JPH01101884A - 新規アルカリプロテアーゼｌおよびその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〈産業上の利用分野〉 本発明は、バチルス属の１新開株を培養することにより
得られる新規アルカリプロテアーゼおよびその製造法に
関する。更に詳細には、衣料用洗浄剤全般に配合して低
温での洗浄力改善に大きく寄与する新規アルカリプロテ
アーゼおよびその製造法に関する。

〈従来技術〉 近年、洗浄剤の洗浄力を向上させるために、例えばプロ
テアーゼやアミラーゼなどの酵素を配合することが行な
われている。その中でも、蛋白質分解酵素、特にアルカ
リプロテアーゼは、洗浄剤のみでは落ちにくい蛋白汚垢
を分解し、洗浄力の改善に寄与する。そのため、該酵素
を洗浄剤に添加することが不可欠である。一般的にアル
カリプロテアーゼとして、バチルス　ズブチリス（Ｂａ
ｃｉｌｌｕｓ　５ｕｂｔｉｌｉｓ）　、バチルス　リケ
ニフオルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏ
ｒｍｉｓ）、バチルス　アル力ロフィルｘ　（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ　ａｌｋａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、その他ストレ
プトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アスペ
ルギルス＠　（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、アースロバ
フタ−属（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ）、フザリウム属
（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）等の微生物により生産されるもの
が知られている。具体的１例として、バチルス　リケニ
フォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒ
ｍｉｓ）より単離されたアルカリプロテアーゼ〔商品名
アルカラーゼ、ノボ社（以下本文中Ａ酵素と称する）〕
が当該分野でよく知られている。

一方、我国では、水道水をそのまま用いて洗濯する習慣
があり、洗浄剤は通常２５℃以下、特に夏季を除いては
１５℃付近の低温で用いられることが多い。しかし、上
記の酵素は、６０℃付近に最高活性を有し、２５℃以下
の低温では著しく活性が低下するため、低温（１５℃）
での洗浄力にはあまり寄与せず、また、界面活性剤、ビ
ルダー等からなる洗浄剤ベースでの洗浄力も低温（１５
℃）では大きく低下する。そのため２５℃での洗浄力と
比べて低温での洗浄力は、大巾に低下するのが現状であ
る。近年、より低温で高活性を有するアルカリプロテア
ーゼ〔商品名ＡＰ　Ｉ−２１、昭和電工（以下本文中日
酵素と称する）〕が見い出されているが低温における洗
浄力は、必ずしも満足できるものではない。

〈発明が解決しようとする問題点〉 本発明は、低温において衣料用洗浄剤の洗浄力の改善に
大きく寄与するアルカリプロテアーゼおよびその製造法
を提供することを目的とする。

〈問題点を解決するための手段〉 本発明者らは、上記目的を達成するために、広く自然界
よりアルカリプロテアーゼ産生菌を検索した結果、バチ
ルス属に属する１菌種が生産する新規なアルカリプロテ
アーゼが、前記の性質において公知のアルカリプロテア
ーゼより優れたものであることを見い出し、本発明を完
成するに至った。

該酵素を産生ずる微生物はバチルス属に属する微生悔で
あり、その代表例として、バチルス　エスピー（Ｂａｃ
ｉｌｌｕｓ　ｓｐ、）　ＴＮＫ−２（微工研菌寄第９５
６５号）（以下「本菌株」という）を挙げることかでき
る。

次に本菌株の菌学的性質を示す。

菌学的性質の試験及び分類法はＢｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａ
ｎｕａｌｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉ
ｏｌｏｇｙ　（１９８６）に基づいて行なった。本菌株
は中性の培地での生育は概して良好でない為に以下に述
べる試験には炭酸ナトリウム１％を加えｐＨを１０に調
整した培地を用いた。

Ａ、形態的性質 肉汁寒天培地上で３５℃２日間培養した時、以下の形態
的特徴が観察される。

１）細胞の形、大きさ：桿菌　０．６〜１．０μｍ×３
．０〜５．０μｍ ２）多形性：無　し ３）運動性：周鞭毛ををし運動性有り ４）胞　子：０．６〜１．０μｍ　Ｘ　１．Ｑ〜２．０
μｍの楕円形の胞子を中央からやや末端寄りの 拠に形成する。胞子嚢の膨潤はほぼ認 められない。

５）ダラム染色性：陽　性 ６）抗　酸　性：陰性 Ｂ、培養的性質 １）肉汁寒天平板培養 円形、偏平状、金縁のコロニーを形成する。

該コロニーの表面は滑らかで光沢がありやや黄っぽいク
リーム色を呈する。

２）肉汁寒天斜面培養 拡帯状に生育し光沢のあるやや黄っぽいクリーム色のコ
ロニーを形成する。

３）肉汁液体培養 生育良好で菌膜は形成しない。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養 生育良好で液化する。

５）リドマスミルク 生育するが凝固は認められない。培地がアルカリ性の為
リドマスの変色は不明。

Ｃ１生理的性質 １）硝酸塩の還元：陽　性 ２）脱窒反応：陰性 ３）ＭＲテスト　：培地がアルカリ性の為明らかでない
。

４）　Ｖ　Ｐテスト　　：陽　性 ５〉インドール生成：陰　性 ６）硫化水素生成　：陰　性 ７）澱粉加水分解　：陽　性 ８）クエン酸の利用：陽　性 ９）無機窒素源の利用：硝酸塩、アンモニウム塩を利用
する。

１０）色素の生成　：陰　性 １１）ウレアーゼ　：陰　性 １２）オキシダーゼ：陽　性 １３）カタラーゼ　：陽　性 １４）生育の温度範囲：４７℃以下 １５）生育のｐＨ範囲ニア〜１２ １６）酸素に対する態度：好気性 １７）ＯＦテスト　：弱いが醗酵 １８）糖類からの酸及びガスの生成 糖　　　　　　酸生成　ガス生成 し−アラビノース　　十　　　　− Ｄ−キシロース　　　十　　　　− Ｄ−フルクトース　　＋　　　　− Ｄ−グルコース　　　十　　　　− Ｄ−マンノース　　　＋　　　　− Ｄ−ガラクトース　　＋　　　　− マルトース　　　　　＋　　　　− シュークロース　　　±　　　　− ラクトース　　　　　十　　　　− トレハロース　　　　　＋　　　　− 澱粉　　　十　− ソルビット　　　　　−　　　　− イノシフト　　　　　−− マンニット　　　　　−　　　　− ＋：生成する ±：僅かに生成する 一：生成しない Ｄ、その他の性質 １）塩化す）　ＩＪウム耐性：１０％ＮａＣβ下で生育
する。

２）　洗浄剤溶液中で安定であり且つ低温洗浄（１５℃
付近）に於いても優れた酵素活性を発現し、洗浄力改善
に寄与しろるアルカリプロテアーゼを産生ずる。

本ＴＮＫ−２株は上述の如く好気性有胞子細菌であり、
バチルス属に属する事は明らかである。

本菌株の特徴的性状さしてｐＨ７以下及びｐＨ１２以上
では生育出来ず最適ｐＨが１０付近にある事が挙げられ
る。即ち本菌株は好アルカリ性細菌であると判断される
。本菌株は公知の好アルカリ性バチルス属細菌とその菌
学的性状に於いて一部一致する点もあるが、主要な性状
に於いて異っており総体的に判断するならば別異の菌株
として新菌種に位置付けるべきである。

以下に本菌株と公知の好アルカリ性バチルス属細菌との
主要な菌学的性質の比較を詳述する。対比株としてはま
ずアルカリプロテアーゼを産生ずる公知の好アルカリ性
バチルス属細菌として理研、掘越らのバチルス　アル力
ロフィラスＮｏ、　２２１株１）（ＡＴＣＣ２１５２２
）　、Ｎ［１５８株１）及びＮｏ、　Ｄ　−６株２）ラ
イオン■のＹ、Ｘ、Ｐ及びに株３）並びに昭和電工■の
ＮＫＳ−２１株４）又、文献記載の好アルカリ性バチル
ス属細菌として理研掘越らのアルカリカタラーゼ生産株
Ｎ１１Ｋｕ−１株５）、シクロデキストリングルコシル
トランスフェラーゼ（以下ＣＤ　Ｇ　”Ｉ”と略す）生
産株６）並びにアルカリペクチナーゼ生産株Ｎｏ、　Ｐ
　−４−Ｎ株７）を取り挙げた。

本菌株とこれら対比株との菌学的性質の差異について主
だった項目を第１表に要約した。

バチルス属の種間分類の重要な要件である胞子形成につ
いては、まず本菌株が中央から末端寄りに胞子を形成す
るのに対してＮｏ、　Ｄ　−６株、Ｙ、Ｘ。

Ｐ及びに株は末端に形成し、又、ＣＤＧＴ生産株は中央
に胞子を形成する点で明確に異なり、更に本菌株は胞子
嚢はほとんど膨潤しないのに対して、Ｎｏ、　２２１株
、Ｎｏ、　Ｄ　−６株、ＹＳＸＳＰ及びに株、Ｎｏ、　
Ｐ　−４−Ｎ株には明白な膨潤が認められ明らかに異っ
ており、本菌株とＮα２２１株、ＮａＤ−６株、ＹＳＸ
ＳＰ及びに株、ＣＤＧＴ生産株並びにＮｏ、　Ｐ−４−
Ｎ株とは胞子形成特性に於いて明確に区別される。

生育特性については、本菌株の生育温度上限が４７℃で
あるのに対しＮ（Ｌ２２１株、＆Ｋｕ　−１株並びにｋ
Ｐ−４−Ｎ株が５５℃であり、又ＮＫＳ−２１株が４１
℃である点、又、生育ｐＨ範囲に於いても本菌株が７〜
１２であるのに対しＮα２２１株、ＮｃＬＫｕ−１株及
びＮｏ、Ｐ−４−Ｎ株が７〜１１、Ｎ（１５８株、Ｎｏ
、　Ｄ　−６株及びＣＤ６Ｔ生産株が７．５〜１１又、
ｙＳｘ、ｐ及びに株が６〜１２と明確に異っており、生
育特性に於いても本菌株は上記の全公知菌株と容易に区
別される。

さらに、生理的特質に於いても本菌株が硝酸塩を還元す
るのに対しＮｏ、５８株、ＮＫＳ−２１株が還元しない
点、本菌株がＶＰテスト陽性であるのに対しに２２１株
、ＮａＤ−６株、Ｘ、Ｙ、Ｐ及びに株、ＮＫＳ−２１並
びにＮｏ、Ｋｕ　−１株が陰性であり又、ＣＤＧＴ生産
株並びにＮｏ、Ｐ−４−Ｎ株が不明瞭である点、本菌株
がクエン酸塩を利用するのに対しＮｏ、Ｋｕ　−１株並
びにＮ（ＬＰ　　４　　Ｎ株は利用せず、更１：Ｎｏ、
Ｄ−６株並びｉ：ＹＳＸ、Ｐ及びに株はほとんど利用し
ない点、本菌株がウレアーゼ陰性であるのに対してＮＯ
，Ｄ−６株、ＹＳＸＳＰ及びに株は陽性である点に於い
て異なっており、本菌株と上記全公知株とは明確に区別
される。更に糖からの酸生成に於いても本菌株がグリセ
リン、マンニット、ソルビット、イノシフトの糖アルコ
ールから酸を生成しないのに対してＮＦＬ２２１株並び
にＮα５８株はマンニットとソルビットより、ＮａＤ−
６株はグリセリン、マンニットより、ＹＳＸ。

Ｐ及びに株はマンニットより、更にＮＫＳ−２１株はグ
リセリン、マンニット、ソルビット、イノジットより酸
を生成する点に於いて区別される。

以上述べたように、本菌株は菌学的性質において公知の
好アルカリ性バチルス属細菌とは明瞭に区別され、バー
ジニーズマニュアル記載の既知の種のいずれとも、特徴
的性質に於いて全く相違し、明らかに既知の菌種中に一
致する種を見い出し得ない。よって本菌株は新菌種とし
て設定する事が妥当である。

本発明に用いる微生物には、前記バチルス属ＴＮＫ−２
株のほか、その天然または人為的変異株であって、アル
カリ性条件下、低温洗浄での洗浄力向上に寄与するアル
カリプロテアーゼＬの産生能を有するものも含まれる。

次に上記微生物を培養して、培養物より新規アルカリプ
ロテアーゼＬを採取する方法について説明する。

使用される培地としては、通常の微生物の培養に用いら
れるもので、本菌株に利用可能なものであれば何でも良
く例えば有機炭素源及び窒素源としては澱粉、デキスト
リン、糖蜜、乾燥酵母、大豆粉、ペプトン等が良く、無
機塩としてはリン酸二カリウム、硫酸マグネシウムの添
加が有効であり、更に炭酸塩を加えたアルカリ性培地が
好ましい。その他、必要に応じて菌の生育、酵素の産生
に必要な各種有機物、無機物を添加する事が出来る。培
養形態については液体又は固体培養のいずれでも良い。

本発明のバチルス　エスピーＴＮＫ−２株の培養の具体
例を以下に示す。

まず、上記成分を含む培地を通常の、方法で滅菌し、本
菌株を接種し、振盪培養又は通気撹拌培養等を行なう。

例えば２０〜３５℃で４０〜１００時間培養する。培養
終了後、培養物より菌体を分離し、上滑を得る。この上
清液を硫安塩析にかける事によりアルカリプロテアーゼ
を得る。得られたアルカリプロテアーゼの酵素活性はア
ンソン−萩原の変法に従って測定する。即ち、酵素と０
．６％カゼイン基質溶液（ｐＨ１０，５）とを３５℃、
１０分間反応させトリクロロ酢酸混液を用いて反応を停
止させた後、濾過し、濾液の吸光度を２７５ｎｍで測定
する。前記条件下で１分間にチロシンｌμｇ相当量を遊
離させる酵素量を１単位（ＡＰＵ）とする。

次に本発明のアルカリプロテアーゼの分離・精製法につ
き、さらに詳細に説明する。

〔分離・精製法〕

本発明のアルカリプロテアーゼしは分離・精製過程にお
いて３種のアルカリプロテアーゼＬ−１、Ｌ−２、Ｌ−
３から成ることが明らかとなった。

この分離・精製法の一例を第１図に示す。

まず微生物培養液を８．００　Ｏｒｐｍで５分間遠心分
離し菌体を除去した上清を得る。次にこの上清に、４０
％飽和の硫安を加え、夾雑物を析出させ、遠心分離によ
り除去した後、上清に硫安を更に加え、７０％飽和とし
てアルカリプロテアーゼを析出させ、遠心分離により沈
殿物として回収する。

得られた沈殿物を１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ）１９．３
、Ｃａイオン２ｍＭ添加）に溶解し、同緩衝液に対して
透析する。

これをＤＥＡＥ−）ヨバール（東洋曹達製）のアニオン
交換カラムクロマトグラフィーにかけ、１０ｍＭホウ酸
緩衝液（ｐｆｌ　９．’　３　）で溶出させ、非吸着画
分を得る。続いてこの非吸着画分を、再び７０％飽和の
硫安塩析にかけ酵素を濃縮する。得られた沈殿物を再び
１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，３、Ｃａイオン２ｍＭ
添加）に溶解し、同緩衝液に対して透析した。更にまた
、この溶液を蒸留水に対して透析したものを、担体とし
てファルマライト３−１０を用いたショ糖密度勾配等電
点電気泳動にかけ、異なった等電点を示す３種の活性画
分を得る。

この画分をそれぞれ７０％飽和の硫安塩析にかけ、得ら
れた沈殿物を２０ｍＭ、）ＩＪスス−酸緩衝液（ｐ）１
７．２、Ｃａイオン２ｒｒ’ｒＭ添加）に溶解し、同緩
衝液に対して透析した後、トヨパールＨＷ−５５（東洋
曹達製）のゲル濾過カラムクロマトグラフィーにかけ、
同緩衝液で展開させ、活性画分を回収し、等電点がそれ
ぞれ７．０．８．０．９．０である３種の酵素Ｌ−１、
Ｌ−２、Ｌ−３を得る。

以下、アルカリプロテアーゼＬ−１、Ｌ−２およびＬ−
３の物理化学的性質について説明する。

く作　用〉 アルカリ条件下で各種の蛋白質を分解する。

各酵素の基質特異性を、各種の蛋白質の中で異なるもの
について第２表に示す。

第２表 Ａ酵素：アルカラーゼ（ノボ社） Ｂ酵素：ＡＰＩ−２１（昭和電工） ＊Ｉ：Ｌ〜１　：Ｌ−２：Ｌ−３＝１　：　１　：　１
の混合物 〔測定条件〕 ｐＨ１０，５（５０ｍＭホウ酸−Ｎａ［］）Ｉ緩衝液） 温　　　　度　１５℃、２５℃、 反応時間　卵黄６０分、ヘモグロビン１０分、基質濃度
　卵黄１％、ヘモグロビン０．４％、酵素使用量　２５
℃での活性として、ヘモグロビンは１００ＡＰＵ／ｍｊ
７．卵黄は ５００ＡＰＵ／ｒｎ１ ０蛋白質分解率の測定は、アンソン−萩原の変法に従い
、各基質と所定の条件で、反応後、トリクロル酢酸混液
により反応を停止し濾過により未反応蛋白質を除いた反
応溶液の吸光度を２７５ｎｍにて測定した。卵黄は反応
停止後５分間沸騰水中に入れ、その後濾過を行なった。

酵素使用量を決定するための酵素活性は、同じくアンソ
ン−萩原の変法に従い、カゼインを基質として、ｐＨ１
０，５，３５℃にて１０分間反応後、上記と同じ操作を
行ない、１分間にチロシン１μｇを遊離させる酵素活性
を１アル力リプロテアーゼ単位（ＡＰＵ）とした。

この表から、本酵素はＡ酵素、Ｂ酵素とは異なる基質特
異性をもつことが分かる。

〈至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲〉 至適ｐＨ：カゼインを基質として３５℃で１０分間反応
させた場合、Ｌ−１、Ｌ−２、 Ｌ、−３は共にｐＨ１０，８ないし１１．３において作
用が・至適である。

安定ｐ）！範囲：カゼインを基質として２５℃で２４時
間処理した場合、Ｌ−１は ｐＨ７ないしｐＨ１１、Ｌ−２、Ｌ３ はｐａｌ８ないしｐＨ１１において作用が安定である。

本酵素の至適ｐＨおよび安定ｐＮ＠域をそれぞれ第２図
および第３図に示す。用いた緩衝液は以下のとおりであ
る。

ｐＨ領域　　　　　　　　緩衝液 ３．５−５．５　　　　酢酸 ４、５−７．０　　　　　　　　クエン、酸６、０−８
．０　　　　　　　　　リン酸７、５−９．０　　　　
　　　）リス−ＨＣ１８、０−９，０ホウ酸−ＨＣｌ ２、０−１０゜５　　　　グリシン−ＮａＯＨ９、５−
１１，０ホウ酸−ＮａＯＨ １１、Ｏ−１２，０リン酸−ＮａＯＨ １２，０−１３，ＯＫＣｌ−ＮａＯＨ °至適ｐＨは、カゼイン０．６％を含む２０ｍＭの各ｐ
Ｈの緩衝液に各酵、素を１００ＡＰＵ／−となるように
加え、３５℃で１０分間反応させ各ｐＨにおける活性を
測定することにより求めた。至適ｐＨでの活性を１００
としたときの各ｐＨでの相対活性を第２図に示した。

安定ｐＨ範囲は、２０ｍＭの各ｐＨの緩衝液に各酵素を
約４００ＡＰＵ／−となるように加え、２５℃で２４時
間インキュベートした後、各ｐＨにおける活性を測定す
ることにより求めた。インキュベート前の活性を１００
としたときの各ｐＨでの相゛対活性を第３図に示した。

第２図から明らかなごと（、至適ｐＨはＬ−１、Ｌ−２
、Ｌ−３共にｐＨ１０，８ないし１１．３である。

又、第３図から明らかなごとく、安定ｐＨ範囲は相対活
性９０％以上としたとき、Ｌ−１がｐＨ７，０ないし１
１．０ＳＬ−２，３がｐＨ８，０ないし１１．０である
。

〈至適温度と耐熱性〉 至適温度：カゼインを基質としてｐａｌ　１０．５で反
応させた場合、３種の酵素共に温度 ５０℃において作用が至適である。

耐熱性：３種の酵素共にｐＨ９，３で４５℃にて１０分
間熱処理した場合、９５％以上 活性が残存する。

本酵素の至適温度を第４図に、耐熱性を第５図に示す。

至適温度は、基質として０．６％のカゼインを含むｐＨ
１０，５の緩衝液に各酵素を加え、１０分間各温度で反
応させ、３５℃での活性を１００として各温度での相対
活性を求めることにより測定した。

又、耐熱性は、５０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐ、８９．３　
）に約４００ＡＰＵ／ｒｎＩ！の酵素を加え、各温度で
１０分間熱処理し、氷冷した後、活性を測定することに
より求めた。第４図、第５図から明らかなように、３種
の酵素共に至適温度は５０℃であり、４５℃の温度まで
活性が維持される。そして更に、第３表に示す如＜Ｃａ
イオンにより耐熱性は約１０℃向上する。

く金属イオンの影響〉 ３種の酵素共にＨｇイオン、Ｃｕイオンにより活性が阻
害される。

（試験方法） １（１ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，３）に本酵素を約４
００ＡＰＵ／−加え、更に各種金属塩を１ｍＭの濃度で
添加し、３５℃で３０分間処理し、処理後の残存活性を
測定した。数値は０分の活性を１００としてその相対活
性で表わした。活性測定の際の基質としてはカゼインを
用いた。

結果を第４表に示す。この表から、硫酸銅、及び塩化第
二水銀の添加により本酵素は３種共その活性が阻害され
ることが分る。

第４表 く阻害剤の影響〉 ３種の酵素共に、ＥＤＴＡ　（エチレンジアミン四酢酸
）およびＰＣＭＢ　（ｐ−クロロマーキュリー安息香酸
）では活性が阻害されないが、ＤＦＰ（ジイソプロピル
フルオロリン酸）およびＦＭＳ　Ｆ（フェニルメタンス
ルホニルフルオリド）でハ活性が阻害される。

（試験方法） ２０ｍＭピペラジン−Ｎ、Ｎ’−ビス（２−エタンスル
ホン酸）緩衝液（ｐＨ６，８）に各酵素を４００ＡＰＵ
／−になるように加え、各阻害剤を所定濃度添加して３
５℃で３０分間インキ二ベート後、残存活性を測定した
。数値は０分の活性を１００としてその相対活性で示し
た。活性測定の際の基質としてはカゼインを用いた。

結果を第５表に示す。

３種の酵素共に、セリンプロテアーゼ阻害剤であるＤＦ
Ｐ、ＰＭＳＦで活性が阻害されることから、活性中心に
セリンを有するプロテアーゼであることがわかる。

第５表 〈分子量〉 Ｌ−１：　３５０００　（トＥｌバールＨＷ−５５ニよ
るゲル口過法による測 定で±１０００の範回が ある。） Ｌ−２：３’２０００　　（〃　　　　　）Ｌ−３：２
８０００（〃　　　　　） 本酵素の分子量をゲル濾過クロマトグラフィーにより゛
調べた。充填剤には、トヨバールＨＷ−５５を用い２０
ｍＭ）Ｕスー塩酸緩衝液（Ｃａイオン２ｍＭ添加、ｐＨ
７，２＞を溶出液とした。標準蛋白に以下の蛋白（カッ
コ内は分子量を示す。）を用いて検量線を作成した。卵
白アルブミン（４５０００）、サーモライシン（３４５
００）、ズブチリシン・カールスベルグ（２７３００）
、α−キモトリプシノーゲンＡ（２５６００）、トリプ
シン（２４０００）この方法により本酵素の分子量はそ
れぞれＬ−１：３５０００　　Ｌ−２：３２０００Ｌ−
３：２８０００　　（但し測定法上±１０００の範囲が
ある。）と決定した。

〈等電点〉 等電点は、　　Ｌ−１：７．０ Ｌ−２：８．０ Ｌ−３：９．０ （ファルマライト３−１０によるショ糖密度勾配等電点
電気泳動法による。） 本酵素の等電点をショ糖密度勾配等電点電気泳動法によ
り調べた。カラム用担体には、ファルマライト３−１０
を用いた。

この方法により、本酵素の等電点はそれぞれＬ−１：７
．０、Ｌ−２：８．０、Ｌ−３：９．０と決定した。

く公知酵素との比較〉 最後にまとめとして、本酵素の各種性状をＡ酵素、Ｂ酵
素、およびバチルス属の好アルカリ性細菌の生産する公
知のアルカリプロテアーゼのものと比較して、第６表に
示す。

Ｂ酵素以外の類似した公知のアルカリプロテアーゼと比
較すると、まず本酵素３種の至適ｐＨが共に１０，８〜
１１．３であるのに対して、Ｙａ酵素は１０〜１２．５
、Ｙｂ酵素は９〜１０、Ｎα２２１は１１〜１２であり
、明らかに異なる。次に至適温度は、本酵素３種が全て
５０℃にあるのに対し、Ｙａ酵素、Ｙｂ酵素、Ｎα２２
１、Ｅ−１、Ｅ−２、Ａ酵素は６０℃以上であり、この
点においても異なる。

また、耐熱性は、本酵素３種が全て４５℃以下で安定で
あるのに対し、Ｙａ酵素、Ｅ−１、Ｅ−２は５５℃まで
安定であり、Ｙｂ酵素、Ｎα２２１は５０℃まで安定で
あり、Ａ酵素は４０℃以下で安定であり、この点におい
ても異なる。

分子量は、Ｌ　−１、Ｌ−２、Ｌ　−３が３５０００．
３２０００．２８０００　（それぞれ±１０００の範囲
がある）であるのに対し、Ｙａ酵素、Ｙｂ酵素、Ｎｏ、
２２１、Ｅ−１、Ｅ−２はそれぞれ、２１０００．４０
０００．３００００．２００００．２００００であり、
異なっている。

更に、等電点も、本酵素Ｌ−１、Ｌ−２、Ｌ−３がそれ
ぞれ７．０．８．０．９．０であるのに対して、ここに
示すように公知のアルカリプロテアーゼは異なった値を
示す。

以上の点から、本酵素３種は、Ｂ酵素以外の公知のアル
カリプロテアーゼとは明らかに別種の酵素であることが
わかる。

次に低温で高活性を有するアルカリプロテアーゼとされ
ているＢ酵素と比較すると、第１表に示す如く、各種蛋
白質に対する基質特異性が、特に卵黄において大きく異
なる。又、分子量もＢ酵素は２２０００であり、本酵素
３種とは異なる。

更に耐熱性も、本酵素３種が全て４５℃まで安定である
のに対し、Ｂ酵素は４０℃以下で安定である点も異なる
。

以上の点から、本酵素３種は、最も類似の公知アルカリ
プロテアーゼであるＢ酵素とも明らかに別種のものと言
える。

以上のことから、本酵素は従来知られているアルカリプ
ロテアーゼのいずれとも異なる。よって本酵素を新規酵
素と判断することが妥当であり、アルカリプロテアーゼ
し−１、アルカリプロテアーゼし−２、アルカリプロテ
アーゼＬ−３と命名した。

〔実施例〕

〈菌株の培養〉・ 可溶性デンプン２％、硫酸マグネシウム０．０２％を含
む液体培地と、酵母エキス０．５％、ペプトン０．５％
、リン酸水素二カリウム０．１％を含む液体培地とをそ
れぞれ１２１℃にて２０分間別々に滅菌した後、各２０
ｍ１！を５００ｒｎｌの坂ロフラスコに分注し、更に滅
菌済みの炭酸ナトリウムを終濃度１％となるように該フ
ラスコに加え、５０ｍ１の培養液を調製した。この培養
液にバチルス　エスピー（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ、　
）　Ｔ　Ｎ　Ｋ　−２株（微工研菌寄第９５６５号）を
１白金耳接種し、２０℃で７２時間振盪培養した。

培養終了後、坂ロフラスコ２０本の培養液を集め、得ら
れた培養液９’５０ｍｔ’を遠心分離により除菌し、上
清９００ｍｉ’　（２４０ＡＰＵ／ｍりを得た。

く酵素の分離・精製〉 このようにして得た培養上清９００ｍｆ！を冷却撹拌し
ながら、この上清に硫安２１９ｇを加え４０％飽和にし
て夾雑物を析出させ遠心分離により除去した後、この上
清に更に硫安１５９ｇを添加し７０％飽和にしてアルカ
リプロテアーゼを析出させ遠心分離により沈殿物として
回収した。

この沈殿物をｌＱｍＭホウ酸緩衝波緩衝液９．３、Ｃａ
イオン２ｍＭを含む）２０−に溶解し、該溶液を透析膜
に入れ同緩衝液に対して一夜透析した。

ここにＬ−１、Ｌ−２及びＬ−３を全て含む３２ｒｄ！
の粗酵素液（６０００ＡＰＵ／Ｔｎｆりを得た。

続いて夾雑蛋白の除去および脱色のためこの粗酵素液を
１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐＨ９，３）で平衡化したＤＥ
ＡＥ−トヨパールを充填したカラムに展開させ、同緩衝
液で流出させた。この条件でＬ−１、Ｌ−２、Ｌ−３は
全てＤＥＡＥ−トヨパールに吸着しないで流出すること
から、非吸着の活性画分を集め、１８００ＡＰＵ／ｍｌ
！の酵素液９５ｍ１を得た。この画分に硫安４５ｇを添
加し、酵素蛋白を析出させ、遠心分離により沈殿物とし
て回収した。この沈殿物を１０ｍＭホウ酸緩衝液（ｐｆ
１９．３、Ｃａイオン２ｍＭを含む）２０ｍｌ＋：溶解
し、蒸留水に対して一夜透析した酵素液をファルマライ
ト３〜１０をカラム担体としたショ糖密度勾配等電点電
気泳動にて展開させ、等電点がそれぞれ７．０．８．０
．９．０である３つの活性画分を得た。

この段階までの活性回収率（上清９００ｍ１（２４０Ａ
ＰＵ／ｒｎ１．）を１００％としたときの回収率）は３
種の活性の合計で２４％であった。ショ糖密度勾配等電
点電気泳動の電気泳動図を第６図に示す。

更に得られた各活性画分を硫安塩析し、沈殿物を２０ｍ
Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，２、Ｃａイオン２ｍＭ
を含む）に溶解し、同緩衝液に対して透析した後、トヨ
パールＨＷ−５５のゲル濾過カラムクロマトグラフィー
にかけ、同緩衝液で展開させ活性画分を回収してＬ−１
、Ｌ−２、Ｌ−３各精製酵素を得た。

く本酵素の洗浄力〉 本酵素は前述の如く、衣類の汚れとなる蛋白質を分解す
ることから、まず洗浄剤用酵素として使用できるもので
あるが、その他、皮革加工、食品等公知のアルカリプロ
テアーゼと同様な分野で利用することができる。

なお、前記の精製酵素と同様に粗酵素液、公知の乾燥方
法による粗酵素、粉体、粉粒体の状態でも充分なアルカ
リプロテアーゼ作用が得られるので、該粗酵素も本発明
のアルカリプロテアーゼに包含されるものである。洗浄
剤に用いる場合、その組成物は成分として界面活性剤を
組成物中５〜５０重量％、好ましくは１０〜４０重量％
、ビルグーを２〜６０重量％、好ましくは５〜４５重量
％、酵素を４０万ＡＰＵ／ｇｒのものとしＴｏ、０５〜
５重量％、好ましくは０．１〜３重量％、再汚染防止剤
を０〜５重量％、好ましくは１〜３重量％、その他添加
剤を０〜５重量％、好ましくは０．１〜３重量％含有す
ることができる。

界面活性剤としては、平均炭素数１０〜２０のオレフィ
ンスルホン酸塩（とりわけα−オレフィンスルホン酸塩
）、平均炭素数１０〜１６のアルキル基を有する直鎖ア
ルキルベンゼンスルホン酸塩、平均炭素数ＩＯ〜１６の
アルキル基を有するアルキル硫酸塩、平均炭素数１０〜
２０の直鎖または分岐鎖のアルキル基もしくはアルケニ
ル基を有し、平均０．５〜８モルのエチレンオキサイド
を付加したアルキルエーテル硫酸塩もしくはアルケニル
エーテル硫酸塩、平均炭素数１０〜２０のα−スルホ脂
肪酸塩またはα−スルホ脂肪酸エステル塩、平均炭素数
１０〜２Ｑの飽和または不飽和脂肪酸塩などのアニオン
界面活性剤などが使用でき、アニオン界面活性剤におけ
る塩としては通常ナトリウムやカリウムなどのアルカリ
金属塩が適当である。また、平均炭素数１０〜２０のア
ルキル基もしくはアルケニル基を有し、１〜２０モルの
エチレンオキサイドを付加したポリオキシエチレンアル
キルエーテルまたはポリオキシエチレンアルケニルエー
テルなどのノニオン界面活性剤も用いることができる。

ビルグーとしては炭酸塩、珪酸塩などのアルカリビルグ
ー、合成ゼオライト、ニトリロ三酢酸塩などのアミノポ
リ酢酸塩、多価カルボン酸塩、その他ポリアクリル酸、
ポリイタコン酸、ポリアクリル酸−メタクリル酸共重合
物などの高分子電解質などが挙げられる。

再汚染防止剤としてはポリエチレングリコール、ポリビ
ニルアルコーノへカルボキシメチルセルロースなどを用
いることができる。

更に必要に応じて金属イオン封鎖剤、Ｎ　ａ　２　Ｓ　
Ｏ３、ＮａＨ３Ｏ３などの亜硫酸塩、芒硝などの増量剤
、漂白剤、螢光増白剤、香料などを配合することができ
るが、これらについては特に限定されるものではない。

具体的な洗浄剤組成物の例を第７表に示す。

第７表 ＡＯ３：Ｃ口〜＋８α−オレフィンスルホン酸ナトリウ
ム ＬＡＳ　：アルキル基の炭素数が１０〜１４の直鎮アル
キルベンゼンスルホン酸ナトリ ウム ＡＳ：ＣＩ２〜１．アルキル硫酸ナトリウムＡＥＳ：ア
ルキル基の炭素数が１２〜１５、エチレンオキシドの平
均付加モル数３の アルキルエトキシ硫酸ナトリウム ゼオライト：Ａ型合底ゼオライト （平均粒径０．９μｍ） ＰＡＳ　：ポリアクリル酸ナトリウム （Ｍ；−＝５０００） ＭＡｌｏＬ：無水マレイン酸／オレフィン共重合物（Ｍ
；−＝　１００００　） ＮＴＡ　：ニトリロトリ酢酸ナトリウム（試薬品）ケイ
酸Ｎａ　：　Ｎａ２Ｏ：　３１０２　＝　１　：　２．
２炭酸Ｎａ　：　Ｎａ２ＣＯ３（試薬品）ＰＥＧ　：ポ
リエチレングリコール平均分子量亜硫曹；　Ｎａ２　Ｓ
　０３　　（試薬品）次に第７表に示した洗浄剤組成物
例２を用い、各酵素を０．５％配合のとき２．０００Ａ
ＰＵ／ｇ洗浄剤組成物（Ａ酵素４０万ＡＰＵ／ｇのもの
を０．５％配合した場合に相当）、１．５％配合のとき
６．０００ＡＰＵ／ｇ洗浄剤組成物（Ａ酵素４０万Ａ　
Ｐ　Ｕ／　ｇのものを１．５％配合した場合に相当）と
なるように添加し、洗浄力を評価した。

その方法を以下に示す。

（１）人工汚垢布の調製 結晶性鉱物であるカオリナイト、バーミキユライトなど
を主成分とする粘土を２００℃で３０時間乾燥したもの
を無機汚垢として使用した。

９５０ｍ１の水にゼラチン３．５ｇを約４０℃で溶解し
たのち強力な乳化分散機であるポリトロン（スイスＫＩ
ＮＥＭＡＴＩＣＡ製）で０．２５　ｇのカーボンブラッ
クを水中に分散した。次に無機汚垢１４．９　ｇを加え
てポリトロンで分散し、さらに有機汚垢３Ｌ、　３５　
ｇを加えてポリトロンで乳化分散して安定な汚垢浴を作
った。この汚垢浴中に１０ｃｍＸ２０ｃｍの所定の清浄
布（日本油化学協会指定綿布６０番）を浸漬したのち、
ゴム製２本ロールで水を絞り、汚垢の付着量を均一化し
た。この汚垢布を１０５℃で３０分間乾燥したのち、汚
垢布の両面を左右２５回づつラビングした。これを５ｃ
ｍＸ５ｃｍに裁断して反射率が４２±２％の範囲のもの
を汚垢布に供した。こうして得られた人工汚垢布の汚垢
組成は第８表の通りである。

第８表 （２）セバム布の調製 布（綿メリヤス５ｃｍｘ５ｃｍ）に１枚当り第８表に示
す有機汚垢６０ｍｇを付着させたもの。

（３）洗浄メリヤス布 綿メリヤス（セバム布に用いたものと同じもの。）（４
）＆浄方法 洗浄装置は［１，Ｓ、’　Ｔｅ５ｔ　ｉｎｇ社のＴｅｒ
ｇ−０−Ｔｏｍｅｔｅｒを使用し、これに人工汚垢布１
０枚とセバム布３枚とを入れ、さらに洗浄メリヤス布を
入れて浴比を３０倍に合わせ、所定の温度で１２０ｒｌ
１ｍ、１０分間洗浄する。洗浄液は洗浄剤濃度０．１３
３％のもの９００ｍ１を用い、すすぎは９００ｍｊ！の
水で３分間行う。使用水は３°ＤＨのものを用いた。

（５）洗浄力評価法 洗浄力（％）＝ ＲはＣａｒｉ　Ｚｅｉｓｓ社巳ＬＲＥＰＨＯ反射率計に
よって測定される反射率（％）である。

なお、洗浄力の評価は供試人工汚垢布１０枚の平均値で
行った。

結果を第９表に示す。

第９表 ”　Ｌ−１：Ｌ−２：Ｌ−３＝ｌ　Ｏ：　３０　：　６
０の比率で含む混合物。

Ｏ公知酵素であるＡ酵素の２５℃、０．５％の洗浄力を
１００としたときの相対値で示す。

〈発明の効果〉 第９表に示す如く、３種の酵素Ｌ−１、Ｌ−２、Ｌ−３
から成る本酵素りは３種の混合物として使用した場合及
び各酵素単独で使用した場合のどちらにおいても、通常
水道水で考えられる比較的高い温度である２５℃から、
年間を通しての平均的な水温である１５℃という低温ま
で従来の酵素に比べ優れた洗浄力を示す。特に１５℃に
おいて、Ａ酵素、Ｂ酵素を代表とする従来の酵素では、
配合量を増加しても、洗浄力の向上は望めないが、本酵
素では従来の酵素では到達し得ない２５℃での洗浄力レ
ベルに到達しうる。このことは本酵素が特に低温での洗
浄力改善にすぐれていることを示すものである。

【図面の簡単な説明】

第１図は、アルカリプロテアーゼＬの分離・精製法の一
例を示すスキームであり、第２図はアルカリプロテアー
ゼＬの至適ｐＨ１第３図は安定ｐＨ範囲、第４図は至適
温度、第５図は耐熱性、第６図はショ糖密度勾配等電点
電気泳動図を示す。 ｐｌ−１ （ｂ） Ｌ−２の至遍ｐＨ ２図 （ａ） 繊ｌ ￥３図 （ｃ） ｐＩ″１ １図

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）下記の理化学的性質を有するアルカリプロテアー
   ゼＬ−１、Ｌ−２、Ｌ−３およびこれらの２種以上の混
   合物から成る群から選ばれるアルカリプロテアーゼＬ。 作用：Ｌ−１、Ｌ−２およびＬ−３いずれもアルカリ条
   件下で各種の蛋白質を分解 する。 至適ｐＨ：カゼインを基質として３５℃で反応させた場
   合、Ｌ−１、Ｌ−２およびＬ− ３いずれもｐＨ１０．８〜１１．３である。 安定ｐＨ範囲：カゼインを基質として２５℃で２４時間
   処理した場合、Ｌ−１は ｐＨ７〜１１、Ｌ−２およびＬ−３ はｐＨ８〜１１において作用が安定 である。 至適温度：カゼインを基質としてｐＨ１０．５で反応さ
   せた場合、Ｌ−１、Ｌ−２およ びＬ−３いずれも、５０℃である。 耐熱性：Ｌ−１、Ｌ−２およびＬ−３いずれも、ｐＨ９
   ．３で４５℃にて１０分間熱処理し た場合、９５％以上、活性が残存する。 金属イオンの影響：Ｌ−１、Ｌ−２およびＬ−３いずれ
   も、Ｈｇイオン、 Ｃｕイオンにより活性が阻 害される。 阻害剤の影響：Ｌ−１、Ｌ−２およびＬ−３いずれも、
   ＤＦＰ、ＰＭＳＦによ り活性が阻害される。 分子量：（ゲル濾過法による） Ｌ−１：３５０００ Ｌ−２：３２０００ Ｌ−３：２８０００ 等電点：（等電点電気泳動法による） Ｌ−１：７．０ Ｌ−２：８．０ Ｌ−３：９．０
2. （２）バチルス属に属するアルカリプロテアーゼＬ生産
   菌を培養し、培養物からアルカリプロテアーゼＬを採取
   することを特徴とする、アルカリプロテアーゼＬの製造
   法。
3. （３）アルカリプロテアーゼＬ生産菌がバチルスエスピ
   ー（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．）ＴＮＫ−２（微工研菌寄
   第９５６５号）である、特許請求の範囲第（２）項記載
   の製造法。