JP4905351B2 - プロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法 - Google Patents
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Description
トランスグルタミナーゼ製剤のタンパク質含有素材に対する効果がロット間でばらつきがある主な理由は、トランスグルタミナーゼ含有物のトランスグルタミナーゼ活性のばらつきに起因するものと考えられてきたが、トランスグルタミナーゼ活性を制御してもなお品質にばらつきが残り、事業上の大きな課題であった。
トランスグルタミナーゼはタンパク質分子を架橋重合する機能を有するのに対し、プロテアーゼはタンパク質を分解する機能を有している。プロテアーゼは、トランスグルタミナーゼのタンパク質に対する機能とは逆の機能を有しているため、トランスグルタミナーゼ含有物中にプロテアーゼが夾雑することは、トランスグルタミナーゼ含有物及びそれを原料として配合したトランスグルタミナーゼ製剤として好ましくないと考えられる。しかしながら、トランスグルタミナーゼ活性を損なうことなく、含まれているプロテアーゼ活性のみを選択的に失活又は除去する効率的な方法は知られていない。
そのためトランスグルタミナーゼ製剤の品質を確保するためには、試作試験によってプロテアーゼ活性の低いトランスグルタミナーゼ含有物を選定することや、混在しているプロテアーゼ活性に応じて、トランスグルタミナーゼ含有物の配合率を高くするなどの対策が必要であった。これらの対策は、人的および原材料のコスト上昇を招き、トランスグルタミナーゼ製剤の製造コストを大きく押し上げていた。
このためトランスグルタミナーゼ活性を損なうことなく、トランスグルタミナーゼ含有物に含まれているプロテアーゼ活性のみを選択的に失活させる技術が切望されていた。
一般に、トランスグルタミナーゼ含有物中のプロテアーゼ活性を制御する方法としては、トランスグルタミナーゼ含有物中のプロテアーゼの活性を選択的に失活させるか、トランスグルタミナーゼ含有物から選択的に除去する処理を施すことが考えられる。特に、インヒビターやその他の化学的処理により、プロテアーゼを働かないようにするのが基本的な回避策である。
特定の酵素である耐塩性グルタミナーゼに関して、プロテアーゼ活性を選択的に失活させる方法として、pH9.8、37℃、16時間処理することによりプロテアーゼ、α―アミラーゼ等の夾雜酵素活性を除く方法が知られている(特許文献1)。
しかしながら、当該酵素は、アルカリ性で極めて安定であることが知られていたのに対し、トランスグルタミナーゼにおいて同様のアルカリ処理をすることによって、トランスグルタミナーゼ活性を損なうことなく、含まれるプロテアーゼ活性のみを選択的に失活できるかどうかは知られていなかった。
また、プロテアーゼ活性の低減方法に関連するものとしては、ラクターゼ中のプロテアーゼをγ線照射によって失活させる方法が知られている(特許文献2)。しかし、この放射線処理がトランスグルタミナーゼ含有物中のプロテアーゼ活性の選択的な失活手段として適用できるかどうか、また、この処理によるトランスグルタミナーゼのプロテアーゼ活性低下程度がタンパク質含有素材への効果と密接に相関するかどうかは不明であるし、放射線を使用する処理手段である点でも商業的な価値は低い。
本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテアーゼ活性が低減されたトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテアーゼ活性が低減されたトランスグルタミナーゼ含有物を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテアーゼ活性が低減されたトランスグルタミナーゼ含有物を配合した、トランスグルタミナーゼ製剤を提供することを目的とするものである。
また、本発明は、上記処理方法に従って得られるプロテアーゼ活性が低減されたトランスグルタミナーゼ含有物を配合した、トランスグルタミナーゼ製剤を用いた食品の製造方法を提供することを目的とするものである。
なお、本発明において特に限定のない限り、TGはトランスグルタミナーゼの略語を意味する。
本発明は、以下の各発明を包含する。
(1)プロテアーゼが夾雑するトランスグルタミナーゼ含有物を温度0℃以上50℃未満、pH9.0より高くpH13.0未満で、10分以上60時間以下保持して処理することからなるプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
(2)前記保持が、トランスグルタミナーゼ含有物におけるプロテアーゼ活性/トランスグルタミナーゼ活性を0.00024以下となるまで保持することからなる(1)項記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
(3)前記保持が、発酵法によるトランスグルタミナーゼ含有物の製造工程において、発酵液からトランスグルタミナーゼ含有物を単離する工程においてなされることからなる(1)項又は(2)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
(4)(1)項〜(3)項のいずれか1項に記載の製造方法によって製造されたプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物。
(5)(4)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物と副剤からなるトランスグルタミナーゼ製剤。
(6)(4)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とタンパク質含有素材からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
(7)(4)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とコラーゲン及び/又は乳蛋白からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
(8)(4)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材、カルシウム塩類、アルカリ性塩類、賦形剤から選ばれる少なくとも一つの副剤からなる水産練製品用トランスグルタミナーゼ製剤。
(9)(4)項〜(7)項のいずれか1項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を用いた、接着成型食品の製造方法。
(10)(4)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と、コラーゲン及び/又は乳蛋白とを混合した溶液を、食品原材料に添加することからなる接着成型食品の製造方法。
(11)(4)項、(5)項、(8)項のいずれか1項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を魚肉すり身に添加することからなる水産練製品の製造方法。
(12)プロテアーゼが夾雑するトランスグルタミナーゼ含有物を温度5〜50℃、pH9.5〜13.0で10分〜60時間保持して処理することからなるプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
(13)前記保持が、トランスグルタミナーゼ含有物におけるプロテアーゼ活性/トランスグルタミナーゼ活性を0.00024以下となるまで保持することからなる(12)項記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
(14)前記保持が、発酵法によるトランスグルタミナーゼ含有物の製造工程において、発酵液からトランスグルタミナーゼ含有物を単離する工程においてなされることからなる(12)項又は(13)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
(15)(12)項〜(14)項のいずれか1項に記載の製造方法によって製造されたプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物。
(16)(15)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物からなるトランスグルタミナーゼ製剤。
(17)(15)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とコラーゲン及び/又は乳蛋白からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
(18)(16)項又は(17)項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を魚肉すり身に添加することからなる魚肉すり身製品の製造方法。
(19)(16)項又は(17)項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を畜肉及び/又は家禽肉のひき肉に添加することからなるひき肉製品の製造方法。
(20)(16)項又は(17)項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を植物蛋白に添加することからなる植物蛋白含有食品の製造方法。
(21)(16)項又は(17)項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を魚卵蛋白に添加することからなる魚卵製品の製造方法。
(22)(16)項又は(17)項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を鶏卵製品に添加することからなる鶏卵食品の製造方法。
(23)(16)項又は(17)項に記載のトランスグルタミナーゼ製剤を、タンパク質含有素材の接着剤として用いることからなる接着成型食品の製造方法。
(24)(15)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と、コラーゲン及び/又は乳蛋白とを混合した溶液を、タンパク質含有素材に添加することからなる接着成型食品の製造方法。
(25)(15)項に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と異種蛋白を混合してなるピックル液を食肉単身品に添加することからなる食肉単身品の製造方法。
本発明の処理方法を適用することによって得られるトランスグルタミナーゼ含有物は、そのプロテアーゼ活性が極めて低い水準に低減されており、製剤の品質を確保するための、試作試験によるトランスグルタミナーゼ含有物の選別や、配合率を高めに設定するなどの対策を行う必要がなく、高品質のトランスグルタミナーゼ含有物及びトランスグルタミナーゼ製剤を低コストで製造することが可能となる。
図2は、特定処理pHにおいて処理時間を変化させた場合の試料液のトランスグルタミナーゼ活性とプロテアーゼ活性の相対活性を示す図である。
図3は、特定処理pHにおいて処理温度を変化させた場合の試料液のトランスグルタミナーゼ活性とプロテアーゼ活性の相対活性を示す図である。
図4は、特定処理pHにおいて高いプロテアーゼ活性を有するトランスグルタミナーゼ含有物を処理したときと、処理しないときの接着力比較を示す図である。
図5は、特定処理pHにおいて高いプロテアーゼ活性を有するトランスグルタミナーゼ含有物をpH11で保持したときと、保持しないときの蒲鉾物性値の比較を示す図である。
トランスグルタミナーゼ含有物中にプロテアーゼが夾雑することは知られていたが、トランスグルタミナーゼ活性を損なうことなく、含まれているプロテアーゼ活性のみを選択的に失活させることは困難であった。
本発明者らは、トランスグルタミナーゼ含有物中に夾雑するプロテアーゼ活性の低減方法について鋭意検討した結果、前記処理方法を開発し、この処理方法で製造したプロテアーゼ活性の低減されたトランスグルタミナーゼ含有物を使用することにより、高品質なトランスグルタミナーゼ製剤を低コストで製造することを可能ならしめたものである。
本発明におけるプロテアーゼとは、タンパク質を分解する酵素であり、その由来は、トランスグルタミナーゼ含有物を製造する際に、原料から移行するプロテアーゼか、もしくは微生物が分泌するプロテアーゼである。
本発明におけるトランスグルタミナーゼとは、アシル基転移反応を触媒するトランスフェラーゼの一種である。
本発明に用いるトランスグルタミナーゼとしては、組織由来、微生物由来の双方ともに利用できるが、微生物由来トランスグルタミナーゼは安価に入手できる点で好ましい。また、本発明に用いるトランスグルタミナーゼはCa依存性及びCa非依存性のどちらでも使用できるが、Ca非依存性トランスグルタミナーゼの方が、その効果が添加対象におけるCa濃度に依存しない点で好ましい。
本発明におけるトランスグルタミナーゼ含有物とは、トランスグルタミナーゼを含む生体組織もしくは微生物の培養液から得られ、必要に応じて濾過や精製工程を経た液体、またはそれらを乾燥させた粉末を指す。トランスグルタミナーゼ活性を一定に揃えたり、その酵素活性を安定化させるために、賦形剤や安定化剤が混合されることもある。
また、本発明におけるトランスグルタミナーゼ製剤とは、トランスグルタミナーゼ含有物と、目的に応じて選択された副剤とを混合したものを指す。
ここで、副剤としては、タンパク質含有素材、塩類、糖類、賦形剤等が用いられる。
トランスグルタミナーゼ含有物又はトランスグルタミナーゼ製剤の添加対象である、本発明におけるタンパク質含有素材とは、トランスグルタミナーゼの基質となるグルタミン残基を含むタンパク質を含む素材であり、可食、不可食を問わない。可食性のタンパク質含有素材としては、その由来は植物性タンパク質、動物性タンパク質、微生物タンパク質、藻類タンパク質、などが挙げられ、植物性タンパク質としては、大豆たん白、小麦たん白、えんどう豆たん白などが、動物性タンパク質としては、畜肉、家禽肉、魚肉、鶏卵、乳及びこれらの単離精製物、魚卵、血漿たん白、ゼラチン、コラーゲンなどが挙げられる。
塩類としては、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム、焼成カルシウム、リン酸3ナトリウム、炭酸ナトリウム等が使いやすい。糖類としては、糖類、澱粉、デキストリン、糖アルコール類などを使用することができる。賦形剤としては、前記の糖類が使用され、特に味への影響が小さいデキストリン、澱粉、乳糖などを使用するのが好ましい。
本発明において、トランスグルタミナーゼ含有物の処理条件は、pH9.0より高くpH13.0未満の領域が好ましく、pH9.5以上pH12.5以下がより好ましく、さらに好ましくはpH10.5以上pH12.5以下である。また、pH9.5〜13の領域であってもよい。処理時の温度条件及び処理時間は、トランスグルタミナーゼが失活しない温度及び処理時間であれば特に制限はなく、一般的には0℃以上50℃未満、好ましくは10℃以上40℃以下の温度、10分以上60時間以下、好ましくは10分以上18時間以下の処理時間が採用される。また、0℃〜50℃、好ましくは15℃〜40℃の温度であってもよい。
本発明において、前記トランスグルタミナーゼ含有物の処理は、プロテアーゼ活性/トランスグルタミナーゼ活性の比を0.00024以下とする処理が好ましく、さらに好ましくは0.00017以下とする処理である。経験的にみて、実用的な最低限の接着強度が50g、更に好ましくは100gとされており、上記活性比は、上記接着強度に対応する。
また、前記処理は、発酵法によるトランスグルタミナーゼ含有物の製造工程における、発酵液からトランスグルタミナーゼを単離する工程における処理として行うことができる。また、一度粉末化したトランスグルタミナーゼ含有物を再度溶媒に溶解した溶液を処理しても、同様の効果が得られる。さらには、トランスグルタミナーゼ含有物と目的に応じて選択された副剤(タンパク質含有素材、塩類、糖類、賦形剤等)とが混合された溶液を処理しても同様の効果が得られる。
本発明でいう接着用トランスグルタミナーゼ製剤とは、トランスグルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材を粉粉混合したもの、もしくは両者を別々に包装してセットとして供給できるようにしたものを指す。前者は粉末のまま、もしくは水を加えて水溶液として被接着物にまぶすか、塗布するか、被接着物と混合して用いられ、後者は両者を直前に粉粉混合して前者と同様に用いるか、水にトランスグルタミナーゼ含有物とタンパク質含有素材を投入して溶解し、これを被接着物に塗布するか、被接着物と混合して用いられる。また、流通に耐え得る十分な保存安定性が得られるのであれば、製剤の形態は粉末に限らず、液体製剤として供給することもできる。
接着製剤において配合されるタンパク質含有素材の由来としては、前述のタンパク質含有素材から選択することができる。特にカゼインを主体とする乳たん白、水溶性が高いゼラチン、フィブリンを主体とする血漿たん白は接着製剤の副剤として優れている。ゼラチンの中では、魚ゼラチンが特に望ましい。ゼラチンを副剤とする接着用トランスグルタミナーゼ製剤は、接着力が非常に高い反面、プロテアーゼの影響を比較的受けやすいため、本発明の適用によりその品質は格段に向上する。
本発明でいう水産練製品用トランスグルタミナーゼ製剤とは、トランスグルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材、カルシウム塩、アルカリ性塩類、賦形剤から選ばれる少なくとも一つの副剤とを使用することを特徴とする製剤をさす。
カルシウム塩としては、カルシウムを含む塩であればよく、乳酸カルシウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、焼成カルシウム、卵殻カルシウム、貝カルシウムなどが挙げられる。アルカリ性塩類としては、魚肉すり身のpHを上昇させうるものであればよく、リン酸3ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、焼成カルシウムなどが使いやすい。水産練製品用トランスグルタミナーゼ製剤に配合されるタンパク質含有素材としては、カゼインナトリウム、カゼインカリウム、大豆蛋白、小麦蛋白などが挙げられる。賦形剤としては、糖類、澱粉、デキストリン、糖アルコール類などを使用することができ、特に味への影響が小さいデキストリン、澱粉、乳糖などを使用するのが好ましい。
本発明のトランスグルタミナーゼ含有物またはトランスグルタミナーゼ製剤は、接着成型食品や水産練製品に使用することができ、魚肉すり身、畜肉や家禽肉のひき肉、ゼラチン、植物蛋白、魚卵、鶏卵製品等に添加することができる。また、トランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と異種蛋白を混合してなるピックル液を食肉単身品に添加することによって食肉単身品の製造に使用することができる。
本発明でいう接着成型食品とは、食品原材料を接着してなる食品を指す。ここでいう食品原材料とは、牛肉、豚肉、馬肉、羊肉、山羊肉、家禽肉、鶏肉などいわゆる食肉ばかりでなく、各種魚肉、貝類、エビ、カニなどの甲殻類、イカ、タコなどの軟体動物、いくら、スジコ、タラコ、カズノコなどの魚卵類なども利用できる。また、野菜、果実などもこの食品原材料に含まれる。もちろん、これ以外の原料も使用可能であり、また2種類以上の原材料を組み合わせて使用してもかまわない。
本発明においては、プロテアーゼ活性の単位を以下のとおり定義する。
「1分間に1mgのウシ血清アルブミン(BSA)に相当する非たん白性のLowry試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を1ユニット(1U)とする。」
なお、プロテアーゼ活性は、測定条件によって変化するため、同一の測定条件によって測定された値のみ直接比較することができる。
本発明におけるトランスグルタミナーゼの活性単位は、次のように測定され、かつ、定義される。すなわち「温度37℃でpH6.0のトリス緩衝液中、ベンジルオキシカルボニル−L−グルタミルグリシン及びヒドロキシルアミンを基質とする反応系でTGaseを作用せしめ、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体を形成させた後、525nmにおける吸光度を測定し、ヒドロキサム酸量を検量線により求め、1分間に1μモルのヒドロキサム酸を生成せしめる酵素量を1ユニット(1U)とする。」(日本特許公開公報−昭64−27471号参照)。
実施例1
(トランスグルタミナーゼの処理方法)
試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバTG」、味の素(株)社製〕1gを蒸留水20gに溶解した水溶液0.4gを、pH3,4,5,6,7,8,9,10,11,12に調製した0.1M GTA buffer 1.6gに混合した。各水溶液を20℃、30分保持したものを試料液とした。
(トランスグルタミナーゼ活性測定)
上述の条件にて調製した試料液にpH6.0 Tris−HCl bufferを加えて、試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバTG」、味の素(株)社製〕として0.2%になるように希釈した。その後、37℃でベンジルオキシカルボニル−L−グルタミルグリシン及びヒドロキシルアミンを基質とする反応系で、トランスグルタミナーゼ含有物を作用せしめ、生成したヒドロキサム酸をトリクロロ酢酸存在下で鉄錯体にする。次に、反応系の525nmにおける吸光度を測定し、生成したヒドロキサム酸量を検量線により求める。そして、1分間に1μモルのヒドロキサム酸を生成せしめる酵素量をトランスグルタミナーゼの活性単位、即ち1ユニット(1U)とする。
(プロテアーゼ活性測定)
上述の条件にて調製した試料液に、2%KCl、1%Triton X−100、50mM りん酸緩衝液(pH6.0)を加え、試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバTG」、味の素(株)社製〕として0.5%になるように希釈した。スターラーで60分間攪拌した後、遠心分離(3000rpm,10分間、20℃)し、その上澄を孔径0.45μmのシリンジフィルターでろ過する(用時調製)。
ジメチルカゼイン〔SIGMA C9801、Casein,N,N−dimethylated from bovine milk〕2.5gを正確に量りとり50mMリン酸緩衝液(pH6.0)100mlを加え、常温で約30分以上攪拌して溶解する(用時調製)。
アルカリ性銅試液 2%Na2CO3 in 0.1M NaOH:2%酒石酸ナトリウム溶液:1%硫酸銅5水和物 を50:1:1で混合する。(用時調製)
2倍希釈フェノール試液(和光純薬製フェノール試薬)と蒸留水を体積比1:1で混合する。(用時調製)
サンプル:ジメチルカゼイン溶液を5℃±0.5℃に設定した恒温槽中(温度を標準温度計で確認する)で冷却しておく。試験管に試料溶液0.4mLを量り取り、恒温槽中で約10分間以上静置した後、ジメチルカゼイン溶液2mLを加え、直ちに振り混ぜ、5℃±0.5℃で正確に24時間静置する。反応停止時間に、順次5%トリクロロ酢酸を2ml加えて直ちに攪拌し、室温中に出す。37℃±0.5℃に設定した恒温槽中に入れて30〜45分間静置し、遠心分離(3000rpm,10分間20℃)し、孔径0.45μmのシリンジフィルターでろ過し、ろ液を回収する。
ブランク:ジメチルカゼイン溶液2mLを試験管に加えて5℃±0.5℃で24時間静置する。5%トリクロロ酢酸を2ml加えて直ちに攪拌し、室温中に出す。各試料溶液0.4mLを加えて、直ちに攪拌する。37℃±0.5℃に設定した恒温槽中に入れて30〜45分間静置し、遠心分離(3000rpm、10分間、20℃)し、孔径0.45μmのシリンジフィルターでろ過し、ろ液を回収する。
試験管にろ液0.4mLを量り取り、アルカリ性銅試液2mLを加えて振り混ぜ、室温で10分間放置する。次に、水で2倍に希釈したフェノール試薬(和光純薬製)0.2mLを加えて直ちに攪拌する。続いて、37℃±0.5℃に設定した恒温槽中に入れて30分間静置後、室温中で放冷する。この液につき、水を対照とし、波長700nmにおける吸光度(サンプルの吸光度をA1、ブランクの吸光度をA2とする)を測定する。
市販の標準用精製ウシ血清アルブミン(BSA)溶液(Bio−Rad Protein Assay Standard II 濃度既知)に対し、蒸留水による2倍希釈(1→2)を繰り返し、2倍、4倍、8倍希釈溶液を調製する(例:BSA溶液の濃度が1.2mg/mlの場合、希釈溶液の濃度はそれぞれ 0.6, 0.3, 0.15mg/mlとなる)。試験管に希釈したBSA溶液0.4mLを量り取り、アルカリ性銅試液2mLを加えて振り混ぜ、室温で10分間放置する。次に、水で2倍に希釈したフェノール試薬0.2mLを加えて直ちに攪拌する。続いて、37℃±0.5℃に設定した恒温槽中に入れて30分間静置後、室温中で放冷する。この液につき、水を対照とし、波長700nmにおける吸光度(S1)を測定する。別に、BSA溶液の代わりに蒸留水を用い、同様に操作して、吸光度(S0)を測定する。各標準蛋白質溶液の濃度、及び各S1からS0を差し引いた吸光度差を用い、Microsoft社製ソフト「Excel」により散布図を作成し、多項式近似・次数2として近似曲線を作成し、数式を求める。A1及びA2の吸光度からS0を差し引いた値を数式に代入して、それぞれの蛋白質濃度(PA1,PA2)を算出する。
1分間に1mgのウシ血清アルブミン(BSA)に相当する非たん白性のLowry試液呈色物質の増加をもたらす酵素量を1単位(1U)とし、次式により算出する。
プロテアーゼ活性(U/g)=(PA1−PA2)×4.4÷0.4÷T×V÷W
上記式中、
PA1 酵素反応溶液の蛋白質濃度(mgBSA/ml)
PA2 ブランクの蛋白質濃度(mgBSA/ml)
4.4÷0.4 反応停止後の総液量への換算係数
T 反応時間(分)
V 粉末試料溶解体積(ml)
W 粉末試料採取量(g)
を表す。
各条件で処理した試料液のトランスグルタミナーゼ活性とプロテアーゼ活性について、pH処理を行わなかった活性値を100%としたときの相対活性を図1にまとめた。
pH3〜9までは、トランスグルタミナーゼ相対活性値とプロテアーゼ相対活性値(pH処理する前のトランスグルタミナーゼ活性を100%としたときの相対活性)は、ほぼ同等であり、すなわち当該pH領域で保持してもトランスグルタミナーゼ活性を低下させずに、プロテアーゼ活性を低減させることはできないことが明らかとなった(図1)。一方pH9より高い条件にて保持した場合、トランスグルタミナーゼ相対活性値よりプロテアーゼ相対活性値の方が、低くなることが明らかとなった。さらには、pH13以上になるとトランスグルタミナーゼ活性は急激に低下することも確認された。以上より、pH9.0より高くpH13.0未満の条件で、トランスグルタミナーゼ溶液を保持することにより、トランスグルタミナーゼ活性を低減させずに、プロテアーゼ活性を低減することができ、より高品質のトランスグルタミナーゼを製造可能であることが確認された。
実施例2
(トランスグルタミナーゼの処理方法)
試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバTG」、味の素(株)社製〕1gを蒸留水20gに溶解した水溶液0.4gを、pH9,10,11,12に調製した0.1M GTA buffer1.6gに混合した。各水溶液を20℃、30分〜6時間保持したものを試料液とした。
(トランスグルタミナーゼ活性測定方法)
実施例1記載の方法に準じ、測定した。
(プロテアーゼ活性測定方法)
実施例1記載の方法に準じ、測定した。
実施例1の結果と同様に、pH9で6時間保持してもトランスグルタミナーゼ相対活性値とプロテアーゼ相対活性値に差は認められなかったのに対し、pH9より高い条件で保持した場合では、トランスグルタミナーゼ相対活性値よりプロテアーゼ相対活性値の方が低いことが確認された(図2)。さらには、pH11以上で30分以上処理することにより、トランスグルタミナーゼ相対活性を80%以上に保ったまま、プロテアーゼ相対活性を20%以下に低減することが可能であることが確認された。さらに、pH12以上30分以上処理することにより、トランスグルタミナーゼ相対活性を80%以上に保ったまま、プロテアーゼ相対活性を10%以下に低減することが可能であることが認められた。
実施例3
(トランスグルタミナーゼの処理方法)
試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバTG」、味の素(株)社製〕1gを蒸留水20gに溶解した水溶液0.4gを、pH11に調製した0.1M GTA buffer1.6gに混合した。調製した水溶液を10、20、30、40、50℃で30分保持したものを試料液とした。
(トランスグルタミナーゼ活性測定方法)
実施例1記載の方法に準じ、測定した。
(プロテアーゼ活性測定方法)
実施例1記載の方法に準じ、測定した。
各温度帯でトランスグルタミナーゼ水溶液を保持することにより、プロテアーゼ活性を低下させることができることが確認された(図3)。ただし、50℃で保持した場合には、トランスグルタミナーゼ活性の低下も顕著であることから、50℃未満で保持条件により、トランスグルタミナーゼ活性を維持したまま、プロテアーゼ活性を低減させることができることが確認された。
実施例4
プロテアーゼ活性/トランスグルタミナーゼ活性が0.00024より大きい試料トランスグルタミナーゼ〔商品名「アクティバTG」、味の素(株)社製〕0.18g、魚コラーゲン〔Kenny&Ross Ltd.製〕1.2gを、水12gに溶解し、トランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液とした。
調製したトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液を豚もも肉の小片(約2cm角)300gを添加し混合後、無水リン酸3ナトリウム0.3g添加し、さらに混合し折り幅75mmのケーシングチューブに詰めた。
別試験区として、上述のとおり調製したトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン溶液に無水リン酸3ナトリウム0.3gを添加混合し、pH11の水溶液を調製した。このpH11水溶液にて25℃で、30分および2時間保持した後、それぞれの水溶液を豚もも肉の小片(約2cm角)300gへ添加し、混合後折り幅75mmのケーシングチューブに詰めた。
上述のとおりケーシングチューブに詰めたトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液と豚もも肉混合物を5℃2時間放置し、トランスグルタミナーゼ反応を進行させた。放置後、−40℃の冷凍庫に入れ、評価するまで冷凍保存した。冷凍したトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液と豚もも肉混合物を厚さ9mm、幅2.5cmにスライスし、解凍後、Stable Micro Systems社製テクスチャーアナライザーで引っ張り試験により接着強度を測定した。
実用的な最低限の接着強度は経験的に50g/cm2とされている。結果より、pH11で処理を行わなかったトランスグルタミナーゼ魚コラーゲン水溶液を使用した場合の接着強度は実用的な最低限の接着強度50g/cm2以下であった(図4)。一方、同じ試料トランスグルタミナーゼを用いpH11水溶液で30分、2時間処理した場合、実用強度50g/cm2以上の接着強度が得られることが確認された。実用強度が得られなかった試料トランスグルタミナーゼ中のプロテアーゼ活性が、pH11水溶液で保持することで、トランスグルタミナーゼ活性を低下させることなく低減され、実用強度が得られたと考えられる。
実施例5
プロテアーゼ活性/トランスグルタミナーゼ活性が0.00024より大きい試料トランスグルタミナーゼ(高プロテアーゼTG)と、0.00024以下の試料トランスグルタミナーゼ(低プロテアーゼTG)〔商品名「アクティバTG」、味の素(株)社製〕それぞれ0.336gを1%食塩水40mlに添加溶解させた。トランスグルタミナーゼ水溶液に、1%リン酸三ナトリウム水溶液5mlを添加しpH11に調製し、25℃30分、保持した。その後0.4%フマル酸水溶液5mlを添加しpH7に中和したものをpH11処理トランスグルタミナーゼ含有物とした。一方、1%リン酸三ナトリウム水溶液5mlと0.4%フマル酸水溶液5mlをあらかじめ混合した水溶液をトランスグルタミナーゼ水溶液に添加混合したものをコントロールとし、以上処理を行ったトランスグルタミナーゼ含有物を用いて、下記に示す手順に従い蒲鉾を試作した。
フレークにした冷凍すり身(すけそうだら、FA級)1000gをステファンカッターで、温度が−2〜0℃になるまでカッティングする。食塩30gを添加し、氷水350gを加え、ステファンカッターで温度が7〜8℃になるまでカッティングする。グラニュー糖20g、馬鈴薯澱粉40g、氷水350g、水産練製品用製剤2gを加え、温度が7〜8℃になるまでカッティングする。得られた生地を、直径30mmの筒状の塩化ビニリデン製ケーシングに詰め、40℃の蒸気中で30分、続いて85℃の蒸気中で20分加熱し、氷水に浸して冷却する。
テクスチャーアナライザーを用い、破断試験を行う。円柱形の蒲鉾を高さ30mmに切断し、直径5mmの球形のプランジャーを蒲鉾の断面中央に対して1mm/秒の速さで突刺し、破断した時点の応力(破断応力)を測定する。蒲鉾の破断応力と、試料トランスグルタミナーゼ原末の各条件のプロテアーゼ活性について、Microsoft社製ソフト「Excel」を用いて相関係数を求める。
経験的に蒲鉾の破断強度を比較する場合、強度の差が5%以上あれば食感上の差異が認められる。結果を図5に示す。図5より低プロテアーゼTGの蒲鉾破断応力を100%(511.0g)としたときの高プロテアーゼTG蒲鉾破断応力は90.8%(464.2g)であり、食感上の差異が認められる。
一方、高プロテアーゼTGをpH11で30分保持した場合には、蒲鉾破断応力は99.6%(509.1g)となり、食感上差異が認められない強度になることが確認された。高プロテアーゼ活性のトランスグルタミナーゼ含有物を、pH11水溶液で保持することで、トランスグルタミナーゼ活性を低下させることなくプロテアーゼ活性が低減され、低プロテアーゼ活性のトランスグルタミナーゼ含有物と同等の効果が得られたと考えられる。
本出願は日本国で出願された特許出願番号2005−248771を基礎としており、その内容は本明細書中に全て包含されるものである。
Claims (11)
- ストレプトバーチシリウム・モバラエンス由来のプロテアーゼが夾雑するストレプトバーチシリウム・モバラエンス由来のトランスグルタミナーゼ含有物を温度0℃以上50℃未満、pH9.0より高くpH13.0未満で、10分以上60時間以下保持することからなるプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
- 前記保持が、トランスグルタミナーゼ含有物におけるプロテアーゼ活性/トランスグルタミナーゼ活性を0.00024以下となるまで保持することからなる請求項1記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
- 前記保持が、発酵法によるトランスグルタミナーゼ含有物の製造工程において、発酵液からトランスグルタミナーゼ含有物を単離する工程においてなされることからなる請求項1又は2に記載のトランスグルタミナーゼ含有物の製造方法。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の製造方法によって製造されたプロテアーゼ活性が低減されているトランスグルタミナーゼ含有物。
- 請求項4に記載のトランスグルタミナーゼ含有物と副剤からなるトランスグルタミナーゼ製剤。
- 請求項4に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とタンパク質含有素材からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
- 請求項4に記載のトランスグルタミナーゼ含有物とコラーゲン及び/又は乳蛋白からなる接着用トランスグルタミナーゼ製剤。
- 請求項4に記載のトランスグルタミナーゼ含有物と、タンパク質含有素材、カルシウム塩類、アルカリ性塩類、賦形剤から選ばれる少なくとも一つの副剤からなる水産練製品用トランスグルタミナーゼ製剤。
- 請求項4に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を用いた、接着成型食品の製造方法。
- 請求項4に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を水溶液とし、この水溶液と、コラーゲン及び/又は乳蛋白とを混合した溶液を、食品原材料に添加することからなる接着成型食品の製造方法。
- 請求項4に記載のトランスグルタミナーゼ含有物を魚肉すり身に添加することからなる水産練製品の製造方法。
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