JP2023138320A - α－アミラーゼ変異体 - Google Patents

Abstract

【課題】低温で優れたデンプン分解活性を示し、さらに低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で優れた安定性を示すα－アミラーゼを提供する。【解決手段】配列番号２で示されるアミノ酸配列のＨ２３８又はＥ１８５位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、以下の（Ａ）又は（Ｂ）で示されるアミノ酸残基の置換を含む親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体（但し、同アミノ酸配列のＨ２３８、Ｓ２３９及びＧ１７８位に相当する３か所、Ｈ２３８、Ｒ２０９及びＧ１７８位に相当する３か所、並びにＥ１８５、Ｎ１９０及びＧ１７８位に相当する３か所の位置でのアミノ酸残基が置換されたα－アミラーゼ変異体を除く）。（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＴ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６及びＬ３２３位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、同アミノ酸配列のＮ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９及びＳ２３９位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換【選択図】なし

Description

本発明は、α－アミラーゼの変異体に関する。

α－アミラーゼは澱粉産業、醸造産業、繊維産業、医薬品産業及び食品産業等幅広い産業分野で利用されている他、洗浄剤への配合適性が知られており、デンプン質の汚れを除去する成分として自動食器洗浄機用の食器洗浄剤や衣料用洗剤等へ配合されている。

洗浄剤用として有用なα－アミラーゼとしては、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＫＳＭ－１３７８（ＦＥＲＭ ＢＰ－３０４８）株由来のα－アミラーゼＡＰ１３７８（特許文献１）、バチルス リケニフォルミス由来のα－アミラーゼであるターマミルやデュラミル（登録商標）の他、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＤＳＭ１２６４９株由来のα－アミラーゼＡＡ５６０（特許文献２）、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）ＳＰ７２２株由来のα－アミラーゼＳＰ７２２（特許文献３の配列番号４）、サイトファーガ属由来のα－アミラーゼＣｓｐＡｍｙ２（特許文献４）等が知られている。また、これらのα－アミラーゼについては、特定の用途に向けて機能が改善するように改変され、例えば洗剤中における安定性が向上した変異体等が報告されている（特許文献５）。

近年では、環境保護や洗浄コスト軽減の観点から、食器洗浄や洗濯洗浄、特にランドリーでの洗濯洗浄の際の温度を下げることが重要とされ、また洗浄時間の短縮化も望まれている。しかしながら、アミラーゼを含む大部分の酵素の至適温度は、低温洗浄において通常設定される温度よりも高く、このため、多くのデンプン質の汚れは完全に除去することが困難となっている。したがって、低温においても、洗浄性能やデンプン分解活性が保持され、汚れ除去効果が高いα－アミラーゼを見出すことが重要である。

また、近年、低ｐＨ環境での洗浄が洗浄品に対して優しく、一般的に使用されるアルカリ性組成物ほど強力ではないため、ガラス、模様付き食器などの洗浄品を長い間新しい見た目に保つ効果があること、また、布地の悪臭を減少させ、布地上の汚れを捕捉する傾向のあるカルシウム石鹸の放出を助け、ｐＨ反応性の染みに対する性能を向上させ、及び更には布地の感触に対して利益を齎すこと等が知られている。
また、食器洗浄剤においては、主な洗浄対象である食器類を洗浄する以外に、ステンレス製や樹脂製のシンク廻りの洗浄にも用いられるため、水垢汚れに対する洗浄力を発揮するクエン酸などのキレート剤を高濃度で配合される場合がある。
したがって、酸性及び／又はキレート剤配合洗剤は洗浄場面において様々なメリットがあると言え、斯かる洗剤にα－アミラーゼなどの酵素を添加することで、より洗浄性が向上することが期待できると考えられる。

特許文献６には、酸性条件下のデンプン液化プロセスにおいて安定なアミラーゼ、又はキレート剤配合洗剤中で安定なアミラーゼが記載されている。また、特許文献７には、キレート剤配合洗剤中で安定なＳＰ７２２ α－アミラーゼ変異体が記載されている。更に低温においても洗浄性能やデンプン分解活性が保持され、汚れ除去効果が高いα－アミラーゼＹＲ２８８を含有する洗浄剤組成物もまた報告されている（特許文献８）。
しかしながら、酸性又はキレート剤を含む洗剤、特に酸性且つキレート剤を含む洗剤において、高い洗浄力を発揮できることに加えて安定性が高いα－アミラーゼの提供には依然として課題がある。

国際公開第９４／２６８８１号 国際公開第００／６００６０号 国際公開第０６／００２６４３号 国際公開第２０１４／１６４７７７号 国際公開第９８／０４４１２６号 特表２０２１－５０５１６７号公報 特許６１８５２４３号公報 国際公開第２０２２／０１７７２８号

本発明は、低温で優れたデンプン分解活性を示し、さらに低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で優れた安定性を示すα－アミラーゼを提供することに関する。

本発明者らは、低温下で機能するα－アミラーゼを親として、当該親α－アミラーゼと比して低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で安定性が向上したα－アミラーゼ変異体を得ることに成功した。

すなわち、本発明は、以下に係るものである。
１）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＨ２３８又はＥ１８５位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、以下の（Ａ）又は（Ｂ）で示されるアミノ酸残基の置換を含む親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体（但し、同アミノ酸配列のＨ２３８、Ｓ２３９及びＧ１７８位に相当する３か所、Ｈ２３８、Ｒ２０９及びＧ１７８位に相当する３か所、並びにＥ１８５、Ｎ１９０及びＧ１７８位に相当する３か所の位置でのアミノ酸残基が置換されたα－アミラーゼ変異体を除く）。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＴ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６及びＬ３２３位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、同アミノ酸配列のＮ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９及びＳ２３９位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換
２）１）の変異体をコードするポリヌクレオチド。
３）２）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
４）３）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
５）１）の変異体を含む洗浄剤組成物。

本発明によれば、親α－アミラーゼと比して低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で安定性が向上したα－アミラーゼ変異体を提供することができる。斯かるα－アミラーゼ変異体を用いることにより、低ｐＨ、さらにはキレート剤存在下でも安定したデンプン汚れ除去効果を発揮する洗浄が可能となる。

本明細書において、「アミラーゼ」（ＥＣ３．２．１．１；α－Ｄ－（１→４）－グルカングルカノヒドロラーゼ）とは、デンプンならびに他の直鎖又は分岐１，４－グリコシドオリゴ糖若しくは多糖類の加水分解を触媒する酵素群を意味する。α－アミラーゼ活性は、デンプンの酵素的分解による還元末端の生成量を測定することによって決定することができる。また、これに限定されず、例えばＰｈａｄｅｂａｓのような色素架橋デンプンの酵素的分解による色素の遊離を測定することによっても決定することができる（Soininen, K., M. Ceska, and H. Adlercreutz. "Comparison between a new chromogenic α-amylase test (Phadebas) and the Wohlgemuth amyloclastic method in urine." Scandinavian journal of clinical and laboratory investigation 30.3 (1972): 291-297.）。

本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ ｓｉｚｅ ｔｏ ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。

本明細書において、「アミノ酸残基」とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸残基、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リシン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）を意味する。

本明細書において、アミノ酸の位置及び変異体の記載は、公認されているＩＵＰＡＣの１文字のアミノ酸略記を用いて、以下のように表記される。
所定位置のアミノ酸は、[アミノ酸、位置]で表記される。例えば位置２２６のスレオニンは、「Ｔ２２６」と示される。
アミノ酸の「置換」に関しては、[元のアミノ酸、位置、置換されたアミノ酸]で表記される。例えば位置２２６のスレオニンのアラニンへの置換は、「Ｔ２２６Ａ」と示される。
アミノ酸の「欠失」に関しては、[元のアミノ酸、位置、Δ]で表記される。例えば、位置１８１でのセリンの欠失は「Ｓ１８１Δ」と示される。
複数の改変を含む変異体は、加算記号（「＋」）によって表記される。例えば、「Ｒ１７０Ｙ＋Ｇ１９５Ｅ」は、それぞれ、位置１７０のアルギニンのチロシンへの置換と位置１９５のグリシンのグルタミン酸への置換を表す。
１つの位置で異なる改変を導入可能である場合、異なる改変はスラッシュ（「／」）によって分けられ、例えば、「Ｒ１７０Ｙ／Ｅ」は、位置１７０のアルギニンのチロシン又はグルタミン酸への置換を表す。

本明細書において、プロモーター等の制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。

本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。

本明細書において、細胞の機能や性状、形質に対して使用する用語「本来」とは、当該機能や性状、形質が当該細胞に元から存在していることを表すために使用される。対照的に、用語「外来」とは、当該細胞に元から存在するのではなく、外部から導入された機能や性状、形質を表すために使用される。例えば、「外来」遺伝子又はポリヌクレオチドとは、細胞に外部から導入された遺伝子又はポリヌクレオチドである。外来遺伝子又はポリヌクレオチドは、それが導入された細胞と同種の生物由来であっても、異種の生物由来（すなわち異種遺伝子又はポリヌクレオチド）であってもよい。

＜変異体＞
本発明の変異体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＨ２３８又はＥ１８５位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、以下の（Ａ）又は（Ｂ）で示されるアミノ酸残基の置換を含む親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するものである。但し、同アミノ酸配列のＨ２３８、Ｓ２３９及びＧ１７８位に相当する３か所、Ｈ２３８、Ｒ２０９及びＧ１７８位に相当する３か所、並びにＥ１８５、Ｎ１９０及びＧ１７８位に相当する３か所の位置でのアミノ酸残基が置換されたα－アミラーゼ変異体は除かれる。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＴ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６及びＬ３２３位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、同アミノ酸配列のＮ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９及びＳ２３９位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換

すなわち、「変異体」は、親α－アミラーゼにおいて、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＨ２３８又はＥ１８５位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、上記（Ａ）又は（Ｂ）で示されるアミノ酸残基の置換が組み合わせて行われたα－アミラーゼ活性を有するポリペプチドを意味する。斯かる所定位置のアミノ酸残基の置換は、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下で安定性を向上させるための改変であり、したがって、当該変異体は、親α－アミラーゼと比して低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での向上した安定性を有する。

「親α－アミラーゼ」とは、本発明の変異体をもたらすために改変が行われる基準α－アミラーゼを意味し、本発明においては、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するα－アミラーゼである。親は、天然（野生型）ポリペプチド又はその変異体であり得る。
斯かる親α－アミラーゼとしては、配列番号２で示されるアミノ酸配列と好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の配列同一性を有するものが挙げられる。

ここで、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼは、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにおいて、ＷＰ＿１００３４６３６２．１として登録されているα－アミラーゼＹＲ２８８（国際公開第２０２２／０１７７２８号公報）を構成するアミノ酸配列（配列番号４）において、Ｒ１７８及びＴ１８０に対応するアミノ酸残基が欠失した（Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ）α－アミラーゼである。斯かるα－アミラーゼは、洗剤中での安定性がＹＲ２８８よりも飛躍的に向上している（特願２０２１－１３５７４６）。したがって、配列番号２で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９０％、好ましくは少なくともは９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列において、配列番号４で示されるアミノ酸配列のＲ１７８、Ｇ１７９、Ｔ１８０及びＧ１８１の各位置に相当する位置から選ばれる２箇所以上のアミノ酸残基を欠失させたα－アミラーゼ変異体は、配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼを含め、いずれも本発明の変異体の親α－アミラーゼとなり得る。
ここで、２箇所以上のアミノ酸残基の欠失としては、好ましくはＲ１７８Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｔ１８０Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１７９Δ、Ｒ１７８Δ＋Ｇ１８１Δ、Ｇ１７９Δ＋Ｇ１８１Δ等が挙げられ、Ｒ１７８Δ＋Ｔ１８０Δがより好ましい。
本発明のα－アミラーゼ変異体における変異位置は、当該配列番号２で示されるアミノ酸配列のアミノ酸番号に基づいて番号付けされる。
なお、配列番号２で示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列からなるα－アミラーゼとしては、この他に、バチルス フレクサス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｌｅｘｕｓ）由来のα－アミラーゼであるＤＥ０１７８や、バチルス エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐ．）由来のα－アミラーゼであるＲＵ２Ｃなどが存在する（特願２０２０－１２１６２６）。

本発明において、アミノ酸配列上の「相当する位置」は、目的配列と参照配列（本発明においては配列番号２で示されるアミノ酸配列）とを、最大の相同性を与えるように整列（アラインメント）させることにより決定することができる。アミノ酸配列のアラインメントは、公知のアルゴリズムを用いて実行することができ、その手順は当業者に公知である。例えば、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗマルチプルアラインメントプログラム（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ，１９９４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：４６７３－４６８０）をデフォルト設定で用いることにより、行うことができる。あるいは、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗの改訂版であるＣｌｕｓｔａｌ Ｗ２やＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａを使用することもできる。Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｗ２及びＣｌｕｓｔａｌ ｏｍｅｇａは、例えば、欧州バイオインフォマティクス研究所（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ：ＥＢＩ［ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ］）や、国立遺伝学研究所が運営する日本ＤＮＡデータバンク（ＤＤＢＪ［ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐ／ｓｅａｒｃｈｅｓ－ｊ．ｈｔｍｌ］）のウェブサイト上で利用することができる。上述のアラインメントにより参照配列の任意の位置にアラインされた目的配列の位置は、当該任意の位置に「相当する位置」とみなされる。

当業者であれば、上記で得られたアミノ酸配列のアラインメントを、最適化するようにさらに微調整することができる。そのような最適アラインメントは、アミノ酸配列の類似性や挿入されるギャップの頻度等を考慮して決定するのが好ましい。ここでアミノ酸配列の類似性とは、２つのアミノ酸配列をアラインメントしたときにその両方の配列に同一又は類似のアミノ酸残基が存在する位置の数の全長アミノ酸残基数に対する割合（％）をいう。類似のアミノ酸残基とは、タンパク質を構成する２０種のアミノ酸のうち、極性や電荷の点で互いに類似した性質を有しており、いわゆる保存的置換を生じるようなアミノ酸残基を意味する。そのような類似のアミノ酸残基からなるグループは当業者にはよく知られており、例えば、アルギニンとリシン又はグルタミン；グルタミン酸とアスパラギン酸又はグルタミン；セリンとスレオニン又はアラニン；グルタミンとアスパラギン又はアルギニン；ロイシンとイソロイシン等がそれぞれ挙げられるが、これらに限定されない。

上記所定位置で行われるアミノ酸残基の「置換」は、ある位置にあるアミノ酸を異なるアミノ酸で置き換えることを意味する。
本発明において、アミノ酸残基の置換箇所は２箇所以上であり得るが、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性の点から、３個所以上であるのが好ましく、より好ましくは２～２０箇所、より好ましくは３～１９箇所が挙げられる。
なお、当該変異体は、洗浄性能、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性向上の点から、配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、好ましくは少なくともは８５％、より好ましくは少なくとも９０％、好ましくは少なくともは９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を有するα－アミラーゼであるのが好ましい。
また、変異体は、上記変異体としての性質を保持する限り、任意の数の保存的アミノ酸置換を含み得る。

（Ａ）で示されるアミノ酸残基の置換は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＴ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６及びＬ３２３位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換であるが、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性の点から、好ましくは２箇所以上の置換であるのが好ましく、より好ましくは３～６個所である。
また、上記Ｔ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６及びＬ３２３位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換に加えて、さらに、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９、Ｓ２３９、Ｇ１７８、Ｍ１９７、Ｆ２０３、Ｙ２４０、Ｅ２５５、Ｙ３５８、Ｗ４０６、Ｇ４７４の各位置に相当する位置から選択される１箇所以上、好ましくは２箇所以上、より好ましくは５箇所以上、より好ましくは８箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換を組み合わせることが、洗浄性能及び低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性向上の点から好ましい。

（Ｂ）で示されるアミノ酸残基の置換は、配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、同アミノ酸配列のＮ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９及びＳ２３９位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換である。

本発明のα－アミラーゼ変異体における、上記のＨ２３８、Ｅ１８５、Ｔ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６、Ｌ３２３、Ｇ１７８、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９、Ｓ２３９、Ｍ１９７、Ｆ２０３、Ｙ２４０、Ｅ２５５、Ｙ３５８、Ｗ４０６、Ｇ４７４の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の置換の好適な態様を以下に示す。
すなわち、Ｈ２３８は、Ｆへの置換（Ｈ２３８Ｆ）が好ましく；
Ｅ１８５は、Ｐへの置換（Ｅ１８５Ｐ）が好ましく；
Ｔ１１６は、Ｑへの置換（Ｔ１１６Ｑ）が好ましく；
Ａ１８１は、Ｔ、Ｅ又はＱへの置換（Ａ１８１Ｔ／Ｅ／Ｑ）が好ましく；
Ａ１９９は、Ｅへの置換（Ａ１９９Ｅ）が好ましく；
Ａ２７５は、Ｎへの置換（Ａ２７５Ｎ）が好ましく；
Ｖ２７７は、Ｔへの置換（Ｖ２７７Ｔ）が好ましく；
Ａ２８６は、Ｖへの置換（Ａ２８６Ｖ）が好ましく；
Ｌ３２３は、Ｆへの置換（Ｌ３２３Ｆ）が好ましく；
Ｇ１７８は、Ｈへの置換（Ｇ１７８Ｈ）が好ましく；、
Ｎ１２６は、Ｙへの置換（Ｎ１２６Ｙ）が好ましく；
Ｔ１２９は、Ｉへの置換（Ｔ１２９Ｉ）が好ましく；
Ｎ１９０は、Ｆへの置換（Ｎ１９０Ｆ）が好ましく；
Ｒ２０９は、Ｌ、Ｖ又はＩへの置換（Ｒ２０９Ｌ／Ｖ／Ｉ）が好ましく；
Ｓ２３９は、Ａ、Ｑ、Ｄ、Ｌ、Ｙ、Ｐ又はＨへの置換（Ｓ２３９Ａ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｐ／Ｈ）が好ましく；
Ｍ１９７は、Ｌ、Ｔ、Ａ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、Ｖ又はＩへの置換（Ｍ１９７Ｌ／Ｔ／Ａ／Ｎ／Ｑ／Ｓ／Ｖ／Ｉ）が好ましく；
Ｆ２０３は、Ｙへの置換（Ｆ２０３Ｙ）が好ましく； Ｙ２４０は、Ｆへの置換（Ｙ２４０Ｆ）が好ましく；
Ｅ２５５は、Ｔへの置換（Ｅ２５５Ｔ）が好ましく；
Ｙ３５８は、Ｃ、Ｍ、Ｌ又はＶへの置換（Ｙ３５８Ｃ／Ｍ／Ｌ／Ｖ）が好ましく；
Ｗ４０６は、Ｐへの置換（Ｗ４０６Ｐ）が好ましく；
Ｇ４７４は、Ａ、Ｐ、Ｅ、Ｓ、Ｆ、Ｒ又はＫへの置換（Ｇ４７４Ａ／Ｐ／Ｅ／Ｓ／Ｆ／Ｒ／Ｋ）が好ましい。

次に、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性向上に寄与する好適な変異の組み合わせを、下記表１（表１－１～１－３）に示す。したがって、当該組み合わせ変異を少なくとも有する変異体は、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性向上に特に寄与する変異体である。

次に、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性向上に寄与する、より好適な変異の組み合わせを、下記表２に示す。したがって、当該組み合わせ変異を少なくとも有する変異体は、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性の向上に特に寄与する変異体である。

＜本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド＞
本発明の変異体は、当技術分野で公知の各種の変異導入技術を使用して製造することができる。例えば、その基準アミノ酸配列をコードする親α－アミラーゼ遺伝子（基準α－アミラーゼ遺伝子）内の改変対象のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドを、改変後のアミノ酸残基をコードするポリヌクレオチドに変異させ、更にその変異遺伝子から変異体を発現させることにより、製造することができる。

本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。

本発明において、親α－アミラーゼのアミノ酸残基を変異させる手段としては、当技術分野で公知の各種変異導入技術を使用することができる。例えば、親α－アミラーゼのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチド（以下、親遺伝子ともいう）において、変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を、変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列に変異させることにより、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。

親遺伝子への目的の変異の導入は、基本的には、当業者に周知の様々な部位特異的変異導入法を用いて行うことができる。部位特異的変異導入法は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法などの任意の手法により行うことができる。市販の部位特異的変異導入用キット（例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ ＩＩ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｋｉｔ等）を使用することもできる。

親遺伝子への部位特異的変異導入は、最も一般的には、導入すべきヌクレオチド変異を含む変異用プライマーを用いて行うことができる。該変異用プライマーは、親遺伝子における変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列を含む領域にアニーリングし、かつその変異すべきアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）に代えて変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）を有するヌクレオチド配列を含むように設計すればよい。変異前及び変異後のアミノ酸残基をコードするヌクレオチド配列（コドン）は、当業者であれば通常の教科書等に基づいて適宜認識し選択することができる。あるいは、部位特異的変異導入は、導入すべきヌクレオチド変異を含む相補的な２つのプライマーを別々に用いて変異部位の上流側及び下流側をそれぞれ増幅したＤＮＡ断片を、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７（１）：ｐ６１－６８）により１つに連結する方法を用いることもできる。

親遺伝子を含む鋳型ＤＮＡは、上述したα－アミラーゼを産生する微生物から、常法によりゲノムＤＮＡを抽出するか、又はＲＮＡを抽出し逆転写によりｃＤＮＡを合成することによって、調製することができる。あるいは、親α－アミラーゼのアミノ酸配列に基づいて、対応するヌクレオチド配列を化学合成して鋳型ＤＮＡとして用いてもよい。配列番号２で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼをコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号１に、配列番号４で示されるアミノ酸配列からなるα－アミラーゼ（ＹＲ２８８）をコードする塩基配列を含むＤＮＡ配列を配列番号３に示した。

変異用プライマーは、ホスホロアミダイト法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ４ｅｓｅａｒｃｈ，１９８９，１７：７０５９－７０７１）等の周知のオリゴヌクレオチド合成法により作製することができる。そのようなプライマー合成は、例えば市販のオリゴヌクレオチド合成装置（ＡＢＩ社製など）を用いて実施することもできる。該変異用プライマーを含むプライマーセットを使用し、親遺伝子を鋳型ＤＮＡとして上記のような部位特異的変異導入を行うことにより、目的の変異を有する本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを得ることができる。

当該本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドは、一本鎖又は２本鎖のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡもしくは他の人工核酸を含み得る。該ＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡは、化学合成されていてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に加えて、非翻訳領域（ＵＴＲ）のヌクレオチド配列を含んでいてもよい。また当該ポリヌクレオチドは、本発明の変異ポリペプチド産生用の形質転換体の種にあわせて、コドン至適化されていてもよい。各種生物が使用するコドンの情報は、Ｃｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅ（[www.kazusa.or.jp/codon/]）から入手可能である。

＜ベクター又はＤＮＡ断片＞
得られた本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクター等の任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明の変異体を組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ Ｊ Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）等のシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）等のバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、等が挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ等）を用いることもできる。

上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド（すなわち変異体遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。なお、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。

上記プロモーター領域、ターミネーター、分泌シグナル領域等の制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列等が挙げられる。

あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。

上記本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ ｂｙ ｏｖｅｒｌａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。

＜形質転換細胞＞
本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。

宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ Ｍａｒｂｕｒｇ Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｉｚｈｏｐｕｓ）などが挙げられる。

宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。

あるいは、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。

斯くして得られた、本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明の変異体が生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。

あるいは、本発明の変異体は、無細胞翻訳系を使用して本発明の変異体をコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸等の試薬を加えて、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。

上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明の変異体は、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等を単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。このとき、形質転換体内のベクター上で本発明のα－アミラーゼ変異体をコードする遺伝子と分泌シグナル配列が作動可能に連結されている場合、生成されたタンパク質は細胞外に分泌されるため、より容易に培養物から回収され得る。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。

斯くして得られる本発明の変異体は、親α－アミラーゼと比して、低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での向上した安定性を有する。
「低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での向上した安定性」とは、親α－アミラーゼと比して向上した、低ｐＨ環境下及び／又はキレート剤存在下でのα－アミラーゼ活性の維持能力を意味する。
ここで、低ｐＨとは、弱酸性、すなわちｐＨ４～７、好ましくはｐＨ４．５～６．５を指し、低ｐＨ環境下での安定性とは、ｐＨが約４～７の洗浄剤組成物中でα－アミラーゼ活性が維持されること、及び洗浄剤組成物を水に溶解または希釈して調製したｐＨ約４～７の洗浄水中でα－アミラーゼ活性が維持されることを意味する。

キレート剤としては、後述する、アミノカルボン酸系キレート剤、ホスホン酸系キレート剤、ヒドロキシカルボン酸系キレート剤及び多価カルボン酸系キレート剤等の洗浄剤組成物に配合され得るキレート剤が挙げられる。

斯かる低ｐＨ及び／又はキレート剤存在下での安定性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、キレート剤を含むｐＨ４～７の洗浄用組成物に酵素溶液を添加して、所定時間処理の前後でα－アミラーゼ活性を測定し、処理前のサンプルの活性値を初発活性として、処理後の活性値の初発活性に対する割合を残存活性（％）とすることで求めることができる。

本発明の変異体は、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に４０℃以下の低温洗浄に適し、酸性かつキレート剤を配合した洗浄剤組成物への配合用酵素として有用である。

洗浄剤組成物中への本発明の変異体の配合量は、当該タンパク質が活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上、より好ましくは５０ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また１～５０００ｍｇであるのが好ましく、１０～１０００ｍｇであるのがより好ましく、５０～５００ｍｇであるのがより好ましい。

洗浄剤組成物は、本発明の変異体以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼ等である。このうち、本発明のタンパク質とは異なるアミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、リパーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼ等が好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
プロテアーゼとしては市販のＡｌｃａｌａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ｋａｎｎａｓｅ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ Ｕｎｏ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標；ＢＡＳＦ社）、またＫＡＰ（花王）、等が挙げられる。
セルラーゼとしてはＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０－３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）等が挙げられる。
アミラーゼとしてはＴｅｒｍａｍｙｌ、Ｄｕｒａｍｙｌ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ Ｐｌｕｓ、Ａｍｐｌｉｆｙ Ｐｒｉｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、またＫＡＭ（花王）、等が挙げられる。
リパーゼとしてはＬｉｐｏｌａｓｅ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標；ノボザイムズ社）等が挙げられる。

洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。

（１）界面活性剤
界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５～６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０～４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０～９０質量％配合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。

洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。

陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８～２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、内部オレフィンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、α－スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０～１４の、より好ましくは１２～１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキレン鎖の炭素数が１２～２０の、より好ましくは１６～１８の内部オレフィンスルホンから選ばれる一種以上の陰イオン性界面活性剤が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。内部オレフィンスルホン酸は例えばＷＯ２０１７/０９８６３７を参照することができる。

非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシド等のアルキレンオキシドを４～２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５～１５．０、好ましくは１１．０～１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。

（２）二価金属イオン捕捉剤
二価金属イオン捕捉剤は０．０１～５０質量％、好ましくは５～４０質量％配合される。本発明の洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１～１０μｍ、特に０．１～５μｍのものが好適に使用される。

（３）アルカリ剤
アルカリ剤は０．０１～８０質量％、好ましくは１～４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。

（４）再汚染防止剤
再汚染防止剤は０．００１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千～１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。

（５）漂白剤
例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１～１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１～１０質量％配合することができる。

（６）蛍光剤
洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としては、ビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１～２質量％配合するのが好ましい。

（７）キレート剤
キレート剤は、例えば、汚れの易洗浄化や、洗浄時の水硬度の低減のために配合される。
斯かるキレート剤としては、アミノカルボン酸系キレート剤、ホスホン酸系キレート剤、ヒドロキシカルボン酸系キレート剤、多価カルボン酸系キレート剤等が挙げられる。
アミノカルボン酸系キレート剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、メチルグリシン二酢酸（ＭＧＤＡ）、トリエチレンテトラミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、グルタミン酸二酢酸（ＧＬＤＡ）、ヒドロキシエチルイミノ二酢酸（ＨＩＤＡ）、ジヒドロキシエチルグリシン（ＤＨＥＧ）、アスパラギン酸二酢酸（ＡＳＤＡ）、エチレンジアミンコハク酸（ＥＤＤＳ）及びこれらの塩等が挙げられる。
ホスホン酸系キレート剤としては、ヒドロキシエチリデンジホスホン酸（ＨＥＤＰ）、ニトリロトリスメチレンホスホン酸（ＮＴＭＰ）、ホスホノブタントリカルボン酸（ＰＢＴＣ）、エチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）及びこれらの塩等が挙げられる。
ヒドロキシカルボン酸系キレート剤としては、クエン酸、リンゴ酸、酒石酸、グルコン酸、乳酸及びこれらの塩等が挙げられる。
多価カルボン酸系キレート剤としては、コハク酸、シュウ酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、マロン酸及びこれらの塩等が挙げられる。

（８）緩衝剤
緩衝剤は、洗浄液の低ｐＨを維持可能な緩衝系を生成するために配合される。斯かる緩衝剤としては、有機酸とその塩との混合物、例えばポリカルボン酸とその塩の混合物、好ましくは、クエン酸とクエン酸塩の混合物が挙げられる。

（９）その他の成分
洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル[商品名]、安息香酸など）、その他の添加剤を含有させることができる。

洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明のタンパク質及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。

斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられ、より好ましくはランドリー用衣料洗浄剤（ランドリー用洗濯洗剤）、手洗いによる食器洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤が挙げられる。
また、当該洗浄剤組成物は、低温（例えば、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上）での使用に適する。

上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞配列番号２で示されるアミノ酸配列のＨ２３８又はＥ１８５位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、以下の（Ａ）又は（Ｂ）で示されるアミノ酸残基の置換を含む親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体（但し、同アミノ酸配列のＨ２３８、Ｓ２３９及びＧ１７８位に相当する３か所、Ｈ２３８、Ｒ２０９及びＧ１７８位に相当する３か所、並びにＥ１８５、Ｎ１９０及びＧ１７８位に相当する３か所の位置でのアミノ酸残基が置換されたα－アミラーゼ変異体を除く）。
（Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＴ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６及びＬ３２３位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換
（Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、同アミノ酸配列のＮ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９及びＳ２３９位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換
＜２＞前記（Ａ）で示されるアミノ酸残基の置換が、さらに配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９、Ｓ２３９、Ｇ１７８、Ｍ１９７、Ｆ２０３、Ｙ２４０、Ｅ２５５、Ｙ３５８、Ｗ４０６及びＧ４７４の各位置に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含む＜１＞の変異体。
＜３＞前記（Ａ）で示される配列番号２で示されるアミノ酸配列のＴ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６及びＬ３２３位に相当する位置から選択される２箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含む、＜１＞又は＜２＞の変異体。
＜４＞前記Ｈ２３８、Ｅ１８５、Ｔ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６、Ｌ３２３、Ｇ１７８、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９及びＳ２３９の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の置換が、それぞれＨ２３８Ｆ、Ｅ１８５Ｐ、Ｔ１１６Ｑ、Ａ１８１Ｔ／Ｅ／Ｑ、Ａ１９９Ｅ、Ａ２７５Ｎ、Ｖ２７７Ｔ、Ａ２８６Ｖ、Ｌ３２３Ｆ、Ｇ１７８Ｈ、Ｎ１２６Ｙ、Ｔ１２９Ｉ、Ｎ１９０Ｆ、Ｒ２０９Ｖ／Ｌ／Ｉ、Ｓ２３９Ａ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｐ／Ｈである、＜１＞～＜３＞のいずれかの変異体。
＜５＞変異体が、前記表１－１、表１－２及び表２で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、＜１＞の変異体。
＜６＞＜１＞～＜５＞のいずれかの変異体をコードするポリヌクレオチド。
＜７＞＜６＞のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜８＞＜７＞のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜９＞微生物である、＜８＞の形質転換細胞。
＜１０＞＜１＞～＜５＞の変異体を含む洗浄剤組成物。
＜１１＞衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、＜１０＞の洗浄剤組成物。
＜１２＞粉末又は液体である、＜１１＞の洗浄剤組成物。
＜１３＞弱酸性、好ましくはｐＨ４～７である、＜１１＞又は＜１２＞の洗浄剤組成物。
＜１４＞キレート剤を含む、＜１１＞～＜１３＞のいずれかの洗浄剤組成物。
＜１５＞キレート剤が、アミノカルボン酸系キレート剤、ホスホン酸系キレート剤、ヒドロキシカルボン酸系キレート剤又は多価カルボン酸系キレート剤である＜１４＞の洗浄剤組成物。

（１）ＹＲ２８８変異体発現プラスミドの構築
下記の実施例に記載のＹＲ２８８変異体の構築方法を記す。５’末端にリバースプライマーとの相補配列を１５塩基有し変異配列を含むフォワードプライマー、及び変異配列の直前の塩基を５’末端とするリバースプライマーを変異導入用プライマー対として用いた。特開２０２２－０１９６０１の実施例に記載のＹＲ２８８ Ｒ１７８Δ Ｔ１８０Δ発現プラスミド又は本実施例にて作成したＹＲ２８８変異体発現プラスミドを鋳型として、変異導入用プライマー対を使用してＰＣＲを行った。複数断片を連結する場合、それぞれのＰＣＲ産物を用いてＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ，ＨＤ Ｃｌｏｎｉｎｇ ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のプロトコルに従ってＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応を行った。ＰＣＲ産物又はＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応液を枯草菌にプロトプラスト法により形質転換して目的のＹＲ２８８変異体発現プラスミドを保持する形質転換体を取得した。

（２）酵素生産培養
１０ｐｐｍテトラサイクリンを添加したＬＢ培地５００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに（１）で得た組換え枯草菌コロニーを植菌した後、３２℃、１５００ｒｐｍで一晩培養した。翌日、培養液２０μＬを２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１０ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）５００μＬを分注した９６穴ディープウェルプレートに植菌し、３２℃、１５００ｒｐｍで２日間培養した後、菌体から産生された酵素を含む培養上清を遠心分離により回収し酵素溶液とした。

（３）培養上清のタンパク質濃度測定
培養上清のタンパク質濃度測定にはプロテインアッセイラピッドキット ワコーII（富士フイルム和光純薬株式会社）を用いた。アミラーゼ発現カセットを持たないｐＨＹ３００ＰＬＫ（タカラバイオ）導入株の培養上清のタンパク質濃度をブランクとすることで培養上清中のアミラーゼの濃度を算出した。

（４）アミラーゼ変異体安定性評価（１）
実施例（１）に記載の方法によりＹＲ２８８ Ｒ１７８Δ+Ｔ１８０Δ（配列番号２）を親ポリペプチドとして様々な変異体を構築し、これら変異体の酸性かつ高キレート剤存在下での保存安定性を評価した。
２００ｍＭ ＥＤＴＡ－２ＮＡ及び５０ｍＭＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ５．０）を等量ずつ混合した溶液にアミラーゼ溶液を添加し、４０℃で３０分間インキュベートした後に、５０ｍＭＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ８．０）にて１０倍希釈したものを用いて活性測定を行った。４０℃処理前のサンプルの活性値を初発活性として、処理後の活性値の初発活性に対する割合を残存活性（％）とした。表３にその結果を示す。いずれの変異体も酸性かつキレート剤存在下において高い安定性を示した。

（５）アミラーゼ変異体安定性評価（２）
ＡＡＴＣＣ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ＷＩＴＨＯＵＴ Ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒを１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）で１０倍希釈したものにアミラーゼ溶液を添加し、５０℃で１時間インキュベートした後に５０ｍＭＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ８．０）にて１０倍希釈したものを用いて活性測定を行った。５０℃処理前のサンプルの活性値を初発活性として、処理後の活性値の初発活性に対する割合を残存活性（％）とした。表４（表４－１、表４－２及び表４－３）にその結果を示す。いずれの変異体も希釈洗剤中で高い安定性を示した。

（６）アミラーゼ変異体安定性評価（３）
ＡＡＴＣＣ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ＷＩＴＨＯＵＴ Ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒを１００ｍＭクエン酸バッファー（ｐＨ５．０）で１０倍希釈したものにアミラーゼ溶液を添加し、５０℃で１８時間インキュベートした後に５０ｍＭＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ８．０）にて１０倍希釈したものを用いて活性測定を行った。５０℃処理前のサンプルの活性値を初発活性として、処理後の活性値の初発活性に対する割合を残存活性（％）とした。表５（表５－１、表５－２）にその結果を示す。いずれの変異体も希釈洗剤中で高い安定性を示した。

（７）アミラーゼ変異体安定性評価（４）
ＡＡＴＣＣ Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｓｔａｎｄａｒｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔ ＷＩＴＨＯＵＴ Ｂｒｉｇｈｔｅｎｅｒに終濃度１００ｍＭとなるように５０％ｗ／ｗクエン酸溶液を加え、１ＭＮａＯＨにてｐＨ５．２に合わせた。この洗剤にアミラーゼ溶液を添加し、４０℃で１週間インキュベートした後に５０ｍＭＢｒｉｔｔｏｎ－Ｒｏｂｉｎｓｏｎバッファー（ｐＨ８．０）にて１０倍希釈したものを用いて活性測定を行った。４０℃処理前のサンプルの活性値を初発活性として、処理後の活性値の初発活性に対する割合を残存活性（％）とした。表６にその結果を示す。いずれの変異体も洗剤中で高い安定性を示した。

Claims (14)

1. 配列番号２で示されるアミノ酸配列のＨ２３８又はＥ１８５位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、以下の（Ａ）又は（Ｂ）で示されるアミノ酸残基の置換を含む親α－アミラーゼの変異体であって、前記親α－アミラーゼ又はα－アミラーゼ変異体は配列番号２で示されるアミノ酸配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する、α－アミラーゼ変異体（但し、同アミノ酸配列のＨ２３８、Ｓ２３９及びＧ１７８位に相当する３か所、Ｈ２３８、Ｒ２０９及びＧ１７８位に相当する３か所、並びにＥ１８５、Ｎ１９０及びＧ１７８位に相当する３か所の位置でのアミノ酸残基が置換されたα－アミラーゼ変異体を除く）。
   （Ａ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＴ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６及びＬ３２３位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換
   （Ｂ）配列番号２で示されるアミノ酸配列のＧ１７８位に相当する位置でのアミノ酸残基の置換と、同アミノ酸配列のＮ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９及びＳ２３９位に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換
2. 前記（Ａ）で示されるアミノ酸残基の置換が、さらに配列番号２で示されるアミノ酸配列のＮ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９、Ｓ２３９、Ｇ１７８、Ｍ１９７、Ｆ２０３、Ｙ２４０、Ｅ２５５、Ｙ３５８、Ｗ４０６及びＧ４７４の各位置に相当する位置から選択される１箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含む請求項１の変異体。
3. 前記（Ａ）で示される配列番号２で示されるアミノ酸配列のＴ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６及びＬ３２３位に相当する位置から選択される２箇所以上の位置でのアミノ酸残基の置換を含む、請求項１又は２記載の変異体。
4. 前記Ｈ２３８、Ｅ１８５、Ｔ１１６、Ａ１８１、Ａ１９９、Ａ２７５、Ｖ２７７、Ａ２８６、Ｌ３２３、Ｇ１７８、Ｎ１２６、Ｔ１２９、Ｎ１９０、Ｒ２０９及びＳ２３９の各位置に相当する位置のアミノ酸残基の置換が、それぞれＨ２３８Ｆ、Ｅ１８５Ｐ、Ｔ１１６Ｑ、Ａ１８１Ｔ／Ｅ／Ｑ、Ａ１９９Ｅ、Ａ２７５Ｎ、Ｖ２７７Ｔ、Ａ２８６Ｖ、Ｌ３２３Ｆ、Ｇ１７８Ｈ、Ｎ１２６Ｙ、Ｔ１２９Ｉ、Ｎ１９０Ｆ、Ｒ２０９Ｖ／Ｌ／Ｉ、Ｓ２３９Ａ／Ｑ／Ｄ／Ｌ／Ｙ／Ｐ／Ｈである、請求項１～３のいずれか１項に記載の変異体。
5. 変異体が、下記表１－１、表１－２、表１－３及び表２で示される変異の組み合わせから選ばれる変異を少なくとも含む、請求項１に記載の変異体。
   

   

   
6. 請求項１～５のいずれか１項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
7. 請求項６に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
8. 請求項７に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
9. 微生物である、請求項８に記載の形質転換細胞。
10. 請求項１～５のいずれか１項に記載の変異体を含む洗浄剤組成物。
11. 衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項１０に記載の洗浄剤組成物。
12. 粉末又は液体である、請求項１１に記載の洗浄剤組成物。
13. 弱酸性である、請求項１１又は１２に記載の洗浄剤組成物。
14. キレート剤を含む、請求項１１～１３のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物。