はこれらの塩、アミノトリ（メチレンホスホン酸）、１－ヒドロキシエチリデン－１，１－ジホスホン酸、エチレンジアミンテトラ（メチレンホスホン酸）、ジエチレントリアミンペンタ（メチレンホスホン酸）、及びこれらのアルカリ金属又は低級アミン塩、などが挙げられる。本発明の洗剤組成物におけるキレート剤の含有量は、好ましくは０．１～５質量％、より好ましくは０．１～４質量％である。
　再汚染防止剤及び分散剤としては、例えばポリアクリル酸、ポリマレイン酸、カルボキシメチルセルロース、重量平均分子量５０００以上のポリエチレングリコール、無水マレイン酸－ジイソブチレン共重合体、無水マレイン酸－メチルビニルエーテル共重合体、無水マレイン酸－酢酸ビニル共重合体、ナフタレンスルホン酸塩ホルマリン縮合物、及び特開昭５９－６２６１４号公報の請求項１～２１（１頁３欄５行～３頁４欄１４行）記載のポリマーなどの再汚染防止剤及び分散剤を挙げることができる。本発明の洗剤組成物における当該再汚染防止剤及び分散剤の含有量は、それぞれ０．０１～１０質量％が好ましい。
　色移り防止剤としては、例えばポリビニルピロリドンが挙げられ、含有量は０．０１～１０質量％が好ましい。
　漂白剤としては、例えば過酸化水素、過炭酸塩、過硼酸塩などの漂白剤を、当該洗剤組成物中１～１０質量％含有させることが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を、当該洗剤組成物中０．０１～１０質量％含有させることができる。
　蛍光剤としては、例えばビフェニル型蛍光剤（チノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（ＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。本発明の洗剤組成物における当該蛍光剤の含有量は０．００１～２質量％が好ましい。
　本発明の変異プロテアーゼ以外の他の酵素としては、例えば、他のプロテアーゼ、セルラーゼ、β－グルカナーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ、α－アミラーゼ、グルコアミラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、キシログルカナーゼ、キシラナーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、ペクチンリアーゼ、マンナナーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、セロビオヒドロラーゼ、及びトランスグルタミナーゼ等の加水分解酵素、ならびにそれらの２種以上の混合物が挙げられる。
　酵素安定化剤としては、例えばホウ素化合物、カルシウムイオン源（カルシウムイオン供給化合物）、ヒドロキシ化合物、蟻酸などが挙げられ、酸化防止剤としては、ブチルヒドロキシトルエン、ジスチレン化クレゾール、亜硫酸ナトリウム及び亜硫酸水素ナトリウムなどが挙げられ、可溶化剤としては、パラトルエンスルホン酸、クメンスルホン酸、メタキシレンスルホン酸、安息香酸塩（防腐剤としての効果もある）などが挙げられる。さらに、本発明の洗剤組成物は、オクタン、デカン、ドデカン、トリデカンなどのパラフィン類、デセン、ドデセンなどのオレフィン類、塩化メチレン、１，１，１－トリクロロエタンなどのハロゲン化アルキル類、Ｄ－リモネンなどのテルペン類などの水非混和性有機溶剤、色素、香料、抗菌防腐剤、シリ・BR>Rーン等の消泡剤などを含有していてもよい。
　本発明の変異プロテアーゼを配合することができる洗剤組成物の好ましい例としては、特開２０１７－００８３０３号公報に記載される液体洗剤組成物、及び特開２０１３－１２９７２９号公報に記載される液体洗剤組成物が挙げられる。これらの洗剤組成物に本発明の変異プロテアーゼを配合することにより、本発明の洗剤組成物を調製することができる。
　本発明の洗剤組成物は、限定するものではないが、好ましい例としては、衣料又は布製品（例えばシーツ、カーテン、カーペット、壁クロス等）の洗浄用の洗剤組成物、及び台所用（例えば食器又は調理器具用）の洗剤組成物が挙げられる。好ましくは、本発明に係る洗剤組成物は、高濃度洗剤液による洗浄用の洗剤組成物であり、より好ましくは塗布洗浄用又は漬け置き洗浄用の洗剤組成物であり、さらに好ましくは、塗布洗浄用の洗剤組成物である。
　本発明はまた、例示的実施形態として以下の物質、製造方法、用途、方法等を包含する。但し、本発明はこれらの実施形態に限定されない。
〔１〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ：
（ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；
（ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
（ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ。
〔２〕好ましくは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ。
〔３〕好ましくは、前記（ｅ）のアミノ酸残基と、前記（ｆ）のアミノ酸残基とを有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ。
〔４〕好ましくは、前記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基と、下記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、〔１〕記載の変異プロテアーゼ：
（ｈ）配列番号１の８２位に相当する位置におけるＧｌｎ。
〔５〕好ましくは、前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、〔４〕記載の変異プロテアーゼ。
〔６〕〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
〔７〕〔６〕記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
〔８〕〔６〕記載のポリヌクレオチド又は〔７〕記載のベクターを含む組換えバチルス属細菌。
〔９〕〔８〕記載の組換えバチルス属細菌を用いる変異プロテアーゼの製造方法。
〔１０〕前記組換えバチルス属細菌を培養することを含む、〔９〕記載の方法。
〔１１〕〔１〕～〔５〕のいずれか１項記載の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物。
〔１２〕好ましくは高濃度洗剤液による洗浄用の洗剤組成物であり、より好ましくは塗布洗浄用又は漬け置き洗浄用の洗剤組成物であり、さらに好ましくは塗布洗浄用の洗剤組成物である、〔１１〕記載の洗剤組成物。
〔１３〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、変異プロテアーゼの製造方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
〔１４〕配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法：
（Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
（Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
（Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
〔１５〕好ましくは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１６〕好ましくは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ｅ）の変異と、前記（Ｆ）の変異を施すことを含む、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法。
〔１７〕好ましくは、前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異と、下記（Ｈ）の変異を施すことを含む、〔１３〕又は〔１４〕記載の方法：
（Ｈ）配列番号１の８２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＧｌｎへの置換。
　以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。
実施例１　変異プロテアーゼの作製
　特許文献５の参考例１に記載される野生型ＫＰ４３プロテアーゼ発現プラスミドｐＨＡ６４ＴＳＡは、テトラサイクリン耐性遺伝子及び、バチルス・エスピー　ＫＳＭ－６４株のアルカリセルラーゼＫ－６４遺伝子由来のプロモーター領域に連結された野生型ＫＰ４３プロテアーゼのコード配列全長を含む。ｐＨＡ６４ＴＳＡを鋳型として、相補的プライマー対を用いたＰＣＲによる部位特異的導入法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２（１４）：ｅ１１５参照）によってＫＰ４３プロテアーゼ遺伝子に部位特異的変異を繰り返し導入することで配列番号１のプロテアーゼを発現するプラスミドを作製した。得られた配列番号１のプロテアーゼを発現するプラスミドを鋳型として、同様の手法で、親酵素である配列番号１のプロテアーゼに対して以下のアミノ酸置換：Ｔ３１１Ｒ、Ｎ３０２Ｒ、Ｙ３００Ｋ、Ｎ２４３Ｋ、Ｓ１９１Ｒ、Ｙ１７Ｒ、Ｄ１４１Ａ、Ｄ１４１Ｆ、Ｙ１７Ｒ／Ｓ１９１Ｒ、Ｓ１９１Ｒ／Ｎ２４３Ｋ、Ｙ３００Ｋ／Ｎ３０２Ｒ、Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒ、又はＳ１９１Ｆ、を有する変異プロテアーゼを発現するプラスミドを作製した。以下、これらのプラスミドから発現される変異プロテアーゼを、各々Ｔ３１１Ｒ、Ｎ３０２Ｒ、Ｙ３００Ｋ、Ｎ２４３Ｋ、Ｓ１９１Ｒ、Ｙ１７Ｒ、Ｄ１４１Ａ、Ｄ１４１Ｆ、Ｙ１７Ｒ／Ｓ１９１Ｒ、Ｓ１９１Ｒ／Ｎ２４３Ｋ、Ｙ３００Ｋ／Ｎ３０２Ｒ、Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒ、及びＳ１９１Ｆと称する。
　作製した親酵素又は変異プロテアーゼを発現するプラスミドを用いて、宿主菌であるバチルス・エスピーＫＳＭ９８６５株（ＦＥＲＭ　Ｐ－１８５６６）を形質転換した。形質転換はエレクトロポレーション法を用いて行い、形質転換後の細胞をスキムミルク含有アルカリ寒天培地〔１％スキムミルク（ディフコ）、１％バクトトリプトン（ディフコ）、０．５％酵母エキス（ディフコ）、１％塩化ナトリウム、１．５％寒天、０．０５％炭酸ナトリウム、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％〕に塗抹して３０℃で数日間培養した。寒天培地上に生育したコロニーのうち、スキムミルク溶解斑が見られるものをプロテアーゼ遺伝子が導入された形質転換体として選抜した。取得した形質転換体を５ｍＬの種母培地〔６．０％ポリペプトンＳ、０．０５％酵母エキス、１．０％マルトース、０．０２％硫酸マグネシウム７水和物、０．１％リン酸２水素カリウム、０．２５％炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％〕に植菌し、３０℃で１６時間振盪培養した。次いで２０ｍＬの主培地〔８％ポリペプトンＳ、０．３％酵母エキス、１０％マルトース、０．０４％硫酸マグネシウム７水和物、０．２％リン酸２水素カリウム、１．５％無水炭酸ナトリウム、３０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％〕に種母培養液を１％（ｖ／ｖ）植菌し、３０℃で３日間振盪培養した。得られた培養液を遠心分離してプロテアーゼを含む培養上清を取得した。培養上清中に含まれるタンパク質濃度はプロテインアッセイラピッドキッドワコーII（富士フィルム和光純薬）を使用して測定した。
実施例２　変異プロテアーゼの塗布洗浄力評価
　市販の濃縮液体洗剤（アタックＺＥＲＯレギュラー；花王株式会社）を電子レンジにて加熱し、製品中の酵素を失活させた。この液体洗剤に対して、実施例１で取得した各変異プロテアーゼを含む培養上清を、タンパク濃度が０．１ｇ／Ｌとなるように添加し、よく攪拌して変異プロテアーゼを含む液体洗剤組成物（試験組成物）を調製した。対照として、親酵素を含む液体洗剤組成物（対照組成物）を同様の手順で調製した。得られた液体洗剤組成物を用いて、襟袖汚れモデルである人工汚染布ＤＩＮＧＹ＿ＴＮ／ＣＰ／（ＣＯＮＳＵＭＥＲＴＥＣ）を塗布洗浄した。すなわち、１．５ｃｍ四方に裁断したＤＩＮＧＹ＿ＴＮ／ＣＰ／上に試験組成物又は対照組成物を２０μＬ滴下し、５分間静置した後、汚染布をターゴトメーター（上島製作所）の洗浄槽内の２０℃に保温した６００ｍＬの水道水中に移し、６０ｒｐｍで１０分間洗浄した。塗布洗浄後の汚染布を洗浄槽から取り出し、水道水ですすぎ、乾燥させた。塗布洗浄前後の汚染布、及び別途準備した汚染布の原布の明度（Ｌ値）を分光測色計ｃｍ－７００ｄ（コニカミノルタ）を用いて測定し、以下の式を用いて汚染布の洗浄率を算出した。
　　洗浄率（％）＝（Ｌ2－Ｌ1）／（Ｌ0－Ｌ1） × １００
　（Ｌ0：汚染布の原布のＬ値、Ｌ1：洗浄前の汚染布のＬ値、Ｌ2：洗浄後の汚染布のＬ値）。
　対照組成物に対する各試験組成物の相対洗浄率（試験組成物での洗浄率／対照組成物での洗浄率）を算出し、塗布洗浄における各変異プロテアーゼの親プロテアーゼに対する相対洗浄力（相対塗布洗浄力）を評価した。
　各変異プロテアーゼの相対塗布洗浄力（各変異プロテアーゼを含む試験組成物の相対洗浄率）を表２及び図１に示す。Ｓ１９１Ｆを除くいずれの変異プロテアーゼも相対塗布洗浄力が１を上回っており、親酵素よりも明白に高い塗布洗浄力を示した。
　配列番号１の親プロテアーゼに対する１９１位の変異の効果について表３及び図２にまとめた。配列番号１の１９１位のセリン（Ｓ）をアルギニン（Ｒ）に置換したプロテアーゼ（Ｓ１９１Ｒ）は、親プロテアーゼと比べて塗布洗浄力が向上した。一方、１９１位のフェニルアラニン（Ｆ）への置換（Ｓ１９１Ｆ）は塗布洗浄力に影響を与えなかった。８２位グルタミンと１９１位アルギニンを有する変異体（Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒ）はさらに高い塗布洗浄力を示した。
実施例３　変異プロテアーゼの安定性評価
　市販の濃縮液体洗剤（アタックＺＥＲＯレギュラー；花王株式会社）を電子レンジにて加熱し、製品中の酵素を失活させた。この液体洗剤に対して、実施例１で取得した変異プロテアーゼＥ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒを含む培養上清を、タンパク濃度が０．２ｇ／Ｌとなるように添加し、よく攪拌して変異プロテアーゼを含む液体洗剤組成物（試験サンプル）を調製した。対照として、親酵素を含む液体洗剤組成物（対照サンプル）を同様の手順で調製した。酵素配合直後（０ｈ）、及び４０℃で２週間保存した後（２ｗ）の試験サンプルのプロテアーゼ活性を以下の方法で測定した。Ｐｒｏｔａｚｙｍｅ　ＡＫ　Ｔａｂｌｅｔｓ（Ｍｅｇａｚｙｍｅ）１錠を、１ｍＬの０．１Ｍリン酸バッファーに懸濁し、基質溶液とした。０ｈ及び２ｗの試験サンプルは、それぞれ０．１Ｍリン酸バッファーで６０倍に希釈した。基質溶液に該希釈したサンプルを１ｍＬ添加し、４０℃で３０分間インキュベートした。２％リン酸三ナトリウム水溶液を１０ｍＬ添加して反応を停止し、攪拌後に反応液を１ｍＬずつ１．５ｍＬチューブに分取した。１２０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清を分取して５９０ｎｍにおける吸光度を測定した。試験サンプルの代わりに酵素を加えていない加熱失活液体洗剤を用いて同様に測定した吸光度をブランクとし、試験サンプルの吸光度とブランクとの差分を活性値とした。同様の手順で、０ｈ及び２ｗの対照サンプルの活性値を求めた。２ｗのサンプルの活性値を０ｈのサンプルの活性値で割ることで二週間後の残存活性率を求め、その値を１／１４乗することで４０℃処理による１日当たりの活性維持率を求めた。１日当たりの活性維持率を底とする０．５の対数を求めてプロテアーゼ活性の半減期（日）とした。変異プロテアーゼの半減期を親プロテアーゼの半減期で割ることで相対安定性を求めた。変異体Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒの相対安定性は１．８９であり、Ｅ８２Ｑ及びＳ１９１Ｒの変異導入によってプロテアーゼの安定性が大きく向上した。特許文献３には、８２Ｅ又は８２Ｑを有するプロテアーゼが液体洗剤中での安定性が高いことが記載されている。一方、本実施例の変異体Ｅ８２Ｑ／Ｓ１９１Ｒは、８２Ｅを有する親プロテアーゼと比べて安定性が向上しており、Ｓ１９１Ｒの変異がプロテアーゼの安定性をさらに向上させることが示唆された。
　以上、本発明の実施形態を説明したが、これらが、本発明を、説明した特定の実施形態に限定することを意図するものではないことを理解すべきである。本発明の範囲内にある様々な他の変更及び修正は当業者には明白である。
　本明細書に引用されている文献及び特許出願は、あたかもそれが本明細書に完全に記載されているかのように参考として援用される。

Claims (16)

  1. 　配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基を有する、変異プロテアーゼ：
    （ａ）配列番号１の１９１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
    （ｂ）配列番号１の１７位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
    （ｃ）配列番号１の１４１位に相当する位置におけるＡｌａ又はＰｈｅ；
    （ｄ）配列番号１の２４３位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
    （ｅ）配列番号１の３００位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
    （ｆ）配列番号１の３０２位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ；
    （ｇ）配列番号１の３１１位に相当する位置におけるＡｒｇ又はＬｙｓ。
  2. 　前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｂ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基とを有する、請求項１記載の変異プロテアーゼ。
  3. 　前記（ｅ）のアミノ酸残基と、前記（ｆ）のアミノ酸残基とを有する、請求項１記載の変異プロテアーゼ。
  4. 　前記（ａ）～（ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基と、下記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、請求項１記載の変異プロテアーゼ：
    （ｈ）配列番号１の８２位に相当する位置におけるＧｌｎ。
  5. 　前記（ａ）のアミノ酸残基と、前記（ｈ）のアミノ酸残基とを有する、請求項４記載の変異プロテアーゼ。
  6. 　請求項１～５のいずれか１項記載の変異プロテアーゼをコードするポリヌクレオチド。
  7. 　請求項６記載のポリヌクレオチドを含有するベクター。
  8. 　請求項６記載のポリヌクレオチド又は請求項７記載のベクターを含む組換えバチルス属細菌。
  9. 　請求項８記載の組換えバチルス属細菌を用いる変異プロテアーゼの製造方法。
  10. 　請求項１～５のいずれか１項記載の変異プロテアーゼを含有する洗剤組成物。
  11. 　塗布洗浄用の洗剤組成物である、請求項１０記載の洗剤組成物。
  12. 　配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、変異プロテアーゼの製造方法：
    （Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
    （Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
  13. 　配列番号１のアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列からなる親プロテアーゼに対して、下記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、プロテアーゼの高濃度洗剤液中におけるタンパク質汚れに対する洗浄性能の向上方法：
    （Ａ）配列番号１の１９１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｂ）配列番号１の１７位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｃ）配列番号１の１４１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｌａ又はＰｈｅへの置換；
    （Ｄ）配列番号１の２４３位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｅ）配列番号１の３００位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｆ）配列番号１の３０２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換；
    （Ｇ）配列番号１の３１１位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基の、Ａｒｇ又はＬｙｓへの置換。
  14. 　前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）の変異と、前記（Ｂ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異を施すことを含む、請求項１２又は１３記載の方法。
  15. 　前記親プロテアーゼに対して、前記（Ｅ）の変異と、前記（Ｆ）の変異を施すことを含む、請求項１２又は１３記載の方法。
  16. 　前記親プロテアーゼに対して、前記（Ａ）～（Ｇ）からなる群より選択される少なくとも１つの変異と、下記（Ｈ）の変異を施すことを含む、請求項１２又は１３記載の方法：
    （Ｈ）配列番号１の８２位又はこれに相当する位置におけるアミノ酸残基のＧｌｎへの置換。 
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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WO2017213168A1 (ja) * 2016-06-09 2017-12-14 花王株式会社 変異アルカリプロテアーゼ
WO2020184410A1 (ja) * 2019-03-11 2020-09-17 花王株式会社 変異プロテアーゼ

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