WO2023199946A1 - 新規リパーゼ - Google Patents

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WO2023199946A1
WO2023199946A1 PCT/JP2023/014863 JP2023014863W WO2023199946A1 WO 2023199946 A1 WO2023199946 A1 WO 2023199946A1 JP 2023014863 W JP2023014863 W JP 2023014863W WO 2023199946 A1 WO2023199946 A1 WO 2023199946A1
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lipase
cleaning
amino acid
acid sequence
present
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貴大 日置
三佳 寺井
彰人 川原
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花王株式会社
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
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    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/18—Carboxylic ester hydrolases (3.1.1)
    • C12N9/20—Triglyceride splitting, e.g. by means of lipase

Definitions

  • the present invention relates to a novel lipase.
  • Lipases are useful in a variety of applications, including laundry detergents, dishwashing detergents, oil and fat processing, pulp processing, feed, and pharmaceutical intermediate synthesis. In cleaning, lipases contribute to the removal of oil-containing soils by hydrolyzing triglycerides to produce fatty acids.
  • TLL lipase derived from Thermomyces lanuginosus
  • LIPOLASE registered trademark
  • Patent Document 1 discloses that lipase Lipr139 derived from Cedecea sp-16640 strain has superior cleaning performance compared to TLL.
  • US Pat. No. 5,001,203 discloses variants of lipases from Proteus bacteria (hereinafter PvLip) that have improved cleaning performance when compared to one or more reference lipolytic enzymes.
  • PvLip Proteus bacteria
  • Patent Document 3 discloses that metagenome-derived lipase Lipr138 has superior cleaning performance compared to TLL.
  • Patent Document 1 Japanese Translation of PCT Publication No. 2015-523078 (Patent Document 2) International Publication No. 2020/046613 (Patent Document 3) Japanese Patent Publication No. 2015-525248
  • the present invention relates to the following 1) to 6).
  • a lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 91% identity thereto.
  • a polynucleotide encoding the lipase described in 1).
  • a transformed cell containing the vector or DNA fragment of 3).
  • a cleaning composition containing the lipase according to 1).
  • Lipase activity of each lipase in surfactant solution Lipase activity in model washing solution containing surfactant for each lipase. Detergent power of each lipase in a model cleaning solution containing a surfactant.
  • lipase refers to triacylglycerol lipase (EC3.1.1.3), and refers to a group of enzymes that have the activity of hydrolyzing triglycerides to produce fatty acids. Lipase activity can be determined by measuring the rate of increase in absorbance associated with the release of 4-nitrophenol by hydrolysis of 4-nitrophenyl octoate. Specific procedures for measuring lipase activity are detailed in the Examples below.
  • the identity of amino acid sequences or nucleotide sequences is calculated by the Lipman-Pearson method (Science, 1985, 227: 1435-1441). Specifically, genetic information processing software GENETYX Ver. It is calculated by performing an analysis using a search homology program of 12 with Unit size to compare (ktup) set to 2.
  • operable linkage between a control region such as a promoter and a gene means that the gene and the control region are linked so that the gene can be expressed under the control of the control region. means. Procedures for "operably linking" genes and control regions are well known to those skilled in the art.
  • upstream and downstream with respect to a gene refer to upstream and downstream of the gene in the direction of transcription.
  • a gene located downstream of a promoter means that the gene is located on the 3' side of the promoter in the DNA sense strand
  • upstream of the gene means that the gene is located on the 5' side of the promoter in the DNA sense strand. means the area on the side.
  • lipase It is known that the activity of lipase is inhibited by surfactants contained in cleaning compositions. As far as the present inventors actually verified, among the known lipases whose suitability for washing has been disclosed, all of TLL, Lipr139 and PvLip were significantly inhibited in activity by the coexistence of a surfactant. Inhibition of activity by surfactants is a major problem common to cleaning lipases. Furthermore, lipases are often used together with surfactants not only in cleaning applications but also in industrial applications such as pulp processing, and inhibition of activity by surfactants is a problem for all industrial lipases. There is a need for a lipase that is less inhibited by surfactants and exhibits high cleaning effects.
  • the lipase of the present invention has significantly high resistance to activity inhibition by surfactants, and exhibits excellent cleaning effects even in the presence of surfactants.
  • the lipase of the present invention is a lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 91% identity thereto.
  • the lipase of the present invention has significantly high resistance to inhibition of lipase activity by surfactants, and exhibits significantly high detergency even in the presence of surfactants.
  • Amino acid sequences having at least 91% identity include amino acid sequences in which one or more amino acids have been deleted, inserted, substituted, or added.
  • amino acid sequence in which one or more amino acids are deleted, inserted, substituted, or added refers to 1 to 30, preferably 20 or less, more preferably 10 or less, and even more preferably 5 or less. Examples include amino acid sequences in which amino acids are deleted, inserted, substituted, or added.
  • a lipase consisting of an amino acid sequence having at least 91% identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 is an artificially produced variant of the lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14.
  • the mutant can be produced by, for example, introducing a mutation into the gene encoding the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 by known mutagenesis methods such as ultraviolet irradiation or site-directed mutagenesis. It can be produced by expressing a gene having the mutation and selecting a protein having the desired lipase activity. Procedures for creating such variants are well known to those skilled in the art.
  • the lipase of the present invention has an amino acid sequence different from conventionally isolated or purified lipases and proteins predicted as triacylglycerol lipase in the NCBI protein sequence database.
  • Conventionally isolated or purified lipases include, for example, lipase TLL derived from Thermomyces lanuginosus (SEQ ID NO: 18), Cedecea sp.
  • Lipase Lipr139 (SEQ ID NO: 2) derived from -16640 strain, lipase derived from a Proteus bacterium (hereinafter referred to as PvLip, SEQ ID NO: 4) disclosed as a parent enzyme of a group of lipase mutants suitable for washing in Patent Document 2.
  • metagenome-derived lipase Lipr138 (SEQ ID NO: 16), which is disclosed as a lipase suitable for washing in Patent Document 3, and the like.
  • proteins estimated as triacylglycerol lipase in the NCBI protein sequence database include the protein with accession number WP_123598507.1 (hereinafter referred to as PfLip, SEQ ID NO: 6) and the protein with accession number WP_115457195.1 (hereinafter referred to as PfLip).
  • the lipase KAL-A8 of the present invention which consists of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14, has 72%, 60%, 59%, 68%, 86% and 71% of Lipr139, PvLip, PfLip, EtLip, EspLip and YeLip, respectively. Amino acid sequence identity is shown.
  • the lipase of the present invention is a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14.
  • the lipase of the present invention can be produced, for example, by expressing the polynucleotide encoding the lipase of the present invention.
  • the lipase of the present invention can be produced from a transformant into which a polynucleotide encoding the lipase of the present invention has been introduced.
  • a polynucleotide encoding the lipase of the present invention or a vector containing the same is introduced into a host to obtain a transformant, and the transformant is cultured in an appropriate medium, the polynucleotide can be introduced into the transformant.
  • the lipase of the present invention is produced from the polynucleotide encoding the lipase of the present invention.
  • the lipase of the present invention can be obtained by isolating or purifying the produced lipase from the culture.
  • the polynucleotide encoding the lipase of the present invention may be a polynucleotide encoding a lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 91% identity thereto. Furthermore, the polynucleotide encoding the lipase of the present invention may be in the form of single-stranded or double-stranded DNA, RNA, or artificial nucleic acid, or may be cDNA or chemically synthesized DNA without introns.
  • a polynucleotide encoding the lipase of the present invention can be synthesized chemically or genetically based on the amino acid sequence of the lipase.
  • the polynucleotide can be chemically synthesized based on the amino acid sequence of the lipase of the present invention described above.
  • a nucleic acid synthesis contract service eg, provided by Medical and Biological Research Institute, Genscript, etc.
  • the synthesized polynucleotide can also be amplified by PCR, cloning, etc.
  • the polynucleotide encoding the lipase of the present invention can be mutated by a known mutagenesis method such as the ultraviolet irradiation or site-directed mutagenesis described above on the polynucleotide synthesized by the above procedure. It can be produced by introducing.
  • a polynucleotide encoding the lipase of the present invention can be obtained by introducing mutations into the polynucleotide of SEQ ID NO: 13 by a known method, expressing the resulting polynucleotide to examine lipase activity, and producing a protein having the desired lipase activity. can be obtained by selecting a polynucleotide encoding.
  • Site-specific mutations can be introduced into polynucleotides using any method such as the inverse PCR method or annealing method (edited by Muramatsu et al., "New Genetic Engineering Handbook, Revised 4th Edition,” Yodosha, p. 82-88). This can be done by If necessary, use Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit or QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Various commercially available site-directed mutagenesis kits such as Kit can also be used.
  • any method such as the inverse PCR method or annealing method (edited by Muramatsu et al., "New Genetic Engineering Handbook, Revised 4th Edition," Yodosha, p. 82-88). This can be done by If necessary, use Stratagene's QuickChange II Site-Directed Mutagenesis Kit or QuickChange Multi Site-Directed Mutagenesis Various commercially available site-directed mutagenesis kits such as Kit can also be used.
  • a polynucleotide encoding the lipase of the present invention can be incorporated into a vector.
  • the type of vector containing the polynucleotide is not particularly limited, and may be any vector such as a plasmid, phage, phagemid, cosmid, virus, YAC vector, or shuttle vector.
  • the vector is preferably, but not limited to, a vector that can be amplified in a bacterium, preferably a bacterium of the genus Bacillus (for example, Bacillus subtilis or a mutant strain thereof), and more preferably a vector capable of amplifying the introduced gene in a bacterium of the genus Bacillus.
  • shuttle vectors which are vectors that can be replicated in both Bacillus bacteria and other organisms, can be suitably used for recombinant production of the lipase of the present invention.
  • preferred vectors include, but are not limited to, pHA3040SP64, pHSP64R or pASP64 (Patent No.
  • pHY300PLK expression vector capable of transforming both Escherichia coli and Bacillus subtilis; Jpn J Genet, 1985, 60: Shuttle vectors such as pAC3 (Nucleic Acids Res, 1988, 16:8732); pUB110 (J Bacteriol, 1978, 134:318-329), pTA10607 (Plasmid, 1987, 18:8-1) 5) etc.
  • Examples include plasmid vectors that can be used to transform bacteria belonging to the genus Bacillus.
  • plasmid vectors derived from E. coli eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, pBluescript, etc.
  • E. coli eg, pET22b(+), pBR322, pBR325, pUC57, pUC118, pUC119, pUC18, pUC19, p
  • the above-mentioned vector may include a DNA region containing a DNA replication initiation region or an origin of replication.
  • a promoter region, a terminator region, or an expressed protein for initiating transcription of the gene is placed upstream of the polynucleotide encoding the lipase of the present invention (i.e., the lipase gene of the present invention).
  • a control sequence such as a secretory signal region for secretion to the outside may be operably linked.
  • the term "operably linked" between a gene and a control sequence means that the gene and the control region are arranged such that the gene can be expressed under the control of the control region. means.
  • control sequences such as the promoter region, terminator region, secretion signal region, etc. are not particularly limited, and commonly used promoters and secretion signal sequences can be appropriately selected and used depending on the host to be introduced.
  • suitable examples of control sequences that can be incorporated into vectors include Bacillus sp.
  • Examples include the cellulase gene promoter and secretion signal sequence of the KSM-S237 strain.
  • the vector of the present invention may further incorporate a marker gene (for example, a drug resistance gene for ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, etc.) for selecting a host into which the vector has been appropriately introduced. You can leave it there.
  • a marker gene for example, a drug resistance gene for ampicillin, neomycin, kanamycin, chloramphenicol, etc.
  • a gene encoding a required nutrient synthesizing enzyme may be incorporated into the vector as a marker gene.
  • a gene related to the metabolism may be incorporated into the vector as a marker gene.
  • An example of such a metabolism-related gene is an acetamidase gene for utilizing acetamide as a nitrogen source.
  • the above polynucleotide encoding the lipase of the present invention and the control sequence and marker gene can be linked by a method known in the art such as SOE (splicing by overlap extension)-PCR method (Gene, 1989, 77:61-68). This can be done by any method. Procedures for introducing ligated fragments into vectors are well known in the art.
  • the transformed cells of the present invention can be transformed by introducing into a host a vector containing a polynucleotide encoding the lipase of the present invention, or by introducing a DNA fragment containing a polynucleotide encoding the lipase of the present invention into the genome of the host. Obtainable.
  • Examples of host cells include microorganisms such as bacteria and filamentous fungi.
  • bacteria include Escherichia coli, bacteria belonging to the genus Staphylococcus, genus Enterococcus, genus Listeria, and genus Bacillus.
  • Bacillus bacteria for example, Bacillus subtilis Marburg No. 168 or mutant strains thereof) are preferred.
  • Bacillus subtilis mutants include J. subtilis mutants. Biosci. Bioeng. , 2007, 104(2): 135-143, and the protease 9-deficient strain KA8AX, as well as Biotechnol. Lett.
  • the D8PA strain is a protease octad-deficient strain with improved protein folding efficiency.
  • filamentous fungi include Trichoderma, Aspergillus, Rhizopus, and the like.
  • a method for introducing the vector into the host methods commonly used in the field, such as protoplast method and electroporation method, can be used. By selecting a strain into which the introduction has been properly carried out using marker gene expression, auxotrophy, etc. as indicators, it is possible to obtain the desired transformant into which the vector has been introduced.
  • a fragment in which a polynucleotide encoding the lipase of the present invention, a control sequence, and a marker gene are linked can be directly introduced into the host genome.
  • a DNA fragment is constructed by adding sequences complementary to the host's genome to both ends of the above-mentioned ligated fragment by SOE-PCR method, etc., and this is introduced into the host to create a gap between the host genome and the DNA fragment.
  • a polynucleotide encoding the lipase of the present invention is introduced into the genome of the host.
  • the thus obtained transformant into which the polynucleotide encoding the lipase of the present invention or the vector containing the same has been introduced is cultured in an appropriate medium, the gene encoding the protein on the vector will be expressed.
  • a lipase of the invention is produced.
  • the medium used for culturing the transformant can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the type of microorganism of the transformant.
  • the lipase of the present invention may be expressed from a polynucleotide encoding the lipase of the present invention or a transcription product thereof using a cell-free translation system.
  • a "cell-free translation system” is an in vitro transcription translation system or an in vitro translation system in which reagents such as amino acids necessary for protein translation are added to a suspension obtained by mechanically disrupting host cells. It is composed of
  • the lipase of the present invention produced in the above-mentioned culture or cell-free translation system can be produced by conventional methods used for protein purification, such as centrifugation, ammonium sulfate precipitation, gel chromatography, ion exchange chromatography, affinity chromatography, etc. Isolation or purification can be achieved by using either alone or in appropriate combination. Proteins recovered from the culture may be further purified by known means.
  • the thus obtained lipase of the present invention has significantly higher resistance to inhibition of lipase activity by surfactants than known proteins, and has significantly higher detergency even in the presence of surfactants. Show power.
  • “high resistance” refers to a known protein, specifically a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10 or 12, or a lipase estimated to be a lipase in the NCBI protein sequence database. It means high resistance compared to proteins. Resistance to inhibition of lipase activity by detergents can be assessed using methods well known in the art.
  • a lipase solution and a surfactant solution are mixed, a 4-nitrophenyl octoate solution, which is a substrate for lipase, is added to the mixture, and the absorbance change at 405 nm (OD/min) due to the release of 4-nitrophenol is measured. is measured, and the difference ⁇ OD/min from the blank is determined as the lipase activity value (lipase activity value in the surfactant solution).
  • calculate the lipase activity value when a buffer is used instead of the surfactant solution (lipase activity value in the buffer) divide the lipase activity value in the surfactant solution by the lipase activity value in the buffer, and calculate 100.
  • the multiplied value is calculated as relative activity (%). It can be determined that the higher the relative activity (%), the higher the resistance to inhibition of lipase activity by surfactants.
  • the lipase of the present invention preferably has a relative lipase activity (%) of 20% or more, more preferably 30% in an SDS solution (0.1% (w/v)) under the conditions (3) of Examples below. These are the above lipases.
  • the lipase of the present invention has a relative lipase activity (%) in a Triton X-100 solution (0.1% (w/v)) of preferably 50% or more, more preferably is more than 70% lipase.
  • high detergency refers to a known protein, specifically a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 2, 4, 6, 8, 10, or 12, or a lipase estimated to be a lipase in the NCBI protein sequence database. It refers to the ability to provide high detergency, eg, soil removal, in a laundering or washing process compared to proteins. Detergency can be assessed using methods well known in the art. For example, a cleaning solution containing lipase is added to a model stain containing a predetermined indicator substance (for example, a dye with high fat solubility such as Sudan III), and the stain is washed under predetermined conditions. A portion of the cleaning liquid is taken out, and the concentration of the indicator substance in the model soil solubilized in the cleaning liquid through the cleaning process is measured, for example, by absorbance measurement, and the difference from the blank can be determined as the cleaning power.
  • a predetermined indicator substance for example, a dye with high fat solubility such as Sudan
  • the lipase of the present invention is useful as an enzyme for blending in various cleaning compositions, and is particularly useful as an enzyme for blending in cleaning compositions suitable for low-temperature cleaning.
  • “low temperature” includes 40°C or lower, 35°C or lower, 30°C or lower, and 25°C or lower, and also includes 5°C or higher, 10°C or higher, and 15°C or higher. Further examples include 5 to 40°C, 10 to 35°C, 15 to 30°C, and 15 to 25°C.
  • the amount of the lipase of the present invention incorporated into the cleaning composition is not particularly limited as long as the lipase exhibits activity, but for example, preferably 0.1 mg or more, more preferably 1 mg per 1 kg of the cleaning composition. Above, it is more preferably 5 mg or more, and preferably 5000 mg or less, more preferably 1000 mg or less, and even more preferably 500 mg or less. Further, it is preferably 0.1 to 5000 mg, more preferably 1 to 1000 mg, and even more preferably 5 to 500 mg.
  • the cleaning composition preferably contains a sulfosuccinate or a salt thereof in addition to the lipase of the present invention.
  • Sulfosuccinic acid esters or salts thereof are known as components to be included in cleaning compositions (for example, Japanese Patent Application Publication No. 2019-182911).
  • the sulfosuccinic acid ester or its salt is preferably a sulfosuccinic acid branched alkyl ester or its salt having a branched chain alkyl group having 9 to 12 carbon atoms, and a sulfosuccinic acid branched alkyl ester having a branched chain alkyl group having 9 or 10 carbon atoms or Salts thereof are more preferred, and sulfosuccinic acid branched alkyl esters having a branched alkyl group having 10 carbon atoms or salts thereof are even more preferred.
  • the sulfosuccinic acid ester or its salt is a sulfosuccinic acid di-branched alkyl ester or its salt
  • the two branched-chain alkyl groups are each a branched-chain alkyl group having 9 or more and 12 or less carbon atoms.
  • Esters or salts thereof are preferred, and sulfosuccinic acid di-branched alkyl esters or salts thereof, in which the two branched alkyl groups each have 9 or 10 carbon atoms, are more preferred, and the two branched alkyl groups each have 10 carbon atoms.
  • sulfosuccinic acid di-branched alkyl esters or salts thereof which are branched chain alkyl groups
  • bis-(2-propylheptyl)sulfosuccinic acid or salts thereof are particularly preferred.
  • the salt examples include alkali metal salts and alkanolamine salts, preferably alkali metal salts or alkanolamine salts, and salts selected from sodium salts, potassium salts, triethanolamine salts, diethanolamine salts, and monoethanolamine salts. is more preferred, and sodium salt is even more preferred.
  • Examples of the sulfosuccinic acid ester or its salt include a compound represented by the following formula 1.
  • R 1 and R 2 are each a branched alkyl group having 9 to 12 carbon atoms, and A 1 O and A 2 O are each an alkyleneoxy group having 2 to 4 carbon atoms.
  • x1 and x2 are average numbers of added moles, each of which is a number from 0 to 10, and M is a cation.
  • R 1 and R 2 are each preferably a branched alkyl group selected from a branched nonyl group, a branched decyl group, and a branched dodecyl group, and more preferably a branched decyl group.
  • the branched decyl group is preferably a 2-propylheptyl group.
  • a 1 O and A 2 O are each an alkyleneoxy group having 2 or more and 4 or less carbon atoms, preferably 2 or 3 carbon atoms from the viewpoint of lubricity against water.
  • x1 and x2 represent the average number of added moles of A 1 O and A 2 O, respectively, from 0 to 10, preferably from the viewpoint of water lubricity to 6 or less, more preferably 4 or less, and Preferably the number is 2 or less, and 0 is more preferable.
  • M is a cation.
  • M is preferably a cation other than a hydrogen ion.
  • M include alkali metal ions such as lithium ions, sodium ions, and potassium ions, alkaline earth metal ions such as calcium ions and barium ions, triethanolammonium ions, diethanolammonium ions, monoethanolammonium ions, and trimethylammonium ions. , organic ammonium ions such as monomethylammonium ion, and the like.
  • M is preferably an alkali metal ion or an alkanol ammonium ion, more preferably a sodium ion, a potassium ion, a triethanol ammonium ion, a diethanol ammonium ion, or a monoethanol ammonium ion, and even more preferably a sodium ion.
  • the sulfosuccinic acid ester or its salt is preferably a compound represented by the following formula 1-1.
  • the compound of formula 1-1 is a compound in which x1 and x2 in formula 1 are each 0.
  • R 1 and R 2 are each a branched alkyl group having 9 or more and 12 or less carbon atoms, and M is a cation.
  • Specific examples and preferred examples of R 1 , R 2 and M in Formula 1-1 are the same as in Formula 1.
  • the sulfosuccinate or salt thereof is bis-(2-propylheptyl)sulfosuccinic acid or a salt thereof.
  • the amount of the sulfosuccinate or its salt added to the cleaning composition is preferably 0.01% by mass or more, more preferably 0.1% by mass or more, and preferably 2.0% by mass or less, more preferably It is 1.0% by mass or less. Further, it is preferably 0.01 to 2.0% by mass, and more preferably 0.1 to 1.0% by mass.
  • the cleaning composition can also contain various enzymes in addition to the lipase of the present invention.
  • enzymes include hydrolase, oxidase, reductase, transferase, lyase, isomerase, ligase, synthetase, and the like.
  • lipases, amylases, proteases, cellulases, keratinases, esterases, cutinases, pullulanase, pectinases, mannanases, glucosidases, glucanases, cholesterol oxidases, peroxidases, laccases, etc. which are different from the lipase of the present invention, are preferable, and particularly proteases, cellulases, and amylases. , lipase is preferred.
  • Proteases include commercially available Alcalase, Esperase, Everlase, Savinase, Kannase, Progress Uno (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ, EFFECTENZ, EXCELLENZ (registered trademark; DuPont), Lav ergy (registered trademark; BASF), and KAP ( Kao), etc.
  • cellulases include Celluclean, Carezyme (registered trademark; Novozymes), KAC, alkaline cellulase produced by Bacillus sp. Examples include alkaline cellulase (Kao).
  • amylase examples include Termamyl, Duramyl, Stainzyme, Stainzyme Plus, Amplify Prime (registered trademark; Novozymes), PREFERENZ, EFFECTENZ (registered trademark; DuPont), and KAM (Kao).
  • lipases examples include Lipolase and Lipex (registered trademark; Novozymes).
  • Known detergent components can be blended into the detergent composition, and examples of the known detergent components include the following.
  • the surfactant is blended in the cleaning composition in an amount of 0.5 to 60% by mass, particularly 10 to 45% by mass for powdered cleaning compositions, and 20 to 90% for liquid cleaning compositions. It is preferable to mix % by mass. Furthermore, when the detergent composition of the present invention is a laundry detergent or a detergent for automatic dishwashers, the surfactant is generally blended in an amount of 1 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
  • the surfactants used in the cleaning composition include anionic surfactants, nonionic surfactants, amphoteric surfactants, and cationic surfactants other than the above-mentioned sulfosuccinates or their salts.
  • anionic surfactants and nonionic surfactants are preferred.
  • anionic surfactants include sulfate ester salts of alcohols having 10 to 18 carbon atoms, sulfate ester salts of alkoxylated alcohols having 8 to 20 carbon atoms, alkylbenzene sulfonates, paraffin sulfonates, and ⁇ -olefin sulfones.
  • Preferred are acid salts, internal olefin sulfonates, ⁇ -sulfo fatty acid salts, ⁇ -sulfo fatty acid alkyl ester salts, or fatty acid salts.
  • a linear alkylbenzene sulfonate having an alkyl chain of 10 to 14 carbon atoms, more preferably 12 to 14 carbon atoms, and an internal olefin having an alkylene chain of 12 to 20 carbon atoms, more preferably 16 to 18 carbon atoms
  • One or more anionic surfactants selected from sulfones are preferred, and as counterions, alkali metal salts and amines are preferred, with sodium and/or potassium, monoethanolamine, and diethanolamine being particularly preferred.
  • alkali metal salts and amines are preferred, with sodium and/or potassium, monoethanolamine, and diethanolamine being particularly preferred.
  • Nonionic surfactants include polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) ether, alkyl polyglycoside, polyoxyalkylene alkyl (8 to 20 carbon atoms) phenyl ether, polyoxyalkylene sorbitan fatty acid (8 to 20 carbon atoms) 22) Ester, polyoxyalkylene glycol fatty acid (carbon number 8 to 22) ester, and polyoxyethylene polyoxypropylene block polymer are preferred.
  • 4 to 20 moles of alkylene oxide such as ethylene oxide or propylene oxide are added to an alcohol having 10 to 18 carbon atoms [HLB value (calculated by Griffin method) of 10.5 to 15. 0, preferably 11.0 to 14.5] are preferred.
  • the divalent metal ion scavenger is blended in an amount of 0.01 to 50% by mass, preferably 5 to 40% by mass.
  • the divalent metal ion scavenger used in the cleaning composition of the present invention includes condensed phosphates such as tripolyphosphate, pyrophosphate, and orthophosphate, aluminosilicates such as zeolite, and synthetic layered crystalline silicates. , nitrilotriacetate, ethylenediaminetetraacetate, citrate, isocitrate, polyacetal carboxylate, and the like.
  • crystalline aluminosilicate is particularly preferred, and among A-type, X-type, and P-type zeolites, A-type is particularly preferred.
  • the synthetic zeolite preferably has an average primary particle size of 0.1 to 10 ⁇ m, particularly 0.1 to 5 ⁇ m.
  • Alkaline agent is blended in an amount of 0.01 to 80% by weight, preferably 1 to 40% by weight.
  • examples include alkali metal carbonates such as sodium carbonate, which are collectively referred to as dense ash and light ash, and amorphous alkali metal silicates such as JIS No. 1, No. 2, and No. 3.
  • alkali metal carbonates such as sodium carbonate, which are collectively referred to as dense ash and light ash
  • amorphous alkali metal silicates such as JIS No. 1, No. 2, and No. 3.
  • These inorganic alkaline agents are effective in forming particle skeletons during detergent drying, and can yield detergents that are relatively hard and have excellent fluidity.
  • alkalis other than these include sodium sesquicarbonate and sodium hydrogen carbonate, and phosphates such as tripolyphosphate also act as alkaline agents.
  • sodium hydroxide and mono-, di-, or triethanolamine can be used as alkaline agents used in liquid detergents, and can also be
  • Anti-restaining agent is blended in an amount of 0.001 to 10% by mass, preferably 1 to 5% by mass.
  • anti-recontamination agents used in the cleaning composition of the present invention include polyethylene glycol, carboxylic acid polymers, polyvinyl alcohol, and polyvinylpyrrolidone.
  • carboxylic acid polymers have the ability to prevent recontamination, as well as the ability to capture metal ions and disperse solid particle stains from clothing into the washing bath.
  • the carboxylic acid polymer is a homopolymer or copolymer of acrylic acid, methacrylic acid, itaconic acid, etc.
  • the preferred copolymer is a copolymer of the above monomers and maleic acid, and those with a molecular weight of several thousand to 100,000 are suitable. preferable.
  • polymers such as polyglycidylate, cellulose derivatives such as carboxymethylcellulose, and aminocarboxylic acid-based polymers such as polyaspartic acid also have metal ion scavenging agents, dispersing agents, and re-fouling prevention abilities. Therefore, it is preferable.
  • Bleaching agent Bleaching agents such as hydrogen peroxide and percarbonate are preferably blended in an amount of 1 to 10% by mass.
  • a bleaching activator such as tetraacetylethylenediamine (TAED) or the one described in JP-A-6-316700 can be added.
  • Fluorescent agent examples include biphenyl type fluorescent agents (eg, Tinopal CBS-X, etc.) and stilbene type fluorescent agents (eg, DM type fluorescent dye, etc.).
  • the fluorescent agent is preferably blended in an amount of 0.001 to 2% by mass.
  • the detergent composition includes builders, softeners, reducing agents (such as sulfites), foam suppressants (such as silicones), fragrances, and antibacterial and antifungal agents known in the field of laundry detergents. (Proxel [trade name], benzoic acid, etc.) and other additives can be included.
  • a cleaning composition can be produced in accordance with a conventional method by combining the lipase of the present invention obtained by the above method and the above-mentioned known cleaning components.
  • the form of the detergent can be selected depending on the application, and can be, for example, liquid, powder, granule, paste, solid, etc.
  • the cleaning composition thus obtained can be used as a laundry detergent, a dishwashing agent, a bleaching agent, a hard surface cleaning agent, a drain cleaning agent, a denture cleaning agent, a disinfectant cleaning agent for medical instruments, etc.
  • laundry detergents and dishwashing agents preferred are laundry detergents and dishwashing agents, and more preferred are laundry detergents (laundry laundry detergents), hand-washing dishwashing agents, and automatic dishwashing detergents.
  • the cleaning composition is suitable for use at temperatures of 40°C or lower, 35°C or lower, 30°C or lower, 25°C or lower, and 5°C or higher, 10°C or higher, or 15°C or higher.
  • Preferred usage modes include use in low-temperature (15-30°C) washing in laundry facilities and low-temperature (15-30°C) washing in automatic dishwashers.
  • the cleaning composition of the present invention By using the cleaning composition of the present invention, objects to be cleaned that require stain removal (e.g., clothes, tableware, hard surfaces, drain pipes, dentures, medical instruments, etc.) can be cleaned, that is, stains can be removed. can do.
  • a cleaning method includes bringing the cleaning composition of the present invention into contact with an object to be cleaned that requires stain removal.
  • the stain is a sebum stain or a stain containing food-derived oils and fats.
  • the object to be cleaned in order to bring the object to be cleaned and the cleaning agent composition into contact, the object to be cleaned may be soaked in water in which the cleaning agent composition is dissolved; The material may be applied directly to the object to be cleaned.
  • the object to be cleaned after soaking or applying the detergent composition may be further washed by hand or in a washing machine, but this is not always necessary.
  • the present invention further discloses the following aspects.
  • ⁇ 1> A lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 91% identity thereto.
  • ⁇ 2> The lipase according to ⁇ 1>, which consists of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14.
  • ⁇ 3> A polynucleotide encoding the lipase according to ⁇ 1> or ⁇ 2>.
  • ⁇ 4> A vector or DNA fragment comprising the polynucleotide according to ⁇ 3>.
  • ⁇ 5> A transformed cell containing the vector or DNA fragment according to ⁇ 4>.
  • ⁇ 6> The transformed cell according to ⁇ 5>, which is a microorganism.
  • ⁇ 7> The transformed cell according to ⁇ 5> or ⁇ 6>, which is Escherichia coli or a bacterium belonging to the genus Bacillus.
  • Sulfosuccinic acid ester or salt thereof preferably a sulfosuccinic acid branched alkyl ester or salt thereof having a branched chain alkyl group having 9 to 12 carbon atoms, more preferably a sulfosuccinate having a branched chain alkyl group having 9 or 10 carbon atoms.
  • the cleaning composition according to ⁇ 8> further comprising an acid branched alkyl ester or a salt thereof, more preferably a sulfosuccinic acid branched alkyl ester or a salt thereof having a branched alkyl group having 10 carbon atoms.
  • a sulfosuccinic acid diester or a salt thereof preferably a sulfosuccinic acid di-branched alkyl ester or a salt thereof, wherein each of the two branched chain alkyl groups is a branched chain alkyl group having 9 to 12 carbon atoms, more preferably two branched chains.
  • a di-branched sulfosuccinic acid alkyl ester or salt thereof in which the alkyl groups are each a branched-chain alkyl group having 9 or 10 carbon atoms, more preferably a di-branched sulfosuccinic acid, in which the two branched-chain alkyl groups are each a branched-chain alkyl group having 10 carbon atoms.
  • ⁇ 11> The cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 10>, which is a clothes cleaning agent or a dishwashing agent.
  • ⁇ 12> The cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 11>, which is a powder or liquid.
  • ⁇ 13> The cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 12>, which is used at low temperatures.
  • ⁇ 14> Used at temperatures below 40°C, below 35°C, below 30°C, below 25°C, and above 5°C, above 10°C, above 15°C, or from 5 to 40°C, 10 to 35°C, 15°C
  • the cleaning composition according to ⁇ 13> which is used at ⁇ 30°C and 15-25°C.
  • ⁇ 15> A method for cleaning dirt using the cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 14>.
  • ⁇ 16> The method according to ⁇ 15>, which comprises contacting the object to be cleaned with the cleaning composition according to any one of ⁇ 8> to ⁇ 14>.
  • ⁇ 17> The method according to ⁇ 15> or ⁇ 16>, wherein the stain is a sebum stain or a stain containing food-derived oils and fats.
  • ⁇ 18> Use of a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 91% identity thereto for the production of a cleaning composition.
  • ⁇ 19> The use according to ⁇ 18>, wherein the lipase is a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14.
  • ⁇ 20> The use according to ⁇ 18> or ⁇ 19>, wherein the cleaning composition is a laundry detergent or a dishwasher.
  • the cleaning composition is a powder or liquid.
  • ⁇ 22> The use according to any one of ⁇ 18> to ⁇ 21>, wherein the cleaning composition is used at low temperatures.
  • the cleaning composition is used at a temperature of 40°C or lower, 35°C or lower, 30°C or lower, 25°C or lower, and 5°C or higher, 10°C or higher, 15°C or higher, or 5 to 40°C, 10°C or lower.
  • ⁇ 24> Use of a lipase consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 14 or an amino acid sequence having at least 91% identity thereto for cleaning stains.
  • ⁇ 25> The use according to ⁇ 24>, wherein the lipase is a lipase consisting of the amino acid sequence shown by SEQ ID NO: 14.
  • ⁇ 26> The use according to ⁇ 24> or ⁇ 25>, wherein the stain is a sebum stain or a stain containing food-derived oils and fats.
  • ⁇ 27> The use according to any one of ⁇ 24> to ⁇ 26>, wherein the washing is washing at a low temperature.
  • Washing is at 40°C or lower, 35°C or lower, 30°C or lower, 25°C or lower, and at 5°C or higher, 10°C or higher, 15°C or higher, or 5-40°C, 10-35°C
  • lipase expression plasmid was constructed using the plasmid for expression of VHH of SEQ ID NO: 26 containing the Bacillus subtilis spoVG gene-derived promoter described in WO2021/153129 as a template. It was constructed by replacing each lipase gene with the full length ORF containing the VHH gene of the above plasmid by In-Fusion reaction.
  • Lipr139 (polynucleotides of SEQ ID NO: 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13 and 15, respectively, SEQ ID NO: 2) , 4, 6, 8, 10, 12, 14 and 16) from the plasmids pHY-Lipr139, pHY-PvLip, pHY-PfLip, pHY-EtLip, pHY-EspLip, pHY-YeLip, pHY, respectively.
  • -KAL-A8 pHY-Lipr138 were constructed.
  • a lipase TLL gene in which a signal sequence derived from Bacillus subtilis amyE (polynucleotide of SEQ ID NO: 19, encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20) is linked to the full length ORF containing the Lipr139 gene of plasmid pHY-Lipr139 on the N-terminal side.
  • pHY-amyEsig-TLL was constructed by replacing the artificially synthesized gene of polynucleotide number 17 (encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18) by In-Fusion reaction.
  • a lipase expression plasmid was introduced into a Bacillus subtilis strain by the protoplast method, and a 2 ⁇ L-maltose medium (2% tryptone, 1% yeast extract, 1% NaCl, 7.5% maltose, 7.5 ppm sulfuric acid After culturing at 30°C for 2 days in manganese pentahydrate, 0.04% calcium chloride dihydrate, 15 ppm tetracycline (% is (w/v)%), the culture supernatant containing lipase was collected by centrifugation. Recovered. The culture supernatant was buffer exchanged into 10 mM Tris-HCl + 0.01% Triton-X100 (pH 7.0) by dialysis, and the lipase concentration was determined from the band intensity of SDS-PAGE.
  • TLL, Lipr139, PvLip and Lipr138 whose suitability for washing has been disclosed in Patent Documents 1, 2 and 3, and the naturally occurring lipase sequences PfLip, EtLip, EspLip and YeLip, were prepared using SDS and Triton X-100. Activity was significantly inhibited in the presence of Compared to these, the novel lipase KAL-A8 showed high resistance to activity inhibition by SDS and Triton X-100.
  • TLL, Lipr139, PvLip and Lipr138 whose suitability for washing has been disclosed in Patent Documents 1, 2 and 3, and the naturally occurring lipase sequences PfLip, EtLip, EspLip and YeLip, are significantly active in the model washing solution. inhibited.
  • the novel lipase KAL-A8 showed high resistance to activity inhibition in the model wash solution.
  • Lipr139 whose suitability for cleaning is disclosed in Patent Document 1, showed high cleaning power in a model cleaning solution compared to TLL, Lipr138, PvLip, PfLip, EtLip, EspLip, and YeLip.
  • the novel lipase KAL-A8 showed significantly higher detergency in the model washing solution than other lipases including Lipr139.

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Abstract

界面活性剤による活性阻害が緩和され、高い洗浄効果を示すリパーゼの提供。配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。

Description

新規リパーゼ
　本発明は、新規リパーゼに関する。
　リパーゼは、洗濯洗剤、食器用洗剤、油脂加工、パルプ処理、飼料、医薬中間体合成など様々な用途において有用である。洗浄においては、リパーゼはトリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成することによって油を含む汚れの除去に寄与する。
　現行の洗浄組成物や洗浄環境は、リパーゼの活性や洗浄効果を阻害する様々な成分を含んでおり、そのような条件下で機能するリパーゼが求められている。洗浄に有用なリパーゼとして、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼ（以下ＴＬＬ）がＬＩＰＯＬＡＳＥ（登録商標）の商品名で販売されている。特許文献１にはＣｅｄｅｃｅａ　ｓｐ－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。特許文献２には、１つ又は複数の参照脂肪分解酵素と比較した場合に改善された洗浄性能を有するＰｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ（以下ＰｖＬｉｐ）の変異体が開示されている。特許文献３にはメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８がＴＬＬと比較して優れた洗浄性能を有することが開示されている。
　　（特許文献１）特表２０１５－５２３０７８号公報
　　（特許文献２）国際公開第２０２０／０４６６１３号
　　（特許文献３）特表２０１５－５２５２４８号公報
　本発明は、下記１）～６）に係るものである。
　１）配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
　２）１）に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
　３）２）のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
　４）３）のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
　５）１）に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
　６）５）に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
各リパーゼの界面活性剤溶液中でのリパーゼ活性。 各リパーゼの界面活性剤を含むモデル洗浄液中でのリパーゼ活性。 各リパーゼの界面活性剤を含むモデル洗浄液中での洗浄力。
発明の詳細な説明
　本明細書中で引用された全ての特許文献、非特許文献、及びその他の刊行物は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
　本明細書において、「リパーゼ」とは、トリアシルグリセロールリパーゼ（ＥＣ３．１．１．３）を指し、トリグリセリドを加水分解して脂肪酸を生成する活性を有する酵素群を意味する。リパーゼ活性は、オクタン酸４－ニトロフェニルの加水分解による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することによって決定することができる。リパーゼ活性の測定の具体的手順は、後述の実施例に詳述されている。
　本明細書において、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列の同一性は、Ｌｉｐｍａｎ－Ｐｅａｒｓｏｎ法（Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８５，２２７：１４３５－１４４１）によって計算される。具体的には、遺伝情報処理ソフトウェアＧＥＮＥＴＹＸ　Ｖｅｒ．１２のホモロジー解析（Ｓｅａｒｃｈ　ｈｏｍｏｌｏｇｙ）プログラムを用いて、Ｕｎｉｔ　ｓｉｚｅ　ｔｏ　ｃｏｍｐａｒｅ（ｋｔｕｐ）を２として解析を行うことにより算出される。
　本明細書において、プロモーターなどの制御領域と遺伝子の「作動可能な連結」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域の制御の下で発現し得るように連結されていることをいう。遺伝子と制御領域との「作動可能な連結」の手順は当業者に周知である。
　本明細書において、遺伝子に関する「上流」及び「下流」とは、該遺伝子の転写方向の上流及び下流をいう。例えば、「プロモーターの下流に配置された遺伝子」とは、ＤＮＡセンス鎖においてプロモーターの３’側に該遺伝子が存在することを意味し、遺伝子の上流とは、ＤＮＡセンス鎖における該遺伝子の５’側の領域を意味する。
　リパーゼは洗浄組成物中に含まれる界面活性剤によってその活性が阻害されることが知られている。実際に本発明者らが検証した限り、洗浄への適性が開示されている公知のリパーゼは、ＴＬＬ、Ｌｉｐｒ１３９及びＰｖＬｉｐのいずれもが界面活性剤の共存によって大きな活性阻害を受けた。界面活性剤による活性阻害は洗浄用リパーゼ共通の大きな課題である。また、リパーゼは洗浄用途に限らずパルプ処理などの産業用途においても界面活性剤と共に使用されることが多く、界面活性剤による活性阻害は産業用リパーゼ全体の課題でもある。界面活性剤による活性阻害が緩和され、高い洗浄効果を示すリパーゼが求められている。
　本発明者らは、斯かる課題に鑑み鋭意検討した結果、界面活性剤による活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、劇的な洗浄効果を示す新規リパーゼＫＡＬ－Ａ８を見出した。
　本発明のリパーゼは、界面活性剤による活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下でも優れた洗浄効果を示す。
＜１．リパーゼ＞
　本発明のリパーゼは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼである。本発明のリパーゼは、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下であっても顕著に高い洗浄力を示す。
　配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼとしては、配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性、具体的には、９１％以上、好ましくは９３％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９６％以上、さらに好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼが挙げられる。
　少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列には、１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が含まれる。「１又は複数個のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列」としては、１個以上３０個以下、好ましくは２０個以下、より好ましくは１０個以下、さらに好ましくは５個以下のアミノ酸が欠失、挿入、置換若しくは付加されたアミノ酸配列が挙げられる。
　配列番号１４で示されるアミノ酸配列と少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼは、例えば、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼの人工的に作製された変異体が挙げられる。当該変異体は、例えば、配列番号１４で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝子に対して紫外線照射や部位特異的変異導入（Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入し、当該突然変異を有する遺伝子を発現させ、所望のリパーゼ活性を有するタンパク質を選択することによって、作製することができる。このような変異体作製の手順は、当業者に周知である。
　本発明のリパーゼは、従来単離又は精製されているリパーゼ及びＮＣＢＩタンパク質配列データベースにおいてトリアシルグリセロールリパーゼとして推定されたタンパク質とは異なるアミノ酸配列を有する。従来単離又は精製されているリパーゼとしては、例えば、Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ　ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ由来のリパーゼＴＬＬ（配列番号１８）、前記特許文献１において洗浄に好適なリパーゼとして開示されているＣｅｄｅｃｅａ　ｓｐ．－１６６４０株由来のリパーゼＬｉｐｒ１３９（配列番号２）、前記特許文献２において洗浄に好適なリパーゼ変異体群の親酵素として開示されているＰｒｏｔｅｕｓ属細菌由来リパーゼ（以下、ＰｖＬｉｐと称する、配列番号４）、前記特許文献３において洗浄に好適なリパーゼとして開示されているメタゲノム由来のリパーゼＬｉｐｒ１３８（配列番号１６）などが挙げられる。また、ＮＣＢＩタンパク質配列データベースにおいてトリアシルグリセロールリパーゼとして推定されたタンパク質としては、アクセッション番号ＷＰ＿１２３５９８５０７．１のタンパク質（以下、ＰｆＬｉｐと称する、配列番号６）、アクセッション番号ＷＰ＿１１５４５７１９５．１のタンパク質（以下、ＥｔＬｉｐと称する、配列番号８）、アクセッション番号ＷＰ＿１３５４９５６３４．１のタンパク質（以下、ＥｓｐＬｉｐと称する、配列番号１０）、アクセッション番号ＷＰ＿００５１６１３６３．１のタンパク質（以下、ＹｅＬｉｐと称する、配列番号１２）などが挙げられる。当該データベースに登録されているこれらのタンパク質について、その酵素学的性質はこれまでに報告されていない。配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる本発明のリパーゼＫＡＬ－Ａ８は、Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ及びＹｅＬｉｐとそれぞれ７２％、６０％、５９％、６８％、８６％及び７１％のアミノ酸配列同一性を示す。
　好ましい一実施形態において、本発明のリパーゼは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである。
＜２．リパーゼの生産方法＞
　本発明のリパーゼは、例えば、上記本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを発現させることにより生産することができる。好ましくは、本発明のリパーゼは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを導入した形質転換体から生産することができる。例えば、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド、又はそれを含むベクターを宿主に導入して形質転換体を得た後、該形質転換体を適切な培地で培養すれば、該形質転換体に導入した本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドから本発明のリパーゼが生産される。生産されたリパーゼを該培養物から単離又は精製することにより、本発明のリパーゼを取得することができる。
　本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼをコードするポリヌクレオチドであり得る。また本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、一本鎖若しくは二本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は人工核酸の形態であり得、あるいはｃＤＮＡ、又はイントロンを含まない化学合成ＤＮＡであり得る。
　本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、該リパーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的又は遺伝子工学的に合成することができる。例えば、該ポリヌクレオチドは、上述した本発明のリパーゼのアミノ酸配列に基づいて、化学的に合成することができる。ポリヌクレオチドの化学合成には、核酸合成受託サービス（例えば、株式会社医学生物学研究所、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ社などより提供されている）を利用することができる。さらに、合成したポリヌクレオチドをＰＣＲ、クローニングなどにより増幅することもできる。
　またあるいは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、上記の手順で合成されたポリヌクレオチドに対して、上述した紫外線照射や部位特異的変異導入のような公知の突然変異導入法により突然変異を導入することによって、作製することができる。例えば、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１３のポリヌクレオチドに公知の方法で突然変異導入し、得られたポリヌクレオチドを発現させてリパーゼ活性を調べ、所望のリパーゼ活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを選択することによって、得ることができる。
　ポリヌクレオチドへの部位特異的変異導入は、例えば、インバースＰＣＲ法やアニーリング法など（村松ら編、「改訂第４版　新遺伝子工学ハンドブック」、羊土社、ｐ．８２－８８）の任意の手法により行うことができる。必要に応じてＳｔｒａｔａｇｅｎｅ社のＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　ＩＩ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔや、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ　Ｍｕｌｔｉ　Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　Ｋｉｔなどの各種の市販の部位特異的変異導入用キットを使用することもできる。
　本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドはベクターに組み込むことができる。当該ポリヌクレオチドを含有するベクターの種類としては、特に限定されず、プラスミド、ファージ、ファージミド、コスミド、ウイルス、ＹＡＣベクター、シャトルベクターなどの任意のベクターであってよい。また該ベクターは、限定ではないが、好ましくは、細菌内、好ましくはバチルス属細菌（例えば枯草菌又はその変異株）内で増幅可能なベクターであり、より好ましくは、バチルス属細菌内で導入遺伝子の発現を誘導可能な発現ベクターである。中でも、バチルス属細菌と他の生物のいずれでも複製可能なベクターであるシャトルベクターは、本発明のリパーゼを組換え生産する上で好適に用いることができる。好ましいベクターの例としては、限定するものではないが、ｐＨＡ３０４０ＳＰ６４、ｐＨＳＰ６４Ｒ又はｐＡＳＰ６４（特許第３４９２９３５号）、ｐＨＹ３００ＰＬＫ（大腸菌と枯草菌の両方を形質転換可能な発現ベクター；Ｊｐｎ　Ｊ　Ｇｅｎｅｔ，１９８５，６０：２３５－２４３）、ｐＡＣ３（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，１９８８，１６：８７３２）などのシャトルベクター；ｐＵＢ１１０（Ｊ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９７８，１３４：３１８－３２９）、ｐＴＡ１０６０７（Ｐｌａｓｍｉｄ，１９８７，１８：８－１５）などのバチルス属細菌の形質転換に利用可能なプラスミドベクター、などが挙げられる。また大腸菌由来のプラスミドベクター（例えばｐＥＴ２２ｂ（＋）、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ５７、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）を用いることもできる。
　上記ベクターは、ＤＮＡの複製開始領域又は複製起点を含むＤＮＡ領域を含み得る。あるいは、上記ベクターにおいては、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド（すなわち本発明のリパーゼ遺伝子）の上流に、該遺伝子の転写を開始させるためのプロモーター領域、ターミネーター領域、又は発現されたタンパク質を細胞外へ分泌させるための分泌シグナル領域などの制御配列が作動可能に連結されていてもよい。本明細書において、遺伝子と制御配列が「作動可能に連結されている」とは、遺伝子と制御領域とが、該遺伝子が該制御領域による制御の下に発現し得るように配置されていることをいう。
　上記プロモーター領域、ターミネーター領域、分泌シグナル領域などの制御配列の種類は、特に限定されず、導入する宿主に応じて、通常使用されるプロモーターや分泌シグナル配列を適宜選択して用いることができる。例えば、ベクターに組み込むことができる制御配列の好適な例としては、Ｂａｃｌｌｕｓ　ｓｐ．ＫＳＭ－Ｓ２３７株のセルラーゼ遺伝子のプロモーター、分泌シグナル配列などが挙げられる。
　あるいは、上記本発明のベクターには、該ベクターが適切に導入された宿主を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤の耐性遺伝子）がさらに組み込まれていてもよい。あるいは、宿主に栄養要求性株を使用する場合、要求される栄養の合成酵素をコードする遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。またあるいは、生育のために特定の代謝を必須とする選択培地を用いる場合、該代謝の関連遺伝子をマーカー遺伝子としてベクターに組み込んでもよい。このような代謝関連遺伝子の例としては、アセトアミドを窒素源として利用するためのアセトアミダーゼ遺伝子が挙げられる。
　上記本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドと、制御配列及びマーカー遺伝子との連結は、ＳＯＥ（ｓｐｌｉｃｉｎｇ　ｂｙ　ｏｖｅｒｌａｐ　ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）－ＰＣＲ法（Ｇｅｎｅ，１９８９，７７：６１－６８）などの当該分野で公知の方法によって行うことができる。連結した断片のベクターへの導入手順は、当該分野で周知である。
　本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主へ導入するか、又は本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドを含むＤＮＡ断片を宿主のゲノムに導入することにより、本発明の形質転換細胞を得ることができる。
　宿主細胞としては、細菌、糸状菌などの微生物が挙げられる。細菌の例としては、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ）、スタフィロコッカス属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）、リステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）に属する細菌などが挙げられ、このうち、大腸菌及びバチルス属細菌（例えば、枯草菌Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌｉｓ　Ｍａｒｂｕｒｇ　Ｎｏ．１６８（枯草菌１６８株）又はその変異株）が好ましい。枯草菌変異株の例としては、Ｊ．Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｅｎｇ．，２００７，１０４（２）：１３５－１４３に記載のプロテアーゼ９重欠損株ＫＡ８ＡＸ、ならびにＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２０１１，３３（９）：１８４７－１８５２に記載の、プロテアーゼ８重欠損株にタンパク質のフォールディング効率を向上させたＤ８ＰＡ株を挙げることができる。糸状菌の例としては、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、アスペルギルス属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、リゾプス属（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）などが挙げられる。
　宿主へのベクターの導入の方法としては、プロトプラスト法、エレクトロポレーション法などの当該分野で通常使用される方法を用いることができる。導入が適切に行われた株をマーカー遺伝子の発現、栄養要求性などを指標に選択することで、ベクターが導入された目的の形質転換体を得ることができる。
　あるいは、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド、制御配列及びマーカー遺伝子を連結した断片を、宿主のゲノムに直接導入することもできる。例えば、ＳＯＥ－ＰＣＲ法などにより、上記連結断片の両端に宿主のゲノムと相補的な配列を付加したＤＮＡ断片を構築し、これを宿主に導入して、宿主ゲノムと該ＤＮＡ断片との間に相同組換えを起こさせることによって、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチドが宿主のゲノムに導入される。
　斯くして得られた、本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド又はそれを含むベクターが導入された形質転換体を適切な培地で培養すれば、該ベクター上のタンパク質をコードする遺伝子が発現して本発明のリパーゼが生成される。当該形質転換体の培養に使用する培地は、当該形質転換体の微生物の種類にあわせて、当業者が適宜選択することができる。
　あるいは、本発明のリパーゼは、無細胞翻訳系を使用して本発明のリパーゼをコードするポリヌクレオチド又はその転写産物から発現させてもよい。「無細胞翻訳系」とは、宿主となる細胞を機械的に破壊して得た懸濁液にタンパク質の翻訳に必要なアミノ酸などの試薬を加えて、ｉｎ　ｖｉｔｒｏ転写翻訳系又はｉｎ　ｖｉｔｒｏ翻訳系を構成したものである。
　上記培養物又は無細胞翻訳系にて生成された本発明のリパーゼは、タンパク質精製に用いられる一般的な方法、例えば、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ゲルクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどを単独で又は適宜組み合わせて用いることにより、単離又は精製することができる。培養物から回収されたタンパク質は、公知の手段でさらに精製されてもよい。
＜３．洗浄剤組成物＞
　斯くして得られる本発明のリパーゼは、公知のタンパク質に比して、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対して顕著に高い耐性を有し、界面活性剤存在下であっても顕著に高い洗浄力を示す。
　ここで、「高い耐性」とは、公知のタンパク質、具体的には配列番号２、４、６、８、１０もしくは１２で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼ又はＮＣＢＩタンパク質配列データベースでリパーゼと推定されたタンパク質に比して高い耐性を意味する。界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対する耐性は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、リパーゼ溶液と界面活性剤溶液を混合し、該混合液にリパーゼの基質となるオクタン酸４－ニトロフェニル溶液を添加し、４－ニトロフェノールの遊離に伴う４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定し、ブランクとの差分ΔＯＤ／ｍｉｎをリパーゼ活性値（界面活性剤溶液中のリパーゼ活性値）として求める。さらに、界面活性剤溶液にかえてバッファーを用いた際のリパーゼ活性値（バッファー中のリパーゼ活性値）を求め、界面活性剤溶液中のリパーゼ活性値をバッファー中のリパーゼ活性値で割って１００を掛けた値を相対活性（％）として求める。相対活性（％）が高い程、界面活性剤によるリパーゼ活性阻害に対する耐性が高いと判断できる。
　本発明のリパーゼは、後記実施例の（３）の条件下、ＳＤＳ溶液（０．１％（ｗ／ｖ））中のリパーゼ相対活性（％）が好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上のリパーゼである。
　本発明のリパーゼは、後記実施例の（３）の条件下、Ｔｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００溶液（０．１％（ｗ／ｖ））中のリパーゼ相対活性（％）が好ましくは５０％以上、より好ましくは７０％以上のリパーゼである。
　また、「高い洗浄力」とは、公知のタンパク質、具体的には配列番号２、４、６、８、１０若しくは１２で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼ又はＮＣＢＩタンパク質配列データベースでリパーゼと推定されたタンパク質に比して高い洗浄力、例えば、汚れの除去を洗濯又は洗浄工程においてもたらす能力を意味する。洗浄力は、当該技術分野において周知の方法を用いて評価され得る。例えば、所定の指標物質（例えば、スダンIIIなどの脂肪に対する溶解性の高い染色剤）を含むモデル汚れにリパーゼを含む洗浄液を添加して所定の条件で洗浄処理する。洗浄液の一部を分取し、洗浄処理により洗浄液に可溶化したモデル汚れ中の指標物質の濃度を、例えば吸光度測定により測定し、ブランクとの差分を洗浄力として求めることができる。
　本発明のリパーゼは、各種洗浄剤組成物配合用酵素として有用であり、特に低温洗浄に適した洗浄剤組成物配合用酵素として有用である。
　ここで、「低温」としては、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下が挙げられ、また５℃以上、１０℃以上、１５℃以上が挙げられる。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃が挙げられる。
　洗浄剤組成物中への本発明のリパーゼの配合量は、当該リパーゼが活性を示す量であれば特に制限されないが、例えば、洗浄剤組成物１ｋｇ当たり好ましくは０．１ｍｇ以上、より好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは５ｍｇ以上であり、且つ好ましくは５０００ｍｇ以下、より好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。また０．１～５０００ｍｇであるのが好ましく、１～１０００ｍｇであるのがより好ましく、５～５００ｍｇであるのがより好ましい。
　洗浄剤組成物は、好ましくは、本発明のリパーゼに加えて、スルホコハク酸エステル又はその塩を含む。スルホコハク酸エステル又はその塩は、洗浄剤組成物に配合される成分として知られている（例えば、特開２０１９－１８２９１１号公報）。スルホコハク酸エステル又はその塩は、炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩が好ましく、炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩がより好ましく、炭素数１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩がさらに好ましい。また、スルホコハク酸エステル又はその塩は、スルホコハク酸ジ分岐鎖アルキルエステル又はその塩であって、２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩が好ましく、２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩がより好ましく、２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩がさらに好ましく、ビス－（２－プロピルヘプチル）スルホコハク酸又はその塩がさらに好ましい。
　塩としては、例えばアルカリ金属塩、アルカノールアミン塩などが挙げられ、アルカリ金属塩又はアルカノールアミン塩が好ましく、ナトリウム塩、カリウム塩、トリエタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、及びモノエタノールアミン塩から選ばれる塩がより好ましく、ナトリウム塩がさらに好ましい。
　スルホコハク酸エステル又はその塩としては、下記式１で表される化合物が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
〔式１中、Ｒ1、Ｒ2は、それぞれ、炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基であり、Ａ1Ｏ、Ａ2Ｏは、それぞれ、炭素数２以上４以下のアルキレンオキシ基であり、ｘ１、ｘ２は、平均付加モル数であり、それぞれ、０以上１０以下の数であり、Ｍは陽イオンである。〕
　式１中、Ｒ1、Ｒ2は、それぞれ、分岐鎖ノニル基、分岐鎖デシル基及び分岐鎖ドデシル基から選ばれる分岐鎖アルキル基が好ましく、分岐鎖デシル基がより好ましい。分岐鎖デシル基は、２－プロピルヘプチル基が好ましい。
　式１中、Ａ1Ｏ、Ａ2Ｏは、それぞれ、炭素数２以上４以下、水に対する潤滑性の観点から好ましくは炭素数２又は３のアルキレンオキシ基である。式１中、ｘ１、ｘ２は、Ａ1Ｏ、Ａ2Ｏの平均付加モル数を表し、それぞれ、０以上１０以下、水に対する潤滑性の観点から好ましくは６以下、より好ましくは４以下、さらに好ましくは２以下の数であり、０がさらに好ましい。
　式１中、Ｍは陽イオンである。Ｍは水素イオン以外の陽イオンが好ましい。Ｍとしては、例えば、リチウムイオン、ナトリウムイオン、カリウムイオンなどのアルカリ金属イオン、カルシウムイオン、バリウムイオンなどのアルカリ土類金属イオン、トリエタノールアンモニウムイオン、ジエタノールアンモニウムイオン、モノエタノールアンモニウムイオン、トリメチルアンモニウムイオン、モノメチルアンモニウムイオンなどの有機アンモニウムイオンなどが挙げられる。
　Ｍは、水への分散性の観点から、アルカリ金属イオン、アルカノールアンモニウムイオンが好ましく、ナトリウムイオン、カリウムイオン、トリエタノールアンモニウムイオン、ジエタノールアンモニウムイオン、モノエタノールアンモニウムイオンがより好ましく、ナトリウムイオンがさらに好ましい。
　スルホコハク酸エステル又はその塩は、下記式１－１で表される化合物が好ましい。式１－１の化合物は、式１中のｘ１、ｘ２がそれぞれ０の化合物である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
〔式１－１中、Ｒ1、Ｒ2は、それぞれ、炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基であり、Ｍは陽イオンである。〕
　式１－１中のＲ1、Ｒ2、Ｍの具体例や好ましい例は式１と同じである。
　好ましい一実施形態において、スルホコハク酸エステル又はその塩は、ビス－（２－プロピルヘプチル）スルホコハク酸又はその塩である。
　洗浄剤組成物中へのスルホコハク酸エステル又はその塩の配合量は、好ましくは０．０１質量％以上、より好ましくは０．１質量％以上、且つ好ましくは２．０質量％以下、より好ましくは１．０質量％以下である。また０．０１～２．０質量％であるのが好ましく、０．１～１．０質量％であるのがさらに好ましい。
　洗浄剤組成物は、本発明のリパーゼ以外に様々な酵素を併用することもできる。例えば、加水分解酵素、酸化酵素、還元酵素、トランスフェラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、シンテターゼなどである。このうち、本発明のリパーゼとは異なるリパーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、セルラーゼ、ケラチナーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、プルラナーゼ、ペクチナーゼ、マンナナーゼ、グルコシダーゼ、グルカナーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、ラッカーゼなどが好ましく、特にプロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼが好ましい。
　プロテアーゼとしては市販のＡｌｃａｌａｓｅ、Ｅｓｐｅｒａｓｅ、Ｅｖｅｒｌａｓｅ、Ｓａｖｉｎａｓｅ、Ｋａｎｎａｓｅ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　Ｕｎｏ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ、ＥＸＣＥＬＬＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、Ｌａｖｅｒｇｙ（登録商標；ＢＡＳＦ社）、またＫＡＰ（花王）、などが挙げられる。
　セルラーゼとしてはＣｅｌｌｕｃｌｅａｎ、Ｃａｒｅｚｙｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、またＫＡＣ、特開平１０－３１３８５９号公報記載のバチルス・エスピーＫＳＭ－Ｓ２３７株が生産するアルカリセルラーゼ、特開２００３-３１３５９２の号公報記載の変異アルカリセルラーゼ（以上、花王）などが挙げられる。
　アミラーゼとしてはＴｅｒｍａｍｙｌ、Ｄｕｒａｍｙｌ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ、Ｓｔａｉｎｚｙｍｅ　Ｐｌｕｓ、Ａｍｐｌｉｆｙ　Ｐｒｉｍｅ（登録商標；ノボザイムズ社）、ＰＲＥＦＥＲＥＮＺ、ＥＦＦＥＣＴＥＮＺ（登録商標；デュポン社）、またＫＡＭ（花王）、などが挙げられる。
　リパーゼとしてはＬｉｐｏｌａｓｅ、Ｌｉｐｅｘ（登録商標；ノボザイムズ社）などが挙げられる。
　洗浄剤組成物には公知の洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成分としては、例えば次のものが挙げられる。
（１）界面活性剤
　界面活性剤は洗浄剤組成物中０．５～６０質量％配合され、特に粉末状洗浄剤組成物については１０～４５質量％、液体洗浄剤組成物については２０～９０質量％配合することが好ましい。また本発明の洗浄剤組成物がランドリー用衣料洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤である場合、界面活性剤は一般に１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。
　洗浄剤組成物に用いられる界面活性剤としては、上記のスルホコハク酸エステル又はその塩以外の、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、陽イオン性界面活性剤の１種又は組み合わせを挙げることが出来るが、好ましくは陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤である。
　陰イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールの硫酸エステル塩、炭素数８～２０のアルコールのアルコキシル化物の硫酸エステル塩、アルキルベンゼンスルホン酸塩、パラフィンスルホン酸塩、α－オレフィンスルホン酸塩、内部オレフィンスルホン酸塩、α－スルホ脂肪酸塩、α－スルホ脂肪酸アルキルエステル塩又は脂肪酸塩が好ましい。本発明では特に、アルキル鎖の炭素数が１０～１４の、より好ましくは１２～１４の直鎖アルキルベンゼンスルホン酸塩及びアルキレン鎖の炭素数が１２～２０の、より好ましくは１６～１８の内部オレフィンスルホンから選ばれる一種以上の陰イオン性界面活性剤が好ましく、対イオンとしては、アルカリ金属塩やアミン類が好ましく、特にナトリウム及び／又はカリウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンが好ましい。内部オレフィンスルホン酸は例えばＷＯ２０１７／０９８６３７を参照することができる。
　非イオン性界面活性剤としては、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）エーテル、アルキルポリグリコシド、ポリオキシアルキレンアルキル（炭素数８～２０）フェニルエーテル、ポリオキシアルキレンソルビタン脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシアルキレングリコール脂肪酸（炭素数８～２２）エステル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンブロックポリマーが好ましい。特に、非イオン性界面活性剤としては、炭素数１０～１８のアルコールにエチレンオキシドやプロピレンオキシドなどのアルキレンオキシドを４～２０モル付加した〔ＨＬＢ値（グリフィン法で算出）が１０．５～１５．０、好ましくは１１．０～１４．５であるような〕ポリオキシアルキレンアルキルエーテルが好ましい。
（２）二価金属イオン捕捉剤
　二価金属イオン捕捉剤は０．０１～５０質量％、好ましくは５～４０質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる二価金属イオン捕捉剤としては、トリポリリン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタールカルボン酸塩などが挙げられる。このうち結晶性アルミノケイ酸塩（合成ゼオライト）が特に好ましく、Ａ型、Ｘ型、Ｐ型ゼオライトのうち、Ａ型が特に好ましい。合成ゼオライトは、平均一次粒径０．１～１０μｍ、特に０．１～５μｍのものが好適に使用される。
（３）アルカリ剤
　アルカリ剤は０．０１～８０質量％、好ましくは１～４０質量％配合される。粉末洗剤の場合、デンス灰や軽灰と総称される炭酸ナトリウムなどのアルカリ金属炭酸塩、並びにＪＩＳ１号、２号、３号などの非晶質のアルカリ金属珪酸塩が挙げられる。これら無機性のアルカリ剤は洗剤乾燥時に、粒子の骨格形成において効果的であり、比較的硬く、流動性に優れた洗剤を得ることができる。これら以外のアルカリとしてはセスキ炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウムなどが挙げられ、またトリポリリン酸塩などのリン酸塩もアルカリ剤としての作用を有する。また、液体洗剤に使用されるアルカリ剤としては、上記アルカリ剤の他に水酸化ナトリウム、並びにモノ、ジ又はトリエタノールアミンを使用することができ、活性剤の対イオンとしても使用できる。
（４）再汚染防止剤
　再汚染防止剤は０．００１～１０質量％、好ましくは１～５質量％配合される。本発明洗浄剤組成物に用いられる再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、カルボン酸系ポリマー、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドンなどが挙げられる。このうちカルボン酸系ポリマーは再汚染防止能の他、金属イオンを捕捉する機能、固体粒子汚れを衣料から洗濯浴中へ分散させる作用がある。カルボン酸系ポリマーはアクリル酸、メタクリル酸、イタコン酸などのホモポリマーないしコポリマーであり、コポリマーとしては上記モノマーとマレイン酸の共重合したものが好適であり、分子量が数千～１０万のものが好ましい。上記カルボン酸系ポリマー以外に、ポリグリシジル酸塩などのポリマー、カルボキシメチルセルロースなどのセルロース誘導体、並びにポリアスパラギン酸などのアミノカルボン酸系のポリマーも金属イオン捕捉剤、分散剤及び再汚染防止能を有するので好ましい。
（５）漂白剤
　例えば過酸化水素、過炭酸塩などの漂白剤は１～１０質量％配合するのが好ましい。漂白剤を使用するときは、テトラアセチルエチレンジアミン（ＴＡＥＤ）や特開平６－３１６７００号公報記載などの漂白活性化剤（アクチベーター）を０．０１～１０質量％配合することができる。
（６）蛍光剤
　洗浄剤組成物に用いられる蛍光剤としてはビフェニル型蛍光剤（例えばチノパールＣＢＳ－Ｘなど）やスチルベン型蛍光剤（例えばＤＭ型蛍光染料など）が挙げられる。蛍光剤は０．００１～２質量％配合するのが好ましい。
（７）その他の成分
　洗浄剤組成物には、衣料用洗剤の分野で公知のビルダー、柔軟化剤、還元剤（亜硫酸塩など）、抑泡剤（シリコーンなど）、香料、防菌防カビ剤（プロキセル［商品名］、安息香酸など）、その他の添加剤を含有させることができる。
　洗浄剤組成物は、上記方法で得られた本発明のリパーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合わせて常法に従い製造することができる。洗剤の形態は用途に応じて選択することができ、例えば液体、粉体、顆粒、ペースト、固形などにすることができる。
　斯くして得られる洗浄剤組成物は、衣料洗浄剤、食器洗浄剤、漂白剤、硬質表面洗浄用洗浄剤、排水管洗浄剤、義歯洗浄剤、医療器具用の殺菌洗浄剤などとして使用することができるが、好ましくは衣料洗浄剤、食器洗浄剤が挙げられ、より好ましくはランドリー用衣料洗浄剤（ランドリー用洗濯洗剤）、手洗いによる食器洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤が挙げられる。
　また、当該洗浄剤組成物は、４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での使用に適する。また、５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での使用に適する。好ましい使用態様としては、ランドリーでの低温（１５～３０℃）洗浄における使用、自動食器洗浄機による低温（１５～３０℃）洗浄における使用が挙げられる。
　本発明の洗浄剤組成物を用いることで、汚れの除去を必要とする被洗浄物（例えば、衣類、食器、硬質表面、排水管、義歯、医療器具など）を洗浄すること、すなわち汚れを除去することができる。斯かる洗浄方法は、汚れの除去を必要とする被洗浄物と本発明の洗浄剤組成物とを接触させることを含む。好ましくは、汚れとは、皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである。
　本発明の洗浄方法において、被洗浄物と洗浄剤組成物とを接触させるには、該洗浄剤組成物を溶かした水に、該被洗浄物を漬け置きしてもよく、また該洗浄剤組成物を、該被洗浄物に直接塗布してもよい。本発明の方法においては、該漬け置き又は洗剤組成物の塗布後の被洗浄物をさらに手洗い、洗濯機などで洗ってもよいが、必ずしもその必要はない。
　上述した実施形態に関し、本発明においては更に以下の態様が開示される。
＜１＞配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
＜２＞配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなる、＜１＞に記載のリパーゼ。
＜３＞＜１＞又は＜２＞に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
＜４＞＜３＞に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
＜５＞＜４＞に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
＜６＞微生物である、＜５＞に記載の形質転換細胞。
＜７＞大腸菌又はバチルス属細菌である、＜５＞又は＜６＞に記載の形質転換細胞。
＜８＞＜１＞又は＜２＞に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
＜９＞スルホコハク酸エステル又はその塩、好ましくは炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩、より好ましくは炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくは炭素数１０の分岐鎖アルキル基を有するスルホコハク酸分岐アルキルエステル又はその塩をさらに含有する、＜８＞に記載の洗浄剤組成物。
＜１０＞スルホコハク酸ジエステル又はその塩、好ましくは２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９以上１２以下の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、より好ましくは２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素数９又は１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくは２つの分岐鎖アルキル基がそれぞれ炭素１０の分岐鎖アルキル基であるスルホコハク酸ジ分岐アルキルエステル又はその塩、さらに好ましくはビス－（２－プロピルヘプチル）スルホコハク酸又はその塩をさらに含有する、＜８＞に記載の洗浄剤組成物。
＜１１＞衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、＜８＞～＜１０＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
＜１２＞粉末又は液体である、＜８＞～＜１１＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
＜１３＞低温で使用される、＜８＞～＜１２＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物。
＜１４＞４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上で使用されるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃で使用される、＜１３＞に記載の洗浄剤組成物。
＜１５＞＜８＞～＜１４＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
＜１６＞被洗浄物と＜８＞～＜１４＞のいずれかに記載の洗浄剤組成物とを接触させることを含む、＜１５＞に記載の方法。
＜１７＞汚れが皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである、＜１５＞又は＜１６＞に記載の方法。
＜１８＞洗浄剤組成物の製造のための配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼの使用。
＜１９＞リパーゼが配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである、＜１８＞に記載の使用。
＜２０＞洗浄剤組成物が衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、＜１８＞又は＜１９＞に記載の使用。
＜２１＞洗浄剤組成物が粉末又は液体である、＜１８＞～＜２０＞のいずれかに記載の使用。
＜２２＞洗浄剤組成物が低温で使用されるものである、＜１８＞～＜２１＞のいずれかに記載の使用。
＜２３＞洗浄剤組成物が４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上で使用されるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃で使用されるものである、＜２２＞に記載の使用。
＜２４＞汚れの洗浄のための配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼの使用。
＜２５＞リパーゼが配列番号１４で示されるアミノ酸配列からなるリパーゼである、＜２４＞に記載の使用。
＜２６＞汚れが皮脂汚れ又は食品由来の油脂を含有する汚れである、＜２４＞又は＜２５＞に記載の使用。
＜２７＞洗浄が低温での洗浄である、＜２４＞～＜２６＞のいずれかに記載の使用。
＜２８＞洗浄が４０℃以下、３５℃以下、３０℃以下、２５℃以下で、且つ５℃以上、１０℃以上、１５℃以上での洗浄であるか、又は５～４０℃、１０～３５℃、１５～３０℃、１５～２５℃での洗浄である、＜２７＞に記載の使用。
　以下、実施例に基づき本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。
（１）リパーゼ発現プラスミドの構築
　リパーゼ発現プラスミドは、ＷＯ２０２１／１５３１２９に記載の枯草菌ｓｐｏＶＧ遺伝子由来プロモーターを含む配列番号２６のＶＨＨの発現用プラスミドを鋳型として構築した。上記プラスミドのＶＨＨ遺伝子を含むＯＲＦ全長に、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって各リパーゼ遺伝子を載せ替えることで構築した。人工遺伝子合成したリパーゼ遺伝子Ｌｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ、ＹｅＬｉｐ、ＫＡＬ－Ａ８、Ｌｉｐｒ１３８（それぞれ配列番号１、３、５、７、９、１１、１３及び１５のポリヌクレオチド、それぞれ配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４及び１６のアミノ酸配列をコードする）から、それぞれプラスミドｐＨＹ－Ｌｉｐｒ１３９、ｐＨＹ－ＰｖＬｉｐ、ｐＨＹ－ＰｆＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｔＬｉｐ、ｐＨＹ－ＥｓｐＬｉｐ、ｐＨＹ－ＹｅＬｉｐ、ｐＨＹ－ＫＡＬ－Ａ８、ｐＨＹ－Ｌｉｐｒ１３８を構築した。プラスミドｐＨＹ－Ｌｉｐｒ１３９のＬｉｐｒ１３９遺伝子を含むＯＲＦ全長に、Ｎ末端側に枯草菌ａｍｙＥ由来シグナル配列（配列番号１９のポリヌクレオチド、配列番号２０のアミノ酸配列をコードする）が連結されたリパーゼＴＬＬ遺伝子（配列番号１７のポリヌクレオチド、配列番号１８のアミノ酸配列をコードする）の人工合成遺伝子をＩｎ－Ｆｕｓｉｏｎ反応によって載せ替えることでｐＨＹ－ａｍｙＥｓｉｇ－ＴＬＬを構築した。
（２）リパーゼ溶液の調整
　リパーゼ発現プラスミドを枯草菌株にプロトプラスト法によって導入し、２×Ｌ－マルトース培地（２％トリプトン、１％酵母エキス、１％ＮａＣｌ、７．５％マルトース、７．５ｐｐｍ硫酸マンガン五水和物、０．０４％塩化カルシウム二水和物、１５ｐｐｍテトラサイクリン；％は（ｗ／ｖ）％）で、３０℃、２日間培養した後、リパーゼを含む培養上清を遠心分離により回収した。透析によって培養上清を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ＋０．０１％　Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００（ｐＨ７．０）にバッファー交換し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥのバンド強度からリパーゼ濃度を定量した。
（３）界面活性剤溶液中での活性測定
　オクタン酸４－ニトロフェニル（ＳＩＧＭＡ）を基質として用いた。リパーゼの作用による４－ニトロフェノールの遊離に伴う吸光度の増加速度を測定することでリパーゼの活性を求めることができる。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２０ｍＭ　オクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いた。２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）にＳＤＳ又はＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００を０．１％（ｗ／ｖ）添加したものを界面活性剤溶液として用いた。２ｐｐｍに調整したリパーゼ溶液５μＬと界面活性剤溶液１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液１０μＬを添加して、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを活性値とした。各リパーゼについて、界面活性剤溶液の代わりに２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を用いた際の活性値（バッファー中での活性）で界面活性剤溶液中での活性値を割って１００をかけた値を、相対活性（％）として求めた（図１）。
　ＴＬＬ、特許文献１、２及び３において洗浄への適性が開示されているＬｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８、及び自然界に現存するリパーゼ配列であるＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ及びＹｅＬｉｐは、ＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００の存在下で著しく活性が阻害された。これらと比較して、新規リパーゼＫＡＬ－Ａ８はＳＤＳ及びＴｒｉｔｏｎ　Ｘ－１００による活性阻害に対して高い耐性を示した。
（４）モデル洗浄液中での活性測定
　２０　ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中の２０ｍＭ　オクタン酸４－ニトロフェニルを基質溶液として用いた。モデル洗浄液として、表１の水性媒体を用いた。４ｐｐｍに調整したリパーゼ溶液２μＬと試験液（モデル洗浄液又は２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０））１００μＬを９６穴アッセイプレートの各ウェルで混合し、基質溶液１０μＬを添加して、３０℃で４０５ｎｍの吸光度変化（ＯＤ／ｍｉｎ）を測定した。ブランク（酵素添加無しサンプル）との差分ΔＯＤ／ｍｉｎを求めた。３１～５００μＭの４－ニトロフェノールを含む２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）１０μＬを各試験液１００μＬと混合し、４０５ｎｍの吸光度を測定し検量線を作成した。各試験液の検量線とΔＯＤ／ｍｉｎの値から、一分間あたりの４－ニトロフェノールの遊離速度（μＭ／ｍｉｎ）を活性値として算出した。
　各リパーゼについて、２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．０）を試験液とした際の活性値（バッファー中での活性）で、モデル洗浄液を試験液とした際の活性値を割って１００をかけた値を、相対活性（％）として求めた（図２）。
　ＴＬＬ、特許文献１、２及び３において洗浄への適性が開示されているＬｉｐｒ１３９、ＰｖＬｉｐ及びＬｉｐｒ１３８、及び自然界に現存するリパーゼ配列であるＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ及びＹｅＬｉｐは、モデル洗浄液中で著しく活性が阻害された。一方、新規リパーゼＫＡＬ－Ａ８はモデル洗浄液中での活性阻害に対して高い耐性を示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
（５）モデル洗浄液中での洗浄評価
　牛脂（ＳＩＧＭＡ，０３－０６６０）とナタネ油（ＳＩＧＭＡ，２３－０４５０）を重量比９：１で混合し、３倍量のクロロホルムに溶解した後に０．２ｗｔ％のスダンIIIで着色したものをモデル汚れとした。ポリプロピレン製の９６穴ディープウェルプレートのウェル底にモデル汚れを１０μＬずつ滴下し、クロロホルムを蒸発・乾燥させ、汚れプレートとした。
　表１記載のモデル洗浄液に、１／１００容量の２４０ｐｐｍのリパーゼ溶液を添加したものを洗浄液とした。汚れプレートに洗浄液を３００μＬずつ緩やかに添加し、室温（約２２℃）で１５分間静置して浸漬洗浄を行った。底部の汚れに触れないように洗浄液を１００μＬずつ分取し、新しい９６穴プレートに移した。浸漬洗浄によって洗浄液に可溶化したモデル汚れ中のスダンIIIを定量するため、５００ｎｍの吸光度（Ａ５００）を測定した。洗浄後のＡ５００から洗浄前のＡ５００を差し引いた値ΔＡ５００は洗浄液中への油の遊離量に対応し、洗浄力の指標として用いることができる。各リパーゼの洗浄力ΔＡ５００を図３に示した。
　特許文献１において洗浄への適性が開示されているＬｉｐｒ１３９は、ＴＬＬ、Ｌｉｐｒ１３８、ＰｖＬｉｐ、ＰｆＬｉｐ、ＥｔＬｉｐ、ＥｓｐＬｉｐ及びＹｅＬｉｐと比較して、モデル洗浄液中で高い洗浄力を示した。一方、新規リパーゼＫＡＬ－Ａ８はモデル洗浄液中でＬｉｐｒ１３９を含む他のリパーゼと比較して顕著に高い洗浄力を示した。

Claims (11)

  1. 　配列番号１４で示されるアミノ酸配列又はこれと少なくとも９１％の同一性を有するアミノ酸配列からなるリパーゼ。
  2. 　請求項１に記載のリパーゼをコードするポリヌクレオチド。
  3. 　請求項２に記載のポリヌクレオチドを含むベクター又はＤＮＡ断片。
  4. 　請求項３に記載のベクター又はＤＮＡ断片を含有する形質転換細胞。
  5. 　微生物である、請求項４に記載の形質転換細胞。
  6. 　請求項１に記載のリパーゼを含有する洗浄剤組成物。
  7. 　衣料洗浄剤又は食器洗浄剤である、請求項６に記載の洗浄剤組成物。
  8. 　粉末又は液体である、請求項７に記載の洗浄剤組成物。
  9. 　低温で使用される、請求項７又は８に記載の洗浄剤組成物。
  10. 　５～４０℃の温度で使用される、請求項９に記載の洗浄剤組成物。
  11. 　請求項６～１０のいずれか１項に記載の洗浄剤組成物を用いる、汚れの洗浄方法。
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