CN109312323B - 突变碱性蛋白酶 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种对螯合剂的稳定性得以提升的突变碱性蛋白酶。本发明的突变碱性蛋白酶是在序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列中，与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基被取代。

Description

突变碱性蛋白酶
技术领域
本发明涉及一种突变碱性蛋白酶。
背景技术
洗剂根据其形态而可分为粉末洗剂与液体洗剂。与粉末洗剂相比，液体洗剂具有溶解性优异、且能够于污渍部分直接涂布原液的优点。另一方面，由于必须在液体中常温保存蛋白酶等酶，因此液体洗剂存在粉末洗剂所没有的关于酶的稳定保存的技术难题。
进而，液体洗剂含有表面活性剂、脂肪酸、溶剂、螯合剂等，因此对酶而言为极其严苛的条件。例如，现有作为使液体洗剂中酶稳定的方法，已知添加钙离子，但液体洗剂所含的螯合剂具有夺取与酶配位的钙离子的性质，因此会减弱由钙离子产生的稳定化效果，而使酶变得不稳定。
洗剂中配合蛋白酶的目的在于分解衣物上附着的蛋白质污渍而使其低分子化，促进污渍的去除。作为洗剂用蛋白酶，现已开发出对不仅存在蛋白质且也混存有脂质的复合污渍具有清洁性的分子量约43,000的碱性蛋白酶(参照专利文献1)。进而，进行有通过使碱性蛋白酶突变而提升比活性或稳定性等，从而提高其清洁性能的研究(专利文献2、3)。
[现有技术文献]
[专利文献]
[专利文献1]国际公开第99/18218号小册子
[专利文献2]日本专利特开2010-273673号公报
[专利文献3]日本专利第5202690号公报
发明内容
在一方式中，本发明提供一种突变碱性蛋白酶，其由如下氨基酸序列构成：所述氨基酸序列是在序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列中，与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基被取代为苏氨酸。
在另一方式中，本发明提供一种编码上述突变碱性蛋白酶的多聚核苷酸。
在另一方式中，本发明提供一种含有上述多聚核苷酸的载体。
在另一方式中，本发明提供一种包含上述多聚核苷酸或上述载体的转化体。
在另一方式中，本发明提供一种使用上述转化体的突变碱性蛋白酶的制造方法。
进而在另一方式中，本发明提供一种含有上述突变碱性蛋白酶的洗剂组合物。
进而在另一方式中，本发明提供一种突变碱性蛋白酶的制造方法，其包括在序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列中，将与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基取代为苏氨酸。
进而在另一方式中，本发明提供一种碱性蛋白酶的对螯合剂的稳定性提升方法，其包括在序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列中，将与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基取代为苏氨酸。
附图说明
图1表示柠檬酸盐水溶液中的碱性蛋白酶突变体的残存相对活性。
图2表示EDTA水溶液中的碱性蛋白酶突变体的残存相对活性。
图3表示EDTA水溶液中的碱性蛋白酶突变体的残存相对活性。
具体实施方式
本说明书中，所谓“氨基酸残基”意味着构成蛋白质的20种氨基酸残基，即，丙氨酸(Ala或A)、精氨酸(Arg或R)、天冬酰胺(Asn或N)、天冬氨酸(Asp或D)、半胱氨酸(Cys或C)、谷氨酰胺(Gln或Q)、谷氨酸(Glu或E)、甘氨酸(Gly或G)、组氨酸(His或H)、异亮氨酸(Ile或I)、亮氨酸(Leu或L)、赖氨酸(Lys或K)、蛋氨酸(Met或M)、苯丙氨酸(Phe或F)、脯氨酸(Pro或P)、丝氨酸(Ser或S)、苏氨酸(Thr或T)、色氨酸(Trp或W)、酪氨酸(Tyr或Y)及缬氨酸(Val或V)。
本说明书中，核苷酸序列或氨基酸序列间的同一性可通过Lipman-Pearson法(Science,1985,227：1435-41)进行计算。具体而言，使用基因信息处理软件Genetyx-Win(Ver.5.1.1；软件开发)的同源性解析(Search homology)程序，将对照用单元大小(Unitsize to compare)(ktup)设定为2，进行解析而算出。
本说明书中，作为“1个或多个氨基酸被缺失、插入、取代或附加的氨基酸序列”，可列举1个以上20个以下、优选为1个以上10个以下、更优选为1个以上5个以下、进而优选为1个以上3个以下的氨基酸被缺失、插入、取代或附加的氨基酸序列。又，本说明书中，作为“1个或多个核苷酸被缺失、插入、取代或附加的核苷酸序列”，可列举1个以上60个以下、优选为1个以上30个以下、更优选为1个以上15个以下、进而优选为1个以上10个以下的核苷酸被缺失、插入、取代或附加的核苷酸序列。又，本说明书中，氨基酸或核苷酸的“附加”包括向序列的一末端及两末端的1个或多个氨基酸或核苷酸的附加。
本说明书中，氨基酸序列或核苷酸序列上的“相当的位置”可通过使目标序列与参照序列(例如序列号2所表示的氨基酸序列)以对各氨基酸序列或核苷酸序列中所存在的保守氨基酸残基或核苷酸赋予最大的同源性的方式进行比对(alignment)而确定。比对可使用公知的算法执行，其流程为本领域技术人员公知。例如比对可基于上述Lipman-Pearson法等以人工操作进行，也可通过在默认设置中采用Clustal W多重比对程序(Thompson,J.D.et al,1994,Nucleic Acids Res,22：4673-4680)进行。或者也可使用作为Clustal W修订版的Clustal W2或Clustal omega。Clustal W、Clustal W2及Clustal omega例如可以在欧洲生物信息学研究所(European Bioinformatics Institute：EBI[www.ebi.ac.uk/index.html])、或国立遗传学研究所运营的日本DNA数据库(DDBJ[www.ddbj.nig.ac.jp/Welcome-j.html])的网站上利用。
本领域技术人员可进而对上述获得的氨基酸序列的比对进行微调整以使之最优化。此种最优比对优选考虑到氨基酸序列的类似性或所插入间隙的频度等而决定。此处，所谓氨基酸序列的类似性是指将2个氨基酸序列比对时该两序列中存在同一或类似的氨基酸残基的位置数相对于全长氨基酸残基数的比率(％)。所谓类似的氨基酸残基意味着构成蛋白质的20种氨基酸中，如在极性或电荷方面具有相互类似的性质而会产生所谓保守性取代的氨基酸残基。由此种类似的氨基酸残基构成的群组为本领域技术人员公知，例如可列举：精氨酸与赖氨酸或谷氨酰胺、谷氨酸与天冬氨酸或谷氨酰胺、丝氨酸与苏氨酸或丙氨酸、谷氨酰胺与天冬酰胺或精氨酸、亮氨酸与异亮氨酸等，但并不限定于这些。
通过上述比对而和与参照序列的任意位置对应的位置比对的目标氨基酸序列的氨基酸残基的位置被视为“与该任意位置相当的位置”，该氨基酸残基被称为“相当的位置上的氨基酸残基”。
本说明书中，所谓突变多聚核苷酸或多肽的“亲本”多聚核苷酸或多肽是指通过对该核苷酸或氨基酸残基施加特定突变而会变为该突变多聚核苷酸或多肽的多聚核苷酸或多肽。
又，本说明书中，所谓控制区域与基因的“可工作地连结”是指基因与控制区域被以该基因能够在该控制区域的控制下进行表达的方式连结。基因与控制区域的“可工作地连结”的流程为本领域技术人员公知。
本说明书中，只要无特别限定，则有关基因的所谓“上游”及“下游”是指该基因的转录方向的上游及下游。
本说明书中，所谓“螯合剂”是指可与金属离子配位键合的化合物。洗剂组合物中添加的螯合剂具有对洗涤用水或污渍中的钙离子、镁离子等会对清洁产生不良影响的金属离子进行封阻的作用。作为添加在洗剂组合物中的螯合剂的例子，可列举：氮基三乙酸、亚胺基二乙酸、乙二胺乙酸、二亚乙基三胺五乙酸、二醇醚二胺四乙酸、羟乙基亚胺基二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸、黎豆氨酸等氨基聚乙酸或这些的盐，二甘醇酸、氧二琥珀酸、羧基甲氧基琥珀酸、柠檬酸、乳酸、酒石酸、草酸、苹果酸、氧二琥珀酸、葡萄糖酸、羧甲基琥珀酸、羧甲基酒石酸等有机酸或这些的盐，氨基三(亚甲基膦酸)、1-羟基亚乙基-1,1-二膦酸、乙二胺四(亚甲基膦酸)、二亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)、及这些的碱金属或低级胺盐等。
本发明涉及提供一种对螯合剂的稳定性得以提升的碱性蛋白酶突变体。
本发明人发现，分子量43,000的碱性蛋白酶KP43通过取代其氨基酸序列中的特定位置上的氨基酸残基，由此在包含螯合剂的液体中的稳定性得以提升。
本发明的突变碱性蛋白酶对螯合剂具有较高的稳定性，适宜作为配合在包含螯合剂的组合物(例如洗剂组合物)中的酶。包含本发明的突变碱性蛋白酶的洗剂组合物由于可在洗剂液中稳定地保持蛋白酶活性，因此可对含蛋白质及脂质的复合污渍发挥优异的清洁性能。
本发明提供一种突变碱性蛋白酶。本发明的突变碱性蛋白酶是相对于由序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，由与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基被取代的氨基酸序列构成的。
作为本发明的突变碱性蛋白酶的亲本碱性蛋白酶，可列举由序列号2所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶、以及由与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶，且与294位相当的位置上的氨基酸残基并非苏氨酸的碱性蛋白酶。作为由序列号2所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的例子，可列举源自KP43[芽孢杆菌属(Bacillus sp.)KSM-KP43(FERM BP-6532)]的碱性蛋白酶(参照专利文献1)。
作为由与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的例子，可列举与序列号2所表示的氨基酸序列具有95％以上的同一性、优选为96％以上的同一性、更优选为97％以上的同一性、进而优选为98％以上的同一性、进而更优选为99％以上的同一性的碱性蛋白酶。作为由与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的另一例子，可列举由相对于序列号2所表示的氨基酸序列而有1个或多个氨基酸被缺失、插入、取代或附加的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶。
作为由与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的另一例子，可列举：蛋白酶KP9860[源自芽孢杆菌属KSM-KP9860(FERM BP-6534)，WO99/18218，GenBank accession no.AB046403]、及蛋白酶9865[源自芽孢杆菌属KSM-9865(FERM P-18566)，GenBank accession no.AB084155]。
本发明中，用作亲本碱性蛋白酶的由与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶也可为源自由序列号2所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的突变碱性蛋白酶。作为该突变碱性蛋白酶的例子，可列举对源自上述KP-43株的碱性蛋白酶施加日本专利5202690号公报、日本专利特开2002-218989号公报、日本专利特开2002-306176号公报、日本专利特开2004-000122号公报、日本专利特开2004-305176号公报、日本专利特开2006-129865号公报、日本专利特开2007-061101号公报、日本专利特开2008-212084号公报、日本专利特开2009-034062号公报、日本专利特开2010-273672号公报、日本专利特开2010-273673号公报、日本专利特开2012-228216号公报及日本专利特开2013-233141号公报所记载的突变中的1种以上所得的突变碱性蛋白酶。
作为上述本发明中用作亲本碱性蛋白酶的突变碱性蛋白酶的优选例子，可列举相对于序列号2所表示的氨基酸序列而具有选自以下的(a)～(ds)中的1种以上的突变的突变碱性蛋白酶，
(a)将6位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F；
(b)将9位或与其相当的位置上的K取代为Q；
(c)将11位或与其相当的位置上的D取代为G、S或N；
(d)将15位或与其相当的位置上的S取代为H、C、Q、D、E、R、A、V、M、W或F；
(e)将16位或与其相当的位置上的S取代为T、Q、V、C、Y、D、E、R、K、H、L、I、M、W或F；
(f)将20位或与其相当的位置上的Y取代为F或A；
(g)将22位或与其相当的位置上的Q取代为W；
(h)将23位或与其相当的位置上的G取代为N；
(i)将37位或与其相当的位置上的R取代为T；
(j)将40位或与其相当的位置上的S取代为V、L、I、W或F；
(k)将41位或与其相当的位置上的S取代为I；
(l)将46位或与其相当的位置上的F取代为S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W；
(m)将49位或与其相当的位置上的K取代为Q；
(n)将52位或与其相当的位置上的A取代为G或S；
(o)将53位或与其相当的位置上的L取代为A、V或I；
(p)将54位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、H、A、V、M、W、F或P；
(q)将56位或与其相当的位置上的L取代为V；
(r)将57位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(s)将59位或与其相当的位置上的T取代为V、L、I、M、W或F；
(t)将60位或与其相当的位置上的N取代为V、L、I、W或F；
(u)将63位或与其相当的位置上的N取代为S、D或L；
(v)将65位或与其相当的位置上的T取代为W或P；
(w)将66位或与其相当的位置上的N取代为G、S、T、C、Q、D、E、H、A、V、L、I、M或W；
(x)将80位或与其相当的位置上的G取代为H或A；
(y)将81位或与其相当的位置上的S取代为Q、Y、L、I、W或F；
(z)将82位或与其相当的位置上的T取代为G、S、C、Q、D、E、R、K、H、A或M；
(aa)将83位或与其相当的位置上的N取代为S、C或A；
(ab)将84位或与其相当的位置上的K取代为R；
(ac)将89位或与其相当的位置上的Q取代为H；
(ad)将91位或与其相当的位置上的N取代为C；
(ae)将100位或与其相当的位置上的S取代为L、I、W或F；
(af)将101位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(ag)将102位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(ah)将103位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(ai)将104位或与其相当的位置上的L取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(aj)将105位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(ak)将106位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(al)将107位或与其相当的位置上的L取代为S、R、K或A；
(am)将109位或与其相当的位置上的S取代为L、I或F；
(an)将113位或与其相当的位置上的T取代为L或W；
(ao)将119位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P；
(ap)将120位或与其相当的位置上的S取代为Y、R、I、W或F；
(aq)将124位或与其相当的位置上的R取代为K或A；
(ar)将132位或与其相当的位置上的A取代为S、T、N、Q、D、I或M；
(as)将133位或与其相当的位置上的A取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P；
(at)将134位或与其相当的位置上的V取代为G、S、T或A；
(au)向133位或与其相当的位置与134位或与其相当的位置之间插入G、S、T、N、Q、Y、R、K、H、A、L、I、M或W；
(av)将135位或与其相当的位置上的N取代为R、A、L或M；
(aw)将136位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(ax)将138位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P；
(ay)将140位或与其相当的位置上的T取代为L、W或F；
(az)将148位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、M、W、F或P；
(ba)将151位或与其相当的位置上的K取代为F；
(bb)将163位或与其相当的位置上的E取代为S、T、N、Q、D、K、H、V、L、I或F；
(bc)将166位或与其相当的位置上的N取代为G、V、L、I、W或F；
(bd)将167位或与其相当的位置上的G取代为V；
(be)将170位或与其相当的位置上的I取代为V或L；
(bf)将171位或与其相当的位置上的S取代为G、T、E或A；
(bg)将187位或与其相当的位置上的N取代为S；
(bh)将191位或与其相当的位置上的S取代为V、L、I、W或F；
(bi)将193位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(bj)将194位或与其相当的位置上的S取代为Y、R或K；
(bk)将195位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(bl)将200位或与其相当的位置上的N取代为W；
(bm)将204位或与其相当的位置上的Q取代为S、T、C、N、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W或P；
(bn)将205位或与其相当的位置上的F取代为S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W；
(bo)将212位或与其相当的位置上的K取代为N、Q、R、V、L或W；
(bp)将226位或与其相当的位置上的F取代为Y；
(bq)将233位或与其相当的位置上的S取代为L、I或W；
(br)将237位或与其相当的位置上的D取代为N；
(bs)将238位或与其相当的位置上的S取代为L；
(bt)将243位或与其相当的位置上的N取代为Y、L或I；
(bu)将245位或与其相当的位置上的D取代为N；
(bv)将246位或与其相当的位置上的S取代为Y、V、L、W或F；
(bw)将247位或与其相当的位置上的K取代为S、T、C、N、Q、E、H、A、V、L、I、M、W或F；
(bx)将248位或与其相当的位置上的Y取代为F；
(by)将250位或与其相当的位置上的Y取代为F；
(bz)将251位或与其相当的位置上的M取代为G、T、N、Q、D、A、V、L或I；
(ca)将256位或与其相当的位置上的M取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、W、F或P；
(cb)将257位或与其相当的位置上的A取代为V或I；
(cc)将264位或与其相当的位置上的N取代为G、S、T、C、Q、D、E、A、V、L、I或M；
(cd)将273位或与其相当的位置上的V取代为G、T或I；
(ce)将275位或与其相当的位置上的N取代为L、W或F；
(cf)将277位或与其相当的位置上的G取代为V、L、I或F；
(cg)将281位或与其相当的位置上的K取代为R；
(ch)将296位或与其相当的位置上的I取代为V；
(ci)将297位或与其相当的位置上的G取代为L、W或F；
(cj)将304位或与其相当的位置上的N取代为S；
(ck)将313位或与其相当的位置上的D取代为N；
(cl)将319位或与其相当的位置上的A取代为S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P；
(cm)将320位或与其相当的位置上的Y取代为G、T、V、L、I或F；
(cn)将326位或与其相当的位置上的S取代为W；
(co)将330位或与其相当的位置上的S取代为M、W或F；
(cp)将332位或与其相当的位置上的K取代为G、T或V；
(cq)将334位或与其相当的位置上的T取代为L；
(cr)将335位或与其相当的位置上的Y取代为F；
(cs)将337位或与其相当的位置上的F取代为G、S、T、C、Q、R、K、H、A或V；
(ct)将342位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P；
(cu)将343位或与其相当的位置上的K取代为T；
(cv)将346位或与其相当的位置上的K取代为R；
(cw)将357位或与其相当的位置上的S取代为L；
(cx)将359位或与其相当的位置上的T取代为G、S、Q、V、L、I或F；
(cy)将361位或与其相当的位置上的S取代为V、I或W；
(cz)将369位或与其相当的位置上的D取代为N；
(da)将376位或与其相当的位置上的N取代为W；
(db)将378位或与其相当的位置上的T取代为L或W；
(dc)将379位或与其相当的位置上的Q取代为D、E、R或K；
(dd)将380位或与其相当的位置上的Y取代为F；
(de)将385位或与其相当的位置上的F取代为Y、M或P；
(df)将386位或与其相当的位置上的T取代为A、L、I或M；
(dg)将387位或与其相当的位置上的S取代为G、优选为Q、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F；
(dh)将390位或与其相当的位置上的N取代为G、S、T、Y或F；
(di)将393位或与其相当的位置上的W取代为Q；
(dj)将396位或与其相当的位置上的R取代为G；
(dk)将403位或与其相当的位置上的F取代为T或K；
(dl)将405位或与其相当的位置上的N取代为D、V、L、I、W、F或P；
(dm)将406位或与其相当的位置上的A取代为V、W或F；
(dn)将407位或与其相当的位置上的P取代为G或C；
(do)将408位或与其相当的位置上的Q取代为N、Y、I或W；
(dp)将409位或与其相当的位置上的S取代为Y或W；
(dq)将411位或与其相当的位置上的T取代为A、V、L或P；
(dr)将427位或与其相当的位置上的T取代为R或V；
(ds)将433位或与其相当的位置上的V取代为L。
上述(a)～(ds)的突变可单独应用任一种，也可将任两种以上加以组合。作为优选例子，可列举：该(ar)；该(as)、(at)及(au)的组合；该(bk)；该(cz)；该(v)、(cd)、(cx)及(dg)的组合；该(bc)及(bd)的组合；该(e)及(aa)的组合；该(j)、(s)、(y)、(bh)及(dl)的组合；该(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合；该(e)、(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合；该(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合；该(j)、(s)、(v)、(y)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bh)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)、(dg)及(dl)的组合；该(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合；该(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合；该(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(bm)、(cd)、(cl)、(cx)、(cz)及(dg)的组合；以及该(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bj)、(bk)、(bo)、(cd)、(cx)、(cz)、(dc)及(dg)的组合。
优选为在该本发明的突变体的亲本碱性蛋白酶的氨基酸序列中，与序列号2所表示的氨基酸序列的30位相当的位置上的氨基酸残基为天冬氨酸，与68位相当的位置上的氨基酸残基为组氨酸，且与255位相当的位置上的氨基酸残基为丝氨酸。更优选为该本发明的突变体的亲本碱性蛋白酶在与序列号2所表示的氨基酸序列中的下述表1(i)所记载的各位置相当的位置上具有表1(ii)所记载的氨基酸残基。表1所示的氨基酸残基为在上述例示的亲本碱性蛋白酶间经高度保留的氨基酸残基(Saeki等人,Journal of bioscience andBioengineering,2007,103：501-508)。
[表1]
(i)位置 (ii)氨基酸残基 (i)位置 (ii)氨基酸残基
10 丙氨酸 161 甘氨酸
18 甘氨酸 162 天冬酰胺
21 甘氨酸 173 脯氨酸
26 缬氨酸 182 缬氨酸
27 丙氨酸 183 甘氨酸
28 缬氨酸 184 丙氨酸
30 天冬氨酸 203 丙氨酸
32 甘氨酸 205 苯丙氨酸
43 组氨酸 206 丝氨酸
52 丙氨酸 209 甘氨酸
64 天冬氨酸 222 丙氨酸
66 天冬酰胺 223 脯氨酸
68 组氨酸 224 甘氨酸
69 甘氨酸 225 苏氨酸
70 苏氨酸 229 丝氨酸
71 组氨酸 253 甘氨酸
72 缬氨酸 254 苏氨酸
73 丙氨酸 255 丝氨酸
74 甘氨酸 256 蛋氨酸
85 甘氨酸 257 丙氨酸
87 丙氨酸 259 脯氨酸
88 脯氨酸 261 缬氨酸
92 亮氨酸 262 丙氨酸
106 甘氨酸 263 甘氨酸
118 丙氨酸 266 丙氨酸
129 丝氨酸 289 亮氨酸
131 甘氨酸 297 甘氨酸
145 缬氨酸 303 甘氨酸
159 丙氨酸
优选为该本发明的突变体的亲本碱性蛋白酶具有由序列号2所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶(专利文献1)所具有的下述酶学性质中的任一者：1)具有耐氧化剂性，在碱性侧(pH值8以上)作用，且较稳定。此处，所谓具有耐氧化剂性是指将该碱性蛋白酶在50mM过氧化氢(含5mM氯化钙)溶液中(20mM伯瑞坦-罗比森(Britton-Robinson)缓冲液，pH值10)、于20℃下放置20分钟后的残存活性(合成基质法)为至少50％以上；2)于50℃、pH值10的条件下经10分钟处理时表现出80％以上的残存活性；3)可被二异丙基氟磷酸(DFP)及苯甲磺酰氟(PMSF)抑制；4)基于SDS-PAGE的分子量为43,000±2,000。更优选为该亲本碱性蛋白酶具有上述1)～4)的各项酶学性质。
优选为本发明的突变碱性蛋白酶的亲本碱性蛋白酶在与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上具有丙氨酸。
作为该本发明的突变体的亲本碱性蛋白酶的优选例子，可列举由序列号2～11中的任一者所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶。序列号3、4、5、6、7、8、9、10及11所表示的氨基酸序列相对于序列号2所表示的氨基酸序列而分别具有99.8％、97.7％、97.5％、97.5％、96.3％、97.7％、97.5％、97.2％及96.8％的同一性。再者，序列号3～11所表示的氨基酸序列中的与序列号2的294位丙氨酸相当的氨基酸残基为294位丙氨酸(序列号3～5、8、10)及295位丙氨酸(序列号6～7、9、11)。
本发明的突变碱性蛋白酶可通过将上述亲本碱性蛋白酶的氨基酸序列中与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基取代为苏氨酸而制造。因此，在本发明的突变碱性蛋白酶中，与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基为苏氨酸。本发明的突变碱性蛋白酶与其亲本碱性蛋白酶相比，对螯合剂的稳定性得以提升。因此，本发明的突变碱性蛋白酶与其亲本碱性蛋白酶相比，在含有螯合剂的液体、例如洗剂液中更稳定，其结果，可在该含有螯合剂的液体中保持更高的碱性蛋白酶活性。
本发明的突变碱性蛋白酶优选为与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基为苏氨酸，且与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性。本发明的突变碱性蛋白酶更优选为与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的序列同一性，与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基为苏氨酸，与序列号2所表示的氨基酸序列的30位相当的位置上的氨基酸残基为天冬氨酸，与68位相当的位置上的氨基酸残基为组氨酸，且与255位相当的位置上的氨基酸残基为丝氨酸。
认为在上述亲本碱性蛋白酶之间，与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基是在这些蛋白质的三维结构中存在于与序列号2所表示的碱性蛋白酶的294位丙氨酸同等的位置。因此，推测亲本碱性蛋白酶中的与该294位相当的位置上存在的氨基酸残基的突变对这些的特异性功能产生相互类似的效果。
再者，在如上述(au)般对亲本碱性蛋白酶插入有1个氨基酸残基的情形时，该亲本碱性蛋白酶的与序列号2的134位以后的位置相当的位置位于与序列号2相差1个残基的下游。
本发明的突变碱性蛋白酶除了与上述294位相当的位置上的突变以外，只要无损其在含有螯合剂的溶液中的稳定性提升效果，则也可相对于亲本碱性蛋白酶而在其它的任意位置上具有突变(例如缺失、取代、附加、插入)。该突变可为天然产生，也可为人工导入。
例如本发明的突变碱性蛋白酶也可具有选自上述(a)～(ds)所示的取代后的氨基酸残基中的1种以上。例如本发明的突变碱性蛋白酶可具有以下的氨基酸残基：该(ar)所示的取代后的氨基酸残基；该(as)、(at)及(au)所示的取代后的氨基酸残基；该(bk)所示的取代后的氨基酸残基；该(cz)所示的取代后的氨基酸残基；该(v)、(cd)、(cx)及(dg)所示的取代后的氨基酸残基；该(bc)及(bd)所示的取代后的氨基酸残基；该(e)及(aa)所示的取代后的氨基酸残基；该(j)、(s)、(y)、(bh)及(dl)所示的取代后的氨基酸残基；该(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示的取代后的氨基酸残基；该(e)、(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示的取代后的氨基酸残基；该(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示的取代后的氨基酸残基；该(j)、(s)、(v)、(y)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bh)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)、(dg)及(dl)所示的取代后的氨基酸残基；该(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示的取代后的氨基酸残基；该(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)所示的取代后的氨基酸残基；该(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(bm)、(cd)、(cl)、(cx)、(cz)及(dg)所示的取代后的氨基酸残基；或该(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bj)、(bk)、(bo)、(cd)、(cx)、(cz)、(dc)及(dg)所示的取代后的氨基酸残基。这些突变碱性蛋白酶可通过在具有该(a)～(ds)所示的突变中的任一种以上的亲本碱性蛋白酶中，将其与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的丙氨酸取代为苏氨酸而获得，或也可通过在序列号2所表示的氨基酸序列的亲本碱性蛋白酶中，导入A294T突变、以及该(a)～(ds)所示的突变中的任一种以上而获得。
例如作为本发明的突变碱性蛋白酶，可列举：由序列号2～5、8、10中的任一者所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的A294T突变体、及由序列号6～7、9、11中的任一者所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的A295T突变体。
本发明中，作为使亲本碱性蛋白酶的氨基酸残基突变的方法，可采用该技术领域中公知的各种突变导入技术。例如在编码亲本碱性蛋白酶的氨基酸序列的多聚核苷酸(以下也称为亲本基因)中，使编码应突变的氨基酸残基的核苷酸序列突变为编码突变后的氨基酸残基的核苷酸序列，进而由该突变基因表达蛋白质，由此可获得目标突变碱性蛋白酶。
对亲本基因的目标突变的导入基本上例如可基于使用亲本基因作为模板DNA的PCR扩增或各种利用DNA聚合酶的复制反应，使用本领域技术人员公知的各种定点突变导入法而进行。定点突变导入法可通过例如反向PCR法或退火法等(村松等编，“修订第4版新基因工程手册”，羊土社，p82-88)任意方法进行。也可使用Stratagene公司的QuickChange II单点突变试剂盒(Site-Directed Mutagenesis Kit)、或QuickChange多点突变试剂盒(Multi Site-Directed Mutagenesis Kit)等各种市售的定点突变导入用试剂盒。
对亲本基因的定点突变导入最为普遍的是可使用包含应导入的核苷酸突变的突变用引物而进行。该突变用引物只要以如下方式设计即可：在亲本基因中的包含编码应突变的氨基酸残基的核苷酸序列的区域进行退火，且包含具有编码突变后的氨基酸残基的核苷酸序列(密码子)代替该编码应突变的氨基酸残基的核苷酸序列(密码子)的核苷酸序列。编码突变前及突变后的氨基酸残基的核苷酸序列(密码子)可由本领域技术人员根据通常的教科书等适当辨识选择。又，定点突变导入也可采用如下方法：通过SOE(splicing byoverlap extension，重叠延伸拼接)-PCR(Horton et al,Gene,1989,77(1)：p61-68)，将分开使用包含应导入的核苷酸突变的2个互补引物而分别使突变部位的上游侧及下游侧得到扩增的DNA片段连结为一整体。
包含亲本基因的模板DNA可通过如下方式制备：自上述芽孢杆菌属KSM-KP43(FERMBP-6532)、芽孢杆菌属KSM-KP9860(FERM BP-6534)、芽孢杆菌属KSM-9865(FERM P-18566)等菌、或这些的突变株，利用常规方法提取基因组DNA，或者提取RNA并利用逆转录合成cDNA。或可基于亲本碱性蛋白酶的氨基酸序列，化学合成与之对应的核苷酸序列而用作模板DNA。
自该芽孢杆菌属菌株的基因组DNA的制备可采用例如Pitcher et al,Lett ApplMicrobiol,1989,8：151-156所记载的方法等进行。包含亲本基因的模板DNA可以在任意载体中插入有所制备的cDNA、或自基因组DNA切出的包含亲本基因的DNA片段的形式制备。
突变用引物可通过亚磷酰胺法(Nucleic Acids Research,1989,17：7059-7071)等公知的寡核苷酸合成法制作。此种引物合成也可使用例如市售的寡核苷酸合成装置(ABI公司制造等)实施。使用包含该突变用引物的引物集，以亲本基因作为模板DNA进行如上所述的定点突变导入，由此可获得导入有目标突变的突变碱性蛋白酶基因。
因此，本发明也提供一种突变碱性蛋白酶基因。本发明的突变碱性蛋白酶基因是编码该本发明的突变碱性蛋白酶的多聚核苷酸。该本发明的多聚核苷酸可能包含单链或双链的DNA、cDNA、RNA或其它人工核酸。该DNA、cDNA及RNA可化学合成。又，该本发明的多聚核苷酸可包含开放阅读框架(ORF)、以及非翻译区(UTR)的核苷酸序列。
本发明也提供一种含有编码该本发明的突变碱性蛋白酶的多聚核苷酸的载体。该载体可通过将该本发明的多聚核苷酸以常规方法插入连结至任意载体中而制作。该载体的种类并无特别限定，可为质粒、噬菌体、噬菌粒(phagemid)、黏粒(cosmid)、病毒、YAC载体、穿梭载体等任意载体。又，该载体虽无限定，但优选为能够于细菌内、尤其是芽孢杆菌属细菌内扩增的载体，更优选为能够在芽孢杆菌属细菌内诱导所导入基因的表达的表达载体。其中，作为在芽孢杆菌属细菌与其它生物中均能够复制的载体的穿梭载体可优选地用于本发明的突变碱性蛋白酶的重组生产。优选载体的例子并无限定，可列举：pHA3040SP64、pHSP64R或pASP64(日本专利第3492935号)、pHY300PLK(能够将大肠杆菌与枯草芽孢杆菌两者进行转化的表达载体；Ishikawa and Shibahara,Jpn J Genet,1985,60：235-243)、pAC3(Moriyama et al,Nucleic Acids Res,1988,16：8732)等穿梭载体；pUB110(Gryczan etal,J Bacteriol,1978,134：318-329)、pTA10607(Bron et al,Plasmid,1987,18：8-15)等能够用于芽孢杆菌属细菌的转化的质粒；能够对重组蛋白质赋予分泌信号的分泌载体(山根等人，“基于枯草芽孢杆菌分泌载体的融合蛋白质”淀粉科学，34.(1987)，163-170)等。又，也可使用源自大肠杆菌的质粒(例如pET22b(+)、pBR322、pBR325、pUC118、pUC119、pUC18、pUC19、pBluescript等)。
在重组生产本发明的突变碱性蛋白酶的情形时，该载体优选为表达载体。表达载体视需要可包含转录启动子、终止子、核糖体结合位点等在宿主生物中进行表达所必须的各种元件(element)；多聚接头(Polylinker)、增强子等顺式作用元件(cis-element)；polyA加成信号；核糖体结合序列(SD序列)；药剂(例如氨苄青霉素、新霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素等)耐性基因等选择标记基因等有用的序列。
本发明也提供一种转化体，所述转化体包含编码本发明的突变碱性蛋白酶的多聚核苷酸或含有其的载体。该转化体可通过对宿主导入编码本发明的突变碱性蛋白酶的多聚核苷酸、或含有其的载体(优选为重组表达载体)而制造。
作为该转化体的宿主，可列举：以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌等细菌、酵母细胞为代表的微生物、以及昆虫细胞、动物细胞(例如哺乳动物细胞)、植物细胞等任意细胞。该宿主优选为芽孢杆菌属细菌，更优选为枯草芽孢杆菌或其突变株。因此，本发明的转化体为重组芽孢杆菌属细菌，更优选为枯草芽孢杆菌或其突变株的重组体。
宿主的转化可应用例如磷酸钙法、电穿孔法、脂质转染法、基因枪法、PEG法等公知的转化技术。例如作为可应用于芽孢杆菌属细菌的转化法，可列举：感受态细胞转化法(JBacteriol,1967,93：1925-1937)、电穿孔法(Brigidi et al,FEMS Microbiol Lett,1990,55：135-138)、原生质粒转化法(Chang and Cohen,Mol Gen Genet,1979,168：111-115)、Tris-PEG法(Takahashi et al,J Bacteriol,1983,156：1130-1134)等。
通过培养该本发明的转化体而可制造本发明的突变碱性蛋白酶。因此，本发明也提供一种使用本发明的转化体的突变碱性蛋白酶的制造方法。用于突变碱性蛋白酶制造的该转化体的培养可依据本领域技术人员常见的方法进行。例如作为对基于大肠杆菌或酵母细胞等微生物宿主的转化体进行培养的培养基，只要含有该微生物宿主能够消化的碳源、氮源、无机盐类等，而有效率地进行转化体的培养的培养基即可。该培养基可使用天然培养基及合成培养基的任意者。例如用以生产重组蛋白质的枯草芽孢杆菌转化体的培养可使用LB培养基、2×YT培养基、2×L-麦芽糖培养基、或CSL发酵培养基等。也可对该培养基添加与转化体中所导入的药剂耐性基因(选择标记基因)的种类对应的药剂。又，在对已通过使用诱导型启动子的表达载体而实现转化的微生物进行培养的情形时，视需要可在培养基中添加诱导剂。例如在对已通过使用Lac启动子的表达载体而实现转化的微生物进行培养时，可在培养基中添加异丙基-1-硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)等，在对已通过使用trp启动子的表达载体而实现转化的微生物进行培养时，可在培养基中添加吲哚乙酸(IAA)等。
或者，本发明的突变碱性蛋白酶可使用无细胞翻译系统，由编码本发明的突变碱性蛋白酶的多聚核苷酸或其转录产物进行表达。所谓“无细胞翻译系统”是指对机械地破坏成为宿主的细胞而得的悬浮液添加蛋白质的翻译所需的氨基酸等试剂，而构成体外(invitro)转录翻译系统或体外翻译系统。
利用该转化体或无细胞翻译系统所制造的本发明的突变碱性蛋白酶可通过单独地或适当组合使用蛋白质纯化中使用的常规方法，例如离心分离、硫酸铵沉淀、凝胶色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法等，自培养液、细胞破碎液、无细胞翻译系统的反应液等取得。或可将使用离心分离或超滤型过滤器等而经分离或浓缩的培养上清液或溶菌液上清液等溶液直接以粗酶液的形式使用。在所表达出的突变碱性蛋白酶并非自细胞内分泌的情形时，将该细胞破碎后进行蛋白质的分离纯化即可。
本发明中所用的mRNA的制备、cDNA的制作、PCR、RT-PCR、基因库的制作、向载体中的接合、细胞的转化、DNA的碱基序列的确定、核酸化学合成、蛋白质的N末端侧的氨基酸序列确定、突变诱发、蛋白质的提取等实验可通过通常的实验书中记载的方法进行。作为此种实验书，例如可列举Sambrook等人的Molecular Cloning,A laboratory manual,2001,3rdEd.,Sambrook,J.&Russell,DW.Cold Spring Harbor Laboratory Press。进而，关于枯草芽孢杆菌的基因重组实验，可参照有关枯草芽孢杆菌的基因操作的常用实验书，例如吉川博文著“7.2枯草芽孢杆菌系”“续生化学实验讲座1.基因研究法II”，1986，东京化学同人社(东京)，p150-169等。
通过本发明的制造方法所获得的突变碱性蛋白酶与亲本碱性蛋白酶相比，对螯合剂的稳定性得以提升，可更具稳定性地存在于含有螯合剂的液体、优选为液体洗剂中，因此，本发明的另一方式可为一种碱性蛋白酶的对螯合剂的稳定性提升方法，其包括对上述亲本碱性蛋白酶的氨基酸序列中与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基进行取代。
本发明的突变碱性蛋白酶由于对螯合剂的稳定性较高，因此可用作洗剂配合用酶。含有本发明的突变碱性蛋白酶的洗剂能够维持较现有更高的蛋白酶活性，结果可发挥更强力的酶清洁力。因此，本发明也提供一种含有本发明的突变碱性蛋白酶的洗剂组合物。该洗剂组合物可为粉末洗剂组合物，但优选为液体洗剂组合物。
本发明的洗剂组合物含有螯合剂。本发明的洗剂组合物可含有的螯合剂的例子如上文所列举。本发明的洗剂组合物中的螯合剂的含量优选为0.1～5质量％、更优选为0.1～4质量％。
本发明的洗剂组合物中的本发明的突变碱性蛋白酶的含量只要为碱性蛋白酶显示活性的量，则并无特别限制，相对于每1kg洗剂组合物，优选为0.1～25000U，更优选为0.1～5000U，进而优选为0.1～2500U。再者，碱性蛋白酶的活性(U)是通过以下方法测定：取1/15M磷酸缓冲液(pH值7.4)0.9mL、40mM Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-对硝基酰替苯胺(p-nitroanilide)/二甲基亚砜溶液0.05mL置于试验管内，于30℃下保温5分钟。向其中添加酶液0.05mL，于30℃下进行10分钟的反应后，添加5％(w/v)柠檬酸水溶液2.0mL而停止反应，使用分光光度计测定420nm下的吸光度。此处，酶1单位(U)是设为在上述反应中1分钟内能够生成1μmol对硝基苯胺(p-nitroaniline)的量。
本发明的洗剂组合物中除本发明的突变碱性蛋白酶以外也含有表面活性剂及水。作为表面活性剂，可使用阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、两性表面活性剂、及阳离子表面活性剂等任意的表面活性剂中的1种或将2种以上组合使用。本发明的洗剂组合物中的该表面活性剂的含量优选为10～80质量％、更优选为30～70质量％。
作为非离子表面活性剂，只要为液体洗剂中通常所配合的具有C8～C22的烃基、且加成有数摩尔以上的C2氧化烯基的非离子表面活性剂即可，例如可列举以下：
R1O-(AO)m-H(R1＝C8-C22烃、AO＝C2-C5氧化烯基、m＝16～35)[日本专利特开2010-275468号公报]；
R1O-(EO)l-(AO)m-(EO)n-H(R1＝C8-C18烃、EO＝C2氧化烯基、AO＝C3-C5氧化烯基、l＝3～30、m＝1～5、l+n＝14～50)[日本专利特开2010-265445号公报、日本专利特开2011-63784号公报]；
R1O-(EO)m/(AO)n-H(R1＝C8-C22烃、EO＝C2氧化烯基、AO＝C3-C5氧化烯基、m＝10～30、n＝0～5、EO与AO为无规或嵌段键合)[日本专利特开2010-189551号公报]；
R1(CO)lO-(EO)m/(AO)n-R2(R1＝C8-C22烃、EO＝C2氧化烯基、AO＝C3-C5氧化烯基、l＝0～1、m＝14～50、n＝1～5、R2＝氢(l＝0)或C1-C3烷基、EO与AO为无规或嵌段键合)[日本专利特开2010-229385号公报]；
R1O-(EO)m-(AO)n-H(R1＝C8-C22烃、EO＝C2氧化烯基、AO＝C3-C5氧化烯基、m＝15～30、n＝1～5)[日本专利特开2010-229387号公报]；
R1O-(AO)m/(Gly)n-H及/或R2-COO-(AO)p/(Gly)q-H(R1＝C8-C22烃基、R2＝C7-C21烃基、AO＝C2-C3氧化烯基、Gly＝甘油基、m＝0～5、n＝2～10、p＝0～5、q＝2～10、AO与Gly为无规或嵌段键合)[日本专利特开2010-254881号公报]；
R1-COO-(PO)m/(EO)n-R2(R1＝C7-C21烃基、COO＝羰氧基、R2＝C1-C3烷基、PO＝氧化丙烯基、EO＝氧化乙烯基、m＝0.3～5、n＝8～25、PO与EO为无规或嵌段键合)[日本专利特开2010-265333号公报]；
R1O-(EO)l-(PO)m-(EO)n-H(R1＝C8-C20烃、EO＝C2氧化烯基、PO＝氧化丙烯基、l＞＝1、n＞＝1、0＜m＜l+n、EO与PO为嵌段键合)[WO98/24865]；
R1O-(EO)m-(PO)n-H(R1＝C10-C16的烷基或烯基、EO＝乙烯氧基、PO＝丙烯氧基、m＝5～15、n＝1～3)[日本专利特开平8-157867号公报]；
R1(CO)-(EO)m-OR2(R1＝C11-C13直链或支链状烷基或烯基、R2＝C1-C3烷基、EO＝乙烯氧基、m＝10～20)[日本专利特开2008-7706号公报、日本专利特开2009-7451号公报、日本专利特开2009-155594号公报、日本专利特开2009-155606号公报]；
R1(CO)-(AO)m-OR2(R1＝C9-C13直链或支链状烷基或烯基、AO＝C2-C4氧化烯基、R2＝C1-C3烷基、m＝5～30)[日本专利特开2009-144002号公报、日本专利特开2009-173858号公报、日本专利特开2010-189612号公报]；以及
脂肪酸烷醇酰胺、脂肪酸烷醇葡糖酰胺、烷基聚葡糖苷等。
作为阴离子表面活性剂，例如可列举：羧酸酯型阴离子表面活性剂、磺酸型或硫酸酯型阴离子表面活性剂、非皂系阴离子表面活性剂、直链烷基苯磺酸、苯磺酸或其盐、聚氧苯磺酸或其盐、聚氧乙烯烷基硫酸酯盐、聚氧化烯基烷基醚硫酸酯盐、α-烯烃磺酸盐、烷基苯磺酸盐、α-磺基脂肪酸盐、脂肪酸皂、磷酸酯盐系表面活性剂、酰基丙氨酸盐、酰基牛磺酸盐、烷基醚羧酸、醇硫酸酯等。
作为阳离子表面活性剂，例如可列举：具有长链烷基的季铵盐、具有1个长链烷基的叔铵、烷基三甲基铵盐、二烷基二甲基铵盐、烷基吡啶鎓盐等。可优选地列举：具有1个碳原子数8～22的长链烷基的季铵型表面活性剂、具有1个碳原子数8～22的长链烷基的叔铵。
作为两性离子活性剂，例如可列举：烷基乙酸甜菜碱、烷醇酰胺丙基乙酸甜菜碱、烷基咪唑啉、烷基丙氨酸等烷基甜菜碱型、烷基酰胺甜菜碱型、咪唑啉型、烷基氨基砜型、烷基氨基羧酸型、烷基酰胺羧酸型、酰胺氨基酸型或磷酸型的两性表面活性剂等。可优选地列举具有碳原子数10～18的烷基的磺基甜菜碱或羰基甜菜碱。
本发明的洗剂组合物中可进而含有洗剂组合物通常使用的成分，例如水溶性聚合物、水混合性有机溶剂、碱剂、有机酸或其盐、本发明的突变碱性蛋白酶以外的其它酶、酶稳定剂、荧光剂、防再污染剂、分散剂、防移染剂、整理剂、过氧化氢等漂白剂、抗氧化剂、助溶剂、pH调节剂、缓冲剂、防腐剂、香料、盐、醇、糖类等。
作为水溶性聚合物，例如可列举：具有(i)包含源自碳原子数2～5的环氧化物的聚合单元而构成的聚醚链部分与(ii)包含源自选自丙烯酸、甲基丙烯酸及顺丁烯二酸中的一种以上的不饱和羧酸单体的聚合单元而构成的聚合物链部分，(i)或(ii)的任一者为主干链、另一者为分支链的具有接枝结构的高分子化合物(日本专利特开2010-275468号公报、日本专利特开平10-060496号公报)；具有对苯二甲酸亚烷基酯单元及/或间苯二甲酸亚烷基酯单元、与氧化烯单元及/或聚氧化烯单元的水溶性聚合物(日本专利特开2009-155606号公报)等。本发明的洗剂组合物中的该水溶性聚合物的含量优选为0.2～10质量％、更优选为0.4～5质量％。
作为水混合性有机溶剂，例如可列举：烷醇类的亚烷基二醇类或甘油、聚亚烷基二醇类、(聚)亚烷基二醇(单或二)烷基醚类、烷基甘油醚类、(聚)亚烷基二醇的芳香族醚类。优选为乙二醇、丙二醇、丁二醇、或己二醇等碳原子数2～6的亚烷基二醇类或甘油、或聚乙二醇单苯醚、乙二醇单苄醚、二乙二醇单苄醚等。本发明的洗剂组合物中的该水混合性有机溶剂的含量优选为1～40质量％、更优选为1～35质量％。
作为碱剂，例如作为具有1～3个C2-C4的烷醇的烷醇胺，可列举：单乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、聚氧化烯基胺、二甲氨基丙基胺等。优选为单乙醇胺、三乙醇胺。本发明的洗剂组合物中的该碱剂的含量优选为0～20质量％、更优选为0～10质量％。
作为有机酸或其盐，例如可列举：饱和脂肪酸、琥珀酸、顺丁烯二酸、反丁烯二酸、或这些的盐等多元羧酸类，柠檬酸、苹果酸、乙醇酸、对羟基苯甲酸、苯甲酸、或这些的盐等羟基羧酸类等；其中，优选为柠檬酸或其盐。本发明的洗剂组合物中的该有机酸或其盐的含量优选为0～5质量％、更优选为0～3质量％。
作为防再污染剂及分散剂，例如可列举：聚丙烯酸、聚顺丁烯二酸、羧甲基纤维素、重量平均分子量5000以上的聚乙二醇、顺丁烯二酸酐-二异丁烯共聚物、顺丁烯二酸酐-甲基乙烯醚共聚物、顺丁烯二酸酐-乙酸乙烯酯共聚物、萘磺酸盐福尔马林缩合物、及日本专利特开昭59-62614号公报的权利要求1～21(第1页第3栏第5行～第3页第4栏第14行)记载的聚合物等防再污染剂及分散剂，但不适于配合的情形时可除外。
作为防移染剂，例如可列举聚乙烯吡咯啶酮，含量优选为0.01～10质量％。
作为漂白剂，优选为使该洗剂组合物中含有1～10质量％的例如过氧化氢、过碳酸盐、过硼酸盐等漂白剂。在使用漂白剂时，可使该洗剂组合物中含有0.01～10质量％的四乙酰乙二胺(TAED)或日本专利特开平6-316700号公报记载等漂白活化剂(activator)。
作为荧光剂，例如可列举联苯型荧光剂(Tinopal CBS-X等)或芪型荧光剂(DM型荧光染料等)。本发明的洗剂组合物中的该荧光剂的含量优选为0.001～2质量％。
作为本发明的突变碱性蛋白酶以外的其它酶，例如可列举：其它蛋白酶、纤维素酶、β-葡聚醣酶、半纤维素酶、脂肪酶、过氧化物酶、虫漆酶、α-淀粉酶、葡糖淀粉酶、角质酶(cutinase)、果胶酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、木质素酶、普鲁兰酶、果胶酸酶、木葡聚糖酶(xyloglucanase)、木聚糖酶、果胶乙酰酯酶、聚半乳醣醛酸酶、鼠李半乳糖醛酸酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、果胶甲酯酶、纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)、及转谷氨酰胺酶等水解酶、以及这些的2种以上的混合物。
作为酶稳定剂，例如可列举：硼化合物、钙离子源(供给钙离子的化合物)、羟基化合物、甲酸等，作为抗氧化剂，可列举：丁基羟基甲苯、二苯乙烯化甲酚、亚硫酸钠及亚硫酸氢钠等，作为助溶剂，可列举：对甲苯磺酸、异丙苯磺酸、间二甲苯磺酸、苯甲酸盐(也具有作为防腐剂的效果)等。进而，本发明的洗剂组合物中也可含有辛烷、癸烷、十二烷、十三烷等石蜡类、癸烯、十二烯等烯烃类、二氯甲烷、1,1,1-三氯乙烷等卤化烷基类、D-柠檬烯等萜烯类等的水非混合性有机溶剂、色素、香料、抗菌防腐剂、硅酮等消泡剂等。
作为可配合本发明的突变碱性蛋白酶的洗剂组合物的优选例子，可列举：日本专利特开2010-265333号公报、日本专利特开2014-141662号公报、日本专利特开2009-191128号公报、日本专利特开2012-224652号公报、日本专利特表2013-503950号公报、日本专利特表平11-512768号公报的实施例中记载的液体洗剂组合物。例如通过对日本专利特开2014-141662号公报的实施例4所记载的液体洗剂组合物[配合有表面活性剂30％(阴离子表面活性剂20％、非离子表面活性剂10％)、柠檬酸3％、具有羟基的有机溶剂(二乙二醇单丁醚)18％、使组合物的pH值成为8.0所需的碱剂(单乙醇胺)、离子交换水、及香料等的组合物]配合本发明的突变碱性蛋白酶而可制备本发明的洗剂组合物。
本发明的洗剂组合物的用途并无限定，优选为衣物或布制品(床单、窗帘、地毯、壁纸等)的清洁用。本发明的洗剂组合物由于可稳定地保持本发明的突变碱性蛋白酶，因此可发挥较高的酶清洁力。
本发明的例示的实施方式也包括以下的物质、制造方法、用途、方法等。但本发明并不限定于这些实施方式。
[1]一种突变碱性蛋白酶，其中，由如下氨基酸序列构成：该氨基酸序列是在序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列中，与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基被取代为苏氨酸。
[2]如[1]记载的突变碱性蛋白酶，其中，优选为上述序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列在与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上具有丙氨酸。
[3]如[1]或[2]记载的突变碱性蛋白酶，其中，优选为上述与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列为蛋白酶KP9860或蛋白酶9865的氨基酸序列。
[4]如[1]至[3]中任一项记载的突变碱性蛋白酶，其中，上述与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列
(i)优选为具有选自以下的(a')～(ds')中的1种以上的氨基酸残基：
(a')序列号2所表示的氨基酸序列的6位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F，
(b')序列号2所表示的氨基酸序列的9位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Q，
(c')序列号2所表示的氨基酸序列的11位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S或N，
(d')序列号2所表示的氨基酸序列的15位或与其相当的位置上的氨基酸残基为H、C、Q、D、E、R、A、V、M、W或F，
(e')序列号2所表示的氨基酸序列的16位或与其相当的位置上的氨基酸残基为T、Q、V、C、Y、D、E、R、K、H、L、I、M、W或F，
(f')序列号2所表示的氨基酸序列的20位或与其相当的位置上的氨基酸残基为F或A，
(g')序列号2所表示的氨基酸序列的22位或与其相当的位置上的氨基酸残基为W，
(h')序列号2所表示的氨基酸序列的23位或与其相当的位置上的氨基酸残基为N，
(i')序列号2所表示的氨基酸序列的37位或与其相当的位置上的氨基酸残基为T，
(j')序列号2所表示的氨基酸序列的40位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V、L、I、W或F，
(k')序列号2所表示的氨基酸序列的41位或与其相当的位置上的氨基酸残基为I，
(l')序列号2所表示的氨基酸序列的46位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W，
(m')序列号2所表示的氨基酸序列的49位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Q，
(n')序列号2所表示的氨基酸序列的52位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G或S，
(o')序列号2所表示的氨基酸序列的53位或与其相当的位置上的氨基酸残基为A、V或I，
(p')序列号2所表示的氨基酸序列的54位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、H、A、V、M、W、F或P，
(q')序列号2所表示的氨基酸序列的56位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V，
(r')序列号2所表示的氨基酸序列的57位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(s')序列号2所表示的氨基酸序列的59位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V、L、I、M、W或F，
(t')序列号2所表示的氨基酸序列的60位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V、L、I、W或F，
(u')序列号2所表示的氨基酸序列的63位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、D或L，
(v')序列号2所表示的氨基酸序列的65位或与其相当的位置上的氨基酸残基为W或P，
(w')序列号2所表示的氨基酸序列的66位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T、C、Q、D、E、H、A、V、L、I、M或W，
(x')序列号2所表示的氨基酸序列的80位或与其相当的位置上的氨基酸残基为H或A，
(y')序列号2所表示的氨基酸序列的81位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Q、Y、L、I、W或F，
(z')序列号2所表示的氨基酸序列的82位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、C、Q、D、E、R、K、H、A或M，
(aa')序列号2所表示的氨基酸序列的83位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、C或A，
(ab')序列号2所表示的氨基酸序列的84位或与其相当的位置上的氨基酸残基为R，
(ac')序列号2所表示的氨基酸序列的89位或与其相当的位置上的氨基酸残基为H，
(ad')序列号2所表示的氨基酸序列的91位或与其相当的位置上的氨基酸残基为C，
(ae')序列号2所表示的氨基酸序列的100位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L、I、W或F，
(af')序列号2所表示的氨基酸序列的101位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ag')序列号2所表示的氨基酸序列的102位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ah')序列号2所表示的氨基酸序列的103位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ai')序列号2所表示的氨基酸序列的104位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(aj')序列号2所表示的氨基酸序列的105位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ak')序列号2所表示的氨基酸序列的106位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(al')序列号2所表示的氨基酸序列的107位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、R、K或A，
(am')序列号2所表示的氨基酸序列的109位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L、I或F，
(an')序列号2所表示的氨基酸序列的113位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L或W，
(ao')序列号2所表示的氨基酸序列的119位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P，
(ap')序列号2所表示的氨基酸序列的120位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Y、R、I、W或F，
(aq')序列号2所表示的氨基酸序列的124位或与其相当的位置上的氨基酸残基为K或A，
(ar')序列号2所表示的氨基酸序列的132位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、N、Q、D、I或M，
(as')序列号2所表示的氨基酸序列的133位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P，
(at')序列号2所表示的氨基酸序列的134位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T或A，
(au')序列号2所表示的氨基酸序列的133位或与其相当的位置与134位或与其相当的位置之间的氨基酸残基为G、S、T、N、Q、Y、R、K、H、A、L、I、M或W，
(av')序列号2所表示的氨基酸序列的135位或与其相当的位置上的氨基酸残基为R、A、L或M，
(aw')序列号2所表示的氨基酸序列的136位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ax')序列号2所表示的氨基酸序列的138位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P，
(ay')序列号2所表示的氨基酸序列的140位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L、W或F，
(az')序列号2所表示的氨基酸序列的148位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、M、W、F或P，
(ba')序列号2所表示的氨基酸序列的151位或与其相当的位置上的氨基酸残基为F，
(bb')序列号2所表示的氨基酸序列的163位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、N、Q、D、K、H、V、L、I或F，
(bc')序列号2所表示的氨基酸序列的166位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、V、L、I、W或F，
(bd')序列号2所表示的氨基酸序列的167位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V，
(be')序列号2所表示的氨基酸序列的170位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V或L，
(bf')序列号2所表示的氨基酸序列的171位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、T、E或A，
(bg')序列号2所表示的氨基酸序列的187位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S，
(bh')序列号2所表示的氨基酸序列的191位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V、L、I、W或F，
(bi')序列号2所表示的氨基酸序列的193位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(bj')序列号2所表示的氨基酸序列的194位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Y、R或K，
(bk')序列号2所表示的氨基酸序列的195位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(bl')序列号2所表示的氨基酸序列的200位或与其相当的位置上的氨基酸残基为W，
(bm')序列号2所表示的氨基酸序列的204位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、N、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W或P，
(bn')序列号2所表示的氨基酸序列的205位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W，
(bo')序列号2所表示的氨基酸序列的212位或与其相当的位置上的氨基酸残基为N、Q、R、V、L或W，
(bp')序列号2所表示的氨基酸序列的226位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Y，
(bq')序列号2所表示的氨基酸序列的233位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L、I或W，
(br')序列号2所表示的氨基酸序列的237位或与其相当的位置上的氨基酸残基为N，
(bs')序列号2所表示的氨基酸序列的238位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L，
(bt')序列号2所表示的氨基酸序列的243位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Y、L或I，
(bu')序列号2所表示的氨基酸序列的245位或与其相当的位置上的氨基酸残基为N，
(bv')序列号2所表示的氨基酸序列的246位或与其相当的位置上的Y氨基酸残基为V、L、W或F，
(bw')序列号2所表示的氨基酸序列的247位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、N、Q、E、H、A、V、L、I、M、W或F，
(bx')序列号2所表示的氨基酸序列的248位或与其相当的位置上的氨基酸残基为F，
(by')序列号2所表示的氨基酸序列的250位或与其相当的位置上的氨基酸残基为F，
(bz')序列号2所表示的氨基酸序列的251位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、T、N、Q、D、A、V、L或I，
(ca')序列号2所表示的氨基酸序列的256位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、W、F或P，
(cb')序列号2所表示的氨基酸序列的257位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V或I，
(cc')序列号2所表示的氨基酸序列的264位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T、C、Q、D、E、A、V、L、I或M，
(cd')序列号2所表示的氨基酸序列的273位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、T或I，
(ce')序列号2所表示的氨基酸序列的275位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L、W或F，
(cf')序列号2所表示的氨基酸序列的277位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V、L、I或F，
(cg')序列号2所表示的氨基酸序列的281位或与其相当的位置上的氨基酸残基为R，
(ch')序列号2所表示的氨基酸序列的296位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V，
(ci')序列号2所表示的氨基酸序列的297位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L、W或F，
(cj')序列号2所表示的氨基酸序列的304位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S，
(ck')序列号2所表示的氨基酸序列的313位或与其相当的位置上的氨基酸残基为N，
(cl')序列号2所表示的氨基酸序列的319位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P，
(cm')序列号2所表示的氨基酸序列的320位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、T、V、L、I或F，
(cn')序列号2所表示的氨基酸序列的326位或与其相当的位置上的氨基酸残基为W，
(co')序列号2所表示的氨基酸序列的330位或与其相当的位置上的氨基酸残基为M、W或F，
(cp')序列号2所表示的氨基酸序列的332位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、T或V，
(cq')序列号2所表示的氨基酸序列的334位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L，
(cr')序列号2所表示的氨基酸序列的335位或与其相当的位置上的氨基酸残基为F，
(cs')序列号2所表示的氨基酸序列的337位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T、C、Q、R、K、H、A或V，
(ct')序列号2所表示的氨基酸序列的342位或与其相当的位置上的氨基酸残基为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(cu')序列号2所表示的氨基酸序列的343位或与其相当的位置上的氨基酸残基为T，
(cv')序列号2所表示的氨基酸序列的346位或与其相当的位置上的氨基酸残基为R，
(cw')序列号2所表示的氨基酸序列的357位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L，
(cx')序列号2所表示的氨基酸序列的359位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、Q、V、L、I或F，
(cy')序列号2所表示的氨基酸序列的361位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V、I或W，
(cz')序列号2所表示的氨基酸序列的369位或与其相当的位置上的氨基酸残基为N，
(da')序列号2所表示的氨基酸序列的376位或与其相当的位置上的氨基酸残基为W，
(db')序列号2所表示的氨基酸序列的378位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L或W，
(dc')序列号2所表示的氨基酸序列的379位或与其相当的位置上的氨基酸残基为D、E、R或K，
(dd')序列号2所表示的氨基酸序列的380位或与其相当的位置上的氨基酸残基为F，
(de')序列号2所表示的氨基酸序列的385位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Y、M或P，
(df')序列号2所表示的氨基酸序列的386位或与其相当的位置上的氨基酸残基为A、L、I或M，
(dg')序列号2所表示的氨基酸序列的387位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、Q、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F，
(dh')序列号2所表示的氨基酸序列的390位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G、S、T、Y或F，
(di')序列号2所表示的氨基酸序列的393位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Q，
(dj')序列号2所表示的氨基酸序列的396位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G，
(dk')序列号2所表示的氨基酸序列的403位或与其相当的位置上的氨基酸残基为T或K，
(dl')序列号2所表示的氨基酸序列的405位或与其相当的位置上的氨基酸残基为D、V、L、I、W、F或P，
(dm')序列号2所表示的氨基酸序列的406位或与其相当的位置上的氨基酸残基为V、W或F，
(dn')序列号2所表示的氨基酸序列的407位或与其相当的位置上的氨基酸残基为G或C，
(do')序列号2所表示的氨基酸序列的408位或与其相当的位置上的氨基酸残基为N、Y、I或W，
(dp')序列号2所表示的氨基酸序列的409位或与其相当的位置上的氨基酸残基为Y或W，
(dq')序列号2所表示的氨基酸序列的411位或与其相当的位置上的氨基酸残基为A、V、L或P，
(dr')序列号2所表示的氨基酸序列的427位或与其相当的位置上的氨基酸残基为R或V，
(ds')序列号2所表示的氨基酸序列的433位或与其相当的位置上的氨基酸残基为L；
(ii)更优选为具有以下的任一者：
(ar')所示的氨基酸残基，
(as')、(at')及(au')所示的氨基酸残基，
(bk')所示的氨基酸残基，
(cz')所示的氨基酸残基，
(v')、(cd')、(cx')及(dg')所示的氨基酸残基，
(bc')及(bd')所示的氨基酸残基，
(e')及(aa')所示的氨基酸残基，
(j')、(s')、(y')、(bh')及(dl')所示的氨基酸残基，
(e')、(v')、(aa')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示的氨基酸残基，
(e')、(v')、(aa')、(ar')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示的氨基酸残基，
(v')、(as')、(at')、(au')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示的氨基酸残基，
(j')、(s')、(v')、(y')、(as')、(at')、(au')、(bc')、(bd')、(bh')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')、(dg')及(dl')所示的氨基酸残基，
(v')、(aa')、(ar')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示的氨基酸残基，
(v')、(as')、(at')、(au')、(bc')、(bd')、(bk')、(cd')、(cx')、(cz')及(dg')所示的氨基酸残基，
(e')、(v')、(aa')、(bc')、(bd')、(bk')、(bm')、(cd')、(cl')、(cx')、(cz')及(dg')所示的氨基酸残基，及
(v')、(as')、(at')、(au')、(bc')、(bd')、(bj')、(bk')、(bo')、(cd')、(cx')、(cz')、(dc')及(dg')所示的氨基酸残基。
[5]如[1]至[4]中任一项记载的突变碱性蛋白酶，其中，上述与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列
优选为在与序列号2所表示的氨基酸序列的30位相当的位置上具有天冬氨酸，在与68位相当的位置上具有组氨酸，且在与255位相当的位置上具有丝氨酸；
更优选为在与序列号2所表示的氨基酸序列的上述表1(i)记载的位置相当的位置上具有该表1(ii)记载的氨基酸残基。
[6]如[1]至[5]中任一项记载的突变碱性蛋白酶，其中，优选为由序列号2～5、8、10中的任一者所表示的氨基酸序列构成的突变碱性蛋白酶的A294T突变体，或由序列号6～7、9、11中的任一者所表示的氨基酸序列构成的突变碱性蛋白酶的A295T突变体。
[7]一种多聚核苷酸，其中，编码如[1]至[6]中任一项记载的突变碱性蛋白酶。
[8]一种载体，其中，含有如[7]记载的多聚核苷酸。
[9]一种转化体，其中，包含外来的如[7]记载的多聚核苷酸或如[8]记载的载体。
[10]如[8]记载的载体或[9]记载的转化体，其中，优选为上述载体为能够在芽孢杆菌属细菌内诱导所导入基因的表达的表达载体。
[11]如[9]或[10]记载的转化体，其中，优选为重组芽孢杆菌属细菌。
[12]一种突变碱性蛋白酶的制造方法，其中，使用如[9]至[11]中任一项记载的转化体。
[13]一种洗剂组合物，其中，含有如[1]至[6]中任一项记载的突变碱性蛋白酶。
[14]如[13]记载的洗剂组合物，其中，优选为含有螯合剂。
[15]如[13]或[14]记载的洗剂组合物，其中，优选为液体洗剂组合物。
[16]如[15]记载的洗剂组合物，其中，表面活性剂的含量优选为10～80质量％、更优选为30～70质量％。
[17]一种突变碱性蛋白酶的制造方法，其中，包括在序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列中，将与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基取代为苏氨酸。
[18]一种碱性蛋白酶的对螯合剂的稳定性提升方法，其中，包括在序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列中，将与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基取代为苏氨酸。
[19]如[17]或[18]记载的方法，其中，优选为上述与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列在与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上具有丙氨酸。
[20]如[17]至[19]中任一项记载的方法，其中，优选为上述与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列为蛋白酶KP9860或蛋白酶9865的氨基酸序列。
[21]如[17]至[19]中任一项记载的方法，其中，优选为上述与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列为相对于序列号2所表示的氨基酸序列而具有以下突变的氨基酸序列：
(i)优选为选自以下的(a)～(ds)中的1种以上：
(a)将6位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F，
(b)将9位或与其相当的位置上的K取代为Q，
(c)将11位或与其相当的位置上的D取代为G、S或N，
(d)将15位或与其相当的位置上的S取代为H、C、Q、D、E、R、A、V、M、W或F，
(e)将16位或与其相当的位置上的S取代为T、Q、V、C、Y、D、E、R、K、H、L、I、M、W或F，
(f)将20位或与其相当的位置上的Y取代为F或A，
(g)将22位或与其相当的位置上的Q取代为W，
(h)将23位或与其相当的位置上的G取代为N，
(i)将37位或与其相当的位置上的R取代为T，
(j)将40位或与其相当的位置上的S取代为V、L、I、W或F，
(k)将41位或与其相当的位置上的S取代为I，
(l)将46位或与其相当的位置上的F取代为S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W，
(m)将49位或与其相当的位置上的K取代为Q，
(n)将52位或与其相当的位置上的A取代为G或S，
(o)将53位或与其相当的位置上的L取代为A、V或I，
(p)将54位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、H、A、V、M、W、F或P，
(q)将56位或与其相当的位置上的L取代为V，
(r)将57位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(s)将59位或与其相当的位置上的T取代为V、L、I、M、W或F，
(t)将60位或与其相当的位置上的N取代为V、L、I、W或F，
(u)将63位或与其相当的位置上的N取代为S、D或L，
(v)将65位或与其相当的位置上的T取代为W或P，
(w)将66位或与其相当的位置上的N取代为G、S、T、C、Q、D、E、H、A、V、L、I、M或W，
(x)将80位或与其相当的位置上的G取代为H或A，
(y)将81位或与其相当的位置上的S取代为Q、Y、L、I、W或F，
(z)将82位或与其相当的位置上的T取代为G、S、C、Q、D、E、R、K、H、A或M，
(aa)将83位或与其相当的位置上的N取代为S、C或A，
(ab)将84位或与其相当的位置上的K取代为R，
(ac)将89位或与其相当的位置上的Q取代为H，
(ad)将91位或与其相当的位置上的N取代为C，
(ae)将100位或与其相当的位置上的S取代为L、I、W或F，
(af)将101位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ag)将102位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ah)将103位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ai)将104位或与其相当的位置上的L取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(aj)将105位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ak)将106位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(al)将107位或与其相当的位置上的L取代为S、R、K或A，
(am)将109位或与其相当的位置上的S取代为L、I或F，
(an)将113位或与其相当的位置上的T取代为L或W，
(ao)将119位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P，
(ap)将120位或与其相当的位置上的S取代为Y、R、I、W或F，
(aq)将124位或与其相当的位置上的R取代为K或A，
(ar)将132位或与其相当的位置上的A取代为S、T、N、Q、D、I或M，
(as)将133位或与其相当的位置上的A取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P，
(at)将134位或与其相当的位置上的V取代为G、S、T或A，
(au)向133位或与其相当的位置与134位或与其相当的位置之间插入G、S、T、N、Q、Y、R、K、H、A、L、I、M或W，
(av)将135位或与其相当的位置上的N取代为R、A、L或M，
(aw)将136位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(ax)将138位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、M、W、F或P，
(ay)将140位或与其相当的位置上的T取代为L、W或F，
(az)将148位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、M、W、F或P，
(ba)将151位或与其相当的位置上的K取代为F，
(bb)将163位或与其相当的位置上的E取代为S、T、N、Q、D、K、H、V、L、I或F，
(bc)将166位或与其相当的位置上的N取代为G、V、L、I、W或F，
(bd)将167位或与其相当的位置上的G取代为V，
(be)将170位或与其相当的位置上的I取代为V或L，
(bf)将171位或与其相当的位置上的S取代为G、T、E或A，
(bg)将187位或与其相当的位置上的N取代为S，
(bh)将191位或与其相当的位置上的S取代为V、L、I、W或F，
(bi)将193位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(bj)将194位或与其相当的位置上的S取代为Y、R或K，
(bk)将195位或与其相当的位置上的Y取代为G、S、T、C、N、Q、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(bl)将200位或与其相当的位置上的N取代为W，
(bm)将204位或与其相当的位置上的Q取代为S、T、C、N、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W或P，
(bn)将205位或与其相当的位置上的F取代为S、T、C、N、Q、Y、E、K、H、A、V、L、I、M或W，
(bo)将212位或与其相当的位置上的K取代为N、Q、R、V、L或W，
(bp)将226位或与其相当的位置上的F取代为Y，
(bq)将233位或与其相当的位置上的S取代为L、I或W，
(br)将237位或与其相当的位置上的D取代为N，
(bs)将238位或与其相当的位置上的S取代为L，
(bt)将243位或与其相当的位置上的N取代为Y、L或I，
(bu)将245位或与其相当的位置上的D取代为N，
(bv)将246位或与其相当的位置上的S取代为Y、V、L、W或F，
(bw)将247位或与其相当的位置上的K取代为S、T、C、N、Q、E、H、A、V、L、I、M、W或F，
(bx)将248位或与其相当的位置上的Y取代为F，
(by)将250位或与其相当的位置上的Y取代为F，
(bz)将251位或与其相当的位置上的M取代为G、T、N、Q、D、A、V、L或I，
(ca)将256位或与其相当的位置上的M取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、W、F或P，
(cb)将257位或与其相当的位置上的A取代为V或I，
(cc)将264位或与其相当的位置上的N取代为G、S、T、C、Q、D、E、A、V、L、I或M，
(cd)将273位或与其相当的位置上的V取代为G、T或I，
(ce)将275位或与其相当的位置上的N取代为L、W或F，
(cf)将277位或与其相当的位置上的G取代为V、L、I或F，
(cg)将281位或与其相当的位置上的K取代为R，
(ch)将296位或与其相当的位置上的I取代为V，
(ci)将297位或与其相当的位置上的G取代为L、W或F，
(cj)将304位或与其相当的位置上的N取代为S，
(ck)将313位或与其相当的位置上的D取代为N，
(cl)将319位或与其相当的位置上的A取代为S、T、C、N、Q、Y、D、E、R、K、H、V、L、I、M、W、F或P，
(cm)将320位或与其相当的位置上的Y取代为G、T、V、L、I或F，
(cn)将326位或与其相当的位置上的S取代为W，
(co)将330位或与其相当的位置上的S取代为M、W或F，
(cp)将332位或与其相当的位置上的K取代为G、T或V，
(cq)将334位或与其相当的位置上的T取代为L，
(cr)将335位或与其相当的位置上的Y取代为F，
(cs)将337位或与其相当的位置上的F取代为G、S、T、C、Q、R、K、H、A或V，
(ct)将342位或与其相当的位置上的G取代为S、T、C、Q、Y、D、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W、F或P，
(cu)将343位或与其相当的位置上的K取代为T，
(cv)将346位或与其相当的位置上的K取代为R，
(cw)将357位或与其相当的位置上的S取代为L，
(cx)将359位或与其相当的位置上的T取代为G、S、Q、V、L、I或F，
(cy)将361位或与其相当的位置上的S取代为V、I或W，
(cz)将369位或与其相当的位置上的D取代为N，
(da)将376位或与其相当的位置上的N取代为W，
(db)将378位或与其相当的位置上的T取代为L或W，
(dc)将379位或与其相当的位置上的Q取代为D、E、R或K，
(dd)将380位或与其相当的位置上的Y取代为F，
(de)将385位或与其相当的位置上的F取代为Y、M或P，
(df)将386位或与其相当的位置上的T取代为A、L、I或M，
(dg)将387位或与其相当的位置上的S取代为G、Q、E、R、K、H、A、V、L、I、M、W或F，
(dh)将390位或与其相当的位置上的N取代为G、S、T、Y或F，
(di)将393位或与其相当的位置上的W取代为Q，
(dj)将396位或与其相当的位置上的R取代为G，
(dk)将403位或与其相当的位置上的F取代为T或K，
(dl)将405位或与其相当的位置上的N取代为D、V、L、I、W、F或P，
(dm)将406位或与其相当的位置上的A取代为V、W或F，
(dn)将407位或与其相当的位置上的P取代为G或C，
(do)将408位或与其相当的位置上的Q取代为N、Y、I或W，
(dp)将409位或与其相当的位置上的S取代为Y或W，
(dq)将411位或与其相当的位置上的T取代为A、V、L或P，
(dr)将427位或与其相当的位置上的T取代为R或V，
(ds)将433位或与其相当的位置上的V取代为L；
(ii)更优选为以下的任一者：
(ar)，
(as)、(at)及(au)的组合，
(bk)，
(cz)，
(v)、(cd)、(cx)及(dg)的组合，
(bc)及(bd)的组合，
(e)及(aa)的组合，
(j)、(s)、(y)、(bh)及(dl)的组合，
(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合，
(e)、(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合，
(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合，
(j)、(s)、(v)、(y)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bh)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)、(dg)及(dl)的组合，
(v)、(aa)、(ar)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合，
(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bk)、(cd)、(cx)、(cz)及(dg)的组合，
(e)、(v)、(aa)、(bc)、(bd)、(bk)、(bm)、(cd)、(cl)、(cx)、(cz)及(dg)的组合，及
(v)、(as)、(at)、(au)、(bc)、(bd)、(bj)、(bk)、(bo)、(cd)、(cx)、(cz)、(dc)及(dg)的组合。
[22]如[17]至[21]中任一项记载的方法，其中，上述与序列号2所表示的氨基酸序列具有至少95％的同一性的氨基酸序列
优选为在与序列号2所表示的氨基酸序列的30位相当的位置上具有天冬氨酸，在与68位相当的位置上具有组氨酸，且在与255位相当的位置上具有丝氨酸；
更优选为在与序列号2所表示的氨基酸序列的上述表1(i)记载的位置相当的位置上具有该表1(ii)记载的氨基酸残基。
[23]如[17]至[22]中任一项记载的方法，其中，优选为上述序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列为序列号2～11中的任一者所表示的氨基酸序列。
[实施例]
以下，使用实施例而更具体地说明本发明。但本发明的技术范围并不限定于这些实施例。
实施例1碱性蛋白酶突变体的制作
以使野生型KP43蛋白酶成熟酶区域的氨基酸序列(序列号2)中的294位的丙氨酸(A294)突变为苏氨酸的“A294T”突变体的制作为例，在以下揭示本发明的碱性蛋白酶突变体的制作方法。
对于含有源自芽孢杆菌属KSM-KP43株的编码序列号2的碱性蛋白酶的碱性蛋白酶结构基因(序列号1)的重组载体，导入将序列号2的294位的氨基酸残基取代为苏氨酸的定点突变。设计突变用引物A294-F(序列号12：GGTGCAACTGACATCGGCCTTGGCTAC)及A294-R(序列号13：GATGTCAGTTGCACCGGCAATCAGTGC)。使用这些引物，依据PrimeSTAR突变基础试剂盒(Mutagenesis Basal Kit)(Takara)的操作说明，取得导入有突变的PCR产物。利用PCR产物纯化试剂盒(PCR product purification kit)(Roche)将PCR产物加以纯化后，转化为作为宿主菌的芽孢杆菌属KSM9865株(FERM P-18566)。
使所获得的转化体在含脱脂乳的碱性琼脂培养基[脱脂乳(Difco)1％(w/v)、胰化蛋白胨(Difco)1％、酵母提取液(Difco)0.5％、氯化钠1％、琼脂1.5％、碳酸钠0.05％、四环素15ppm]中生长，根据晕圈的形成状况，判定是否导入有突变蛋白酶基因。将该转化体植菌至5mL的母种培养基[6.0％(w/v)聚蛋白胨S、0.05％酵母提取液、1.0％麦芽糖、0.02％硫酸镁七水合物、0.1％磷酸二氢钾、0.25％碳酸钠、30ppm四环素]中，于30℃下进行16小时的振荡培养。继而，对20mL的主培养基[8％聚蛋白胨S、0.3％酵母提取液、10％麦芽糖、0.04％硫酸镁七水合物、0.2％磷酸二氢钾、1.5％无水碳酸钠、30ppm四环素]植菌1％(v/v)的母种培养液，于30℃下进行3天的振荡培养。将所获得的培养液进行离心分离，取得包含碱性蛋白酶突变体的培养上清液，使用和光蛋白快速检测试剂盒(Protein Assay Rapid Kit Wako)(和光纯药)测定其蛋白质量。
实施例2碱性蛋白酶多重突变体的制作
参考日本专利5202690号公报、日本专利特开2002-218989号公报、日本专利特开2002-306176号公报、日本专利特开2004-000122号公报、日本专利特开2004-305176号公报、日本专利特开2006-129865号公报、日本专利特开2007-061101号公报、日本专利特开2008-212084、日本专利特开2010-273672号公报、日本专利特开2010-273673号公报、及日本专利特开2013-233141号公报的记载，对野生型KP43蛋白酶(序列号2)导入突变，制作以下的KP43蛋白酶突变体。
(1)1重突变体(序列号3)：
将132位的丙氨酸取代为苏氨酸(日本专利5202690号公报)；
(2)10重突变体-1(序列号4)：
将195位的酪氨酸取代为谷氨酰胺(日本专利特开2002-218989号公报)，
将369位的天冬氨酸取代为天冬酰胺(日本专利特开2002-306176号公报)，
将65位的苏氨酸取代为脯氨酸、将273位的缬氨酸取代为异亮氨酸、将359位的苏氨酸取代为丝氨酸、及将387位的丝氨酸取代为丙氨酸(日本专利特开2004-000122号公报)，
将166位的天冬酰胺取代为甘氨酸、及将167位的甘氨酸取代为缬氨酸(日本专利特开2004-305176号公报)，
将16位的丝氨酸取代为缬氨酸、及将83位的天冬酰胺取代为丙氨酸(日本专利特开2010-273672号公报、及日本专利特开2010-273673号公报)；
(3)11重突变体-1(序列号5)：
将132位的丙氨酸取代为苏氨酸(日本专利5202690号公报)，
将195位的酪氨酸取代为谷氨酰胺(日本专利特开2002-218989号公报)，
将369位的天冬氨酸取代为天冬酰胺(日本专利特开2002-306176号公报)，
将65位的苏氨酸取代为脯氨酸、将273位的缬氨酸取代为异亮氨酸、将359位的苏氨酸取代为丝氨酸、及将387位的丝氨酸取代为丙氨酸(日本专利特开2004-000122号公报)，
将166位的天冬酰胺取代为甘氨酸、及将167位的甘氨酸取代为缬氨酸(日本专利特开2004-305176号公报)，
将16位的丝氨酸取代为缬氨酸、及将83位的天冬酰胺取代为丙氨酸(日本专利特开2010-273672号公报、及日本专利特开2010-273673号公报)；
(4)11重突变体-2(序列号6)：
将195位的酪氨酸取代为谷氨酰胺(日本专利特开2002-218989号公报)，
将369位的天冬氨酸取代为天冬酰胺(日本专利特开2002-306176号公报)，
将65位的苏氨酸取代为脯氨酸、将273位的缬氨酸取代为异亮氨酸、将359位的苏氨酸取代为丝氨酸、及将387位的丝氨酸取代为丙氨酸(日本专利特开2004-000122号公报)，
将166位的天冬酰胺取代为甘氨酸、及将167位的甘氨酸取代为缬氨酸(日本专利特开2004-305176号公报)，
将133位的丙氨酸取代为丝氨酸、将134位的缬氨酸取代为苏氨酸、及向133位与134位之间插入丝氨酸(日本专利特开2006-129865号公报)；
(5)16重突变体(序列号7)：
将195位的酪氨酸取代为谷氨酰胺(日本专利特开2002-218989号公报)，
将369位的天冬氨酸取代为天冬酰胺(日本专利特开2002-306176号公报)，
将65位的苏氨酸取代为脯氨酸、将273位的缬氨酸取代为异亮氨酸、将359位的苏氨酸取代为丝氨酸、及将387位的丝氨酸取代为丙氨酸(日本专利特开2004-000122号公报)，
将166位的天冬酰胺取代为甘氨酸、及将167位的甘氨酸取代为缬氨酸(日本专利特开2004-305176号公报)，
将133位的丙氨酸取代为丝氨酸、将134位的缬氨酸取代为苏氨酸、及向133位与134位之间插入丝氨酸(日本专利特开2006-129865号公报)，
将40位的丝氨酸取代为异亮氨酸、将59位的苏氨酸取代为缬氨酸、将81位的丝氨酸取代为亮氨酸、将191位的丝氨酸取代为亮氨酸、及将405位的天冬酰胺取代为亮氨酸(日本专利特开2013-233141号公报)。
(6)10重突变体-2(序列号8)：
将132位的丙氨酸取代为苏氨酸(日本专利5202690号公报)，
将195位的酪氨酸取代为精氨酸(日本专利特开2002-218989号公报)，
将369位的天冬氨酸取代为天冬酰胺(日本专利特开2002-306176号公报)，
将65位的苏氨酸取代为脯氨酸、将273位的缬氨酸取代为异亮氨酸、将359位的苏氨酸取代为丝氨酸、及将387位的丝氨酸取代为丙氨酸(日本专利特开2004-000122号公报)，
将166位的天冬酰胺取代为甘氨酸、及将167位的甘氨酸取代为缬氨酸(日本专利特开2004-305176号公报)，
将83位的天冬酰胺取代为丙氨酸(日本专利特开2010-273672号公报)；
(7)11重突变体-3(序列号9)：
将195位的酪氨酸取代为精氨酸(日本专利特开2002-218989号公报)，
将369位的天冬氨酸取代为天冬酰胺(日本专利特开2002-306176号公报)，
将65位的苏氨酸取代为脯氨酸、将273位的缬氨酸取代为异亮氨酸、将359位的苏氨酸取代为丝氨酸、及将387位的丝氨酸取代为丙氨酸(日本专利特开2004-000122号公报)，
将166位的天冬酰胺取代为甘氨酸、及将167位的甘氨酸取代为缬氨酸(日本专利特开2004-305176号公报)，
将133位的丙氨酸取代为丝氨酸、将134位的缬氨酸取代为苏氨酸、及向133位与134位之间插入丝氨酸(日本专利特开2006-129865号公报)；
(8)12重突变体(序列号10)：
将195位的酪氨酸取代为谷氨酰胺(日本专利特开2002-218989号公报)，
将369位的天冬氨酸取代为天冬酰胺(日本专利特开2002-306176号公报)，
将65位的苏氨酸取代为脯氨酸、将273位的缬氨酸取代为异亮氨酸、将359位的苏氨酸取代为丝氨酸、及将387位的丝氨酸取代为丙氨酸(日本专利特开2004-000122号公报)，
将166位的天冬酰胺取代为甘氨酸、及将167位的甘氨酸取代为缬氨酸(日本专利特开2004-305176号公报)，
将83位的天冬酰胺取代为丙氨酸、及将319位的丙氨酸取代为缬氨酸(日本专利特开2010-273672号公报)，
将16位的丝氨酸取代为缬氨酸、及将204位的谷氨酰胺取代为天冬氨酸(日本专利特开2010-273673号公报)；
(9)14重突变体(序列号11)：
将195位的酪氨酸取代为精氨酸(日本专利特开2002-218989号公报)，
将369位的天冬氨酸取代为天冬酰胺(日本专利特开2002-306176号公报)，
将65位的苏氨酸取代为脯氨酸、将273位的缬氨酸取代为异亮氨酸、将359位的苏氨酸取代为丝氨酸、及将387位的丝氨酸取代为丙氨酸(日本专利特开2004-000122号公报)，
将166位的天冬酰胺取代为甘氨酸、及将167位的甘氨酸取代为缬氨酸(日本专利特开2004-305176号公报)，
将133位的丙氨酸取代为丝氨酸、将134位的缬氨酸取代为苏氨酸、及向133位与134位之间插入丝氨酸(日本专利特开2006-129865号公报)，
将194位的丝氨酸取代为精氨酸、将212位的赖氨酸取代为精氨酸、将379位的谷氨酰胺取代为精氨酸(日本专利特开2008-212084号公报)。
上述1重突变体(序列号3)、10重突变体-1(序列号4)、11重突变体-1(序列号5)、11重突变体-2(序列号6)、16重突变体(序列号7)、10重突变体-2(序列号8)、11重突变体-3(序列号9)、12重突变体(序列号10)及14重突变体(序列号11)相对于野生型KP43蛋白酶(序列号2)，分别具有99.8％、97.7％、97.5％、97.5％、96.3％、97.7％、97.5％、97.2％、及96.8％的氨基酸序列的同一性。
对编码上述获得的各突变体的多聚核苷酸，依据与实施例1相同的流程，导入将与序列号2的294位相当的位置上的丙氨酸取代为苏氨酸的突变(相对于序列号3～5、8、10的A294T、及相对于序列号6～7、9、11的A295T)后，转化为宿主，培养该转化体，取得包含碱性蛋白酶突变体的培养上清液，测定其蛋白质量。在以下的实施例中，将实施例1及2中获得的在与序列号2的294位相当的位置上具有T的碱性蛋白酶突变体统称为A294T突变体。
实施例3碱性蛋白酶突变体在含有螯合剂的液体中的稳定性评价(1)在柠檬酸盐水溶液中的稳定性评价
对包含或不含2mM柠檬酸三钠的20mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)添加实施例1中获得的A294T突变体的培养上清液，充分混合而获得酶溶液(酶终浓度0.017mg/mL)。将200μL的该酶溶液分取至96孔测定板内，向其中添加10μL的10mM Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA·H2O(PEPTIDE INSTITUTE,INC.)，使用微孔板读取器(infinite M200Pro；TECAN)，一面于30℃下振荡15分钟一面经时测定405nm的吸光度。将吸光度变化速度(mOD405/min)视为酶活性，获得初期活性值。将该酶溶液于70℃下加热10分钟后，对其通过与初期活性值的测定相同的方法取得残存活性值。采用下式，算出碱性蛋白酶的残存活性(％)：
残存活性(％)＝残存活性值/初期活性值×100
继而，将亲本碱性蛋白酶(野生型KP43蛋白酶；序列号2)的残存活性设为100％，求出在该情形时的该A294T突变体的残存活性的相对值(残存相对活性(％))。
同样地算出实施例2中获得的1重突变体(序列号3)、11重突变体-2(序列号6)、14重突变体(序列号11)、及16重突变体(序列号7)的A294T突变体的残存活性(％)，并求出各自相对于亲本碱性蛋白酶的残存相对活性(％)。
(2)在EDTA水溶液中的稳定性评价
对包含或不含1mM EDTA的20mM Tris-HCl缓冲液(pH值8.0)添加实施例1中获得的A294T突变体的培养上清液，充分混合而获得酶溶液(酶终浓度0.017mg/mL)。使用该酶溶液，在与上述(1)相同的条件下算出碱性蛋白酶的残存活性(％)，并求出相对于亲本碱性蛋白酶的残存相对活性(％)。
同样地算出实施例2中获得的1重突变体(序列号3)、10重突变体-1(序列号4)、10重突变体-2(序列号8)、11重突变体-1(序列号5)、11重突变体-2(序列号6)、11重突变体-3(序列号9)、12重突变体(序列号10)及16重突变体(序列号7)的A294T突变体的残存活性(％)，并求出各自相对于亲本碱性蛋白酶的残存相对活性(％)。
(3)结果
图1及表2显示上述(1)中测得的A294T突变体在柠檬酸盐水溶液中的残存相对活性。图2～3及表3～4显示上述(2)中测得的A294T突变体在EDTA水溶液中的残存相对活性。A294T突变体在不含螯合剂的液体中的残存活性与这些的亲本碱性蛋白酶相比为同等水平，但在含有螯合剂的液体中则具有更高的残存活性。由此表明与亲本碱性蛋白酶相比，该A294T突变体在含有螯合剂的液体中的稳定性得以提升。
[表2]
Figure GDA0001896250350000491
[表3]
Figure GDA0001896250350000501
[表4]
Figure GDA0001896250350000502
实施例4碱性蛋白酶突变体在洗剂组合物中的稳定性评价
将市售的衣物用液体洗剂组合物(Ultra Attack Neo；花王，2015年发售，配合有柠檬酸盐)在微波炉中加热而使制品中的酶失活。对其添加1.0％(v/v)的实施例1的A294T突变体或野生型KP43蛋白酶，充分混合而获得含有酶的洗剂组合物。利用离子交换水将该洗剂组合物稀释10倍后，充分搅拌。将200μL的所获得的洗剂液分取至96孔测定板内，于其中添加10μL的10mM Glt-Ala-Ala-Pro-Leu-pNA·H2O(PEPTIDE INSTITUTE,INC.)，使用微孔板读取器(infinite M200Pro；TECAN)，一面于30℃下振荡15分钟一面经时测定405nm的吸光度。将吸光度变化速度(mOD405/min)视为酶活性，获得初期活性值。又，将该洗剂组合物于40℃下保存28天后，通过与初期活性值的测定相同的方法取得残存活性值，采用下式，算出碱性蛋白酶的残存活性(％)。
残存活性(％)＝残存活性值/初期活性值×100
继而，将野生型KP43蛋白酶的残存活性设为100％，求出在该情形时的该A294T突变体的残存相对活性(％)。
结果示于表5。A294T突变体与作为其亲本碱性蛋白酶的野生型KP43蛋白酶相比，在洗剂组合物中的保存稳定性提升了约2倍。
[表5]
酶 40℃、28天保存后的残存相对活性(％)
野生型 100.0
A294T 198.0
参考例1
针对实施例2中用作亲本碱性蛋白酶的KP43蛋白酶的1重突变体及多重突变体，在与实施例3及4相同的条件下测定柠檬酸耐性及EDTA耐性。将柠檬酸耐性的结果示于表6，将EDTA耐性的结果示于表7。表6及7的值表示将野生型KP43蛋白酶(序列号2)的残存活性设为100％时的各突变体的残存相对活性(％)。与野生型KP43蛋白酶相比，各亲本碱性蛋白酶具有同等以上的螯合剂耐性。这些结果表明，实施例3及4所示的A294T突变体的螯合剂耐性优于亲本碱性蛋白酶及野生型任何一者。
[表6]
2mM柠檬酸三钠
酶 残存相对活性(％)
野生型 100.0
1重突变体 115.9
14重突变体 170.7
16重突变体 165.0
[表7]
1mM EDTA
酶 残存相对活性(％)
野生型 100.0
1重突变体 113.3
10重突变体-1 108.3
10重突变体-2 137.3
11重突变体-1 126.5
11重突变体-2 120.4
16重突变体 103.9
以上说明了本发明的实施方式，但应理解这些并非意在将本发明限定于所说明的特定的实施方式。本领域技术人员明白处于本发明的范围内的各种其它的变更及修正。
将本说明书所引用的文献及日本专利申请完整地记载于本说明书，以供参考。
序列表
<110> 花王株式会社
<120> 突变碱性蛋白酶
<130> KS1491
<150> JP 2016-115734
<151> 2016-06-09
<150> JP 2017-103390
<151> 2017-05-25
<160> 13
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1302
<212> DNA
<213> 芽孢杆菌属（Bacillus sp.）KSM-KP43
<220>
<223> 野生型（Wild-type）
<400> 1
aatgatgttg cgcgtggaat tgtcaaagcg gatgtggctc agagcagcta cgggttgtat 60
ggacaaggac agatcgtagc ggttgccgat acagggcttg atacaggtcg caatgacagt 120
tcgatgcatg aagccttccg cgggaaaatt actgcattat atgcattggg acggacgaat 180
aatgccaatg atacgaatgg tcatggtacg catgtggctg gctccgtatt aggaaacggc 240
tccactaata aaggaatggc gcctcaggcg aatctagtct tccaatctat catggatagc 300
ggtgggggac ttggaggact accttcgaat ctgcaaacct tattcagcca agcatacagt 360
gctggtgcca gaattcatac aaactcctgg ggagcagcag tgaatggggc ttacacaaca 420
gattccagaa atgtggatga ctatgtgcgc aaaaatgata tgacgatcct tttcgctgcc 480
gggaatgaag gaccgaacgg cggaaccatc agtgcaccag gcacagctaa aaatgcaata 540
acagtcggag ctacggaaaa cctccgccca agctttgggt cttatgcgga caatatcaac 600
catgtggcac agttctcttc acgtggaccg acaaaggatg gacggatcaa accggatgtc 660
atggcaccgg gaacgttcat actatcagca agatcttctc ttgcaccgga ttcctccttc 720
tgggcgaacc atgacagtaa atatgcatac atgggtggaa cgtccatggc tacaccgatc 780
gttgctggaa acgtggcaca gcttcgtgag cattttgtga aaaacagagg catcacacca 840
aagccttctc tattaaaagc ggcactgatt gccggtgcag ctgacatcgg ccttggctac 900
ccgaacggta accaaggatg gggacgagtg acattggata aatccctgaa cgttgcctat 960
gtgaacgagt ccagttctct atccaccagc caaaaagcga cgtactcgtt tactgctact 1020
gccggcaagc ctttgaaaat ctccctggta tggtctgatg cccctgcgag cacaactgct 1080
tccgtaacgc ttgtcaatga tctggacctt gtcattaccg ctccaaatgg cacacagtat 1140
gtaggaaatg actttacttc gccatacaat gataactggg atggccgcaa taacgtagaa 1200
aatgtattta ttaatgcacc acaaagcggg acgtatacaa ttgaggtaca ggcttataac 1260
gtaccggttg gaccacagac cttctcgttg gcaattgtga at 1302
<210> 2
<211> 434
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属（Bacillus sp.）KSM-KP43
<220>
<223> 野生型（Wild-type）
<400> 2
Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
20 25 30
Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
50 55 60
Thr Asn Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Ser Val Leu Gly Asn Gly
65 70 75 80
Ser Thr Asn Lys Gly Met Ala Pro Gln Ala Asn Leu Val Phe Gln Ser
85 90 95
Ile Met Asp Ser Gly Gly Gly Leu Gly Gly Leu Pro Ser Asn Leu Gln
100 105 110
Thr Leu Phe Ser Gln Ala Tyr Ser Ala Gly Ala Arg Ile His Thr Asn
115 120 125
Ser Trp Gly Ala Ala Val Asn Gly Ala Tyr Thr Thr Asp Ser Arg Asn
130 135 140
Val Asp Asp Tyr Val Arg Lys Asn Asp Met Thr Ile Leu Phe Ala Ala
145 150 155 160
Gly Asn Glu Gly Pro Asn Gly Gly Thr Ile Ser Ala Pro Gly Thr Ala
165 170 175
Lys Asn Ala Ile Thr Val Gly Ala Thr Glu Asn Leu Arg Pro Ser Phe
180 185 190
Gly Ser Tyr Ala Asp Asn Ile Asn His Val Ala Gln Phe Ser Ser Arg
195 200 205
Gly Pro Thr Lys Asp Gly Arg Ile Lys Pro Asp Val Met Ala Pro Gly
210 215 220
Thr Phe Ile Leu Ser Ala Arg Ser Ser Leu Ala Pro Asp Ser Ser Phe
225 230 235 240
Trp Ala Asn His Asp Ser Lys Tyr Ala Tyr Met Gly Gly Thr Ser Met
245 250 255
Ala Thr Pro Ile Val Ala Gly Asn Val Ala Gln Leu Arg Glu His Phe
260 265 270
Val Lys Asn Arg Gly Ile Thr Pro Lys Pro Ser Leu Leu Lys Ala Ala
275 280 285
Leu Ile Ala Gly Ala Ala Asp Ile Gly Leu Gly Tyr Pro Asn Gly Asn
290 295 300
Gln Gly Trp Gly Arg Val Thr Leu Asp Lys Ser Leu Asn Val Ala Tyr
305 310 315 320
Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr Ser
325 330 335
Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp Ser
340 345 350
Asp Ala Pro Ala Ser Thr Thr Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp Leu
355 360 365
Asp Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Gln Tyr Val Gly Asn Asp
370 375 380
Phe Thr Ser Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val Glu
385 390 395 400
Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu Val
405 410 415
Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala Ile
420 425 430
Val Asn
<210> 3
<211> 434
<212> PRT
<213> 芽孢杆菌属（Bacillus sp.）KSM-KP43
<220>
<223> 突变体
<400> 3
Asn Asp Val Ala Arg Gly Ile Val Lys Ala Asp Val Ala Gln Ser Ser
1 5 10 15
Tyr Gly Leu Tyr Gly Gln Gly Gln Ile Val Ala Val Ala Asp Thr Gly
20 25 30
Leu Asp Thr Gly Arg Asn Asp Ser Ser Met His Glu Ala Phe Arg Gly
35 40 45
Lys Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Leu Gly Arg Thr Asn Asn Ala Asn Asp
50 55 60
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Tyr Val Asn Glu Ser Ser Ser Leu Ser Thr Ser Gln Lys Ala Thr Tyr
325 330 335
Ser Phe Thr Ala Thr Ala Gly Lys Pro Leu Lys Ile Ser Leu Val Trp
340 345 350
Ser Asp Ala Pro Ala Ser Thr Ser Ala Ser Val Thr Leu Val Asn Asp
355 360 365
Leu Asn Leu Val Ile Thr Ala Pro Asn Gly Thr Arg Tyr Val Gly Asn
370 375 380
Asp Phe Thr Ala Pro Tyr Asn Asp Asn Trp Asp Gly Arg Asn Asn Val
385 390 395 400
Glu Asn Val Phe Ile Asn Ala Pro Gln Ser Gly Thr Tyr Thr Ile Glu
405 410 415
Val Gln Ala Tyr Asn Val Pro Val Gly Pro Gln Thr Phe Ser Leu Ala
420 425 430
Ile Val Asn
435
<210> 12
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 寡核苷酸引物（Oligonucleotide primer）A294-F
<400> 12
ggtgcaactg acatcggcct tggctac 27
<210> 13
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 寡核苷酸引物（Oligonucleotide primer）A294-R
<400> 13
gatgtcagtt gcaccggcaa tcagtgc 27

Claims (8)

1.一种突变碱性蛋白酶，其中，
所述突变碱性蛋白酶为：由序列号2～5、8、10中的任一者所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的A294T突变体、或由序列号6～7、9、11中的任一者所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的A295T突变体。
2.一种多聚核苷酸，其中，
编码权利要求1所述的突变碱性蛋白酶。
3.一种载体，其中，
含有权利要求2所述的多聚核苷酸。
4.一种转化体，其中，
包含权利要求2所述的多聚核苷酸或权利要求3所述的载体。
5.一种突变碱性蛋白酶的制造方法，其中，
使用权利要求4所述的转化体。
6.一种洗剂组合物，其中，
含有权利要求1所述的突变碱性蛋白酶。
7.一种突变碱性蛋白酶的制造方法，其中，
包括在序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列中，将与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基取代为苏氨酸，
所述突变碱性蛋白酶为：由序列号2～5、8、10中的任一者所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的A294T突变体、或由序列号6～7、9、11中的任一者所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的A295T突变体。
8.一种碱性蛋白酶的对螯合剂的稳定性提升方法，其中，
包括在序列号2所表示的氨基酸序列或与其具有至少95％的同一性的氨基酸序列中，将与序列号2所表示的氨基酸序列的294位相当的位置上的氨基酸残基取代为苏氨酸，
通过所述取代而获得的碱性蛋白酶为：由序列号2～5、8、10中的任一者所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的A294T突变体、或由序列号6～7、9、11中的任一者所表示的氨基酸序列构成的碱性蛋白酶的A295T突变体。
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