JP3396001B2 - ペプチド混合物の新規な製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、所定量の遊離アミノ酸
を含有したペプチド混合物を、常に安定した状態で、一
定の品質で製造する方法に関するものである。詳しく
は、本発明は、１種若しくは２種以上の蛋白質からなる
原料蛋白質の水溶液又は予め軽度に加水分解した原料蛋
白質の水溶液（以下これらの水溶液をまとめて原料水溶
液と記載することがある）に、蛋白分解酵素を添加し、
原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の加
水分解を開始し、加水分解により分解液中に遊離した特
定アミノ酸の量を経時的に測定し、原料蛋白質又は予め
軽度に加水分解した原料蛋白質に含まれる特定アミノ酸
の総量に対する遊離した特定アミノ酸の量の割合を算出
し、その算出した値が予め設定された特定の範囲内に達
したとき直ちに加水分解を停止することを特徴とするペ
プチド混合物の新規な製造法、である。本明細書におい
て、百分率は、特に断りのない限り、重量による表示で
ある。

【０００２】

【従来の技術】動物性蛋白質（獣乳、卵、肉類、魚類
等）又は植物性蛋白質（大豆、小麦等）を蛋白分解酵素
で分解して得られるペプチド混合物には、増粘性、起泡
性、抗酸化性、易消化吸収性、ミネラル可溶化性、低抗
原性等の性質、上皮細胞成長因子、細胞増殖因子、カル
シウム吸収促進機能、オピオイド様活性等の生理活性機
能が知られており（食品と開発、第２６巻、第１１号、
第２８〜３６ページ、１９９１年）、畜肉、水産練り製
品、パン、菓子、ミネラル強化食品、乳幼児用食品、ス
ポーツ飲料、一般栄養食品、経腸栄養剤、蛋白アレルギ
ー対応食品、特殊栄養食品、医薬品等の製造に不可欠な
原料の一つとなっている。

【０００３】従来、これらの食品又は医薬品の製造に使
用されるペプチド混合物の製造方法としては、用途に応
じてそれぞれ異なるが、 ａ）遊離のアミノ酸の生成をできるだけ制限するために
原料蛋白質をエンドペプチダーゼのみで分解して目的の
ペプチド混合物を製造する方法 ｂ）原料蛋白質をエンドペプチダーゼとエキソペプチダ
ーゼの組み合わせで分解し、逆に所定量の遊離アミノ酸
を含有させたペプチド混合物を製造する方法、及び、 ｃ）これらペプチド混合物からウルトラフィルトレーシ
ョン（ＵＦ）、リバースオスモシス（ＲＯ）、ゲル濾
過、イオン交換樹脂法等の分離操作により更に目的とす
るペプチド混合物を精製、分取する方法、等に大別する
ことができる。

【０００４】それらの従来技術の幾つかを例示すれば次
のとおりである。 １）蛋白質をエンド型プロテアーゼ及びエキソ型プロテ
アーゼ共存水系下に、０．５〜１０時間酵素分解し、苦
味の極めて少ない平均鎖長３〜１０のオリゴペプチドを
得ることを特徴とするオリゴペプチド混合物の製造法が
開示されている（特開昭６２−１４３６９７号公報）。

【０００５】２）任意の起源のタンパク質原料を水に５
〜２０％(w/v)となるように分散させ、酸によってｐＨ
を１〜４に調整し、２種以上の酸性プロテアーゼを同時
に又は逐次的に添加して２５〜６０℃の温度で８〜７２
時間遊離のアミノ酸の生成をおさえつつ酵素分解反応を
行い低分子ペプチド組成物を製造する方法が開示されて
いる（特公昭５７ー４５５６０号公報）。

【０００６】３）カゼイン溶液をカラムに詰めた固定化
酵素で部分分解する方法において、カゼイン溶液の通液
速度を制御してカゼインの部分分解物を製造する方法が
開示されている（特公平３−３１４２１号公報）。

【０００７】４）溶解水等に蛋白質又は蛋白質を含有す
る物質と溶解促進剤を混合溶解した後、単数もしくは複
数の蛋白質分解酵素を添加し消化反応せしめて蛋白分解
物を製造するに際し、少なくとも前期蛋白分解物を添加
した後の溶液の粘度を経時的に計測し、該粘度が大きく
上昇して下降するその下降前に消化反応を停止すること
を特徴とする不溶解物の生成を防止した蛋白質分解物の
製造方法が開示されている（特公平３−５８２５２号公
報）。

【０００８】５）獣乳κ−カゼイン由来のグリコポリペ
プチドのプロテアーゼ加水分解物であって、フィッシャ
ー値が３０から６０の範囲であるペプチド混合物を製造
する方法において、分解率が５〜２５％となった時点で
加熱処理して酵素を失活させる方法が開示されている
（特開平２−３００１３７号公報）。

【０００９】６）乳蛋白質を固定化プロテアーゼで分解
して蛋白分解物を製造する方法において、ペプチドセン
サーでペプチド濃度を測定する方法及びペプチドの平均
鎖長を測定する方法が開示されている（食品産業バイオ
リアクターシステム技術研究組合編、「実践バイオリア
クター」、第１６６〜１８４ページ、食品産業バイオリ
アクターシステム技術研究組合発行、１９９０年）。

【００１０】７）小麦グルテンを固定化プロテアーゼで
分解してグルテン分解物を製造する方法において、グル
テン分解物の疎水性を逆相高速液体クロマトグラフィー
（以下高速液体クロマトグラフィーをＨＰＬＣと記載す
る）で経時的に計測して泡末安定性に優れたグルテン分
解物が製造できることが開示されている（食品産業バイ
オリアクターシステム技術研究組合編、「実践バイオリ
アクター」、第１０６〜１２６ページ、食品産業バイオ
リアクターシステム技術研究組合発行、１９９０年）。

【００１１】８）味噌、醤油等の発酵食品の製造、リジ
ン、グルタミン酸等のアミノ酸発酵における工程管理に
おいて目的生産物である遊離アミノ酸量を測定すること
が知られている（食品工業、第３４巻、第１６号、第１
〜１１ページ、１９９１年）。

【００１２】

【発明が解決しようとする課題】上記従来技術に示され
るように、従来、蛋白分解酵素で原料の蛋白質を分解し
てペプチド混合物を製造する場合、分解反応の終点を、
反応時間、蛋白溶液の通液速度等を指標とし、分解物の
粘度、分解率、疎水度等を測定することにより決定して
いたが、これらの方法では、刻々変化する分解物の理化
学的性状、特に遊離のアミノ酸量を正確に把握すること
が極めて困難であり、従来のペプチド混合物の製造法に
おいては、製造バッチごとにペプチド混合物が含有する
遊離アミノ酸量及び組成が異なり、ペプチド混合物の品
質が一定しないという致命的な欠点がありその改善が強
く要請されている状況にあった。

【００１３】このような状況の中で、本発明者らは、前
記従来技術に鑑みて、常に安定した状態で、一定の品質
でペプチド混合物を製造する方法について鋭意研究を行
った結果、加水分解物により分解液中に遊離する特定の
アミノ酸の量を、経時的に、かつ短時間で測定し、原料
蛋白質に含まれている該特定アミノ酸の量との割合を算
出し、その値が、特定の範囲内に達したときに直ちに加
水分解を停止することにより、所望のペプチド混合物が
得られることを見い出し、本発明を完成した。本発明の
目的は、遊離アミノ酸の量及び組成が一定し、品質が良
好であるペプチド混合物を容易に製造し得る新規な方法
を提供することにある。

【００１４】

【課題を解決するための手段】前記課題を解決する本発
明は、一定品質のペプチド混合物の製造法であって、１
種若しくは２種以上の蛋白質からなる原料蛋白質の水溶
液又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の水溶液に、
１種若しくは２種以上の蛋白分解酵素を添加し、原料蛋
白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の加水分解
を開始し、加水分解により分解液中に遊離したアミノ酸
から選択された特定アミノ酸の量を経時的に、かつ短時
間で測定し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原
料蛋白質に含まれる特定アミノ酸の総量に対する遊離し
た特定アミノ酸の量の割合を算出し、その算出した値が
予め設定された特定の範囲内に達したとき直ちに加水分
解を停止することを特徴とするペプチド混合物の製造法
であり、遊離したアミノ酸から選択された特定アミノ酸
が、リジン、フェニルアラニン、ロイシン又はアルギニ
ンであることを望ましい態様としてもいる。

【００１５】次に本発明について詳述する。本発明の方
法の出発原料として使用する原料蛋白質は、動物性蛋白
質（例えば、獣乳由来、卵由来、魚肉由来、畜肉由来
等）、植物性蛋白質（穀類由来、海草由来、種子由来
等）又はこれらの任意の混合物であり、特に限定される
ものではない。また、蛋白質を予め軽度に加水分解した
分解物であって、更に蛋白分解酵素により分解し得る大
きい分子量のペプチド混合物を出発原料とすることもで
きる。原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白
質を、蛋白質換算で１０％前後の濃度で水に溶解し、溶
解液のｐＨをアルカリ溶液又は酸溶液を用いて、使用す
る蛋白分解酵素の至適ｐＨ付近に調整し、原料水溶液を
調製する。

【００１６】次いで、前記原料水溶液に動物由来（例え
ば、パンクレアチン、ペプシン、トリプシン等）、植物
由来（例えば、パパイン、ブロメライン等）、微生物由
来（例えば、かび、放線菌、細菌、乳酸菌等）の蛋白分
解酵素又はこれらの任意の組合わせの蛋白分解酵素を目
的に応じ適宜選択し、所定量を添加する。例えば、エン
ドペプチダーゼを原料蛋白質１ｇ当たり２０００〜５０
００ＰＵＮ単位、エキソペプチダーゼを原料蛋白質１ｇ
当たり２０〜１００活性単位の添加を、望ましい態様と
して例示することができる（ＰＵＮ単位及び活性単位に
ついては後記する）。

【００１７】所定量の酵素を添加した原料水溶液は、通
常は酵素の至適温度に所定時間保持して蛋白質の酵素に
よる加水分解を行い、分解中に微生物の増殖が懸念され
る場合は、必要に応じて酵素の至適温度より高温域又は
低温域の温度に所定時間保持して蛋白質の酵素による加
水分解を行うこともできる。

【００１８】加水分解を開始し、分解液中に遊離した特
定アミノ酸の量を経時的に、かつ短時間で測定する。具
体的には、例えば、ＨＰＬＣ、バイオテックアナライザ
ー（旭化成工業社製）、パフュージョン・クロマトグラ
フィー（パーセプティブ・バイオシステム社製。BioCA
D）等を用いることができる。使用する原料蛋白質及び
酵素の種類により遊離するアミノ酸の量が異なるので、
大量に遊離するアミノ酸を特定アミノ酸として選択する
のが望ましい。特に望ましい態様として、分解液中に遊
離した特定アミノ酸の量をオンラインにより、測定する
ことを例示できる。また、特定アミノ酸としては、リジ
ン、フェニルアラニン、ロイシン、アルギニン等が特に
好適なものとして例示される。これらにより、分解液中
に遊離した特定アミノ酸の量を経時的に、かつ短時間に
測定し、出発原料である蛋白質に含まれる特定アミノ酸
の総量に対する遊離した特定アミノ酸量の割合が予め設
定された特定の範囲に達した時、直ちに反応液中の酵素
を失活又は除去し、加水分解を停止する。前記特定の範
囲は、目的とするペプチド混合物、使用する原料、使用
する酵素等により異なるが、例えば、遊離したリジンの
量を経時的、かつ短時間で測定しながら、乳清蛋白質を
加水分解する場合、遊離リジンの量の範囲として５〜４
０％を例示することができる。

【００１９】本発明において、反応液中の酵素を失活又
は除去して加水分解を停止する方法は、特に限定される
ものではなく、適宜の方法が使用されるが、該加水分解
を停止するまでに、時間的ずれを伴う場合もあり（例え
ば、ある量の分解液を加熱し、酵素を失活させるまで、
３０〜６０分を要する場合もある）、この場合加水分解
が進行するおそれがあるので、予め予備試験を行い、所
定の条件のもとに、分解の進行程度（例えば、特定の遊
離アミノ酸の生成速度）を測定し、酵素の失活又は除去
に要する時間を考慮し、前記特定の範囲を決定し、設定
することが望ましい。

【００２０】分解を終了したペプチド混合物を含有する
分解液を、公知の方法により濃縮し、濃縮液とすること
もでき、また、この濃縮液を公知の方法により乾燥し、
粉末とすることもできる。更に、ペプチド混合物を含有
する液を、限外濾過、ゲル濾過等公知の方法により精製
し、公知の方法により濃縮し、濃縮液とすることもで
き、また、この濃縮液を公知の方法により乾燥し、粉末
とすることもできる。

【００２１】また、加水分解を行う反応容器の形状（例
えば、タンク式、チューブ式、カラム式等）、分解処理
方式（例えば、回分式、連続式、逐次式等）、酵素の失
活、分離又は除去方法、ペプチドの精製方法等は、公知
の方法及び装置を使用することが可能であり、特に限定
されるものではない。以上のようにして、遊離アミノ酸
の量及び組成が常に一定であり、かつ品質が変動しない
ペプチド混合物を製造し得る。

【００２２】前記ＰＵＮ単位及び活性単位は、次のとお
りである。エンドペプチダーゼのＰＵＮ単位は、カゼイ
ン［ハマーシュタイン(Hammerstein)。メルク社製］に
エンドペプチダーゼを作用させ、３０℃で１分間に１μ
ｇのチロシンに相当するアリルアミノ酸のフォリン試薬
での呈色反応を示す酵素活性が１ＰＵＮ単位である。

【００２３】また、エキソペプチダーゼの活性単位は、
次の方法により測定した。エキソペプチダーゼを含有す
る粉末を０．２ｇ／１００ｍｌの割合で０．１モルのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に分散又は溶解し酵素溶液と
する。一方、ロイシルパラニトロアニリド（国産化学社
製。以下Ｌｅｕ−ｐＮＡと記載する）を０．１モルのリ
ン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解して２ｍＭの基質溶液
を調製する。酵素溶液１ｍｌに基質溶液１ｍｌを加え３
７℃で５分間反応させた後、３０％の酢酸溶液２ｍｌを
加えて反応を停止させる。反応液をメンブランフィルタ
ーで濾過し、波長４１０ｎｍで濾液の吸光度を測定す
る。エキソペプチダーゼの活性単位は、１分間に１μｍ
ｏｌのＬｅｕ−ｐＮＡを分解するのに必要な酵素量が１
活性単位であり、次式により算出した。 活性単位（粉末１ｇ当たり）＝２０×（Ａ／Ｂ） （ただし、前記の式においてＡ及びＢは、それぞれ波長
４１０ｎｍにおける試料の吸光度及び０．２５ｍＭパラ
ニトロアニリンの吸光度である）

【００２４】次に、試験例を示して本発明を詳述する
が、本発明においては、次の試験方法を採用した。 （１）アミノ酸組成の測定方法 トリプトファン、システイン及びメチオニン以外のアミ
ノ酸については、試料を６Ｎ塩酸で１１０℃、２４時間
加水分解し、トリプトファンについては、水酸化バリウ
ムで１１０℃、２２時間アルカリ分解し、システイン及
びメチオニンについては、過ぎ酸処理後、６Ｎ塩酸で１
１０℃、１８時間加水分解し、それぞれアミノ酸分析機
（日立製作所製。８３５型）により分析し、アミノ酸の
質量を測定した。

【００２５】（２）遊離アミノ酸組成の測定方法 スルホサリチル酸で試料を除蛋白し、アミノ酸分析機
（日立製作所製。８３５型）により分析し、遊離アミノ
酸の質量を測定した。そして前記アミノ酸組成の分析で
得られた各アミノ酸の質量に対する遊離アミノ酸質量の
百分率を算出した。

【００２６】（３）遊離リジン含量の測定方法 リジン測定用酵素電極、２０ｍＭＬ−リジン標準液、
０．１Ｍ燐酸Ｌ−リジン測定用緩衝液及び洗浄用界面活
性剤（いずれも旭化成工業社製）を用い、バイオテック
アナライザー（旭化成工業社製）により遊離リジン濃度
を測定し、原料蛋白質のリジン含有量に対する分解溶液
の遊離リジン含有量から全リジンに対する遊離リジンの
量の割合を算出した。

【００２７】（４）ＨＰＬＣ Inertsil PREP-ODS(ＧＬサイエンス社製。６．５×２５
０ｍｍ）カラムをＨＰＬＣ（島津製作所製）に装着し、
分解液０．１ｍｌを供給し、溶離液Ａ（０．１％トリフ
ルオロ酢酸溶液）に対する溶離液Ｂ（０．１％トリフル
オロ酢酸−アセトニトリル溶液）の割合が１００分間で
５０％となる濃度勾配で１．５ｍｌ／分の流速で溶出を
行った。

【００２８】（５）分解率 分解率（％）は、原料蛋白質溶液の全窒素量当たりの分
解溶液のホルモル態窒素量の百分率であり、次の方法に
より求めた。蛋白分解溶液４ｍｌと蒸留水３０ｍｌを混
合し、０．２Ｎ水酸化ナトリウム溶液又は塩酸溶液でｐ
Ｈを６．８に調整する。この溶液を０．２Ｎ水酸化ナト
リウム溶液でｐＨを８．０に調整したホルマリン溶液５
ｍｌを添加し、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨが
７．９に達するまで滴定する。この時の滴定量をＡｍ
ｌ、０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液のファクターをＦ、
原料蛋白質溶液の蛋白濃度をＢ（％）として、分解率を
次式から算出した。 分解率（％）＝２２．３×Ａ×Ｆ／Ｂ

【００２９】試験例１ この試験は、従来から採用されているペプチド混合物の
製造方法、即ち、反応時間を指標にして酵素分解を停
止する方法及び分解率を指標にして酵素分解を停止す
る方法と、本発明の方法とにより、ペプチド混合物を
製造し、得られたペプチド混合物の品質（遊離アミノ酸
組成及び遊離アミノ酸量の変動）に及ぼす影響を比較検
討した。

【００３０】１）試料の調製 前記の方法では、酵素分解を４時間で停止したこと、
前記の方法では、酵素分解を分解率が２３％に達した
時に停止したこと、前記の本発明の方法では、分解液
中の遊離リジン濃度を経時的に、かつ短時間で測定し、
リジンの遊離率が１５％に達した時点で酵素分解を停止
したこと、を除き、実施例１と同一の方法により乳清蛋
白質溶液の加水分解をそれぞれ５回反復して実施し、合
計１５種類の試料を調製した。

【００３１】２）試験方法 各試料の遊離アミノ酸量及び遊離アミノ酸組成を前記の
方法により測定し、５回の結果の平均値と標準偏差を算
出した。

【００３２】３）試験結果 この試験結果は表１に示すとおりである。表１から明ら
かなように、各方法で製造したペプチド混合物の各遊離
アミノ酸量及び遊離アミノ酸の合計量の平均値には多少
の差はあったが、遊離した各アミノ酸の量の標準偏差及
び遊離アミノ酸量の合計の標準偏差は、の本発明の方
法が最も小さく、安定しており、次いでの方法の変動
が少なく、の方法は最も変動が大きく製造上品質が不
安定であることが認められた。

【００３３】

【表１】

【００３４】試験例２ この試験は、試験例１とは異なる原料蛋白質及び分解条
件で、加水分解を実施した場合の各方法を比較するため
に行った。 １）試料の調製及び試験方法 蛋白質原料として牛乳カゼイン（商品名ＡＬＡＣＩＤ。
蛋白質含量９０％。ニュージーランドデーリーボード
製）１ｋｇを脱イオン水９ｋｇに懸濁させ、２０％カセ
イソーダ溶液でｐＨを７．０に調整して溶解したこと、
前記の方法では、酵素分解を９時間で停止したこと、
前記の方法では、酵素分解を分解率が３０％に達した
時に停止したこと、及び前記の本発明の方法では、分
解液中の遊離リジン濃度を経時的に、かつ短時間で測定
し、リジンの遊離率が３２％に達した時点で酵素分解を
停止したこと、を除き、試験例１と同一の方法により加
水分解をそれぞれ５回反復して実施し、合計１５種類の
試料を調製した。

【００３５】２）試験結果 この試験結果は表２に示すとおりである。表２から明ら
かなように、各方法で製造したペプチド混合物の各遊離
アミノ酸量及び遊離アミノ酸の合計量の平均値には多少
の差はあったが、遊離した各アミノ酸の量の標準偏差及
び遊離アミノ酸量の合計の標準偏差は、の本発明の方
法が最も小さく、安定しており、次いでの方法であ
り、の方法は最も変動が大きく製造上品質が不安定で
あることが認められた。

【００３６】

【表２】

【００３７】試験例３ この試験は、試験例１及び試験例２とは異なる原料蛋白
質及び分解条件で、加水分解を実施した場合の各方法を
比較するために行った。 １）試料の調製及び試験方法 蛋白質原料として大豆蛋白（商品名ＳＵＰＲＯ。蛋白含
量９０％。不二製油社製）に変更したこと、前記の方
法では、酵素分解を６時間で停止したこと、前記，方
法では、酵素分解を分解率が１３％に達した時に停止し
たこと、及び前記の本発明の方法では、分解液中の遊
離リジン濃度を経時的に、かつ短時間に測定し、リジン
の遊離率が２１％に達した時点で酵素分解を停止したこ
と、を除き、試験例１と同一の方法により加水分解をそ
れぞれ５回反復して実施し、合計１５種類の試料を調製
した。

【００３８】２）試験結果 この試験結果は表３に示すとおりである。表３から明ら
かなように、各方法で製造したペプチド混合物の各遊離
アミノ酸量及び遊離アミノ酸の合計量の平均値には多少
の差はあったが、遊離した各アミノ酸の量の標準偏差及
び遊離アミノ酸量の合計の標準偏差は、の本発明の方
法が最も小さく、安定しており、次いでの方法であ
り、の方法は最も変動が大きく製造上品質が不安定で
あることが認められた。尚、蛋白質原料を畜肉、魚肉、
卵等に変更して同様に試験したが、いずれの場合も遊離
アミノ酸組成及び遊離アミノ酸量は、本発明の方法が最
も変動が少なく、安定していることが判明した。

【００３９】

【表３】

【００４０】試験例４ この試験は、特定の遊離アミノ酸の測定方法を調べるた
めに行った。 １）試料の調製及び試験方法 バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）の代わり
にＨＰＬＣ（島津製作所製）を用いて経時的に、かつ短
時間で分解液の遊離リジンの量を測定したこと以外は、
前記試験例１のの方法と同一の方法により乳清蛋白質
からペプチド混合物を調製した。

【００４１】２）試験結果 この試験結果は表４に示すとおりである。表４から明ら
かなように、分解液の遊離リジンの量をバイオテックア
ナライザーで測定した場合も、ＨＰＬＣで測定した場合
も、各アミノ酸の遊離量の平均値及び遊離アミノ酸量の
合計の平均値は異なるが、各アミノ酸の遊離量の標準偏
差及び遊離アミノ酸量の合計の標準偏差は、両者に大差
のないことが認められた。従って、これら遊離アミノ酸
量のいずれの測定方法も、本発明に使用し得ることが判
明した。尚、蛋白質の種類及び加水分解条件を変更して
試験したが、ほぼ同様な結果が得られた。

【００４２】

【表４】

【００４３】試験例５ この試験は、測定する特定の遊離アミノ酸の種類を調べ
るために行った。 １）試料の調製及び試験方法 ＨＰＬＣ（島津製作所製）を用いて経時的に、かつ短時
間で分解液の遊離フェニルアラニンの量を測定し、遊離
フェニルアラニン量が２５％に達した時点で酵素分解を
停止したことを除き、試験例２のの方法と同一の方法
によりカゼインからペプチド混合物を調製した。

【００４４】２）試験結果 この試験結果は表５に示すとおりである。表５から明ら
かなように、分解液の遊離フェニルアラニンの量を測定
した場合も、各アミノ酸の遊離量の標準偏差及び遊離ア
ミノ酸量の合計の標準偏差は小さく、カゼインから品質
の一定したペプチド混合物が、得られることが認められ
た。尚、蛋白質の種類及び加水分解条件を変更して試験
したが、ほぼ同様な結果が得られた。

【００４５】

【表５】

【００４６】試験例６ この試験は、前記試験例５と同様に測定する特定の遊離
アミノ酸の種類を変更して試験した。 １）試料の調製及び試験方法 ＨＰＬＣ（島津製作所製）を用いて経時的に、かつ短時
間で分解液の遊離ロイシンの量を測定し、遊離ロイシン
量が１０％に達した時点で酵素分解を停止したことを除
き、試験例３のの方法と同一の方法により大豆蛋白質
からペプチド混合物を調製した。

【００４７】２）試験結果 この試験結果は表６に示すとおりである。表６から明ら
かなように、分解液の遊離ロイシンの量を測定した場合
も、各アミノ酸の遊離量の標準偏差及び遊離アミノ酸量
の合計の標準偏差は小さく、大豆蛋白質から品質の一定
したペプチド混合物が、得られることが認められた。ま
た、遊離アルギニンの量を測定した場合についても、ほ
ぼ同様の結果が得られた。測定する特定アミノ酸の種類
を前記ロイシン及びアルギニン以外のアミノ酸に変更し
た場合、又は、蛋白質の種類及び加水分解条件を変更し
た場合についても試験したが、ほぼ同様な結果が得られ
た。

【００４８】

【表６】

【００４９】参考例１ コーンスティープリカー２０部（重量。以下同じ）に水
道水１００部及び石灰５部を添加し、コーンスティープ
リカーに含まれている酸を中和し、濾過助剤としてセラ
イト５０部を添加して濾過し、濾液Ａを得た。これとは
別に、フィシュリバー２０部、モラセス３５部及び水道
水２００部の混合液にセライト５０部を添加して濾過
し、濾液Ｂを得た。前記濾液Ａ及び濾液Ｂ等量混合液５
００部にグルコース５部、リン酸一カリウム２．５部、
リン酸二カリウム２．５部及び酢酸ナトリウム５部を添
加し、３０％水酸化ナトリウムでｐＨを６．４に調整
し、水を添加して１０００部に調整した。

【００５０】滅菌した前記組成の培地１０ｌにラクトバ
シラス・ヘルベティカスを培養し、得られた培養液を遠
心分離して乳酸菌菌体を回収し、滅菌水に菌体を懸濁
し、遠心分離して乳酸菌菌体を回収する操作を２回反復
して菌体を洗浄し、のち２０％の濃度で菌体を滅菌水に
懸濁し、超音波破砕機（ブランソン社製。SONIFIER mod
el 250）により菌体を破砕し、凍結乾燥し、乳酸菌由来
のエキソペプチダーゼ粉末約２５ｇを得た。

【００５１】

【実施例】次に実施例を示して本発明を更に詳述する
が、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。 実施例１ 乳清蛋白質含量７５％の市販乳清蛋白質粉末（カリフォ
ルニア・プロテイン社製）１ｋｇを、脱イオン水９ｋｇ
に溶解し、７０℃に５分間保持して殺菌し、ｐＨを９．
０に調整し、市販のプロテアーゼＮアマノ（天野製薬社
製）１５０万ＰＵＮ単位（乳清蛋白質１ｇ当たり２００
０ＰＵＮ単位）及び前記参考例１と同一の方法で調製し
たラクトバシラス・ヘルベチカス菌体破砕物４万活性単
位（乳清蛋白質１ｇ当たり６０活性単位）を添加し、５
０℃に保持して加水分解を開始し、バイオテックアナラ
イザー（旭化成工業社製）を用いて経時的に、かつ短時
間で遊離リジンの量を測定し、遊離リジン量が１４％に
達した時点で、８０℃で６分間加熱して酵素を失活さ
せ、酵素分解を停止させ、のち常法により凍結乾燥し、
乳清蛋白質からペプチド混合物約９５０ｇを得た。前記
の製造法を２回反復して得られたペプチド混合物を、前
記試験方法により試験した結果、各遊離アミノ酸の量及
び遊離アミノ酸の合計量にはほとんど差異が認められな
かった。

【００５２】実施例２ 蛋白質含量８０％の市販小麦蛋白粉末（理研ビタミン社
製。エマソフトＥＸ−１００）１ｋｇを、脱イオン水９
ｋｇに溶解し、ｐＨを７．０に調整し、７０℃で５分間
保持して殺菌した。この小麦蛋白質溶液に市販のパンク
レアチン（天野製薬社製）を２００万ＰＵＮ単位（小麦
蛋白質１ｇ当たり２５００ＰＵＮ単位）及び前記参考例
１と同一の方法で調製したラクトバシラス・ヘルベチカ
ス菌体破砕物６万活性単位（小麦蛋白質１ｇ当たり７５
活性単位）を添加し、５０℃に保持して加水分解を開始
し、バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）を用
いて経時的に、かつ短時間で遊離リジンの量を測定し、
遊離リジン量が３４％に達した時点で、８０℃で１０分
間加熱して酵素を失活させ、酵素分解を停止させ、のち
凍結乾燥し、小麦蛋白質からペプチド混合物約９５０ｇ
を得た。前記の製造法を２回反復して得られたペプチド
混合物を、前記試験方法により試験した結果、各遊離ア
ミノ酸の量及び遊離アミノ酸の合計量にはほとんと差異
が認められなかった。

【００５３】実施例３ 蛋白質含量８０％の市販小麦蛋白粉末（理研ビタミン社
製。エマソフトＥＸ−１００）５００ｇ及び蛋白質含量
９０％の市販大豆蛋白粉末（不二製油社製。商品名ＳＵ
ＰＲＯ）５００ｇを脱イオン水９ｋｇに溶解し、ｐＨを
７．０に調整し、７０℃で５分間保持して殺菌した。こ
の混合蛋白質溶液に市販のパンクレアチン（天野製薬社
製）８５万ＰＵＮ単位（蛋白質１ｇ当たり１０００ＰＵ
Ｎ単位）、プロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）１７
０万ＰＵＮ単位（蛋白質１ｇ当たり２０００ＰＵＮ単
位）及び前記参考例１と同一の方法で調製したラクトバ
シラス・ヘルベチカス菌体破砕物４万活性単位（蛋白質
１ｇ当たり４７活性単位）を添加し、５０℃に保持して
加水分解を開始し、ＨＰＬＣ（島津製作所製）を用いて
経時的に、かつ短時間で遊離アルギニンの量を測定し、
遊離アルギニン量が２１％に達した時点で８０℃で１０
分間加熱し、酵素を失活させ、酵素分解を停止させ、の
ち凍結乾燥し、ペプチド混合物約９５０ｇを得た。前記
の製造法を２回反復して得られたペプチド混合物を、前
記試験方法により試験した結果、各遊離アミノ酸の量及
び遊離アミノ酸の合計量にはほとんど差異が認められな
かった。

【００５４】実施例４ 乳清蛋白質含量７５％の市販乳清蛋白質粉末（カリフォ
ルニア・プロテイン社製）５００ｇ及び蛋白質含量９０
％の市販大豆蛋白粉末（不二製油社製。商品名ＳＵＰＲ
Ｏ）５００ｇを脱イオン水９ｋｇに溶解し、７０℃に５
分間保持して殺菌し、ｐＨを９．０に調整し、市販のプ
ロテアーゼＮアマノ（天野製薬社製）２５０万ＰＵＮ単
位（蛋白質１ｇ当たり４８４８ＰＵＮ単位）及び前記参
考例１と同一の方法で製造したラクトバシラス・ヘルベ
チカス菌体破砕物４万活性単位（蛋白質１ｇ当たり４８
活性単位）を添加し、５０℃に保持して加水分解を開始
し、バイオテックアナライザー（旭化成工業社製）を用
いて経時的に、かつ短時間で遊離リジンの量を測定し、
遊離リジン量が１８％に達した時点で８０℃で６分間加
熱し、酵素を失活させ、酵素分解を停止させ、凍結乾燥
し、ペプチド混合物約９５０ｇを得た。前記の製造法を
２回反復して得られたペプチド混合物を、前記試験方法
により試験した結果、各遊離アミノ酸の量及び遊離アミ
ノ酸の合計量にはほとんど差異が認められなかった。

【００５５】

【発明の効果】以上詳記したとおり本発明は、ペプチド
混合物の新規な製造法であり、本発明によって奏せられ
る効果は次のとおりである。 １）各遊離アミノ酸の量及び遊離アミノ酸の合計量がほ
ぼ一定のペプチド混合物が得られる。 ２）目的とするペプチド混合物が常に安定して得られ
る。 ３）一定品質のペプチド混合物を簡便に製造することが
できる。

フロントページの続き (72)発明者 齋藤 仁志 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳 業株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 川口 靖 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳 業株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 赤染 陽子 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳 業株式会社栄養科学研究所内 (72)発明者 越智 浩 神奈川県座間市東原５−１−83 森永乳 業株式会社栄養科学研究所内 (56)参考文献 特開 平５−252979（ＪＰ，Ａ) 特開 平２−138991（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−20252（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A23J 3/00 - 3/34 C07K 1/12

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 一定品質のペプチド混合物の製造法であ
   って、１種若しくは２種以上の蛋白質からなる原料蛋白
   質の水溶液又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質の水
   溶液に、１種若しくは２種以上の蛋白分解酵素を添加
   し、原料蛋白質又は予め軽度に加水分解した原料蛋白質
   の加水分解を開始し、加水分解により分解液中に遊離し
   たアミノ酸から選択された特定アミノ酸の量を経時的
   に、かつ短時間で測定し、原料蛋白質又は予め軽度に加
   水分解した原料蛋白質に含まれる特定アミノ酸の総量に
   対する遊離した特定アミノ酸の量の割合を算出し、その
   算出した値が予め設定された特定の範囲内に達したとき
   直ちに加水分解を停止することを特徴とするペプチド混
   合物の製造法。
2. 【請求項２】 遊離したアミノ酸から選択された特定ア
   ミノ酸が、リジン、フェニルアラニン、ロイシン又はア
   ルギニンである請求項１に記載のペプチド混合物の製造
   法。