JP2750789B2 - 洗浄剤組成物 - Google Patents
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に詳細には蛋白質汚れに対する洗浄力に優れた洗浄剤組
成物に関する。
等には、従来より蛋白質汚れを除去する目的で種々のプ
ロテアーゼが配合されている。かかるプロテアーゼとし
てはアルカリ領域で作用するアルカリプロテアーゼが用
いられており、その代表的なものとしては、アルカラー
ゼ、サビナーゼ(ノボ・ノルディスク社製)API−2
1(昭和電工社製)、マクサカル(ギスト・ブロケイデ
ス社製)等が挙げられるが、これらのアルカリプロテア
ーゼは家庭洗濯で問題となっている襟、そで口等の水不
溶性蛋白質汚れに対し充分な活性を有しておらず、これ
を配合した洗浄剤は充分な蛋白質汚れ除去作用を発揮し
得ないという問題があった。
素(特開昭61−280278号公報)等が報告されて
いるが、これは活性領域が高温度側にあるため、一般的
に室温付近で洗浄を行う場合には適合しないという問題
があった。
で活性を有し、更に水不溶性蛋白質に対し高い活性を有
するアルカリプロテアーゼを配合した、蛋白質汚れ洗浄
力に優れた洗浄剤組成物が望まれていた。
記課題を解決すべく鋭意検討したところ、水不溶性蛋白
質、特にヒト角質ケラチン線維に対して高い分解活性を
有するアルカリプロテアーゼを配合すれば、蛋白質汚
れ、特に襟、そで口等の水不溶性蛋白質汚れに対する洗
浄力の優れた洗浄剤が得られることを見出し、本発明を
完成した。
上のヒト角質ケラチン線維に対する分解活性を有するア
ルカリプロテアーゼを含有することを特徴とする洗浄剤
組成物を提供するものである。
解活性は、ヒト角質ケラチン線維分解活性能(KFU)
を水溶性蛋白質である尿素変性ヘモグロビン分解活性
(APU)に対する比として示されるものであり、具体
的には後記の方法により行われる。
は、その酵素がアルカリ性領域で安定であり、プロテア
ーゼ活性を示すものをいい、本発明においては特に次の
至適pH及び至適温度を有するものを用いるのが好まし
い。 (1)至適pH(カゼイン基質,40℃10分間反応) 10.0〜12.5 (2)至適温度(カゼイン基質,Ca2+無添加pH10.0
で反応) 50〜60℃
としては、上記の条件を具備するものであれば特に限定
されないが、具体的にはアルカリプロテアーゼK−16
及びアルカリプロテアーゼK−14が挙げられる。
K−16及びK−14は、バチルス(Bacillu
s)属に属する微生物を培養し、該培養物から採取する
ことができるが、その微生物としては、例えば以下に示
すような菌学的性質を有するものが挙げられる。
2.2〜25μm (b)多形性:無し。 (c)運動性:周鞭毛を有し、運動性あり。 (d)胞子〔大きさ、形、位置〕:1.0〜1.2μm
×1.4〜2.2μm、楕円形、中央準端、胞子嚢の膨
潤ややあり。 (e)グラム染色:陽性 (f)抗酸性:陰性 (g)肉汁寒天平板上での発育形態:円形、葉状、表面
円滑、淡黄色、半透明のコロニー。 (h)肉汁寒天斜面上での生育:不規則な葉状、表面少
しだけ粗な円滑、淡黄色、半透明のコロニー。 (i)肉汁液体培養:生育良好で混濁あり菌膜無し。 (j)肉汁ゼラチン穿刺培養:生育良好で液化する。 (k)リトマスミルク:ペプトン化するが、ミルクの凝
固なし、リトマスの変化なし。
ニウム塩は利用しない。 (j)色素の生成:陰性 (k)ウレアーゼ:陰性 (l)オキシダーゼ:陽性 (m)カタラーゼ:陽性 (n)生育の温度範囲:55℃以下 (o)生育のpH範囲:pH6.6〜10.3で生育可能。 (p)酸素に対する態度:好気的 (q)OFテスト:酸化型(O型) (r)塩化ナトリウムに対する耐性:10%塩化ナトリ
ウム存在下で生育する。 (s)糖からの酸生成及びガス生成
マニュアル オブ システマティック バクテリオロ
ジー(Williams & Wilkins社,19
84年)」(Bergey’s Mannual of
Systematic Bacteriology)
の記載に準じ検討したところ、本菌株は、バチルスズブ
チルス(Bacillus subtilis)に属さ
せることが妥当である。しかし、バチルス ズブチルス
がpH10の培地には全く生育しないのに対し、本菌株は
pH10でも良好に生育する。また、バチルス ズブチル
スが55℃では生育できないのに対し、本菌株は55℃
においても生育が可能であること等の相違点が認められ
る。
バチルス ズブチルスに属させることが妥当であるが、
いくつかの点においてこれと相違し、また他の公知の菌
株とも異なるので、本菌株をバチルス・エスピー(Ba
cillus sp.)KSM−K16と命名し、工業
技術院微生物工業技術研究所にFERM BP−337
6として寄託した。
2.5〜25.5μm (b)多形性:無し。 (c)運動性:周鞭毛を有し、運動性あり。 (d)胞子〔大きさ、形、位置〕:1.0〜1.2μm
×1.5〜2.2μm、楕円形、中央準端、胞子嚢の膨
潤ややあり。 (e)グラム染色:陽性 (f)抗酸性:陰性
ニウム塩は利用しない。 (j)色素の生成:陰性 (k)ウレアーゼ:陰性 (l)オキシダーゼ:陽性 (m)カタラーゼ:陽性 (n)生育の温度範囲:55℃以下 (o)生育のpH範囲:pH6.6〜10.3で生育可能。 (p)酸素に対する態度:好気的 (q)OFテスト:酸化型(O型) (r)塩化ナトリウムに対する耐性:10%塩化ナトリ
ウム存在下で生育する。 (s)糖からの酸生成及びガス生成
マニュアル オブ システマティック バクテリオロ
ジー(Williams & Wilkins社,19
84年)」(Bergey’s Mannual of
Systematic Bacteriology)
の記載に準じ検討したところ、本菌株は、バチルスズブ
チルス(Bacillus subtilis)に属さ
せることが妥当である。しかし、バチルス ズブチルス
がpH10の培地には全く生育しないのに対し、本菌株は
pH10でも良好に生育する。また、バチルス ズブチル
スが55℃では生育できないのに対し、本菌株は55℃
においても生育が可能であること等の相違点が認められ
る。
バチルス ズブチルスに属させることが妥当であるが、
いくつかの点においてこれと相違し、また他の公知の菌
株とも異なるので、本菌株をバチルス・エスピー(Ba
cillus sp.)KSM−K14と命名し、工業
技術院微生物工業技術研究所にFERM BP−367
0として寄託した。
ーゼK−16及びK−14を生産するには、当該菌体を
適当な培地に接種し、常法に従って培養すればよい。
培養に用いられ本菌株に利用可能なものであれば何れを
も使用することができるが、該培地中には資化しうる炭
素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好まし
い。
はないが、その例としては、窒素源としてはコーングル
テンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉
エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミー
ル、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチ
ベーター、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、ア
ジックス等が挙げられる。また、炭素源としては、資化
しうる炭素源、例えばアラビノース、キシロース、グル
コース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、蔗
糖、麦芽糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノ
シトール、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転
化糖等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げら
れる。また、その他、リン酸、Mg2+、Ca2+、Mn2+、Z
n2+、Co2+、Na+ 、K+ 等の無機塩や、必要であれば、無
機、有機微量栄養源を培地中に適宜添加することもでき
る。
であるアルカリプロテアーゼK−16及びK−14の採
取及び精製は、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じ
て行うことが出来る。
することによって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液
から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、
溶媒沈澱法(メタノール、エタノール、イソプロピルア
ルコール、アセトン等)によって蛋白質を沈澱させた
り、また、限外濾過(例えばダイアフローメンブレンY
C、アミコン社製)により濃縮させて目的とするアルカ
リプロテアーゼを得る。塩析法では、例えば硫安(30
〜70%飽和画分)、溶媒沈澱では、例えば75%エタ
ノール中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分離、
脱塩することによってこれを凍結乾燥粉末とすることも
可能である。ここで脱塩の方法としては、透析又は、セ
ファデックスG−25等を用いるゲル濾過法等の一般的
方法が用いられる。
ま使用することもできるが、更に公知の方法により精製
結晶化して用いることも出来る。更に酵素を精製するに
は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等
の吸着クロマトグラフィー、DEAE−セファデック
ス、DEAE−セルロース、CM−セルロースやCM−
バイオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びセフ
ァデックスやバイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグ
ラフィーを適宜組み合わせて分別精製すればよい。
アーゼK−16及びK−14は、以下に示すような酵素
学的性質を有する。尚、以下において、酵素活性の測定
は次の如くして行った。
0.0)1mlを0.1mlの酵素溶液と混合し、40℃、
10分間反応させた後、反応停止液(0.123Mトリ
クロロ酢酸−0.246M酢酸ナトリウム−0.369
M酢酸)2mlを加え、30℃、20分間放置した。次に
濾紙(ワットマン社製、No.2)で濾過し、濾液中の蛋白
分解物をフォーリン・ローリー法(Lowry,O.
H.et al.,J.Biol.Chem.,vol
193,p265(1951))の改良法によって測
定した。また1P.U.は、上記反応条件下において1
分間に1mmolのチロシンを遊離する酵素量とした。
Gen.Physiol.,Vol22,p79(19
38))の改良法によって測定される。即ち、基質とし
て用いる尿素変性ヘモグロビンの終濃度を14.7mg/
mlになるように調製した溶液中で、温度25℃、pH1
0.5にて10分間反応させた後、反応溶液にトリクロ
ロ酢酸を終濃度31.25mg/mlになるように添加す
る。トリクロロ酢酸可溶分をフェノール試薬によって呈
色させる。この呈色度を1mmolのチロシンの呈色度を1
APUとした検量線より反応10分間あたりの活性を求
め、これを1分間あたりに換算することによって測定し
た。すなわち、1APUとは、1mmolのチロシンがフェ
ノール試薬により呈色するのと同じ呈色度のトリクロロ
酢酸可溶分量を1分間に与えるプロテアーゼの量のこと
を示す。 (2)ヒト角質ケラチン線維に対する分解活性 (2−1)ケラチン線維の調製 ヒト踵皮(角質)をメスで削り取り、ハサミで細かく裁
断したあと、イオン交換水で洗浄する。角質1gを8M
尿素、25mMβ−メルカプトエタノールを含む50mMト
リス−塩酸緩衝液(pH8.0)の20〜50mlに懸濁
し、一晩スターラーで攪拌する。膨潤した角質をテフロ
ンホモジナイザーを用いてすりつぶした後、遠心分離
(30,000×g,30min )する。上澄液を濾紙を
用いて濾過後、濾液をイオン交換水に対して透析し、凍
結乾燥、粉末化したものをケラチン線維として用いる。 (2−2)分解活性の測定 0.1M炭酸緩衝液(pH10.5)に、調製したケラチ
ン線維を1mg/ml、プロテアーゼを2×10-3APU/
mlになるように添加する。温度30℃、マグネチックス
ターラーで回転数100rpm(スターラーピース35m
m)で一定時間インキュベート後、反応液にフェニルメ
チルスルホニルフルオライドを添加(終濃度2mM)し、
0.5μm メンブレンフィルターで濾過する。濾液中の
可溶化蛋白質をローリー法によりチロシン換算として測
定する。 (2−3)ヒト角質ケラチン線維分解活性の算出 1分間に1mgのチロシンに相当する可溶化蛋白質をヒト
角質ケラチン線維から分解生成物として生成させるプロ
テアーゼ量を1KFUと規定する。
性質 (1)作用 高アルカリ性条件下で各種蛋白質に対して作用する。特
にヒト角質ケラチンに対し48KFU/APUの活性を
有する。
性を、他の市販プロテアーゼと比較した。用いた基質
は、カゼイン、尿素変性ヘモグロビン、獣毛ケラチン、
エラスチンでこれらに対する分解活性を測定した。50
mMホウ酸−NaOH緩衝液(pH10.0)に各基質を1%
(尿素変性ヘモグロビンは2.2%)加え、各酵素液
0.5×10-4P.U.(エラスチンは3.5×10-4
P.U.)を添加し、40℃、10分間反応を行った。
各々の基質におけるアルカリプロテアーゼK−16の活
性を100とした時の各酵素の活性を表3に示す。
プロテアーゼK−16は水可溶性及び水不溶性の蛋白質
を良好に分解し、現在洗剤用酵素として良く用いられて
いる市販酵素A、市販酵素Bと比較して、特にエラスチ
ンに対して優れた作用を示す。
ようにカゼインを加え、アルカリプロテアーゼK−16
を5.2×10-5P.U.加えて40℃、10分間反応
して活性を測定した。最適pHでの活性を100とし、各
pHでの活性を相対的に表した。結果を図1に示す。図1
からも明らかなようにアルカリプロテアーゼK−16の
至適pHは11.0〜12.3である。尚、使用した各種
緩衝液、及びそのpH範囲は次のとおりである。 酢酸緩衝液 pH3.9〜5.7 リン酸緩衝液 pH6.6〜8.3 炭酸緩衝液 pH9.2〜10.9 リン酸−NaOH緩衝液 pH10.9〜12.7 KCl−NaOH緩衝液 pH10.9〜12.6
10-3P.U.のアルカリプロテアーゼK−16を加
え、25℃で48時間放置した。この処理液を50mMホ
ウ酸−NaOH緩衝液(pH10.0)で40倍に希釈後、活
性を測定した。処理前の酵素活性を100%として各pH
での相対活性を求めた。結果を図2に示す。図2から明
らかなようにアルカリプロテアーゼK−16は、Ca2+非
存在下ではその安定領域がpH6.0〜12.0であり、
2mM Ca2+存在下ではその安定域はpH5.0〜12.0
であった。
NaOH緩衝液(pH10.0)に3.1×10-5P.U.の
アルカリプロテアーゼK−16を加え、10分間各温度
で反応を行った。40℃での活性を100%として各温
度での相対活性を求めた。結果は図3に示す。図3から
も明らかなように、アルカリプロテアーゼK−16の至
適温度は、Ca2+非存在下では55℃であり、5mM Ca2+
存在下では70℃であった。
-3P.U.のアルカリプロテアーゼK−16を加え、各
温度で10分間熱処理し、氷冷後、50mMホウ酸−NaOH
緩衝液(pH10.0)で5倍希釈した。そして0.91
%カゼインを基質として活性を測定した。未処理時の活
性を100%として各処理温度での相対活性を求めた。
結果を図4に示す。図4からも明らかなように、アルカ
リプロテアーゼK−16はCa2+非存在下で50℃、5mM
Ca2+存在下では60℃まで上記熱処理条件下で、90
%以上の活性が維持された。
ナトリウム(SDS)−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により調べた。分子量マーカーには低分子量用マー
カーキット(バイオラッド)すなわち、ホスホリラーゼ
b(分子量:97,400)、牛血清アルブミン(分子
量:66,200)、卵白アルブミン(分子量:42,
700)、カルボニックアンヒドラーゼ(分子量:3
1,000)、大豆トリプシンインヒビター(分子量:
21,500)、リゾチーム(分子量:14,400)
を用いた。この方法によりアルカリプロテアーゼK−1
6の分子量は28,000±1,000と決定された。
動法により調べた。カラム用の両性担体にはサーバライ
ト9−11を用いた。この方法によりアルカリプロテア
ーゼK−16の等電点は10.5以上であることがわか
った。
6に対して与える影響を調べた。まず、20mMホウ酸−
NaOH緩衝液(pH9.5)に各種金属塩を1mMの濃度で添
加し、そこに3.9×10-3P.U.の酵素を加えて3
0℃、20分間放置した。その後、50mMホウ酸−NaOH
緩衝液(pH10.0)で5倍に希釈して残存活性を測定
した。残存活性は、金属塩無添加で同様に処理した酵素
活性に対する相対値で表した。結果を表4に示した。こ
の結果から明らかなように、アルカリプロテアーゼK−
16は、Hg2+及びCu2+により活性が阻害されることがわ
かる。また、前記(5)及び(6)の結果よりCa2+によ
り熱安定性が向上することがわかる。
−16に対して与える影響を調べた。10mMリン酸緩衝
液(pH7.0)に各種阻害剤を所定濃度になるように加
え、そこにアルカリプロテアーゼK−16 7.9×1
0-3P.U.を添加し、30℃で20分間放置した。そ
の後、該処理液をイオン交換水にて20倍希釈し、残存
活性を測定した。残存活性は、阻害剤無添加で同様に処
理した酵素活性に対する相対値で表した。結果を表5に
示した。この結果から明らかなように、アルカリプロテ
アーゼK−16は、セリンプロテアーゼの阻害剤である
ジイソプロピルフルオロリン酸(DFP)、フェニルメ
タンスルホニルフルオリド(PMSF)、キモスタチン
で活性が阻害されることから、活性中心にセリン残基を
有するプロテアーゼであることがわかる。
面活性剤を溶かした5mlの0.1Mトリス−塩酸緩衝液
(pH9.0、エタノールを10%含む)に加え40℃で
4時間放置し、その後50mMホウ酸−NaOH緩衝液(pH1
0.0)で20倍希釈後、残存活性を測定した。処理時
間0分での活性を100%とし残存活性を相対値で表し
た。結果を表6に示した。この結果から明らかなように
アルカリプロテアーゼK−16は、各種界面活性剤が高
濃度(1〜10%)存在しても高い安定性を示すもので
あった。このことより、アルカリプロテアーゼK−16
は界面活性剤を含有する洗浄剤成分として有用である。
性質 (1)作用 高アルカリ性条件下で各種蛋白質に対して作用する。特
にヒト角質ケラチンに対し50KFU/APUの活性を
有する。
検討した結果、図5から明らかなようにアルカリプロテ
アーゼK−14の至適pHは10.4〜12.0であっ
た。 (3)pH安定性 前記アルカリプロテアーゼK−16の場合と同様にして
検討した結果、図6から明らかなようにアルカリプロテ
アーゼK−14はCa2+非存在下ではその安定領域がpH7
〜11.5であり、2mM Ca2+存在下ではその安定領域
はpH5〜12であった。 (4)至適温度 前記アルカリプロテアーゼK−16の場合と同様にして
検討した結果、図7から明らかなようにアルカリプロテ
アーゼK−14の至適温度はCa2+非存在下では55℃で
あり、5mM Ca2+存在下では70℃であった。
検討した結果、図8から明らかなように、アルカリプロ
テアーゼK−14はCa2+非存在下で50℃、5mM Ca2+
存在下では60℃まで90%以上の活性が維持された。 (6)等電点 アルカリプロテアーゼK−14の等電点をロトフォア等
電点電気泳動法(バイオラッド社製)により測定した。
その結果、アルカリプロテアーゼK−14の等電点は1
0.0以上であった。
プロテアーゼの配合量は、アルカリプロテアーゼが活性
を示す量であれば特に制限されないが、洗浄剤組成物1
kg当たり0.1〜6,000P.U.、特に5〜400
P.U.が好ましい。
洗浄剤成分を配合することができ、当該公知の洗浄剤成
分としては、例えば次のものが挙げられる。
のアルキル基を有する直鎖アルキルベンゼンスルホン酸
塩、平均炭素数10〜20の直鎖又は分岐鎖のアルキル
基を有し、1分子内に平均0.5〜8モルのエチレンオ
キサイドを付加したアルキルエトキシ硫酸塩、平均炭素
数10〜20のアルキル基を有するアルキル硫酸塩、平
均10〜20の炭素原子を1分子中に有するオレフィン
スルホン酸塩、平均10〜20の炭素原子を1分子中に
有するアルカンスルホン酸塩、平均10〜20の炭素原
子を1分子中に有するα−スルホ脂肪酸メチルあるいは
エチルエステル塩、平均炭素数8〜20の高級脂肪酸
塩、平均炭素数10〜20の直鎖又は分岐鎖のアルキル
基を有し、1分子内に平均0.5〜8モルのエチレンオ
キサイドを付加したアルキルエーテルカルボン酸塩など
のアニオン性界面活性剤;平均炭素数10〜20のアル
キル基を有し、1〜20モルのエチレンオキシドを付加
したポリオキシエチレンアルキルエーテル、高級脂肪酸
アルカノールアミド又はそのアルキレンオキサイド付加
物などの非イオン性界面活性剤;その他ベタイン型両性
界面活性剤;スルホン酸型両性界面活性剤、リン酸エス
テル系界面活性剤、アミノ酸型界面活性剤、カチオン性
界面活性剤など。これらの界面活性剤は洗浄剤組成物中
5〜60重量%(以下単に%で示す)配合され、特に粉
体状洗浄剤組成物については10〜45%、液体洗浄剤
組成物については20〜55%配合することが好まし
い。また、本発明洗浄剤組成物が漂白剤である場合、界
面活性剤は一般に1〜10%、好ましくは1〜5%配合
される。
ン酸塩、ピロリン酸塩、オルソリン酸塩などの縮合リン
酸塩、ゼオライトなどのアルミノケイ酸塩、合成層状結
晶性ケイ酸塩、ニトリロ三酢酸塩、エチレンジアミン四
酢酸塩、クエン酸塩、イソクエン酸塩、ポリアセタール
カルボン酸塩など。この二価金属イオン捕捉剤は、0〜
50%、好ましくは5〜40%配合される。また、リン
を含有しない二価金属イオン捕捉剤を用いることがより
好ましい。
炭酸塩、セスキ炭酸塩、硫酸塩、アルカノールアミンな
ど。これらは0〜80%配合される。
ール、ポリアクリル酸塩、ポリアクリル酸コポリマー、
ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボ
キシメチルセルロースなど。再汚染防止剤は0〜10
%、好ましくは1〜5%配合される。
パーゼ、ヘミセルラーゼ、β−グリコシダーゼ、グルコ
ースオキシダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、上記
アルカリプロテアーゼ以外のプロテアーゼなどの酵素。
上記アルカリプロテアーゼは従来公知のアルカリプロテ
アーゼよりも、セルラーゼ、リパーゼ等の酵素との相性
が良好であり、これらの酵素を併用すれば洗浄力をいっ
そう向上させることができる。
元剤:有効塩素の捕捉剤として、硫酸アンモニウム、尿
素、塩酸グアニジン、炭酸グアニジン、スルファミン酸
グアニジン、二酸化チオ尿素、モノエタノールアミン、
ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、又グリシ
ン、グルタミン酸ナトリウム等で代表されるアミノ酸及
び牛血清アルブミン、カゼインなどの蛋白質、更には蛋
白質の加水分解、肉エキス、魚肉エキスなどが挙げられ
る。還元剤としては、チオ硫酸塩、亜硫酸塩、亜ニチオ
ン酸塩等のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩等及び
ロンガリットC等が挙げられる。
ホン化フタロシアニン亜鉛塩又はアルミニウム塩、過酸
化水素等。
蛍光染料。
ような可溶化剤を用いることができる。エタノールなど
の低級アルコール、ベンゼンスルホン酸塩、p−トルエ
ンスルホン酸塩などの低級アルキルベンゼンスルホン酸
塩、プロピレングリコールなどのポリオール類など。
ング防止剤、酵素の活性化剤、酸化防止剤、防腐剤、色
素、青味付け剤、漂白活性化剤等の洗剤に常用の成分を
必要に応じて配合することができる。
ロテアーゼ及び上記公知の洗浄成分を組み合せて常法に
従い、製造することができる。洗浄剤の形態は、用途に
応じて選択することができ、例えば液体、粉末、顆粒等
とすることができる。また、本発明洗浄剤組成物は、衣
料用洗浄剤、自動食器洗浄機用洗浄剤、配水管洗浄剤、
義歯洗浄剤、漂白剤等として使用することができる。
域において高活性を有し、且つアルカリ耐性、更に強い
ヒト角質ケラチン線維分解活性を有するプロテアーゼ、
例えばバチルス・エスピー(Bacillus s
p.)KSM−K16(FERMBP−3376)の生
菌の生産するアルカリプロテアーゼK−16、又はバチ
ルス・エスピー(Bacillus sp.)KSM−
K14(FERM BP−3670)の生菌の生産する
アルカリプロテアーゼK−14を含有し、蛋白質汚れに
対して優れた洗浄力を与えるものである。
的に説明するが、本発明はこれら実施例等により限定さ
れるものではない。尚、以下における%は特記しない限
り、重量%を示す。
に懸濁し、80℃にて20分間放置し熱処理した。熱処
理上清液0.1mlをケラチンハロー寒天培地へ接種し、
30℃で48時間静置培養した。用いたケラチンハロー
寒天培地の組成は以下に示す通りである。 グルコース 1% 酵母エキス 0.2% 獣毛ケラチン 1% カルボキシメチルセルロース 1% リン酸第一カリウム 0.1% 硫酸マグネシウム・7水塩 0.02% 寒天 1.5%
10%炭酸ナトリウムを1%添加し、最終pHを10.5
に調整後、平板培地を作製した。培養後、生育したコロ
ニーの周囲にハローを生じたものを選抜し、同培地で2
〜3回純化し、均一のプロテアーゼ生産菌を得た。
下に示す液体培地へ接種し、30℃で好気的に48時間
振盪培養を行った。 グルコース 2.0% ポリペプトンS 1.0% 酵母エキス 0.05% リン酸第一カリウム 0.1% 硫酸マグネシウム・7水塩 0.02% 炭酸ナトリウム(別滅菌) 1.0% pH 10.5 培養終了後、得られた培養物を遠心分離(3000rpm;
10分間)して菌を除去し、得られた培養上清を酵素液
とした。
結乾燥により粗酵素サンプルを調製し、市販液体洗剤中
における40℃での保存安定性評価を行った。そのなか
から、最も安定性に優れる酵素を生産するものの菌株と
してバチルス・エスピー KSM−K16株及びバチル
ス・エスピー KSM−K14株を得た。
・エスピー KSM−K16を以下の液体培地(3.0
l) に接種し、30℃で好気的に48時間振盪培養を行
い、アルカリプロテアーゼK−16を生産させた。 グルコース 2.0% 魚肉エキス 1.0% 大豆粉 1.0% 硫酸マグネシウム 0.02% リン酸第一カリウム 0.1% pH 10.0
遠心分離(10,000rpm;5分間)して菌を除去し、
その上清液を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末2gをイオン
交換水10mlに溶解(粗酵素液)した後、同溶液を透析
膜を用いて10mMトリス−塩酸緩衝液(2mM Ca2+添
加、pH7.5)に対して一晩透析し、26mlの透析処理
液(活性3.15P.U./ml、比活性1.97P.
U./mg蛋白)を得た。次に、10mMトリス−塩酸緩衝
液(2mM Ca2+添加、pH7.5)で平衡化したCM−5
2セルロース担体を充填したカラムにかけ、同緩衝液で
カラム内を洗浄した後、0〜0.15M塩化ナトリウム
を含む同緩衝液でアルカリプロテアーゼK−16を溶出
させた。この活性画分を集めたところ全量は15ml、活
性は1.12P.U./ml、比活性は5.75P.U.
/mg蛋白であった。そして、当溶液を50mMトリス−塩
酸緩衝液(10mM Ca2+、0.2M塩化ナトリウム添
加、pH8.0)に対して一晩透析した後、限外濾過(ア
ミコン社製、分画分子量5,000)により濃縮し、5
0mMトリス−塩酸緩衝液(10mM Ca2+、0.2M塩化
ナトリウム添加、pH8.0)で平衡化したセファデック
スG−50(ファルマシア社製)のゲル濾過クロマトグ
ラフィーにかけ同緩衝液にて展開させた。ここで得られ
た活性画分は全量11.5ml、活性は0.9P.U./
ml、比活性は6.03P.U./mg蛋白であった。当溶
液を、イオン交換水に対して一晩透析後、活性0.56
P.U./ml、比活性5.60P.U./mg蛋白の溶液
を得た。当溶液を凍結乾燥し、酵素粉末を得た。得られ
た酵素の比活性は1.87P.U./mgであり、ヒト角
質ケラチン線維分解活性は48KFU/APUであっ
た。
・エスピー KSM−K14を以下の液体培地(3.0
l) に接種し、30℃で好気的に48時間振盪培養を行
い、アルカリプロテアーゼK−14を生産させた。 グルコース 2.0% 魚肉エキス 1.0% 大豆粉 1.0% 硫酸マグネシウム 0.02% リン酸第一カリウム 0.1% pH 10.0 (2)培養終了後、得られた培養物から、参考例2と同
様の方法により、アルカリプロテアーゼK−14の精製
酵素粉末を得た。得られた酵素のヒト角質ケラチン線維
分解活性は50KFU/APUであった。
条件のもとに行った。 1)天然襟布汚染布:木綿金布(♯2023布)をワイ
シャツの襟に縫い付け、成年男子に3日間着用させる。
着用後25℃、65%RHに1ケ月放置後、汚れの程度
を三段階に分け、このうち最も汚れのひどいもののう
ち、中心点に対し汚れが対称な布を選び出し、この汚れ
の対称点で布を半裁し実験に供した。
する場合、9cm×30cmの天然汚染布を対称の位置で半
裁し、9cm×15cmの一対の汚染布の一方を基準洗剤で
ある酵素無添加洗剤で洗浄し、片方を比較洗剤である本
発明の洗剤でそれぞれ洗浄した。まず天然汚染布片15
枚を50cm×50cmの綿布に縫い付け、粉末洗剤の場合
には6l の0.417%の洗剤溶液に、この汚染布と綿
製肌着を合わせて1kg入れ、30℃で2時間浸漬後、東
芝製洗濯機「銀河」に移し、全量を30l とした後、強
反転で10分間洗浄し、乾燥後判定に供した。液体洗剤
の場合には20ccの洗剤液を汚染布に均一に塗付け、1
0分後、綿製肌着と合わせて1kgとし、東芝製洗濯機
「銀河」に移し、全量を30l とし、強反転にて10分
間洗浄し、乾燥後判定に供した。基準洗剤で洗った半裁
布と本発明の洗剤で洗った半裁布とを肉眼判定による一
対比較で評価した。汚れの程度を表わす10段階にラン
クづけした標準汚れを基準にし、洗浄布をランクづけし
た。洗浄性は基準洗剤の洗浄力を100としたときの本
発明の洗剤の洗浄力の点数で表わした。洗浄力指数の差
は0.5以上で有意の差とみなせる。
れたものを芒硝で200倍に稀釈して造粒したもの) (b)アルカリプロテアーゼK−14(参考例3で得ら
れたものを芒硝で200倍に稀釈して造粒したもの) (c)プロテアーゼ(ノボ・ノルディスク社,サビナー
ゼ4.0T) (d)プロテアーゼ( ギスト・ブロケイデス社,マクサ
カルP−400,000) (e)プロテアーゼ(昭和電工社,API−21H) (f)セルラーゼ(花王,微工研菌寄第1138号,5
00IU/g・造粒物) (g)セルラーゼ(ノボ・ノルディスク社,セルザイム
1.0T) (h)リパーゼ(ノボ・ノルディスク社,リポラーゼ1
00T)
製した。
表8に示す。尚、表中洗剤番号は、「実施例番号−使用
した酵素記号」で表示し、酵素を使用しないものは「実
施例番号−◎」と表示する。(以下、同様) 表8の結果より、本発明品は天然襟汚垢に対し、従来の
酵素を含有した洗剤に比べて優れた洗浄力を示すことが
わかる。
み合わせて用いて弱アルカリ性粉末洗剤を調製した。得
られた各種洗剤による洗浄試験の結果を表9に示す。表
9の結果より、アルカリプロテアーゼK−16とセルラ
ーゼ及び/又はリパーゼとを組み合わせて用いることに
より、天然襟汚垢に対して、相乗的な洗浄力の向上効果
が得られることがわかる。
調製した。
表11に示す。表11の結果より、本発明洗浄剤の効果
が各種ビルダーの使用下において有効に発現されること
がわかる。
調製した。
表13に示す。表13の結果より、本発明品は天然襟汚
垢に対し、従来の酵素を含有した洗剤に比べて優れた洗
浄力を示すことがわかる。
調製した。
表15に示す。表15の結果より、本発明品は天然襟汚
垢に対し、従来の酵素を含有した洗剤に比べて優れた洗
浄力を示すことがわかる。
調製した。
表17に示す。表17の結果より、本発明品は天然襟汚
垢に対し、従来の酵素を含有した洗剤に比べて優れた洗
浄力を示すことがわかる。
た。尚、洗剤原液のpHは9.6であった。
定性試験の結果を表19に示す。 1)使用した酵素 (i)アルカリプロテアーゼK−16(参考例2で得ら
れたものをグリセロール及び水で100倍に稀釈して溶
解したもの) (j)アルカリプロテアーゼK−14(参考例3で得ら
れたものをグリセロール及び水で100倍に稀釈して溶
解したもの) (k)プロテアーゼ(ノボ・ノルディスク社,エスペラ
ーゼ8.0L) (l)プロテアーゼ(ノボ・ノルディスク社,サビナー
ゼ8.0L)
及び20日間放置した後、以下の測定法により各酵素の
活性を測定し、次式により酵素活性残存率を算出した。
度2.5°DH)とし、自動分析機オートアナライザー
(登録商標、テクニコン社)を使用して、酵素活性を測
定した。測定の詳細は、下記文献に従った。 文献:Analyst,96〔2〕,p159〜163
(1971)
pHの影響を示す図面である。
すpHの影響を示す図面である。
温度の影響を示す図面である。
す温度の影響を示す図面である。
pHの影響を示す図面である。
すpHの影響を示す図面である。
温度の影響を示す図面である。
す温度の影響を示す図面である。
Claims (4)
- 【請求項1】 40KFU/APU以上のヒト角質ケラ
チン線維に対する分解活性を有するアルカリプロテアー
ゼを含有することを特徴とする洗浄剤組成物。 - 【請求項2】 アルカリプロテアーゼが、次の至適pH
及び至適温度を有するものである請求項1記載の洗浄剤
組成物。 (1)至適pH(カゼイン基質,40℃10分間反応) 10.0〜12.5 (2)至適温度(カゼイン基質,Ca2+イオン無添加
pH10.0で反応) 50〜60℃ - 【請求項3】 アルカリプロテアーゼが、バチルス エ
スピー(Bacillus sp.)KSM−K16
(FERM BP−3376)の生産するアルカリプロ
テアーゼK−16又はバチルス エスピー(Bacil
lus sp.)KSM−K14(FERM BP−3
670)の生産するアルカリプロテアーゼK−14であ
る請求項1又は2記載の洗浄剤組成物。 - 【請求項4】 バチルス エスピー(Bacillus
sp.)KSM−K16(FERM BP−337
6)の生産するアルカリプロテアーゼK−16又はバチ
ルス エスピー(Bacillus sp.)KSM−
K14(FERM BP−3670)の生産するアルカ
リプロテアーゼK−14を含有する洗浄剤組成物。
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