CN101248176B - 制备蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供降低含转谷氨酰胺酶制品中作为杂质存在的蛋白酶而又不降低转谷氨酰胺酶的活性的处理方法;通过处理制备蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品的方法,所述方法包括将其中存在蛋白酶的含转谷氨酰胺酶制品在pH大于9.0但小于13.0、温度0℃或以上但小于50℃下保持10分钟或以上但不超过60小时的处理步骤;通过这一处理方法获得的含转谷氨酰胺酶制品;其中掺入了这一含转谷氨酰胺酶制品的转谷氨酰胺酶制剂;和通过加入这一转谷氨酰胺酶制剂来制备食物的方法。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品及其制备方法。更具体的说,本发明涉及降低在含转谷氨酰胺酶制品中作为杂质存在的蛋白酶的活性的方法。本发明还涉及由蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品及另外的成分所组成的转谷氨酰胺酶制剂,并涉及应用转谷氨酰胺酶制剂制备食物的方法。
技术背景
转谷氨酰胺酶这种酶物质已知能修饰含蛋白质材料的物理特性。它直接被添加到含蛋白质材料中以修饰其物理特性,或者将它与含蛋白质材料特别是明胶和乳蛋白质溶液混合,作为粘结组合物应用于各种物质中。但是,用现有的含转谷氨酰胺酶制品特别是源自微生物的含转谷氨酰胺酶制品制备的转谷氨酰胺酶制剂,和其它的酶制剂一样各批次之间质量相差很大。
各批次转谷氨酰胺酶制剂间在含蛋白质材料中的有效性的差异,其主要原因据认为在于含转谷氨酰胺酶制品中的转谷氨酰胺酶活性的差异。但是,即使对转谷氨酰胺酶活性进行控制,质量上的差异仍会存在,这构成一个重大的操作问题。
与起到使蛋白质分子发生交联和聚合的作用的转谷氨酰胺酶相反的是,蛋白酶起到降解蛋白质的作用。由于蛋白酶对蛋白质作用的方式与转谷氨酰胺酶相反,蛋白酶在含转谷氨酰胺酶制品中作为杂质而存在,这被认为在含转谷氨酰胺酶制品和其中这种制品作为原料掺合的转谷氨酰胺酶制剂中是不合需要的。但是,目前尚未知有方法能选择性地和有效地仅灭活或清除蛋白酶活性而又不减少转谷氨酰胺酶活性。
因此,为保持转谷氨酰胺酶制剂的质量需要采用这样的对策,即通过测试和增加含转谷氨酰胺酶制品相对于所存在的蛋白酶活性的掺合比例,来选出低蛋白酶活性的含转谷氨酰胺酶制品。这些对策造成人工成本和原料成本增加,从而大大抬高了制备转谷氨酰胺酶制剂的成本。
因此,需要有一种能选择性地仅灭活含转谷氨酰胺酶制品中存在的蛋白酶而又不损及转谷氨酰胺酶活性的技术。
通常,控制含转谷氨酰胺酶制品中的蛋白酶的活性的各种方法都包括处理,所述处理能选择性地灭活含转谷氨酰胺酶制品中的蛋白酶或者选择性地将蛋白酶从含转谷氨酰胺酶制品中清除。具体的说,通过化学处理如用抑制剂使蛋白酶停止发挥作用,是解决这个问题的基本手段。
已知在37℃、pH9.8下处理16小时能消除蛋白酶和α-淀粉酶之类的杂质的酶活性(专利文献1),这是一种选择性地灭活蛋白酶而又不影响耐盐谷氨酰胺酶形式的特定酶的方法。
但是,与这种已知对碱性极其稳定的酶(谷氨酰胺酶)不同的是,之前不知道转谷氨酰胺酶进行相同的碱处理是否也能选择性地仅灭活所含的蛋白酶而又不损及转谷氨酰胺酶活性。
此外,通过γ射线辐照灭活乳糖酶中所含的蛋白酶的方法,已知能降低蛋白酶活性(专利文献2)。但是,仍不清楚这种辐照处理是否可作为一种选择性地灭活含转谷氨酰胺酶制品中的蛋白酶的手段加以应用。也不清楚用这种处理所实现的蛋白酶活性下降与转谷氨酰胺酶对含蛋白质材料的作用效果的相关程度如何。此外,辐照处理的使用具有极低的商业价值。
专利文献1
日本专利申请公开说明书第H11-42086号。
专利文献2
日本专利申请公开说明书第S51-76459号。
发明公开内容
本发明的一个目标是提供一种能够降低含转谷氨酰胺酶制品中存在的蛋白酶而又不降低转谷氨酰胺酶活性的处理方法。
本发明的另一个目标是提供一种制备其中蛋白酶活性已用上述处理方法降低的含转谷氨酰胺酶制品的方法。
本发明的又一个目标是提供一种其中蛋白酶活性已用上述处理方法降低的含转谷氨酰胺酶制品。
本发明的又一个目标是提供一种当中掺合有蛋白酶活性已用上述处理方法降低的含转谷氨酰胺酶制品的转谷氨酰胺酶制剂。
本发明的又一个目标是提供一种应用这样的转谷氨酰胺酶制剂来制备食物的方法,所述转谷氨酰胺酶制剂当中掺合有蛋白酶活性已用上述处理方法降低的含转谷氨酰胺酶制品。
“TG”应被用作本发明转谷氨酰胺酶的缩写,除非另有具体规定。
本发明涵盖以下具体发明方案。
(1)一种通过处理制备蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品的方法,所述处理包括将其中蛋白酶作为杂质存在的含转谷氨酰胺酶制品在pH大于9.0但小于13.0、温度0℃或以上但小于50℃下保持10分钟或以上但不超过60小时。
(2)一种根据(1)的制备含转谷氨酰胺酶制品的方法,其中所述处理继续进行至含转谷氨酰胺酶制品中的蛋白酶活性/转谷氨酰胺酶活性之比达到0.00024或以下。
(3)一种根据(1)或(2)的制备含转谷氨酰胺酶制品的方法,其中所述处理在发酵制备含转谷氨酰胺酶制品的过程中的从发酵液分离含转谷氨酰胺酶制品的步骤中进行。
(4)由根据(1)-(3)中任一项的制备方法制备的蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品。
(5)包含根据(4)的含转谷氨酰胺酶制品和另外的成分的转谷氨酰胺酶制剂。
(6)包含根据(4)的含转谷氨酰胺酶制品和含蛋白质材料的粘结用转谷氨酰胺酶制剂。
(7)包含根据(4)的含转谷氨酰胺酶制品和胶原和/或乳蛋白质的粘结用转谷氨酰胺酶制剂。
(8)包含根据(4)的含转谷氨酰胺酶制品和至少一种选自含蛋白质材料、钙盐、碱金属盐和赋形剂的另外成分的鱼糜(Surimi)制品用转谷氨酰胺酶制剂。
(9)一种采用根据(4)-(7)中任一项的含转谷氨酰胺酶制品制备重构(restructured)食物制品的方法。
(10)一种制备重构食物制品的方法,所述方法包括:制备根据(4)的含转谷氨酰胺酶制品的水溶液,将此水溶液与胶原和/或乳蛋白质混合成溶液,并将这一溶液加入到含蛋白质材料中。
(11)一种制备鱼糜制品的方法,所述方法包括将根据(4)、(5)或(8)中任一项的转谷氨酰胺酶制剂加入到磨碎的鱼肉中。
(12)一种通过处理制备蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品的方法,所述处理包括将其中蛋白酶作为杂质存在的含转谷氨酰胺酶制品在pH9.5-13.0、温度5-50℃下保持10分钟至60小时。
(13)一种根据(12)的制备含转谷氨酰胺酶制品的方法,其中所述处理继续进行至含转谷氨酰胺酶制品中的蛋白酶活性/转谷氨酰胺酶活性之比达到0.00024或以下。
(14)一种根据(12)或(13)的制备含转谷氨酰胺酶制品的方法,其中所述处理在发酵制备含转谷氨酰胺酶制品的过程中的从发酵液分离含转谷氨酰胺酶制品的步骤中进行。
(15)由根据(12)-(14)中任一项的制备方法制备的蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品。
(16)包含根据(15)的含转谷氨酰胺酶制品的转谷氨酰胺酶制剂。
(17)包含根据(15)的含转谷氨酰胺酶制品和胶原和/或乳蛋白质的粘结用转谷氨酰胺酶制剂。
(18)一种制备磨碎鱼肉制品的方法,所述方法包括将根据(16)或(17)的转谷氨酰胺酶制剂加入到磨碎的鱼肉中。
(19)一种制备磨碎鱼肉制品的方法,所述方法包括将根据(16)或(17)的转谷氨酰胺酶制剂加入到磨碎的牲畜肉和/或家禽肉中。
(20)一种制备含植物蛋白质的食物的方法,所述方法包括将根据(16)或(17)的转谷氨酰胺酶制剂加入到植物蛋白质中。
(21)一种制备鱼卵制品的方法,所述方法包括将根据(16)或(17)的转谷氨酰胺酶制剂加入到鱼卵蛋白质中。
(22)一种制备基于鸡蛋的食物的方法,所述方法包括将根据(16)或(17)的转谷氨酰胺酶制剂加入到鸡蛋制品中。
(23)一种制备重构食物制品的方法,所述方法包括将根据(16)或(17)的转谷氨酰胺酶制剂加入到含蛋白质材料中。
(24)一种制备重构食物制品的方法,所述方法包括:制备根据(15)的含转谷氨酰胺酶制品的水溶液,将此水溶液与胶原和/或乳蛋白质混合成溶液,并将这一溶液加入到含蛋白质材料中。
(25)一种制备纯肉制品(stand-alone meat product)的方法,所述方法包括:制备根据(15)的含转谷氨酰胺酶制品的水溶液,将此水溶液与异源蛋白质(heterogeneous protein)混合成浸制溶液(picklingsolution),并将这一浸制溶液加入到纯肉制品中。
应用本发明的处理方法获得的含转谷氨酰胺酶制品的蛋白酶活性降低到极低的水平。因此,没有必要采取诸如用试生产试验筛选含转谷氨酰胺酶制品或者增加掺合比例的对策,来确保制剂的质量。可以廉价地制备高质量的含转谷氨酰胺酶制品和转谷氨酰胺酶制剂。
附图简述
图1,该图显示当改变样品溶液的处理pH时样品溶液中的转谷氨酰胺酶和蛋白酶的相对活性。
图2,该系列图显示当在规定的处理pH下改变处理时间时样品溶液中的转谷氨酰胺酶和蛋白酶的相对活性。
图3,该图显示当在规定的处理pH下改变处理温度时样品溶液中的转谷氨酰胺酶和蛋白酶的相对活性。
图4,该图比较了当具有高蛋白酶活性的含转谷氨酰胺酶制品在规定的处理pH下进行处理时和当没有进行这种处理时的粘结强度。
图5,该图比较了当具有高蛋白酶活性的含转谷氨酰胺酶制品在pH11的规定处理pH下进行处理时和当没有进行这种处理时的鱼糜制品特性。
实施本发明的最佳方式
下文说明本发明的实施方式。
尽管已知蛋白酶在含转谷氨酰胺酶制品中作为杂质存在,但难以选择性地仅灭活所含的蛋白酶而又不损及转谷氨酰胺酶的活性。
本发明人深入研究了降低作为杂质存在于含转谷氨酰胺酶制品的蛋白酶的活性的方法,从而开发出上述处理方法。用本发明处理方法制备的蛋白酶活性低的含转谷氨酰胺酶制品,可用来廉价地制备高质量转谷氨酰胺酶制剂。
在本发明中,术语“蛋白酶”指由于在制备含转谷氨酰胺酶制品的过程中从原料移来而存在的或者通过微生物分泌而存在的酶降解蛋白质。
在本发明中,术语“转谷氨酰胺酶”指一类能催化酰基转移反应的转移酶。
本发明所采用的转谷氨酰胺酶可源自组织或来自微生物。但是,微生物转谷氨酰胺酶因其成本低而比较可取。本发明所采用的转谷氨酰胺酶可以是钙依赖性转谷氨酰胺酶或钙不依赖性转谷氨酰胺酶。从其作用不依赖于其所加到的材料的钙浓度这个角度来看,钙不依赖性转谷氨酰胺酶比较可取。
在本发明中,术语“含转谷氨酰胺酶制品”指这样的液体或通过干燥这样的液体获得的粉末,该液体从含有转谷氨酰胺酶的有机组织或微生物培养液获得,然后按需进行过滤或纯化步骤。可混合入赋形剂和稳定剂,以使转谷氨酰胺酶活性均匀或使酶活性稳定。
在本发明中,术语“转谷氨酰胺酶制剂”指含转谷氨酰胺酶制品和一种或多种根据目标进行选择的另外成分的混合物。本文中,术语“另外(的)成分”指含蛋白质材料、盐、糖、赋形剂等。
在本发明中,含转谷氨酰胺酶制品或转谷氨酰胺酶制剂加到其中的“含蛋白质材料”,是含有充当转谷氨酰胺酶的底物的、包含谷氨酰胺残基的蛋白质的材料,它可以是可食用的或不可食用的。可食用的含蛋白质材料的实例有源自植物蛋白质、动物蛋白质、微生物蛋白质和藻类蛋白质的材料。植物蛋白质的实例有大豆蛋白质、小麦蛋白质和豌豆蛋白质。动物蛋白质的实例有牲畜肉、禽肉、鱼肉、鸡蛋、奶及其分离的纯化产物、鱼卵、血浆蛋白质、明胶和胶原。
乳酸钙、碳酸钙、煅烧钙、磷酸三钠、碳酸钠等是容易应用的盐。适合使用的糖的实例包括食糖、淀粉、糊精和糖醇。上述糖可用作赋形剂。特别合宜的是对风味影响极低的糊精、淀粉、乳糖等。
在本发明中,含转谷氨酰胺酶制品宜在以下pH范围的条件下进行处理:大于pH9.0但小于pH13.0,优选pH9.5或以上和pH12.5或以下,更优选pH10.5或以上和pH12.5或以下。这个范围也可以是pH9.5-13。对处理过程中的温度和处理时间没有具体限定,只要转谷氨酰胺酶不被失活即可。通常,所采用的温度为0℃或以上和低于50℃,优选10℃或以上和40℃或以下,处理时间为10分钟或以上和60小时或以下,优选10分钟或以上和18小时或以下。温度0-50℃、优选15-40℃也可接受。
在本发明中,含转谷氨酰胺酶制品宜处理至蛋白酶活性/转谷氨酰胺酶活性之比为0.00024或以下,优选0.00017或以下。最小实用粘结强度凭经验认为是50g,优选100g;上述活性比分别对应于这两个粘结强度。
上述处理可作为发酵制备含转谷氨酰胺酶制品的过程中的从发酵液分离转谷氨酰胺酶的步骤来进行。对将已被粉碎的含转谷氨酰胺酶制品溶解于溶剂中所获得的溶液进行处理,也能获得相同的效果。此外,对将含转谷氨酰胺酶制品与根据目的选择的另外成分(含蛋白质材料、盐、糖、赋形剂等)混合所获得的溶液进行处理,亦能获得相同的效果。
在本发明中,术语“粘结用转谷氨酰胺酶制剂”指含转谷氨酰胺酶制品和含蛋白质制品的混合粉末,或者以这两者分别盛在分开的包装中的形式提供的套组(set)。混合粉末可以原样使用,或者可加水以获得水溶液,然后喷洒或涂抹在要粘结的对象上或者与要粘结的对象混合来使用。当作为套组来提供时,可将两种粉末在临用前进行混合,并按与混合粉末相同的方式来应用,或者可将含转谷氨酰胺酶制品和含蛋白质材料溶于水中,并将溶液涂布在要粘结的对象上或与之混合。制剂的形式并不限于粉末形式,液体制剂也可采用,只要达到这个程度——即足够进行制品搬运和分销的储存稳定性得以实现即可。
掺合到用于粘结应用的制剂中的含蛋白质材料可在上述含蛋白质材料当中选择。主要由酪蛋白组成的乳蛋白质、高度水溶性明胶和主要由血纤蛋白组成的血浆蛋白质,都是良好的另外成分。明胶当中尤其合宜的是鱼明胶。含有明胶形式的另外成分的粘结用转谷氨酰胺酶制剂,能提供极佳的粘结强度。但是,明胶趋向于相对较易受蛋白酶的影响。因此,本发明的实施能提供明显的质量改进。
在本发明中,术语“鱼糜制品用转谷氨酰胺酶制剂”指具有如下特征的制剂,即它包含有含转谷氨酰胺酶制品和至少一种选自含蛋白质材料、钙盐、碱金属盐和赋形剂的另外成分。
钙盐可以是任何含钙的盐,如乳酸钙、碳酸钙、磷酸氢钙、煅烧钙、蛋壳钙和海贝壳钙。任何能提高磨碎鱼肉的pH的碱金属盐都可采用,容易采用的碱金属盐的实例有磷酸三钠、碳酸钠、碳酸氢钠和钙化碳酸盐。掺合到鱼糜制品用转谷氨酰胺酶制剂中的含蛋白质材料的实例有酪蛋白酸钠、酪蛋白酸钾、大豆蛋白质和小麦蛋白质。可以采用食糖、淀粉、糊精、糖醇等形式的赋形剂。糊精、淀粉、乳糖等,对口味的影响小,因此特别适合。
本发明的含转谷氨酰胺酶制品和转谷氨酰胺酶制剂可应用于重构食物制品和鱼糜制品中。可将它们加入到磨碎鱼肉、磨碎的牲畜肉和家禽肉、明胶、植物蛋白质、鱼卵、鸡蛋制品等当中。也可将含转谷氨酰胺酶制品制备成水溶液,将该水溶液与异源蛋白质混合获得浸制溶液,并将该浸制溶液加入到纯肉制品中用于制备纯肉制品。
在本发明中,术语“重构食物制品”指通过将各食物原料进行粘结获得的食物。本文中的术语“食物原料”不仅指肉类如牛肉、猪肉、马肉、绵羊肉、山羊肉、家禽肉和鸡肉,还指各种鱼;贝;虾、蟹和其它甲壳类动物;鱿鱼、章鱼和其它软体动物;以及鱼子酱、鲑鱼卵、鳕鱼卵、鲱鱼卵和其它鱼卵。食物原料还包括蔬菜、水果等。也可采用上述原料之外的原料,亦可将两种或多种原料组合使用。
在本发明中,术语“蛋白酶活性的单位”定义如下:一单位(1U)是一分钟时间内使非蛋白质Lowry试液中的有色物质增加的数量相当于1mg牛血清白蛋白(BSA)所需的酶量。由于蛋白酶活性随测量条件而变,只有在完全相同的测量条件下测得的数值才能直接进行比较。
本发明中的转谷氨酰胺酶的活性单位如下测量和定义:使TG在反应系统中与苄基羰基-L-谷氨酰甘氨酸和羟胺形式的底物在pH6.0tris缓冲液中于37℃下反应;所产生的异羟肟酸用来在三氯乙酸的存在下形成铁络合物;在525nm处测量吸光度;从校准曲线获得异羟肟酸的量;每分钟产生1μmole异羟肟酸所需的酶量定义为一单位(1U)(参见日本专利申请公开说明书第S64-27471号)。
实施方案
下文通过实施方案对本发明作详细的描述。但是,本发明不以任何方式受限于这些实施方案。
实施方案1
(处理转谷氨酰胺酶的方法)
将1 g的样品转谷氨酰胺酶(产品名称:Activa TG,日本味之素公司制备)溶于20g的蒸馏水中,将0.4g的此水溶液混合到1.6g的已调节至pH3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的0.1M GTA缓冲液中。每个水溶液在20℃下保持30分钟,获得各样品溶液。
(转谷氨酰胺酶活性的测量)
将pH6.0 Tris-HCl缓冲液加入到在上述条件下制备的各样品溶液中,将它们稀释成0.2%样品转谷氨酰胺酶(产品名称:Activa TG,日本味之素公司制备)。随后,使含转谷氨酰胺酶制品在反应系统中与苄基羰基-L-谷氨酰甘氨酸和羟胺形式的底物在37℃下反应。所产生的异羟肟酸在三氯乙酸的存在下转化成铁络合物。接着,在525nm处测量反应系统的吸光度,从校准曲线获得异羟肟酸的量。将每分钟产生1μmole异羟肟酸所需的酶量当作活性单位,即一单位(1U)。(蛋白酶活性的测量)
将2%KCl、1%Triton X-100和50mM磷酸缓冲液(pH 6.0)加入到如上所述制备的各样品溶液中,将它们稀释成0.5%样品转谷氨酰胺酶(产品名称:Activa TG,日本味之素公司制备)。用搅拌器将混合物搅拌60分钟,离心(3,000rpm,10分钟,20℃)。使上清液通过0.45μm注射过滤器(使用时制备)。
精确称取2.5g的二甲基酪蛋白(Sigma C9801,N,N-二甲基化酪蛋白,源自牛乳),加入100mL的50mM磷酸盐缓冲液(pH6.0),将混合物在常温下搅拌30分钟或以上使其溶解(使用时制备)。
碱性铜(alkli copper)试液:将2%Na2CO3(于0.1M NaOH中)、2%酒石酸钠溶液和1%五水硫酸铜按50∶1∶1比例混合(使用时制备)。
将二倍稀释的苯酚试液(Wako Junyaku生产的苯酚试剂)和蒸馏水按1∶1体积比混合(使用时制备)。
样品:先将二甲基酪蛋白溶液在设定至5℃±0.5℃(温度用标准温度计确认)的恒温容器中冷却。量取0.4mL的样品溶液,装入试管中。将试管在恒温容器中放置约10分钟或以上,然后加入2mL的二甲基酪蛋白溶液。立即通过振摇将混合物搅拌,然后在精确至5℃±0.5℃下静置24小时。当反应已经结束时,加入2mL的5%三氯乙酸,立即搅拌混合物。使混合物回复到室温。将混合物放入设定至37℃±0.5℃的恒温容器中,静置30-45分钟,离心(3,000rpm,10分钟,20℃),通过0.45μm注射过滤器。回收滤液。
空白:将2mL的二甲基酪蛋白溶液装入试管中,在5℃±0.5℃下静置24小时。加入2mL的5%三氯乙酸。立即搅拌混合物,回复到室温。加入0.4mL的每个样品溶液,立即搅拌混合物。将混合物放入设定至37℃±0.5℃的恒温容器中,静置30-45分钟,离心(3,000rpm,10分钟,20℃),通过0.45μm注射过滤器。回收滤液。
量取0.4mL的滤液,装入试管中,加入2mL的碱性铜试液。将混合物振摇混合,然后在室温下静置10分钟。接着,加入0.2mL的已用水稀释二倍的苯酚试剂(Wako Junyaku生产),立即搅拌混合物。接着,将混合物放入设定至37℃±0.5℃的恒温容器中,静置30分钟,然后冷却至室温。以水为对照,在700nm波长处测量样品的吸光度(样品的吸光度以A1表示,空白的吸光度以A2表示)。
用蒸馏水将市售的标准的纯化牛血清白蛋白(BSA)溶液(Bio-RadProtein Assay Standard II,已知浓度)反复进行二倍(1→2)稀释,以制备二倍、四倍和八倍稀释的溶液(例如当BSA溶液的浓度为1.2mg/mL时,稀释溶液的浓度为0.6、0.3、0.15mg/mL)。量取0.4mL的稀释BSA溶液,装入试管中,加入2mL的碱性铜试液,搅拌混合各成分,混合物在室温下静置10分钟。接着,加入0.2mL的用水稀释二倍的苯酚试剂,立即搅拌混合物。将混合物放入设定至37℃±0.5℃的恒温容器中,静置30分钟,然后冷却至室温。以水为对照,在700nm波长处测量此溶液的吸光度(S1)。另外,用蒸馏水代替BSA溶液进行相同的操作,测量吸光度(S0)。利用各个标准蛋白质溶液的浓度和S1减去S0所得的吸光度差值,用Microsoft软件应用程序Excel制作散点图,按二次多项式近似制作近似曲线,并获得数学方程。将吸光度A1和A2减去S0所得的数值代入方程中,计算出蛋白质浓度(PA1、PA2)。
一分钟时间内使非蛋白质Lowry试液中的有色物质增加的数量相当于1mg牛血清白蛋白(BSA)的酶量定义为一单位(1U),按以下方程计算。
蛋白酶活性(U/g)=(PA1-PA2)x4.4÷0.4÷TxV÷W
方程中的各符号含义如下:
PA1酶反应溶液的蛋白质浓度(mg BSA/mL)
PA2空白的蛋白质浓度(mg BSA/mL)
4.4÷0.4转换成反应结束时的总溶液量的转换系数
T反应时间(分钟)
V粉末样品的溶解体积(mL)
W粉末样品的用量(g)
在不同条件下处理的各样品溶液的转谷氨酰胺酶活性和蛋白酶活性在图1中汇总,为相对于没有进行pH处理时的100%活性值的相对值。
在pH3-9,转谷氨酰胺酶的相对活性值和蛋白酶的相对活性值(相对于定义为100%的pH处理前的转谷氨酰胺酶活性的活性)几乎相当。也就是说,可以确定在这个pH范围内进行的处理不能既降低蛋白酶活性而又不降低转谷氨酰胺酶活性(图1)。但是,当在大于pH9下进行处理时,蛋白酶的相对活性降低得明显比转谷氨酰胺酶的相对活性多。在pH13及以上,也发现转谷氨酰胺酶的活性急遽下降。因此,在大于pH9.0但小于pH13.0下处理转谷氨酰胺酶溶液既能降低蛋白酶活性而又不降低转谷氨酰胺酶活性,从而使高质量转谷氨酰胺酶得以制备。
实施方案2
(处理转谷氨酰胺酶的方法)
将1g的样品转谷氨酰胺酶(产品名称:Activa TG,日本味之素公司制备)溶于20g的蒸馏水中,将0.4g的此水溶液混合到1.6g的已调节至pH9、10、11和12的0.1M GTA缓冲液中。每个水溶液在20℃下保持30分钟至6小时,获得各样品溶液。
(测量转谷氨酰胺酶活性的方法)
转谷氨酰胺酶活性按实施方案1描述的方法测量。
(测量蛋白酶活性的方法)
蛋白酶活性按实施方案1描述的方法测量。
对结果的处理方式同实施方案1对结果的处理方式,发现当在pH9下处理6小时时转谷氨酰胺酶的相对活性和蛋白酶的相对活性之间没有差别,与之对比,可以确定当在大于pH9下处理时蛋白酶的相对活性低于转谷氨酰胺酶的相对活性(图2)。此外,对于在pH11及以上持续进行30分钟或以上的处理来说,转谷氨酰胺酶的相对活性保持80%,而蛋白酶的相对活性发现下降至20%或以下。对于在pH12及以上持续进行30分钟或以上的处理来说,转谷氨酰胺酶的相对活性保持80%, 而蛋白酶的相对活性发现下降至10%或以下。
实施方案3
(处理转谷氨酰胺酶的方法)
将1g的样品转谷氨酰胺酶(产品名称:Activa TG,日本味之素公司制备)溶于20g的蒸馏水中,将0.4g的此水溶液混合到1.6g的已调节至pH11的0.1M GTA缓冲液中。在每个水溶液在10、20、30、40和50℃的温度下保持30分钟,获得各样品溶液。
(测量转谷氨酰胺酶活性的方法)
转谷氨酰胺酶活性按实施方案1描述的方法测量。
(测量蛋白酶活性的方法)
蛋白酶活性按实施方案1描述的方法测量。
当将各转谷氨酰胺酶水溶液在不同的温度区域中保持时,发现蛋白酶的活性出现降低(图3)。但是,由于在50℃下保持时转谷氨酰胺酶的活性的下降也明显,可以确定溶液在小于50℃下保持时可降低蛋白酶活性同时又保持转谷氨酰胺酶活性不受损。
实施方案4
将18.0g的蛋白酶活性/转谷氨酰胺酶活性之比大于0.00024的样品转谷氨酰胺酶(产品名称:Activa TG,日本味之素公司制备)和1.2g的鱼胶原(Kenny & Ross Ltd.制备)溶于12g的水中,获得转谷氨酰胺酶-鱼胶原的水溶液。
将300g的小块猪臀肉(约2厘米见方)混合到所制备的转谷氨酰胺酶-鱼胶原的水溶液中,加入0.3g的无水磷酸三钠。将混合物混合,然后填入折叠宽度为75mm的肠衣管(casing tube)中。
在另一个试验区域,将0.3g的无水磷酸三钠加入到按上述方式制备的转谷氨酰胺酶-鱼胶原溶液中。将这些pH11的水溶液在25℃下分别保持30分钟和2小时。然后将300g的小块(约2厘米见方)猪臀肉加入到每个水溶液中,将各混合物混合并填入折叠宽度为75mm的各肠衣管中。
将如上所述填入肠衣管中的猪臀肉和转谷氨酰胺酶-鱼胶原水溶液的各混合物在5℃下静置2小时,以进行转谷氨酰胺酶反应。随后,将各制品放入-40℃冷冻装置中冷冻保藏以备评估。将猪臀肉和转谷氨酰胺酶-鱼胶原水溶液的各冷冻混合物切成厚9mm、宽2.5mm的小块,解冻。然后用Stable Micro Systems Corp.制备的质构分析仪通过拉伸试验测量粘结强度。
最小实用粘结强度凭经验认为是50g/cm2。根据结果,当采用没有在pH11下处理过的转谷氨酰胺酶-鱼胶原水溶液时,粘结强度小于50g/cm2(图4)。但是,当用pH11水溶液处理相同的样品转谷氨酰胺酶30分钟和2小时时,发现粘结强度为50g/cm2或以上。达到了实用强度的样品转谷氨酰胺酶中的蛋白酶活性,据认为是通过用pH11水溶液处理被降低,而所述处理又不降低转谷氨酰胺酶活性。
实施方案5
将蛋白酶活性/转谷氨酰胺酶活性之比大于0.00024(高蛋白酶TG)的试验转谷氨酰胺酶和该比为0.00024或以下(低蛋白酶TG)的样品转谷氨酰胺酶(产品名称:Activa TG,日本味之素公司制备)各以0.336g的量加入到40mL的1%盐水中并溶解。将5mL的1%磷酸三钠水溶液加入到转谷氨酰胺酶水溶液中。将混合物调节至pH11,在25℃下保持30分钟。随后,加入5mL的0.4%富马酸水溶液以中和至pH7,获得pH11处理过的含转谷氨酰胺酶制品。另外,将通过先混合5mL的1%磷酸三钠水溶液和5mL的0.4%富马酸水溶液获得的水溶液与转谷氨酰胺酶水溶液混合,用作对照。采用如上所述处理过的含转谷氨酰胺酶制品,按以下程序制备煮熟鱼浆(boiled fish paste)。
用Stephan绞肉机将1,000g的压片冷冻碎鱼肉(阿拉斯加青鳕,FA级)绞切至温度达到-2至0℃。加入30g的食盐,加入350g的冰水,用Stephan绞肉机绞切至温度达到7-8℃。向此混合物中加入20g的砂糖、40g的马铃薯淀粉、350g的冰水和2g的鱼糜制品用制剂,进行绞切,直到温度达到7-8℃。将如此获得的材料填入直径30mm的圆柱形偏二氯乙烯肠衣中,在40℃蒸汽中加热30分钟,然后在85℃蒸汽中加热20分钟,接着浸入冰水中冷却。
用质构分析仪进行破断试验。将煮熟鱼浆圆条切成30mm的高度,将直径5mm的球形冲头以1mm/s的速度压入煮熟鱼浆断面的中央,测量破断的那一刻的应力(破断应力)。使用Microsoft Excel应用程序,获得煮熟鱼浆破断应力与原始样品转谷氨酰胺酶粉末的各条件下的蛋白酶活性的相关系数。
根据经验,当煮熟鱼浆的破断强度差值为5%或以上时,会感受到食感上的差别。结果在图5中给出。根据图5,当采纳低蛋白酶TG煮熟鱼浆的破断应力作为100%(511.0g)时,高蛋白酶TG煮熟鱼浆的破断应力为90.8%(464.2g),并发觉食感上的差别。
当高蛋白酶TG在pH11下保持30分钟时,煮熟鱼浆的破断应力变成99.6%(509.1g),在此强度下没有发觉食感上的差别。据认为,通过将高蛋白酶活性含转谷氨酰胺酶制品在pH11水溶液中保持,蛋白酶活性被降低而又不降低转谷氨酰胺酶活性,所产生的结果相当于低蛋白酶活性含转谷氨酰胺酶制品所获得的结果。
产业适用性
如上述所详细说明,本发明方法通过使蛋白酶活性得到选择性降低而不降低转谷氨酰胺酶活性,使更高质量的转谷氨酰胺酶制剂得以制备。它能廉价地供应高质量的含转谷氨酰胺酶制品,这种制品可作为添加剂用于增强各种含有的蛋白质中有谷氨酰胺残基充当转谷氨酰胺酶的底物的材料的质量,特别是作为用于粘结应用的制剂和用于鱼糜制品的制剂的成分。因此,这些含转谷氨酰胺酶制品扩大了上述含蛋白质材料进入食物领域以外的各种领域的用途。
本申请基于在日本提交的专利申请第2005-248771号,该专利申请的内容通过引用整体结合到本文中。
Claims (11)
1.一种通过处理制备蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品的方法,所述处理包括将其中蛋白酶作为杂质存在的含转谷氨酰胺酶制品在pH大于9.0但小于13.0、温度0℃或以上但小于50℃下保持10分钟或以上但不超过60小时。
2.根据权利要求1的制备含转谷氨酰胺酶制品的方法,其中所述处理继续进行至含转谷氨酰胺酶制品中的蛋白酶活性/转谷氨酰胺酶活性之比达到0.00024或以下。
3.根据权利要求2的制备含转谷氨酰胺酶制品的方法,其中所述处理在发酵制备含转谷氨酰胺酶制品的过程中的从发酵液分离含转谷氨酰胺酶制品的步骤中进行。
4.一种蛋白酶活性降低的含转谷氨酰胺酶制品,所述制品由权利要求2或3的制备方法制备。
5.一种转谷氨酰胺酶制剂,所述制剂包含根据权利要求4的含转谷氨酰胺酶制品和另外的成分。
6.一种粘结用转谷氨酰胺酶制剂,所述制剂包含根据权利要求4的含转谷氨酰胺酶制品和含蛋白质材料。
7.一种粘结用转谷氨酰胺酶制剂,所述制剂包含根据权利要求4的含转谷氨酰胺酶制品、胶原和/或乳蛋白质。
8.一种鱼糜制品用转谷氨酰胺酶制剂,所述制剂包含根据权利要求4的含转谷氨酰胺酶制品和至少一种选自含蛋白质材料、钙盐、碱金属盐和赋形剂的另外成分。
9.一种制备重构食物制品的方法,所述方法采用根据权利要求4的含转谷氨酰胺酶制品,或权利要求5-7中任一项的转谷氨酰胺酶制剂。
10.一种制备重构食物制品的方法,所述方法包括:制备根据权利要求4的含转谷氨酰胺酶制品的水溶液,将此水溶液与胶原和/或乳蛋白质混合成溶液,并将这一溶液加入到含蛋白质材料中。
11.一种制备鱼糜制品的方法,所述方法包括将根据权利要求4的含转谷氨酰胺酶制品,或权利要求5或8的转谷氨酰胺酶制剂加入到磨碎的鱼肉中。
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