JP3353893B2 - 好アルカリ性バチルス属ｓｐ．ＡＣ１３株及びそれより獲得できるプロテアーゼ，キシラナーゼ，セルラーゼ - Google Patents

好アルカリ性バチルス属ｓｐ．ＡＣ１３株及びそれより獲得できるプロテアーゼ，キシラナーゼ，セルラーゼ

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は新規微生物、それより獲得できる新規酵素、
及びこの新規酵素を製造するための方法に関する。より
詳しくは、本発明は新規好アルカリ性種のバチルス（Ba
cillus）種AC13の株より獲得できる新規酵素に関する。
更に、本発明は本発明の酵素を製造するための方法、
及びかかる酵素の、特に洗剤又は紙パルプ工業における
利用に関する。
発明の概要 本発明の目的は産業上用途にとって価値ある新規酵素
を発現することのできる新規微生物、及びこれらの生物
から獲得できる様々な種類の新規酵素を提供することを
目的とする。
従って、本発明は好アルカリ性種のバチルス種AC13の
株の単離された生物学的に純粋な培養物を提供する。
別の観点において、本発明はバチルス種AC13の株より
獲得でき、且つバチルス種AC13、NCIMB No.40482に由来
する酵素のそれと同一又は部分的に同一な免疫化学特性
を有する酵素を提供する。
より特定の観点において、本発明はバチルス種AC13の
株より獲得でき、且つバチルス種AC13、NCIMB No.40482
に由来するプロテアーゼと同一又は部分的に同一な免疫
化学特性を有するプロテアーゼを提供する。
別の特定の観点において、本発明はバチルス種AC13の
株より獲得でき、且つバチルス種AC13、NCIMB No.40482
に由来するキシラナーゼのそれと同一又は部分的に同一
な免疫化学特性を有する酵素を提供する。
第三の特定の観点において、本発明はバチルス種AC13
の株より獲得でき、且つバチルス種AC13、NCIMB No.404
82に由来するセルラーゼと同一又は部分的に同一な免疫
化学特性を有するセルラーゼを提供する。
第三の観点において、本発明は本発明の酵素の調製の
ための方法を提供し、この方法はバチルス種AC13の株、
好ましくは株バチルス種AC13、NCIMB No.40482又はその
突然変異体もしくは変異体の、炭素及び窒素源並びに無
機塩類を含む適当な栄養培地の中での培養、それに続く
所望の酵素の回収を含んで成る。
更なる観点において、本発明は本発明の酵素を含んで
成る洗剤添加剤及び洗剤組成物を提供する。
更に、本発明のリグノセルロース系パルプの処理のた
めの方法における本発明のキシラナーゼの利用に関す
る。
図面の簡単な説明 本発明は添付図面を参考に更に説明するが、ここで： 図１は様々なpHにおいて、基質としてカゼインを用い
て25℃で決定した本発明のプロテアーゼの比活性（％相
対値）を示し；そして 図２は様々な温度において（■はpH9.5のバッファ
ー；□は0.1％のSTPPを含むpH9.5のバッファー）、基質
としてカゼインを用いてpH9.5で決定した本発明のプロ
テアーゼの比活性（％相対値）を示す。
発明の詳細な開示 微生物 本発明は、タイプ培養物バチルス種AC13、NCIMB 4048
2により代表される新規の好アルカリ性種のバチルス種A
C13の微生物に関する。
このバチルス種AC13、NCIMB No.40482は特許手続の目
的のために微生物の寄託の国際承認に基づくブタペスト
条件に従い、National Collections of Industrial and
Marine Bacteria Ltd.（23St.Machar Drive,Aberdeen
AB2 1RY,Scotland,UK）において、受託番号NCIMB 40482
のもとで1992年３月３日に寄託してある。
本発明の微生物は好気性で、桿形の胞子形成性細菌で
あり、それ故バチルス属に属する。
形態学的にはそれらは0.6〜0.9μｍの直径及び４〜８
μｍの長さを有する桿形として説明されうる。その胞子
は楕円形から円形の、約1.2×0.8μｍの、末端のふくら
んだ胞子嚢であり、特徴的なラケット又はドラムスティ
ック状の形態の胞子嚢を示している。
バチルス種AC13の微生物は絶対的に好アルカリ性であ
り、増殖のための寒天培地の中でpH9〜10の炭酸バッフ
ァーを必要とする。最適増殖はpH9.5〜10において37℃
で観察される。50℃では増殖しなく、そしてpHでは増殖
しなかった。
0.1Mのセスキ炭酸ナトリウムの添加されたポテトデキ
ストロース寒天（Difco（商標））上のコロニーは白色
であり、特徴的な樹枝状から毛状の縁を有する。
この微生物は下記の特徴により更に説明できうる。
NaCl寛容性 ０〜10％ 12％では弱い増殖 増殖温度 ≦45℃ 50℃では増殖せず 加水分解 カゼイン 陽 ゼラチン 陽 プルナン 陰 デンプン 陽 セルロース 陽 キシラン 陽 カタラーゼ反応 陽 アミノペプチダーゼ試験 陰 フェニルアラニンの脱アミノ化 陰 硫酸塩の還元 陽 主要脂肪酸 C15:O ISO（45％） （C15:O ANTEISO（25％） ISO 17:1 w10c（10％） 不飽和:20％ 枝分れ 約50％ 微生物の培養 本発明の微生物は好気性の条件のもとで、同化性炭素
及び窒素と、その他の必須栄養素とを含む栄養培地の中
で培養でき、その培地は当業界の原理に従って組成とな
っている。
適切な炭素源は炭水化物、例えばスクロース、グルコ
ース及びデンプン、又は炭水化物含有材料、例えば穀
物、麦芽、米及びもろこし類である。培地の中に含ませ
る炭水化物の濃度は幅広く、例えば上限25％そして下限
１〜５％にわたって変えてよいが、しかし通常は８〜10
％が適当である。その％はグルコース当量として算定す
る。
栄養培地中の窒素源は無機及び／又は有機物質であり
うる。適当な無機窒素源は硝酸及びアンモニウム塩であ
る。有機窒素源のうちで、かなりの種類のものが細菌の
培養を含む発酵工程において通常利用されている。代表
例は大豆食品、綿の実食品、ピーナッツ食品、カゼイ
ン、コーン、コーンスティープ液、酵母抽出物、尿素及
びアルブミンである。更に、この栄養培地は通常の微量
物質も含むべきである。
本発明の新規のバチルス種は好アルカリ性であり、そ
して７より低いpHでは増殖できないため、その培養はア
ルカリ性のpH値で好適に行われ、そのpHは増殖培地の滅
菌化の後での安定性バッファー、例えば炭酸ナトリウム
又は炭酸ナトリウムと炭酸水素ナトリウムとの混合物の
添加により獲得できうる。タンク発酵の中での培養のた
めには人工通気を利用することが必要である。通気率は
慣用のタンク発酵に利用するのと類似にする。
発酵の後、液状酵素濃縮物は、培地からの粗製材料の
除去により提供されるか、又は所望するならば、低温で
のエバポレーションもしくは逆浸透による培地の濃縮に
より提供される。最後に、保存剤をその濃縮物に加えて
よい。
塩、例えばNa2SO4、又は水混和性溶媒、例えばエタノ
ールもしくはアセトンによる沈殿によって、固形酵素調
製品を精製及び／又は濃縮培地から調製されうる。適当
な乾燥法、例えばスプレードライングによる培地中の水
の除去も採用されうる。
本発明の微生物は価値ある新規酵素、特にプロテアー
ゼ、キシラナーゼ及びセルラーゼを産生することができ
ることが認められた。
酵 素 本発明の酵素は、本発明の微生物、好ましくはバチル
ス種AC13、NCIMB No.40482又はその突然変異体又は変異
体の、炭素及び窒素源並びに無機塩類を含む適当な栄養
培地中での培養により獲得できる。かかる酵素は組換DN
A工学によっても獲得できうる。
より特定の観点において、本発明の酵素は下記の物理
化学的特徴によって更に説明されうる。
プロテアーゼ 本発明の特定の態様において、プロテアーゼはSDS−P
AGEによる決定に従う約30kDの見かけ上の分子量及びLKB
アンホリンPAGプレート上での等電点電気泳動による決
定に従う約9.3のpIを有することによって更に特徴付け
られうる。
このプロテアーゼは、基質としてカゼインを用い、25
℃で決定したときに、下はpH6から上はpH11に至るpH値
においてタンパク質分解活性を有し、最適性がpH10より
大、即ち、約pH11にあることで更に特徴付けられうる。
更に、このプロテアーゼは基質としてカゼインを用
い、pH9.5で決定したときに、約15℃から上は70℃に至
る温度においてタンパク質分解活性を有し、最適活性が
45〜55℃の範囲、即ち、約50℃にあることで更に特徴付
けられうる。この最適活性は、数多くの商業用洗剤の中
の一般成分であるトリポリリン酸ナトリウム入り又は抜
きで検出されうる。
キシラナーゼ 本発明の特定の態様において、キシラナーゼはSDS−P
AGEにより決定した約25kDの見かけ上分子量及びLKBアン
ホリンPAGプレート上での等電点電気泳動により決定し
た約９のpIを有することにより更に特徴付けられうる。
セルラーゼ 本発明の特定の態様において、２種類のセルラーゼが
更に特徴付けられ、一方はSDS−PAGEにより決定した約4
5kDの見かけ上分子量及びLKBアンホリンPAGプレート上
での等電点電気泳動により決定した約4.3のpIにより、
そして他方はSDS−PAGEにより決定した約55kDの見かけ
上分子量及びLKBアンホリンPAGプレート上での等電点電
気泳動により決定した約4.5のpIにより特徴付けられう
る。
免疫化学特性 本発明の酵素は、バチルス種AC13、NCIMB No.40482の
株に由来する酵素のそれと同一又は部分的に同一（即
ち、少なくとも一部が同一）の免疫化学特性を有する。
この免疫化学特性は交差反応同定試験によって免疫学
的に決定されうる。この同定試験は公知のOuchterlony
二重免疫拡散手順もしくはタンデム交差免疫電気泳動
（Axelsen N.H.;Handbook of Immunoprecipitation−in
−Gel Techniques;Blackwell Scientific Publications
（1983），第５及び14章）により実施されうる。「抗原
的同一性」（“antigenic identity"）及び「部分的抗
原同一性」（“partial antigenic identity"）なる語
が同書の第5,19及び20章に記載されている。
モノ特異性抗血清が上述の方法に従い、本発明の精製
酵素によるウサギの免疫化によって作製される。その免
疫原はフロインドのアジュバントと混合し、そして２週
おきにウサギに皮下注射する。抗血清は８週間の全免疫
化期間を経て得られ、そしてイムノグロブリンはAxelse
n N.H.前掲に記載の通りにそれらより調製される。
タンパク質分解活性についてのアッセイ タンパク質分解活性は基質としてカゼインを用いて決
定する。
１カゼインプロテアーゼ単位（CPU）は、標準の条
件、即ち、25℃及びpH9.5で30分間にわたるインキュベ
ーションにおいて、１分間当りに1mMの第一アミノ基を
遊離させる酵素の量として定義する（セリン標準品との
比較により決定する）。
分析方法を述べているホルダーAF 228/1を引用するこ
とで本明細書に組入れ、それはNovo Nordisk A/Sへの注
問により入手できる。
キシラン分解活性についてのアッセイ キシラン分解活性は、基質としてレマゾール−キシラ
ンを用い、pH9.0で決定して、エンド−キシラナーゼ単
位（EXU）で測定される。
キシラナーゼサンプルをレマゾール−キシラン基質と
インキュベートする。非分解染色基質のバックグランド
はエタノールによって沈殿させる。上清液に残っている
青色はキシラナーゼ活性に比例し、従ってキシラナーゼ
単位は、標準の反応条件、即ち50.0＋／−0.1℃、pH9.0
及び30分の反応時間において、酵素標準品と相対させて
決定する。
分析方法を述べているホルダーAF 293.9/1を引用する
ことで本明細書に組入れ、それはNovo Nordisk A/Sへの
注問により入手できる。
セルロース分解（Cellulytic）活性についてのアッセイ セルロース分解活性は、基質としてカルボキシメチル
セルロース（CMC）を用い、pH9.0で決定して、セルラー
ゼ粘度単位（CEVU）で測定する。
セルラーゼ粘度単位は、酵素標準品（＜１％の水；−
20℃でN2雰囲気中に保存；−80℃でのアーチ標準）に対
して決定する。使用した標準品17−1187は、標準のイン
キュベーション条件、即ち、pH9.0、トリスバッファー
0.1M、CMC 7LFD基質33.3g/1、40.0℃で30分のもとで440
0 CEVU/gである。
分析方法を述べているホルダーAF 253/1を引用するこ
とで本明細書に組入れ、それはNovo Nordisk A/Sへの
注問により入手できる。
産業上の用途 本発明の酵素は様々な産業上の用途を可能にする価値
ある特性を有する。特に、アルカリの中での本発明のプ
ロテアーゼ及びセルラーゼは例えば洗剤組成物の中で有
用な用途が見い出せる。このセルラーゼは織物産業にお
いて、例えばバイオ−ポリシングにおいて有用な用途が
見い出せうる。キシラナーゼは例えば紙パルプ産業にお
いて用途が見い出せうる。
下記の実施例は本発明を更に例示するためであり、そ
してそれらは本発明の範囲を限定することを意図しな
い。
実施例１ 培養剤 バチルス種AC13、NCIMB 40482の株を、下記の組成
（リットル当り）の培地100mlを含む500mlのバッフル付
きエーレンマイヤーフラスコの中で、ロータリーシェー
キングテーブル（300r.p.m）上で30℃で培養した： ポテトスターチ 100g 顆粒バーレー 50g 大豆粉 20g Na2HPO4・12H2O 9g Pluronic（商標） 0.1g カゼイン酸ナトリウム 10g この培地中のデンプンをα−アミラーゼで液状化し、
そしてその培地を120℃で45分加熱することにより滅菌
に付した。
滅菌後、その培地のpHを、各フラスコに1Mのセスキ炭
酸ナトリウム10mlを加えることにより9.7に合わせた。
３日間のインキュベーション後、下記の活性が認めら
れた： タンパク質分解活性 20 CPU/l キシラン分解活性 10 EXU/g セルロース分解活性 4 CEVU/g 様々な基質を載せた等電点電気泳動において、少なく
とも２種類のプロテアーゼ、少なくとも４種類のキシラ
ナーゼ及び少なくとも２種類のセルラーゼが検出され
た。
主要タンパク質分解バンドは約9.3のpI及び約30kDの
分子量を有する。
主要キシラン分解バンドは約９のpI及び約25kDの分子
量を有する。
主要セルロース分解バンドは約4.3のpI及び約45kDの
分子量を有する。
実施例２ タンパク質分解化合物の精製 培養後、実施例１の発酵培地のタンパク質分解活性は
20 CPU/lであると認められた。この発酵培地中で、少な
くとも２種類のタンパク質分解酵素がLKBアンホリンPAG
プレート上での等電点電気泳動により同定された。
固形物質の分離後、その主要タンパク質分解成分を慣
用のクロマトグラフィー法により精製した。１リットル
の培養培地からの収量は、236CPU/lのタンパク質分解活
性を有する50mlのプロテアーゼ調製品であった（60
％）。
この精製プロテアーゼは、LKBアンホリンPAGプレート
上での等電点電気泳動により決定して9.3の見かけ上のp
I値を有する。SDS−PAGEにより、このプロテアーゼの見
かけ上の分子量は30kDであると認められた。純度はSDS
−PAGE及び等電点電気泳動の両方により判定して90％よ
り大であった。
その活性を上述のタンパク質分解活性についてのアッ
セイを利用して決定した。これらの実験の結果を添付し
た図１〜２に示す。
実施例３ キシラン分解化合物の精製 実施例１に従って得られた発酵培地の中で、少なくと
も４種類のキシラン分解酵素が、キシランの上層と組合
せた等電点電気泳動により同定された。キシラン分解酵
素は５〜9.5のpH域を覆っていた。
実施例１の発酵培地より、アルカリ性pIを有するキシ
ラナーゼ（主要キシラン分解成分）が、Ｓ−Sepharose
High Load（商標）及びMono S（商標）での陽イオン変
換クロマトグラフィー、Phenyl−Sepharoseでの疎水性
収着クロマトグラフィー、並びにプロテアーゼの特異的
な除去のためのアフィニティークロマトグラフィーを包
括する慣用のクロマトグラフィー技術によって均質とな
るまで精製した。
精製キシラナーゼは3.5〜9.5の等電点電気泳動用ゲル
において９の見かけ上のpI値を有した。SDS−PAGEによ
り、このキシラナーゼの見かけ上の分子量は25kDである
と認められた。
実施例４ セルロース分解化合物の精製 実施例１に従って得られた発酵培地の中で、少なくと
も２種類のセルロース分解酵素が等電点電気泳動によっ
て同定された。
実施例１の発酵培地を濾過し、そしてセルラーゼアフ
ィニティーカラム上に載せた。pH8.5のトリスバッファ
ーで洗浄後、そのカラムをトリエチルアミンで11.8の高
いpHで溶離させた。溶離液中のpHを7.5に合わせ、そし
てUF濃縮し、そしてトリスバッファーで洗った。
その濃縮物をMono Q（商標）カラム（Pharmacia）に
載せ、そして0.5MのNaClによりトリスバッファーpH9.0
で15カラム容量によって線形勾配で溶離させた。
セルラーゼ含有画分を等電点電気泳動及びSDS−PAGE
にかけ、そして２種類のセルラーゼ分解成分が認めら
れ、一方は約45kDのMW及び約4.3のpI、そして他方は約5
5kDのMW及び約4.5のpIを有していた。
実施例５ Ｎ−末端アミノ酸分析 実施例４に従って得られた約45kDのMWを有するセルラ
ーゼのＮ−末端アミノ酸配列を、ペプチドの獲得及び配
列決定のための標準方法〔Findlay ＆ Geisow（編）,Pr
otein sequencing−a practical approach,1989,IRL Pr
ess〕を利用して決定した。
Ｎ−末端アミノ酸配列は下記の通りであった（添付し
た配列表のSEQ No.1）： 配列表 （１）一般情報 （ｉ）出願人： （Ａ）名称:NOVO NORDISC A/S （Ｂ）通り:Novo Alle （Ｃ）市:DK−2880 Bagsvaerd （Ｅ）国：デンマーク （Ｆ）郵便番号:DK−2880 （Ｇ）電話番号:45 44 44 88 88 （Ｈ）ファックス番号:44 49 32 56 （Ｉ）テレックス番号:37304 （ii）発明の名称：新規微生物 （iii）配列の数:1 （iv）コンピューター読み取り方式： （Ａ）媒体のタイプ：フロッピーディスク （Ｂ）コンピューター:IBM PC コンパチブル （Ｃ）作動システム:PC−DOS/MS−DOS （Ｄ）ソフトウェアー：パテントイン リリース＃
1.0、バージョン＃1.25（EPO） （ｖ）現出願のデーター： 出願番号： （２） SEQ ID NO:1についての情報： （ｉ）配列の特徴： （Ａ）長さ:19アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｃ）鎖の数：一本鎖 （Ｄ）トポロジー：直鎖 （ii）分子のタイプ：ペプチド （iii）ヒポセティカル:NO （ｖ）フラグメントのタイプ:N−末端 （vi）起源： （Ａ）生物：バチルス種 （Ｂ）株:AC 13 NCIMB 40482 （xi）配列の詳細:SEQ ID NO:1:
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｓ 3/08 Ｃ１２Ｓ 3/08 Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｄ２１Ｃ 9/10 Ｚ //(Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:07） Ｃ１２Ｒ 1:07 (Ｃ１２Ｎ 9/24 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/42 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/54 Ｃ１２Ｒ 1:07） (72)発明者 オルセン，アルネ アゲルリン デンマーク国，デーコー―2830 ビル ム，カプレバイ 62 (72)発明者 ビスガールトフランセン，ヘンリク デンマーク国，デーコー―2800 リュン グビー，サンズクロイェン 27 (72)発明者 シェーレイン，マルティン デンマーク国，デーコー―2100 コペン ハーゲン エー，ビーデベルスガゼ 51 (56)参考文献 特開 平１−91772（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／17577（ＷＯ，Ａ１) 米国特許4480037（ＵＳ，Ａ) 米国特許4771003（ＵＳ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＰｕｂＭｅｄ

Claims (18)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】バチルス（Bacillus）属sp.AC13株の単離
    された生物学的に純粋な培養物であって、ここで当該株
    は： ｉ）好アルカリ性であり； ii）45℃以下で増殖し； iii）pH9.5−10で最適増殖性を示し； iv）０−10％の範囲におけるNaCl寛容性を示し、12％の
    NaClにおいては増殖力は弱く； ｖ）カゼイン、ゼラチン、デンプン、セルロース及びキ
    シランを加水分解することができ； vi）胞子は楕円形乃至円形であり、大きさは約1.2×0.8
    μｍであり、末端の膨らんだ胞子嚢を有し、特徴的なラ
    ケット又はドラムスティック状の胞子嚢を示す； ことを特徴とする、培養物。
  2. 【請求項２】前記株が、バチルス属sp.AC13株NCIMB No.
    40482又はその突然変異体もしくは変異体である、請求
    項１記載の培養物。
  3. 【請求項３】バチルス属sp.AC13株から獲得することが
    できるプロテアーゼであって： （ａ）SDS−PAGEによる決定に従う約30kDの見かけ上分
    子量； （ｂ）LKBアンホリンPAGプレート上での等電点電気泳動
    による決定に従う約9.3のpI;及び （ｃ）基質としてカゼインを用いてpH9.5で決定した、5
    0℃を中心として45〜55℃に範囲する温度での至適活
    性； を特徴とするプロテアーゼ。
  4. 【請求項４】バチルス属sp.AC13株NCIMB No.40482又は
    突然変異体もしくは変異体の株から獲得することができ
    る請求項３に記載のプロテアーゼ。
  5. 【請求項５】バチルス属sp.AC13株から獲得することが
    できるキシラナーゼであって： （ａ）SDS−PAGEによる決定に従う約25kDの見かけ上分
    子量；及び （ｂ）LKB−アンホリンPAGプレート上での等電点電気泳
    動による決定に従う約９のpI; を特徴とするキシラナーゼ。
  6. 【請求項６】バチルス属sp.AC13株NCIMB No.40482又は
    その突然変異体もしくは変異体から獲得することができ
    る、請求項５に記載のキシラナーゼ。
  7. 【請求項７】バチルス属sp.AC13株NCIMB No.40482から
    獲得することができるセルラーゼであって： （ａ）SDS−PAGEによる決定に従う約45kDの見かけ上分
    子量； （ｂ）LKB−アンホリンPAGプレート上での等電点電気泳
    動による決定に従う約4.3のpI;及び （ｃ）添付した配列表のID No.1で特定するＮ−末端ア
    ミノ酸配列 を特徴とするセルラーゼ。
  8. 【請求項８】バチルス属sp.AC13株から獲得することが
    できるセルラーゼであって： （ａ）SDS−PAGEによる決定に従う約55kDの見かけ上分
    子量；及び （ｂ）LKBアンホリンPAGプレート上での等電点電気泳動
    による決定に従う約4.5のpI; を特徴とするセルラーゼ。
  9. 【請求項９】バチルス属sp.AC13株NCIMB No.40482又は
    その突然変異体もしくは変異体から獲得することができ
    る、請求項８に記載のセルラーゼ。
  10. 【請求項１０】請求項３〜９のいずれか１項記載の酵素
    の調製方法であって、バチルス属sp.AC13株又はその突
    然変異体もしくは変異体の株の、炭素及び窒素源並びに
    無機塩類を含む適切な栄養培地の中での培養、それに続
    く前記所望の酵素の回収を含んで成る方法。
  11. 【請求項１１】前記バチルス属sp.AC13株がバチルス属s
    p.AC13株NCIMB No.40482である、請求項10記載の方法。
  12. 【請求項１２】顆粒状、液状、スラリー状、又は保護酵
    素状態で提供される、請求項３〜４のいずれか１項記載
    のプロテアーゼ及び／又は請求項７〜９のいずれか１項
    記載のセルラーゼを含んで成る洗剤添加剤。
  13. 【請求項１３】無塵顆粒状又は安定化液状で提供され
    る、請求項12記載の洗剤添加剤。
  14. 【請求項１４】請求項３〜４のいずれか１項記載のプロ
    テアーゼ及び／又は請求項７〜９のいずれか１項記載の
    セルラーゼを含んで成る洗剤組成物。
  15. 【請求項１５】１又は複数のその他の酵素を更に含んで
    成る、請求項14記載の洗剤組成物。
  16. 【請求項１６】前記その他の酵素がリパーゼ、アミラー
    ゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ及び／又はペルオキシダ
    ーゼである、請求項15記載の洗剤組成物。
  17. 【請求項１７】リグノセルロース系化学パルプの処理の
    ための方法であって、ここで当該リグノセルロース系パ
    ルプを請求項５〜６のいずれか１項記載のキシラナーゼ
    により6.5より大のpHで処理し、その後、このようにし
    て処理したセルロールパルプを第一塩素化段階において
    0.20倍以下の活性塩素での塩素により処理する、方法。
  18. 【請求項１８】7.5より大のpHで処理する、請求項17記
    載の方法。
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