JPH04349882A

JPH04349882A - 新規アルカリプロテアーゼ及びその製造方法

Info

Publication number: JPH04349882A
Application number: JP3311791A
Authority: JP
Inventors: Jun Hitomi; 人見　潤; Shigehito Adachi; 足立　重仁; Yoshihiro Hakamata; 佳宏袴田; Mikio Takaiwa; 美喜雄高岩; Toru Kobayashi; 徹小林; Shuji Kawai; 川合　修次; Susumu Ito; 進伊藤
Original assignee: Kao Corp
Current assignee: Kao Corp
Priority date: 1991-01-17
Filing date: 1991-02-27
Publication date: 1992-12-04
Anticipated expiration: 2015-03-27

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は新規なアルカリプロテア
ーゼＫ−１６及びその製造方法に関し、更に詳細には界
面活性剤に対して極めて優れた安定性を有し、洗浄剤配
合酵素として有用なアルカリプロテアーゼＫ−１６及び
その製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】洗浄剤へのプロテアーゼの配合は以前よ
り行われており、現在多くのアルカリプロテアーゼが洗
剤用酵素として用いられている。その代表的なものとし
ては、アルカラーゼ、サビナーゼ、エスペラーゼ（ノヴ
ォ・インダストリー社製）等が挙げられるが、これらア
ルカリプロテアーゼの多くのものは、界面活性剤液中で
の安定性が悪いという問題があった。

【０００３】一方、界面活性剤に安定なものとしてＹａ
酵素（特開昭６１−２８０２７８　号公報）等が報告さ
れているが、これは活性領域が高温度側にあるため、一
般的に室温付近で洗浄を行う日本の洗濯様式には適合し
ないという問題があった。

【０００４】また、より低い温度領域において、従来の
プロテアーゼよりも活性発現力の強いプロテアーゼとし
てＡＰＩ−２１（特公昭６０−５５１１８号公報）が開
発されているが、これも界面活性剤液中での安定性は未
だ充分満足のいくものではなかった。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】従って、界面活性剤中
で高い安定性を有し、洗浄剤配合酵素として優れた機能
を有するアルカリプロテアーゼを新たに提供することが
望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】そこで本発明者らは、上
記課題を解決するため、広く日本の土壌よりアルカリプ
ロテアーゼ生産菌を得るべく、鋭意検索した。その結果
、栃木県芳賀郡の土壌より採取したバチルス属に属する
微生物が洗浄剤配合系において優れた安定性を有する新
規なアルカリプロテアーゼを生産することを見出し、本
発明を完成した。

【０００７】すなわち、本発明は新規なアルカリプロテ
アーゼＫ−１６及びその製造方法を提供するものである
。

【０００８】本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６を
産生する微生物はバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属に属
し、例えば以下に示すような菌学的性質を有するものが
挙げられる。

【０００９】（Ａ）形態的性質（ａ）細胞の形及び大きさ：桿菌　０．８〜１．０　μ
ｍ　×　２．２〜２５μｍ（ｂ）多形性：無し。（ｃ）運動性：周鞭毛を有し、運動性あり。（ｄ）胞子〔大きさ、形、位置〕：　１．０〜１．２　
μｍ　×１．４〜２．２　μｍ　、楕円形、中央準端、
胞子嚢の膨潤ややあり。（ｅ）グラム染色：陽性（ｆ）抗酸性：陰性（ｇ）肉汁寒天平板上での発育形態：円形、葉状、表面
円滑、淡黄色、半透明のコロニー。（ｈ）肉汁寒天斜面上での生育：不規則な葉状、表面少
しだけ粗な円滑、淡黄色、半透明のコロニー。（ｉ）肉汁液体培養：生育良好で混濁あり菌膜無し。（ｊ）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育良好で液化する。（ｋ）リトマスミルク：ペプトン化するが、ミルクの凝
固なし、リトマスの変化なし。

【００１０】（Ｂ）生理的性質（ａ）硝酸塩の還元：陽性（ｂ）脱膣反応：陰性（ｃ）ＭＲテスト：陰性（ｄ）ＶＰテスト：陽性（ｅ）インドール生成：陰性（ｆ）硫化水素生成：陰性（ｇ）澱粉加水分解：陽性（ｈ）クエン酸の利用：陽性（ｉ）無機窒素源の利用：硝酸塩を利用するが、アンモ
ニウム塩は利用しない。（ｊ）色素の生成：陰性（ｋ）ウレアーゼ：陰性（ｌ）オキシダーゼ：陽性（ｍ）カタラーゼ：陽性（ｎ）生育の温度範囲：５５℃以下（ｏ）生育のｐＨ範囲：ｐＨ　６．６〜１０．３で生育
可能。（ｐ）酸素に対する態度：好気的（ｑ）ＯＦテスト：酸化型（Ｏ型）（ｒ）塩化ナトリウムに対する耐性：１０％塩化ナトリ
ウム存在下で生育する。（ｓ）糖からの酸生成及びガス生成

【００１１】

【表１】

【００１２】以上の菌学的性質について「バージェーズ
　　マニュアル　　オブ　　システマティック　　バク
テリオロジー（Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｉｎｓ
社，１９８４年）」（Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ　Ｍａｎｕａｌ
　ｏｆ　Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏ
ｇｙ）　の記載に準じ検討したところ、本菌株は、バチ
ルス　　ズブチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｕｂｔｉｌ
ｉｓ）に属させることが妥当である。しかし、バチルス
　　ズブチルスがｐＨ１０の培地には全く生育しないの
に対し、本菌株はｐＨ１０でも良好に生育する。また、バチルス　　ズブチルスが５５℃では生育できな
いのに対し、本菌株は５５℃においても生育が可能であ
ること等の相違点が認められる。

【００１３】以上の結果から明らかなように、本菌株は
バチルス　　ズブチルスに属させることが妥当であるが
、いくつかの点においてこれと相違し、また他の公知の
菌株とも異なるので、本菌株をバチルス・エスピー（Ｂ
ａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｋ１６と命名し、工
業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第１１４１
８　号として寄託した。

【００１４】この菌株を用いて、界面活性剤に対して極
めて安定な本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６を生
産するには、当該菌体を適当な培地に接種し、常法に従
って培養すればよい。

【００１５】使用される培地としては、通常の微生物の
培養に用いられ本菌株に利用可能なものであれば何れを
も使用することができるが、該培地中には資化しうる炭
素源及び窒素源を適当量含有せしめておくことが好まし
い。

【００１６】この炭素源及び窒素源については特に制限
はないが、その例としては、窒素源としてはコーングル
テンミール、大豆粉、コーンスチープリカー、カザミノ
酸、酵母エキス、ファーマメディア、イワシミール、肉
エキス、ペプトン、ハイプロ、アジパワー、コーンミー
ル、ソイビーンミール、コーヒー粕、綿実油粕、カルチ
ベーター、アミフレックス及びアジプロン、ゼスト、ア
ジックス等が挙げられる。また、炭素源としては、資化
しうる炭素源、例えばアラビノース、キシロース、グル
コース、マンノース、フラクトース、ガラクトース、蔗
糖、麦芽糖、乳糖、ソルビトール、マンニトール、イノ
シトール、グリセリン、可溶性澱粉や廉価な廃糖蜜、転
化糖等、また資化しうる有機酸、例えば酢酸等が挙げら
れる。また、その他、リン酸、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｍ
ｎ２＋、Ｚｎ２＋、Ｃｏ２＋、Ｎａ＋　、Ｋ＋　等の無
機塩や、必要であれば、無機、有機微量栄養源を培地中
に適宜添加することもできる。

【００１７】斯くして得られた培養物中からの目的物質
であるアルカリプロテアーゼＫ−１６の採取及び精製は
、一般の酵素の採取及び精製の手段に準じて行うことが
出来る。

【００１８】すなわち、培養物を遠心分離、又は濾過等
することによって菌体を分離し、その菌体及び培養濾液
から通常の分離手段、例えば、塩析法、等電点沈澱法、
溶媒沈澱法（メタノール、エタノール、イソプロピルア
ルコール、アセトン等）によって蛋白質を沈澱させたり
、また、限外濾過（例えばダイアフローメンブレンＹＣ
、アミコン社製）により濃縮させて本発明のアルカリプ
ロテアーゼＫ−１６を得る。塩析法では、例えば硫安（
３０〜７０％飽和画分）、溶媒沈澱では、例えば７５％
エタノール中で酵素を沈澱させた後、濾過或いは遠心分
離、脱塩することによってこれを凍結乾燥粉末とするこ
とも可能である。ここで脱塩の方法としては、透析又は
、セファデックスＧ−２５等を用いるゲル濾過法等の一
般的方法が用いられる。

【００１９】このようにして得られる酵素液は、そのま
ま使用することもできるが、更に公知の方法により精製
結晶化して用いることも出来る。更に酵素を精製するに
は、例えばヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー等
の吸着クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ−セファデックス
、ＤＥＡＥ−セルロース、ＣＭ−セルロースやＣＭ−バ
イオゲル等のイオン交換クロマトグラフィー及びセファ
デックスやバイオゲルのような分子篩ゲルクロマトグラ
フィーを適宜組み合わせて分別精製すればよい。

【００２０】斯くして得られた本発明のアルカリプロテ
アーゼＫ−１６は、以下に示すような酵素学的性質を有
する。尚、以下において、酵素活性の測定は次の如くし
て行った。

【００２１】カゼイン１％を含む５０ｍＭホウ酸−Ｎａ
ＯＨ緩衝液（ｐＨ１０）１ｍｌを　０．１ｍｌの酵素溶
液と混合し、４０℃、１０分間反応させた後、反応停止
液（０．１２３Ｍトリクロロ酢酸−０．２４６Ｍ酢酸ナ
トリウム−　０．３６９Ｍ　酢酸）２ｍｌを加え、３０
℃、２０分間放置した。次に濾紙（ワットマン社製、Ｎ
ｏ．２）で濾過し、濾液中の蛋白分解物をフォーリン・
ローリー法の改良法によって測定した。

【００２２】また１Ｐ．Ｕ．は、上記反応条件下におい
て１分間に１ｍｍｏｌｅ　のチロシンを遊離する酵素量
とした。

【００２３】（１）作用高アルカリ性条件下で各種蛋白質に対して作用する。

【００２４】（２）基質特異性アルカリプロテアーゼＫ−１６の各種基質に対する特異
性を、他の市販プロテアーゼと比較した。用いた基質は
、カゼイン、尿素変性ヘモグロビン、獣毛ケラチン、エ
ラスチンでこれらに対する分解活性を測定した。５０ｍ
Ｍホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）に各基質を
１％（尿素変性ヘモグロビンは　２．２％）加え、各酵
素液　０．５×１０−４Ｐ．Ｕ．（エラスチンは　３．
５×１０−４Ｐ．Ｕ．）を添加し、４０℃、１０分間反
応を行った。各々の基質におけるアルカリプロテアーゼ
Ｋ−１６の活性を１００とした時の各酵素の活性を表２
に示す。

【００２５】

【表２】

【００２６】この結果からも明らかなように、本発明の
アルカリプロテアーゼＫ−１６は水可溶性及び水不溶性
の蛋白質を良好に分解し、現在洗剤用酵素として良く用
いられている市販酵素Ａ、市販酵素Ｂと比較して、特に
エラスチンに対して優れた作用を示す。

【００２７】（３）至適ｐＨ各種ｐＨ緩衝液（５０ｍＭ）中に最終濃度０．９１％と
なるようにカゼインを加え、アルカリプロテアーゼＫ−
１６を　５．２×１０−５Ｐ．Ｕ．加えて４０℃、１０
分間反応して活性を測定した。最適ｐＨでの活性を１０
０とし、各ｐＨでの活性を相対的に表した。結果を図１
に示す。図１からも明らかなように本発明アルカリプロ
テアーゼＫ−１６の至適ｐＨは１１．０〜１２．３であ
る。尚、使用した各種緩衝液、及びそのｐＨ範囲は次の
とおりである。酢酸緩衝液　　　　　　　　　　　　　　　　　　　ｐ
Ｈ３．９〜５．７リン酸緩衝液　　　　　　　　　　　
　　　　　　ｐＨ６．６〜８．３炭酸緩衝液　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　ｐＨ９．２〜１０．９リ
ン酸−ＮａＯＨ緩衝液　　　　　　　　　　　ｐＨ１０
．９〜１２．７ＫＣｌ−ＮａＯＨ緩衝液　　　　　　　
　　　　　　　ｐＨ１０．９　〜１２．６

【００２８】
（４）ｐＨ安定性（３）で用いたのと同じ緩衝液（２０ｍＭ）中に　７．
９×１０−３Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−１６
を加え、２５℃で４８時間放置した。この処理液を５０
ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で４０倍
に希釈後、活性を測定した。処理前の酵素活性を１００
％として各ｐＨでの相対活性を求めた。結果を図２に示
す。図２から明らかなように本発明アルカリプロテアー
ゼＫ−１６は、Ｃａ２＋非存在下ではその安定領域がｐ
Ｈ　６．０〜１２．０であり、２ｍＭ　Ｃａ２＋存在下
ではその安定域はｐＨ　５．０〜１２．０であった。

【００２９】（５）至適温度基質として０．９１％のカゼインを含む５０ｍＭホウ酸
−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）に３．１　×１０−
５Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−１６を加え、１
０分間各温度で反応を行った。４０℃での活性を１００
％として各温度での相対活性を求めた。結果は図３に示
す。図３からも明らかなように、本発明アルカリプロテ
アーゼＫ−１６の至適温度は、Ｃａ２＋非存在下では５
５℃であり、５ｍＭ　Ｃａ２＋存在下では７０℃であっ
た。

【００３０】（６）耐熱性２０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５　）に　
１．６×１０−３Ｐ．Ｕ．のアルカリプロテアーゼＫ−
１６を加え、各温度で１０分間熱処理し、氷冷後、５０
ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０）で５倍希
釈した。そして０．９１％カゼインを基質として活性を
測定した。未処理時の活性を１００％として各処理温度
での相対活性を求めた。結果を図４に示す。図４からも
明らかなように、Ｃａ２＋非存在下で５０℃、５ｍＭＣ
ａ２＋存在下では６０℃まで上記熱処理条件下で、９０
％以上の活性が維持された。

【００３１】（７）分子量アルカリプロテアーゼＫ−１６の分子量をドデシル硫酸
ナトリウム（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動法により調べた。分子量マーカーには低分子量用マー
カーキット（バイオラッド）すなわち、ホスホリラーゼ
ｂ（分子量：９７，４００）、牛血清アルブミン（分子
量：６６，２００）、卵白アルブミン（分子量：４２，
７００）、カルボニックアンヒドラーゼ（分子量：３１
，０００）、大豆トリプシンインヒビター（分子量：２
１，５００）、リゾチーム（分子量：１４，４００）を
用いた。この方法により本発明のアルカリプロテアーゼ
Ｋ−１６の分子量は２８，０００±１，０００　と決定
した。

【００３２】（８）等電点アルカリプロテアーゼＫ−１６の等電点を等電点電気泳
動法により調べた。カラム用の両性担体にはサーバライ
ト９−１１を用いた。この方法により本発明アルカリプ
ロテアーゼＫ−１６の等電点は１０．５以上であること
がわかった。

【００３３】（９）金属イオンの影響各種金属イオンについて、本発明のアルカリプロテアー
ゼＫ−１６に対して与える影響を調べた。まず、２０ｍ
Ｍホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ９．５　）に各種金属
塩を１ｍＭの濃度で添加し、そこに　３．９×１０−３
Ｐ．Ｕ．の酵素を加えて３０℃、２０分間放置した。そ
の後、５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ１０．０
）で５倍に希釈して残存活性を測定した。残存活性は、
金属塩無添加で同様に処理した酵素活性に対する相対値
で表した。結果を表３に示した。この結果から明らかな
ように、本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６は、Ｈ
ｇ２＋及びＣｕ２＋により活性が阻害されることがわか
る。また、前記（５）及び（６）の結果よりＣａ２＋に
より熱安定性が向上することがわかる。

【００３４】

【表３】

【００３５】（１０）阻害剤の影響一般的な酵素阻害剤について、本発明のアルカリプロテ
アーゼＫ−１６に対して与える影響を調べた。１０ｍＭ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．０　）に各種阻害剤を所定濃度
になるように加え、そこにアルカリプロテアーゼＫ−１
６　７．９×１０−３Ｐ．Ｕ．を添加し、３０℃で２０
分間放置した。その後、該処理液をイオン交換水にて２
０倍希釈し、残存活性を測定した。残存活性は、阻害剤
無添加で同様に処理した酵素活性に対する相対値で表し
た。結果を表４に示した。この結果から明らかなように
、本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６は、セリンプ
ロテアーゼの阻害剤であるジイソプロピルフルオロリン
酸（ＤＦＰ）、フェニルメタンスルホニルフルオリド（
ＰＭＳＦ）、キモスタチンで活性が阻害されることから
、活性中心にセリン残基を有するプロテアーゼであるこ
とがわかる。

【００３６】

【表４】

【００３７】（１１）界面活性剤の影響６．６　×１０
−２Ｐ．Ｕ．の酵素液を、所定濃度の各種界面活性剤を
溶かした５ｍｌの０．１Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ９
．０　、エタノールを１０％含む）に加え４０℃で４時
間放置し、その後５０ｍＭホウ酸−ＮａＯＨ緩衝液（ｐ
Ｈ１０．０）で２０倍希釈後、残存活性を測定した。処
理時間０分での活性を１００％とし残存活性を相対値で
表した。結果を表５に示した。この結果から明らかなよ
うに本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６は、各種界
面活性剤が高濃度（１〜１０％）存在しても高い安定性
を示すものであった。

【００３８】

【表５】

【００３９】

【発明の効果】上述の如く、本発明のアルカリプロテア
ーゼＫ−１６は不溶性蛋白質に対し優れた作用を示し、
広範な温度域で充分な活性を発揮するのに加え、界面活
性剤中で極めて高い安定性を有するため、洗浄剤の添加
用酵素として有用なものである。

【００４０】

【実施例】次に実施例を挙げて、本発明を更に詳しく説
明する。

【００４１】実施例１プロテアーゼ産生菌株の分離、採取：（１）土壌のサンプルの約１ｇを滅菌生理食塩水１０ｍ
ｌに懸濁し、８０℃にて２０分間放置し熱処理した。熱処理上清液　０．１ｍｌを
ケラチンハロー寒天培地へ接種し、３０℃で４８時間静
置培養した。用いたケラチンハロー寒天培地の組成は以
下に示す通りである。グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　１％酵母エキス　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．２％獣
毛ケラチン　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　１％カルボキシメチルセルロース　　　
　　　　　　　　　　１％リン酸第一カリウム　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１％硫酸マグ
ネシウム・７水塩　　　　　　　　　　　　　　　０．
０２％寒天　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　１．５％

【００４２】
（２）上記培地組成物に、別滅菌を施した１０％炭酸ナ
トリウムを１％添加し、最終ｐＨを１０．５に調整後、
平板培地を作製した。培養後、生育したコロニーの周囲
にハローを生じたものを選抜し、同培地で２〜３回純化
し、均一のプロテアーゼ生産菌を得た。

【００４３】（３）上記（２）で得たこれらの菌株を以
下に示す液体培地へ接種し、３０℃で好気的に４８時間
振盪培養を行った。グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２．０％ポリペプトンＳ　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０％酵
母エキス　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　０．０５％リン酸第一カリウム　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．１％硫酸マ
グネシウム・７水塩　　　　　　　　　　　　　　　０
．０２％炭酸ナトリウム（別滅菌）　　　　　　　　　
　　　　　　１．０％ｐＨ　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．５培
養終了後、得られた培養物を遠心分離（３０００ｒｐｍ
；１０分間）して菌を除去し、得られた培養上清を酵素
液とした。

【００４４】（４）上記（３）で得られた酵素液から凍
結乾燥により粗酵素サンプルを調製し、市販液体洗剤中
における４０℃での保存安定性評価を行った。そのなか
から、最も安定性に優れる酵素を生産するものの一菌株
としてバチルス・エスピー　　ＫＳＭ−Ｋ１６株を得た
。

【００４５】実施例２菌体の培養、アルカリプロテアーゼＫ−１６の精製：（
１）実施例１で得られた好アルカリ性細菌、バチルス・
エスピー　　ＫＳＭ−Ｋ１６を以下の液体培地（３．０
ｌ）　に接種し、３０℃で好気的に４８時間振盪培養を
行い、アルカリプロテアーゼＫ−１６を生産させた。グルコース　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　２．０％魚肉エキス　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１．０
％大豆粉　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　１．０％硫酸マグネシウム　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　０．０
２％リン酸第一カリウム　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　０．１％ｐＨ　　　　　　　　　　　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　１０．０

【００４６】（２）培養終了後、得られた培養物３ｌ　
を遠心分離（１０，０００ｒｐｍ；５分間）して菌を除
去し、その上清液を凍結乾燥した。凍結乾燥粉末２ｇを
イオン交換水１０ｍｌに溶解（粗酵素液）した後、同溶
液を透析膜を用いて１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（２ｍ
Ｍ　Ｃａ２＋添加、ｐＨ７．５　）に対して一晩透析し
、２６ｍｌの透析処理液（活性３．１５Ｐ．Ｕ．／ｍｌ
、比活性１．９７Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白）を得た。次に、
１０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（２ｍＭ　Ｃａ２＋添加、
ｐＨ７．５　）で平衡化したＣＭ−５２セルロース担体
を充填したカラムにかけ、同緩衝液でカラム内を洗浄し
た後、０〜０．１５Ｍ　塩化ナトリウムを含む同緩衝液
でアルカリプロテアーゼＫ−１６を溶出させた。この活
性画分を集めたところ全量は１５ｍｌ、活性は１．１２
Ｐ．Ｕ．／ｍｌ、比活性は５．７５Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白
であった。そして、当溶液を５０ｍＭトリス−塩酸緩衝
液（１０ｍＭＣａ２＋、０．２Ｍ塩化ナトリウム添加、
ｐＨ８．０　）に対して一晩透析した後、限外濾過（ア
ミコン社製、分画分子量　５，０００）により濃縮し、
５０ｍＭトリス−塩酸緩衝液（１０ｍＭ　Ｃａ２＋、０
．２Ｍ塩化ナトリウム添加、ｐＨ８．０　）で平衡化し
たセファデックスＧ−５０（ファルマシア社製）のゲル
濾過クロマトグラフィーにかけ同緩衝液にて展開させた
。ここで得られた活性画分は全量１１．５ｍｌ、活性は
　０．９Ｐ．Ｕ．／ｍｌ、比活性は６．０３Ｐ．Ｕ．／
ｍｇ蛋白であった。当溶液を、イオン交換水に対して一
晩透析後、活性０．５６Ｐ．Ｕ．／ｍｌ、比活性５．６
０Ｐ．Ｕ．／ｍｇ蛋白の溶液を得た。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６の活性
に及ぼすｐＨの影響を示す図面である。

【図２】本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６の安定
性に及ぼすｐＨの影響を示す図面である。

【図３】本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６の活性
に及ぼす温度の影響を示す図面である。

【図４】本発明のアルカリプロテアーゼＫ−１６の安定
性に及ぼす温度の影響を示す図面である。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】　　下記の酵素学的性質を有するアルカリ
プロテアーゼＫ−１６。（１）作用高アルカリ性条件下で各種蛋白質に対して作用する。（２）基質特異性カゼイン、牛血清アルブミン等の水可溶性蛋白質ならび
にケラチン、ヘモグロビン、エラスチン等の水不溶性蛋
白質に対して良好な活性を有する。（３）至適ｐＨカゼインを基質とし、４０℃にて１０分間反応を行った
場合、至適ｐＨは１１．０〜１２．３である。（４）ｐＨ安定性カゼインを基質とし、２５℃で処理した場合、Ｃａ２＋
存在下、ｐＨ　５．０〜１２．０の範囲で極めて安定で
ある。（５）至適温度カゼインを基質とし、ｐＨ１０．０で反応を行った場合
、至適温度は５５℃である。（６）耐熱性ｐＨ　９．５、５０℃にて１０分間熱処理した場合、９
０％以上の残存活性を有する。（７）分子量２８，０００±１，０００　（ドデシル硫酸ナトリウム
（ＳＤＳ）−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による
）（８）等電点１０．５以上（等電点電気泳動法による）（９）金属イ
オンの影響カゼインを基質とした場合、Ｈｇ２＋及びＣｕ２＋で活
性が阻害される。また、Ｃａ２＋で熱安定性が増大する
。（１０）阻害剤の影響エチレンジアミン四酢酸、ｐ−クロロマーキュリー安息
香酸、アンチパインで活性が阻害されない。ジイソプロ
ピルフルオロリン酸、フェニルメタンスルホニルフルオ
リド、キモスタチンによって活性が阻害される。（１１）界面活性剤の影響直鎖アルキルベンゼンスルホン酸ナトリウム、ポリオキ
シエチレンアルキル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナト
リウム、α−オレフィンスルホン酸ナトリウム、アルカ
ンスルホン酸ナトリウム、α−スルホ脂肪酸エステル等
の界面活性剤が高濃度に存在しても、酵素は極めて安定
である。
【請求項２】　　バチルス属に属し、アルカリプロテア
ーゼＫ−１６を生産する微生物を培養し、得られた培養
物より該酵素を採取することを特徴とする請求項１記載
のアルカリプロテアーゼＫ−１６の製造方法。
【請求項３】　　バチルス属に属し、アルカリプロテア
ーゼＫ−１６を生産する微生物がバチルス・エスピー（
Ｂａｃｉｌｌｕｓ　ｓｐ．）ＫＳＭ−Ｋ１６である請求
項２記載のアルカリプロテアーゼＫ−１６の製造方法。