CN100379448C - 蛋白酶抑制剂 - Google Patents

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Abstract

一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它包含选自乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段，以及转铁蛋白中的一种或者二种或几种的混合物作为活性成分。这种半胱氨酸蛋白酶抑制剂可用于对骨质疏松，恶性肿瘤诱发的高钙血症等疾病的预防和治疗，以及用于食品，饮料和饲料等。

Description

蛋白酶抑制剂
技术领域
本发明涉及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它包含选自乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段或者转铁蛋白的一种或多种组成部分作为活性成分，可被用于对骨质疏松和恶性高钙血症等疾病的预防或治疗剂，并可用于食品，饮料和饲料等等中。
背景技术
在其活性中心具有巯基的蛋白水解酶通常被称为半胱氨酸蛋白酶(硫醇蛋白酶)。组织蛋白酶L，组织蛋白酶B或组织蛋白酶K，与钙依赖性中性蛋白酶(CAMP)，木瓜蛋白酶，无花果蛋白酶和Promelain等一道，是典型的半胱氨酸蛋白酶中的一种。预期对这些半胱氨酸蛋白酶具有抑制作用的物质可被用于与半胱氨酸蛋白酶有关的疾病作为治疗剂，包括如下疾病：肌肉营养障碍，发育不良，心肌梗塞，中风，Alzheimer氏病，由头部损伤引起的知觉或运动性失调，多发性硬化症，外周神经疾病，白内障，炎症，过敏症，暴发性性肝炎，骨质疏松，高钙血症，乳癌，前列腺癌或前列腺扩大；或者用于癌症作为生长抑制剂或转移预防剂，以及用作抗血栓形成药物等。而且，近年来基于Katsunuma等所作的研究，组织蛋白酶L，组织蛋白酶B与骨质疏松或恶性高钙血症之间的关系已被阐明。因此，应用组织蛋白酶L抑制剂作为对骨质疏松或恶性高钙血症的治疗剂正特别引人注目(Nobuhiko Katsunuma，“BIO media”Vol.7，No.6，pp 73-77，1992)。在骨组织中，整个生命过程都在进行通过成骨细胞的骨生成和通过破骨细胞的骨再吸收。在生长发育时期，由于旺盛的骨生成超过骨再吸收作用使骨密度增加，然而在老年时期，由于过度的骨再吸收超过了骨生成而使骨密度降低，导致形成骨质疏松。有多种原因引起骨质疏松，而其中主要的原因之一特别是骨塌陷(骨再吸收)，它又进一步被区分为如下二种原因，也就是说，其一是归因于钙吸收和沉积作用的减退，更确切地说是与钙的供应，转运，吸收和沉积有关，据认为此过程还涉及维生素D衍生物和雌性激素(雌激素)等物质。另一个原因与骨支持组织，胶原蛋白的加速降解相关联，并且其主要原因是半胱氨酸蛋白酶，特别是组织蛋白酶L，组织蛋白酶B和组织蛋白酶K使骨胶原蛋白降解，这种蛋白酶是从位于破骨细胞内的溶酶体中分泌的。从破骨细胞内溶酶体中分泌的组织蛋白酶L和组织蛋白酶B，促进骨组织内胶原蛋白的降解，借此，引起衰老的骨溶解，钙被游离出，并同羟脯氨酸一起被释放进入血液中，因此，抑制由组织蛋白酶L，组织蛋白酶B和组织蛋白酶K介导的胶原蛋白降解，能够阻止过度的骨塌陷，从而使之有可能治疗骨质疏松。已知雌激素，合成代谢激素，钙制备品，维生素D，降血钙素或二膦酸盐等可作为这种骨质疏松症的治疗剂。此外，关于具有所谓半胱氨酸蛋白酶抑制作用，包括组织蛋白酶L抑制作用，组织蛋白酶B抑制作用和组织蛋白酶K抑制作用机制的用于骨质疏松症的治疗剂，应用某些半胱氨酸蛋白酶抑制剂，开发对骨质疏松症的治疗剂的研究正在进行中(JP 07-179496A，JP2002-501502A)。但是，还要求进一步开发对骨质疏松症的治疗剂。
同时，其血清中钙浓度升高超过正常值的高钙血症是一种代谢性障碍，并且常见于肿瘤病人。据说如果忽视了高钙血症，这种病人的生命将至多延续10天。在多数情况下是由于肿瘤的骨转移而引起。当肿瘤转移至骨骼，发生骨塌陷，钙被释放进入血液中。释放出的钙在肾脏中被处置，当骨塌陷的速度超过了肾脏的处置能力时形成高钙血症。作为治疗方法，已知的有通过用含有速尿灵的生理盐水灌输而促进从肾中排泄钙的方法，以及使用降血钙素作为对骨质疏松症治疗剂的方法。也就是说，用于骨质疏松症抑制骨再吸收的治疗剂还可以有效地作为对恶性高钙血症的治疗剂。
本发明的发明人已经公开了如下药剂作为可用于这种目的的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
(1)组织蛋白酶L特异性抑制多肽(JP 07-179496A)。
(2)硫醇蛋白酶抑制剂(JP 09-221425A)。
(3)缬氨酸衍生物及其用途(JP 2001-139534A)。
(4)硫醇蛋白酶抑制剂(JP 07-242600A)。
(5)FA-70C1物质(JP 2000-72797A)。
(6)FA-70D物质及其生产方法和用途(WO 97/31122)。
但是，还要求进一步开发无抗原性，并且可以作为安全物质使用的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
另一方面，迄今为止已知的是蛋白酶抑制物质存在于母乳中。已知的包含在母乳中的蛋白酶抑制物质包括α1-抗胰凝乳蛋白酶和α1-抗胰蛋白酶，并且在母乳中还含有微量包括间α2-胰蛋白酶抑制物质，α2-抗纤维蛋白溶酶，α2-巨球蛋白，抗凝血酶III和抗白细胞蛋白酶的抑制剂(Iso Kiyosawa，“八乳与婴儿营养”，Kanehara & Co Ltd.pp80-81)。
乳中具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的下列蛋白质已经被公开。
(1)具有分子量大约57kDa的新型半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它带有一个糖链，来源于牛初乳(JP 07-2896A)。
(2)具有分子量16±2kDa或13±2kDa的新型半胱氨酸蛋白酶抑制剂，来源于初乳(JP 07-126294A)。
(3)具有分子量16±2kDa或13±2kDa的新型蛋白质，来源于人乳并且制备方法相同(JP 10-80281A)。
(4)骨再吸收抑制剂，包括作为活性成分的乳来源碱性半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白(Cystatin)从乳中和/或从乳来源碱性半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白的降解产物制备(JP 2000-281587A)。
(5)乳碱性蛋白(MBP)中含有的半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C，以及体外实验中半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白C的骨再吸收抑制作用(“生物科学，生物技术和生物化学，日本”。Vol 66.No 12.2002 pp 2531-2536)。
哺乳动物乳中大量包含的蛋白质包括乳铁传递蛋白和β-酪蛋白。乳铁传递蛋白(此后有时缩写为Lf)是一种铁结合的糖蛋白，它主要包含在母乳中，具有分子量大约80kDa，并且已知对包括大肠埃希氏菌，念珠菌，梭菌和葡萄球菌的病原微生物显示有抗菌作用(儿科学杂志，Vol 94.P 1.1979和Journal of Dairy Science.Vol 67，P60，1984)。此外，因为乳蛋白质具有多种活性，已被广泛地用于治疗疾病。从乳中得到的蛋白质乳铁传递蛋白具有高度安全性，可以被长期连续使用。此外，乳铁传递蛋白本身无味，也没有气味，因此，作为添加剂它是多用途的，可加入各种食品，药物和饲料中。
下面作为实例公开了一些应用乳铁传递蛋白的治疗剂。
(1)抗肿瘤剂(JP 05-86932B)。
(2)抗类风湿剂(JP 05-186368A)。
(3)加速IgA产生的药剂(JP 06-32743A)。
(4)用于婴儿养育的经过加工的乳粉，对于改善粪便状况有效(JP06-205640A)。
(5)用于血管生成相关疾病的治疗剂(JP 09-194388A)。
(6)用于抑制癌转移的口服药剂(JP 10-59864)。
(7)IgE产生抑制剂(JP 2001-158748A)。
还公开了下列Lf水解产物的作用。
(8)抗菌作用和酪氨酸酶抑制作用(欧洲专利438750)。
(9)对致病菌附着于细胞的抑制作用(JP 03-220130A)。
(10)抗病毒作用(JP 01-233226A)。
还更进一步地公开了含有铁结合的乳铁传递蛋白作为活性成分，对于预防或治疗骨相关疾病有效的使骨质富集的药剂(JP 2000-281586A)。这是一种技术，在此通过给予铁-乳铁传递蛋白即铁结合的乳铁传递蛋白，来提供铁，一种包含在脯氨酸和赖氨酸水合作用中酶的辅酶，从而使胶原蛋白的合成过程增强，脯氨酸和赖氨酸是骨基质胶原蛋白的前体物。
如上面所述，迄今已经发现了半胱氨酸蛋白酶抑制物质，并且还在哺乳动物的细胞，血液，尿和乳中找到了它们。在半胱氨酸蛋白酶抑制物质中，从蛋白质中得到的这种物质通常被称为半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白。已知半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白家族具有共同的活性部位，并且其序列已被公开(Hayaishi Osamu Wrote，“蛋白酶及其抑制剂”Medical View Co.Ltd出版，第一版，第一次印刷，P104-115，1993)。
但是，还不知道乳铁传递蛋白，它的部分肽以及转铁蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。此外，也不知道乳铁传递蛋白和转铁蛋白都具有与半胱氨酸蛋白酶抑制蛋白家族中保留的活性部位序列同源的区域。而且还不知道，具有通过乳铁传递蛋白，它的部分肽或转铁蛋白抑制半胱氨酸蛋白酶活性作用机制的，用于预防或治疗骨相关疾病的药剂。
发明内容
本发明的目的是提供一种多用途半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可以被广泛地用作食品材料。并且还可以将它用于对骨质疏松和恶性高钙血症等疾病的预防或治疗剂，以及用于多种类型的食品，饮料和饲料。
本发明者为寻求无抗原性且安全的可用作半胱氨酸蛋白酶抑制剂的物质进行了广泛研究，结果发现从乳中来源一种蛋白质-乳铁传递蛋白，来源于乳铁传递蛋白的肽片段，以及转铁蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，从而完成了本发明。
如下(1)-(12)是本发明的要点。
(1)一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它包含乳铁传递蛋白、乳铁传递蛋白的肽片段以及转铁蛋白中的一种或多种作为活性成分。
(2)根据(1)的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中乳铁传递蛋白和/或转铁蛋白是金属-饱和形式，部分地金属-饱和形式和脱-金属形式中的一种或多种。
(3)根据(1)或(2)的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中乳铁传递蛋白和/或乳铁传递蛋白的肽片段是如下面(a)-(d)中所示的蛋白质或肽中的一种或多种；
(a)具有序列表SEQ ID No.1中所显示的至少氨基酸序号679-695的氨基酸序列的蛋白质或肽，
(b)具有序列表SEQ ID No.1中所显示的至少氨基酸序号679-695的氨基酸序列的蛋白质或肽，包括一个或多个氨基酸的取代，铁失、添加或倒位，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
(c)具有序列表SEQ ID No.2中所显示的至少氨基酸序号676-692的氨基酸序列的蛋白质或肽，以及
(d)具有序列表SEQ ID No.2中所示显示的至少氨基酸序号676-692的氨基酸序列的蛋白或肽，包括一个或多个氨基酸的取代，氛失，加入或倒位，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
(4)根据(1)-(3)中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，是与半胱氨酸蛋白酶有关疾病的预防或治疗剂。
(5)根据(1)-(4)中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，其中与半胱氨酸蛋白酶有关的疾病是骨质疏松或恶性高钙血症。
(6)食品和饮料组合物或饲料组合物，是通过加入根据(1)-(5)中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制剂而制成的。
(7)治疗与半胱氨酸蛋白酶有关疾病的方法，其中将根据(1)-(6)中任何之一的半胱氨酸蛋白酶抑制剂给予受试者。
(8)乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段以及转铁蛋白中的一种或多种在制备半胱氨酸蛋白酶抑制剂中的用途。
(9)根据(8)的用途，其中乳铁传递蛋白和/或转铁蛋白是金属饱和形式，部分地金属饱和形式和脱金属形式中的一种或多种。
(10)根据(8)或(9)的用途，其中乳铁传递蛋白和/或转铁蛋白是如下面(a)-(d)中所示的蛋白质或肽中的一种或多种；
(a)具有序列表SEQ ID No.1中所显示的至少氨基酸序号679-695的氨基酸序列的蛋白质或肽，
(b)具有序列表SEQ ID No.1中所显示的至少氨基酸序号679-695的氨基酸序列的蛋白质或肽，包括一个或多个氨基酸的取代，缺失，加入或倒位，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，
(c)具有序列表SEQ ID No.2中所显示的至少氨基酸序号676-692的氨基酸序列的蛋白质或肽，以及
(d)具有序列表SEQ ID No.2中所显示的至少氨基酸序号676-692的氨基酸序列的蛋白质或肽，包括一个或多个氨基酸的取代，缺失，加入或倒位，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
(11)根据(8)-(10)中任何之一的用途，其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一种对与半胱氨酸蛋白酶有关疾病的预防或治疗剂。
(12)根据(11)的用途，其中与半胱氨酸蛋白酶有关的疾病是骨质疏松或恶性高钙血症。
附图简述：
图1是显示通过反向酶谱分析检测牛乳蛋白质的图形(照片)。
图2是显示人乳铁传递蛋白对半胱氨酸蛋白酶抑制活性的图。
图3是显示如下四个肽的氨基酸序列的图：
人乳铁传递蛋白的肽片段(人乳铁传递蛋白肽Y679-K695)，其在制备实施例1中制备；
牛乳铁传递蛋白的肽片段(牛乳铁传递蛋白肽Y676-K692)；
具有序列表SEQ ID No.3中显示的氨基酸序号666-682氨基酸序列的肽(人转铁蛋白肽Y666-R682)；以及
具有序列表SEQ ID No.4中显示的氨基酸序号672-688氨基酸序列的肽(牛转铁蛋白肽Y672-R688)。
图4是显示人乳铁传递蛋白肽Y679-K695对半胱氨酸蛋白酶抑制活性的图。
图5是显示转铁蛋白对半胱氨酸蛋白酶抑制活性的图。
实施本发明的最佳模式：
下面将详细阐述本发明的优选实施方案。但是，本发明并不限于下面的优选实施方案，并且在本发明的范围之内可以作任何形式的改变。在本详述中使用的所有百分数都表示质量，除非另有说明。
本发明涉及一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它包含作为活性成分的一种或多种乳铁传递蛋白(例如具有Swiss-Prot注册号：P02788氨基酸序列的人乳铁传递蛋白，具有Swiss-Prot注册号：P24627氨基酸序列的牛乳铁传递蛋白，具有Swiss-Prot注册号：Q29477氨基酸序列的山羊乳铁传递蛋白，具有Swiss-Prot注册号：O77811氨基酸序列的马乳铁传递蛋白)，乳铁传递蛋白的肽片段，以及转铁蛋白(例如具有Swiss-Prot注册号：P02787氨基酸序列的人转铁蛋白，具有Swiss-Prot注册号：Q29443氨基酸序列的牛转铁蛋白，具有Swiss-Prot注册号：P27425氨基酸序列的马转铁蛋白)。
在本发明中使用的乳铁传递蛋白可以是市场可购买到的乳铁传递蛋白，或者可以是按照包括离子交换层析的常规程序从原料中分离出的乳铁传递蛋白，原料包括例如哺乳动物初乳，过渡乳，成熟乳，最后期乳或者脱脂乳或乳清，都是加工过的乳。特别优选的是使用以工业规模生产的市场可购买到的乳铁传递蛋白(例如由Morinaga乳业公司生产的乳铁传递蛋白)。此外还可以使用通过遗传工程，应用微生物，哺乳动物细胞或转基因动物等生产的乳铁传递蛋白。
对于本发明半胱氨酸蛋白酶抑制剂的作用，乳铁传递蛋白中的含金属量不是特别受限制，并且可以使用由如下形式乳铁传递蛋白组成的一个或多个基团：以盐酸或柠檬酸等使其脱铁的脱金属形式乳铁传递蛋白；具有100％饱和度的金属饱和的乳铁传递蛋白，其可通过使脱金属形式乳铁传递蛋白与包括铁，铜，锌，镁等金属螯合获得；以及以金属部分饱和的乳铁传递蛋白，金属是以小于100％的饱和度被结合在其中。
关于在本发明中使用的产生乳铁传递蛋白部分肽的方法，在此可对如下三种方法进行例证说明：按照常规程序，通过用酸或蛋白酶水解上述的乳铁传递蛋白的生产方法；按照遗传工程技术通过产生重组肽的生产方法；或者按照化学合成产生合成肽的方法。当应用通过水解的生产方法时，本发明乳铁传递蛋白的肽片段可以以混合物的形式被使用，其中部分肽包含在水解产物中，或者可以按照包括HPLC等的常规程序纯化后，以纯化肽的形式被使用。
例如具有序列表SEQ ID No.1中显示的氨基酸序列的人乳铁传递蛋白，或者具有序列表SEQ ID No.1中显示的至少氨基酸序号679-695的氨基酸序列的蛋白质或肽，可以作为例子说明用于本发明的乳铁传递蛋白或乳铁传递蛋白部分肽的优选形式。在此，具有序列表SEQ IDNo.2中显示的氨基酸序列的牛乳铁传递蛋白，或者具有序列表SEQ IDNo.2中显示的至少氨基酸序号676-692的氨基酸序列的蛋白质或肽，也可以作为说明例证。请注意，序列表SEQ ID No.1中显示的以及序列表SEQ ID No.2中显示的氨基酸序列中，氨基酸序号1-19的序列是信号序列。
这些乳铁传递蛋白和乳铁传递蛋白的肽片段具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，因此它们可以被用作本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。
而且认为，如后面所述因为全长乳铁传递蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，所以具有如下二种氨基酸序列的肽都具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性：一种氨基酸序列包含序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序号679-695，并进一步向N-端侧和C-端侧的一侧或二侧延伸；另一种氨基酸序列包含序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序号676-692，并进一步向N-端侧和C-端侧的一侧或二侧延伸。
因为本发明已揭示了显示半胱氨酸蛋白酶抑制活性的区域，所以可根据包含此区域的氨基酸序列，通过化学合成以及借助于基因重组技术获得上述蛋白质或肽。例如，根据编码包含此区域的氨基酸序列的核苷酸序列，制备合适的引物。然后使用此引物，并以包含目标核苷酸序列的cDNA作模板，借助于PCR等技术扩增此核苷酸序列。应用适合的表达系统表达所获得的核苷酸序列，从而可以得到上述的蛋白质或肽。
由于在种、属和个体等方面的差异，在基因的一个或多个位置通常存在突变，包括一个或多个核苷酸的取代，缺失，插入，添加或倒位，并且在由包含上述突变的基因编码的蛋白质氨基酸序列中发生取代。因此，可以被用于本发明的乳铁传递蛋白和乳铁传递蛋白的肽片段，在不损害半胱氨酸蛋白酶抑制活性的限度内，也可包含这种取代。
可以被用于本发明的乳铁传递蛋白或乳铁传递蛋白的肽片段，包括具有序列表SEQ ID No.1中显示的至少氨基酸序号679-695的氨基酸序列的蛋白质或肽，或者具有序列表SEQ ID No.2中显示的至少氨基酸序号676-692的氨基酸序列的蛋白质或肽，这种蛋白质或肽包含一个或多个氨基酸的取代，缺失，插入，添加或倒位，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。“一个或多个氨基酸的取代，缺失，插入，添加或倒位”可任选地设置，只要不影响具有上述氨基酸序号氨基酸序列的蛋白质或肽与半胱氨酸蛋白酶之间的立体相互作用，并且不损害半胱氨酸蛋白酶活性。例如“几个”是指2-5个氨基酸，优选地是2个或3个氨基酸，更优选地是2个氨基酸。它随氨基酸序列的蛋白质构象中氨基酸残基的位置或种类而改变，此氨基酸序列是在序列表SEQ IDNo.1中显示的氨基酸序号679-695的氨基酸序列，或者是在序列表SEQID No.2中显示的氨基酸序号676-692的氨基酸序列。
在序列表SEQ ID No.1中显示的氨基酸序列氨基酸序号686-690内氨基酸的取代，或者在序列表SEQ ID No.2中显示的氨基酸序列氨基酸序号683-687内氨基酸的取代，优选地是不改变氨基酸种类的取代。也就是说，优选的是在上述序列中的替换氨基酸是具有像被替换的氨基酸类似结构分类特点的氨基酸。具体地说，当上述序列中的氨基酸是酸性氨基酸或酸性氨基酸的酰胺时，优选地是以天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺取代；在碱性氨基酸的情况下，优选地是以赖氨酸，组氨酸或精氨酸取代；在芳香族氨基酸的情况下，优选地是以苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸取代；在脂肪族氨基酸或羟氨基酸的情况下，优选地是以甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸或苏氨酸取代；另外，在除了上述氨基酸的其它氨基酸(半胱氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸等)的情况下，优选的是可任选地进行取代，只要不损害半胱氨酸蛋白酶的活性。更进一步地，一个或多个氨基酸的取代和缺失等，还可能包含在除了显示在序列表SEQ ID No.1中的氨基酸序号679-695氨基酸序列的氨基酸之外的氨基酸中，或者包含在除了显示在序列表SEQ ID No.2中的氨基酸序号676-692氨基酸序列的氨基酸之外的氨基酸中。在这种情况下，名词“几个”是指例如2-10个氨基酸，优选的是2-5个氨基酸，更优选地是2个或3个氨基酸，虽然可随蛋白质构象中氨基酸残基的位置或种类而改变。
而且，可使用于本发明的乳铁传递蛋白或乳铁传递蛋白部分肽的实例，包括与如下二种已知的蛋白质或肽具有氨基酸序列同源性不小于80％的蛋白质或肽，优选地是不小于90％，更优选地是不小于95％，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性：一种已知的蛋白质或肽是具有显示在序列表SEQ ID No.1中的至少氨基酸序号679-695的氨基酸序列；或者另一种已知的蛋白质或肽是具有显示在序列表SEQ ID No.2中的至少氨基酸序号676-692的氨基酸序列。
可以获得一种核苷酸序列，它编码与上述乳铁传递蛋白或乳铁传递蛋白部分肽基本相同的蛋白质或肽，例如通过以定点诱变修饰此核苷酸序列，以这样一种方式，致使位于特定部位的氨基酸残基包含取代，缺失，插入、添加或倒位等。借助于常规的诱变处理可获得这种被修饰的核苷酸序列。
通过在适合的细胞中表达包括突变的核苷酸序列，并且借助于在本发明试验实施例或实施例中所述的测定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的方法，检测半胱氨酸蛋白酶抑制活性，可获得编码与乳铁传递蛋白或乳铁传递蛋白部分肽基本相同的蛋白质或肽的核苷酸序列。
在本发明还可使用转铁蛋白或转铁蛋白的部分肽。在本发明中使用的转铁蛋白可以是市场可购买到的转铁蛋白，或者是按照包括柱层析的常规程序，从包括哺乳动物乳或血液的原料中通过分离可以获得的转铁蛋白。此外还可以使用通过遗传工程，应用微生物，哺乳动物细胞或转基因动物等生产的转铁蛋白。
对于本发明半胱氨酸蛋白酶抑制剂的作用，转铁蛋白中的含金属量不是特别受限制，并且可以使用由如下形式转铁蛋白组成的一个或多个基团：以盐酸或柠檬酸等使其脱铁的脱金属形式的转铁蛋白；具有100％饱和度的金属饱和的转铁蛋白，其可通过使脱金属形式转铁蛋白与包括铁、铜、锌、镁等金属螯合而获得；以及以金属部分饱和的转铁蛋白，金属是以小于100％的饱和度被结合在其中。
在本发明中，转铁蛋白的部分肽也可使用。将转铁蛋白的氨基酸序列与推断为乳铁传递蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的区域(SEQ ID No.1的氨基酸序号679-695，或者SEQ ID No.2的氨基酸序号676-692的区域)相比较，发现SEQ ID No.3中显示的人转铁蛋白氨基酸序列氨基酸序号666-682的区域(人转铁蛋白肽Y666-R682)，以及SEQ ID No.4中显示的牛转铁蛋白氨基酸序列氨基酸序号672-688的区域(牛转铁蛋白肽Y672-R688)，与乳铁传递蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的区域存在高度同源性(图3)。除此事实之外，如在下述实施例中所显示的，还已证明转铁蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，因此强烈地暗示，具有上述区域的人转铁蛋白和牛转铁蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
关于在本发明中使用的转铁蛋白部分肽的制备方法，在此可通过如下三种方法进行例证说明：按照常规程序，通过用酸或蛋白酶水解上述转铁蛋白的生产方法；按照遗传工程技术，通过产生重组肽的生产方法；或者按照化学合成产生合成肽的方法。当应用通过水解的生产方法时，本发明转铁蛋白的部分肽可以以混合物的形式被使用，其中部分肽包含在水解产物中，或者也可以按照包括HPLC等的常规程序纯化后，以纯化肽的形式被使用。
例如具有序列表SEQ ID No.3中显示的氨基酸序列的人转铁蛋白，或者具有序列表SEQ ID No.3中显示的至少氨基酸序号666-682的氨基酸序列的蛋白质或肽，可以作为例子说明用于本发明的转铁蛋白或转铁蛋白的部分肽的优选形式。在此，具有序列表SEQ ID No.4中显示的氨基酸序列的牛转铁蛋白，或者具有序列表SEQ ID No.4中显示的至少氨基酸序号672-688的氨基酸序列的蛋白质或肽，也可作为说明例证。注意，序列表SEQ ID No.3中显示的，以及序列表SEQ ID No.4中显示的氨基酸序列中，氨基酸序号1-19的序列是信号序列。
根据与序列表SEQ ID No.1中氨基酸序号679-695的氨基酸序列(人乳铁传递蛋白)，以及与序列表SEQ ID No.2中氨基酸序号676-692的氨基酸序列(牛乳铁传递蛋白)的序列同源性，可认为由序列表SEQ ID No.3中显示的氨基酸序号666-682氨基酸序列组成的肽，以及由序列表SEQ ID No.4中显示的氨基酸序号672-688氨基酸序列组成的肽具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，它们已被揭示是本发明中带有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的区域。而且认为，因为全长的转铁蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性，所以具有如下二种氨基酸序列的肽都具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性：一种氨基酸序列包含序列表中SEQ ID No.3的氨基酸序号666-682，并进一步向N-端侧和C-端侧的一侧或二侧延伸；另一种氨基酸序列包含序列表中SEQ ID No.4的氨基酸序号672-688，并进一步向N-端侧和C-端侧的一侧或二侧延伸。
因为本发明已揭示了一个显示半胱氨酸蛋白酶抑制活性的区域，所以可根据包含此区域的氨基酸序列，通过化学合成以及借助于基因重组技术获得上述肽。例如，根据编码包含此区域的氨基酸序列的核苷酸序列，制备合适的引物。然后使用此引物，并以包含目标核苷酸序列的cDNA作模板，借助于PCR等技术扩增此核苷酸序列。应用适合的表达系统表达所获得的核苷酸序列，从而可以得到上述的蛋白质或肽。
由于在种、属和个体等方面的差异，在基因的一个或多个位置通常存在突变，包括一个或多个核苷酸的取代，缺失、插入、添加或倒位，并且在包含上述突变的基因编码的蛋白质氨基酸序列中发生取代。因此，可以被用于本发明的转铁蛋白和转铁蛋白的部分肽，在不损害半胱氨酸蛋白酶抑制活性的限度内，也可包含这种取代。
可以被用于本发明的转铁蛋白或转铁蛋白的部分肽，包括具有序列表SEQ ID No.3中显示的至少氨基酸序号666-682的氨基酸序列的肽，或者具有序列表SEQ ID No.4中显示的至少氨基酸序号672-688的氨基酸序列的肽，它们包含一个或多个氨基酸的取代、缺失、插入，添加或倒位，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。“一个或多个氨基酸的取代，缺失，插入，添加或倒位”可任选地设置，只要不影响具有上述氨基酸序号氨基酸序列的蛋白质或肽与半胱氨酸蛋白酶之间的立体相互作用，并且不损害半胱氨酸蛋白酶活性。例如，“几个”是指2-5个氨基酸，优选地是2个或3个氨基酸，更优选地是2个氨基酸。它随氨基酸序列的蛋白质构象中氨基酸残基的位置或种类而改变，此氨基酸序列是在序列表SEQ ID No.3中显示的氨基酸序号666-682的氨基酸序列，或者是在序列表SEQ ID No.4中显示的氨基酸序号672-688的氨基酸序列。在序列表SEQ ID No.3中显示的氨基酸序列的氨基酸序号673-677内，或者在序列表SEQ ID No.4中显示的氨基酸序列的氨基酸序号679-683内氨基酸的取代，优选地是不改变氨基酸种类的取代。也就是说，优选的是在上述序列中的替换氨基酸是具有像被替换的氨基酸类似结构分类特点的氨基酸。具体地说，当上述序列中的氨基酸是酸性氨基酸或酸性氨基酸的酰胺时，优选地是以天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺或谷氨酰胺取代；在碱性氨基酸的情况下，优选地是以赖氨酸，组氨酸或精氨酸取代；在芳香族氨基酸的情况下，优选地是以苯丙氨酸，酪氨酸或色氨酸取代；在脂肪族氨基酸或羟氨基酸的情况下，优选地是以甘氨酸，丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，丝氨酸或苏氨酸取代；另外，在除了上述氨基酸的其它氨基酸(半胱氨酸，甲硫氨酸，脯氨酸等)的情况下，优选的是可任选地进行取代，只要不损害半胱氨酸蛋白酶的活性。更进一步地，一个或多个氨基酸的取代和缺失等，还可能包含在除了显示在序列表SEQ ID No.3中的氨基酸序号666-682氨基酸序列的氨基酸之外的氨基酸中，或者包含在除了显示在序列表SEQ ID No.4中的氨基酸序号672-688氨基酸序列的氨基酸之外的氨基酸中。在这种情况下，名词“多个”是指例如2-10个氨基酸，优选地是2-5个氨基酸，更优选地是2个或3个氨基酸，虽然可随蛋白质构象中氨基酸残基的位置或种类而改变。
而且，可以使用于本发明的转铁蛋白或转铁蛋白的部分肽的实例，包括与如下二种已知的蛋白质或肽具有氨基酸序列同源性不小于80％的蛋白质或肽，优选地是不小于90％，更优选地是不小于95％，并且具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性：一种已知的蛋白质或肽是具有显示在序列表SEQ ID No.3中的至少氨基酸序号666-682的氨基酸序列；或者另一种已知的蛋白质或肽是具有显示在序列表SEQ ID No.4中的至少氨基酸序号672-688的氨基酸序列。
可以获得一种核苷酸序列，它编码与上述转铁蛋白或转铁蛋白部分肽基本相同的蛋白质或肽，例如通过以定点诱变修饰此核苷酸序列，以这样一种方式，致使位于特定部位的氨基酸残基包含取代、缺失、插入，添加或倒位等，借助于常规的诱变处理可获得这种被修饰的核苷酸序列。
通过在适合的细胞中表达包括突变的核苷酸序列，并且借助于在本发明试验实施例或实施例中所述的测定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的方法，检测半胱氨酸蛋白酶抑制活性，可获得编码与转铁蛋白或转铁蛋白部分肽基本相同的蛋白质或肽的核苷酸序列。
在本发明的蛋白酶抑制剂中，乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段，或者转铁蛋白，转铁蛋白的部分肽，可单独使用，或者可以其二种或几种合在一起使用。而且，可以单独使用一种类型的乳铁传递蛋白的肽片段，或者以组合形式使用其几种类型。此外，也可单独使用一种类型的转铁蛋白的部分肽，或者以组合形式使用其几种类型。
可用于本发明的乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段，或者转铁蛋白，具有针对半胱氨酸蛋白酶如组织蛋白酶B，L，S，以及木瓜蛋白酶的抑制活性。可以按照Barrett等(酶学方法，Vol.80.p535-561，1981)的方法测定半胱氨酸蛋白酶抑制活性。将在本发明的试验实施例和实施例中对此测定方法作详细的说明。
通过使用乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段或转铁蛋白，并使它们与药用可接受载体组合，可以产生本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。对本发明药物制剂的给药剂型没有特别的限制，可根据治疗目的作适当的选择。具体地说，给药剂型的实例包括片剂，丸剂，粉剂，液体剂，悬液，乳剂，颗粒剂，胶囊，糖浆剂，栓剂，注射液，软膏剂，贴剂，滴眼液和洗鼻剂。通常用于药剂中作为药物载体的添加剂如赋形剂，粘合剂，崩解剂，润滑剂，稳定剂，芳香剂，稀释剂，表面活性剂和用于注射的溶液，也可在配制时使用。
对包含在本发明药剂中的乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段或转铁蛋白的含量没有特别的限制，可适当地进行选择。例如，通常可在制剂中按重量放置0.005-60％，优选地是0.05-50％。
通过对受试者口服或注射给予本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，可以治疗与半胱氨酸蛋白酶有关的疾病。在此使用的名词“受试者”可以是人或者除人以外的哺乳动物。
对给予本发明药剂的方法也没有特别的限制，可以根据药物的剂型，受试者的年龄或性别，以及包括受试者症状严重程度在内的其它状况来决定。可以根据用药方案，受试者的年龄或性别，疾病程度和其它状况，适当地设置本发明药剂中活性成分的剂量。通常，作为活性成分乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段或转铁蛋白的剂量，可根据从0.1至1200mg/kg/日的剂量范围设置，优选地为10-500mg/kg/日，可每日给予该药物一次或几次。
本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂通常是作为对如下与半胱氨酸蛋白酶有关疾病的预防或治疗剂，例如过敏症，肌肉营养障碍，心肌梗塞，中风，Alzheimer氏病，多发性硬化症，白内障，骨质疏松，恶性高钙血症，前列腺增生，乳癌，前列腺癌和牙周炎，或者作为癌细胞生长或转移的抑制剂，或者作为对细菌(金黄色葡萄球菌V8等)或病毒(脊髓灰质炎病毒，疱疹病毒，冠状病毒，艾滋病毒等)的生长抑制剂。本发明的半胱氨酸蛋白酶抑制剂可被单独使用，或者与对上述疾病的已知预防或治疗剂，或者已知的细菌或病毒生长抑制剂共同使用。这种组合形式可以增强对疾病的预防和治疗作用，或者增强对细菌或病毒的生长抑制作用。将被组合的对上述疾病的已知预防和治疗剂，或者对细菌或病毒的已知生长抑制剂，可作为活性成分包含在本发明的抑制剂中，或者不包含在本发明的抑制剂中，而作为另一种药剂买来，在使用时被组合。
通过将乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段或转铁蛋白加到食品或饮料的原料中，可生产本发明的食品和饮料组合物，可以经口腔摄取这种组合物。作为原料，用于饮料或食品中的物质一般都可使用。以同平常的食品和饮料类似的方法可制备本发明的食品和饮料组合物，不同的是加入了半胱氨酸蛋白酶抑制剂。这种食品和饮料组合物形式的实例包括，饮料如冷饮，含二氧化碳饮料，营养饮料，水果饮料和乳酸菌饮料(包括饮料的浓缩贮备液和调制干粉)；冰冻甜食如冰淇淋，冰冻果子露的刨冰；糖果如冰糖，口香糖，橡皮糖，巧克力，糖丸，零食，饼干，果子冻，果酱，乳酪和烘制糖果；乳制品如消毒奶，乳饮料，发酵酸奶和黄油；还包括面包，肠营养配制品，液体配制品，婴儿奶粉和运动饮料，以及其它功能性食品。
被加入本发明食品和饮料组合物中的乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白部分肽或转铁蛋白的量，可根据食品和饮料组合物的形式适当地选定，通常按重量0.005-60％的含量将它们加入食品或饮料中，优选地是按重量0.05-50％的含量加入。
通过将乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白部分肽或转铁蛋白加入饲料中，可以产生本发明的饲料组合物，因此可通过口服对一般的哺乳动物，家畜，饲养鱼，农田鱼和宠物动物给药。这种饲料组合物形式的实例包括宠物食品，家畜饲料和养鱼饲料，通过将乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段或转铁蛋白与谷物，酒糟，米糠，鱼粉，骨粉肥料，油和脂肪，脱脂乳，乳清，矿物饲料，酵母等调配，可产生本发明的饲料组合物。
被加入本发明饲料组合物中乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白部分肽或转铁蛋白的量，可根据饲料组合物的形式适当地选定，通常按重量0.005-60％的含量将它们加入饲料组合物中，优选地是按重量0.05-50％的含量加入。
本发明的食品和饮料组合物或饲料组合物，可以是具有其功效明示，可对所示疾病作为预防或治疗剂的食品和饮料组合物或饲料组合物。也就是说，它可以被标明作为对与半胱氨酸有关疾病如骨质疏松，恶性高钙血症的预防或治疗剂。
在此使用的名词“标明”，意指对使用者告知上述功效，并且包括例如，在本发明食品和饮料组合物或饲料组合物的商品上，或者在其包装或广告上标明上述功效，并参考和展示具有这种明示的物质。特别优选的实施方案是，标明它作为特定健康用处的食品[参照保健强制法规的条款12(1)，细则5(日本卫生，劳动和福利部长第86号法令，2003年4月30日)]。
下面将通过试验实施例对本发明作详细论述。
[试验实施例1]
实施本试验，以便检测乳中的半胱氨酸蛋白酶抑制物质。
(1)检测方法：
本发明者使用“反向酶谱分析”作为检测蛋白酶抑制物质的方法，并检测了位于SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上的蛋白酶抑制物质。反向酶谱分析是基于与正常酶谱分析相反的技术，反向酶谱分析的基本原理是如下。即把含有蛋白酶抑制物质的样品施加于含有明胶的SDS-聚丙烯酰胺凝胶条上并进行电泳，随后将此凝胶条浸泡在蛋白酶溶液中以便降解凝胶中的蛋白质。在存在抑制物质的部位蛋白酶的活性被抑制，此部位的明胶免于被蛋白酶降解并用染色液将其染色，因此能够检测抑制物质。
(2)试验方法
本发明中反向酶谱分析的方法如下。
使用全乳蛋白和牛乳铁传递蛋白(由Morinaga乳业公司制造)作样品，以含有0.1％明胶的12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳(此后SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳有时被缩写为SDS-PAGE)。电泳之后，将凝胶浸入2.5％Triton X-100溶液中浸洗45分钟，进而将凝胶浸入蒸馏水中45分钟，如此重复操作浸洗3次。然后，将此凝胶浸入含有1mg木瓜蛋白酶(31单位/ml)的0.025M乙酸缓冲液(pH 5.5)100ml中，并通过在37℃保持在此溶液中10小时消化明胶。再以蒸馏水洗此凝胶，用染色液(0.025％考马士亮兰(CBB)R-250，40％甲醇，7％乙酸水溶液)染色1小时，然后用脱色液(40％甲醇，10％乙酸水溶液)脱色。
除此之外，作为对照试验，以如上述同样的方法，用不含明胶的12.5％SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行反向酶谱分析。另外还进行典型的12.5％SDS-PAGE(CBB染色)分析。
(3)试验结果：
本试验的结果如图1中所示。图1显示出反向酶谱分析图形。图1中电泳道1显示乳中全蛋白质的典型SDS-PAGE图，电泳道2显示乳中全蛋白质的反向酶谱分析图，电泳道3显示乳中全蛋白质的反向酶谱分析图，其中的凝胶不含有明胶(对照)，电泳道4显示牛乳铁传递蛋白的反向酶谱分析图，而电泳道5显示牛乳铁传递蛋白反向酶谱分析图，其中的凝胶不含有明胶(对照)。图中的箭头指示SDS-PAGE过程中牛乳铁传递蛋白(分子量78kDa)迁移位置。另外，电泳道6和7与本试验实施例没有直接的关系。
如从图1中显示的，电泳道2中与在牛乳铁传递蛋白(78kDa)迁移位置几乎相同的位置发现了反向酶谱分析的阳性电泳条带。这表明乳中确实存在具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的物质。此外，在显示使用木瓜蛋白酶的反向酶谱分析的电泳道4中也发现了阳性电泳条带，其中牛乳铁传递蛋白被迁移。
上述结果表明从牛得到的乳铁传递蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
[试验实施例2]
实施本试验以便确定在试验实施例1中被表明具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的78kDa电泳条带的N-端氨基酸序列。
(1)试验方法
以在试验实施例1中使用的乳中全蛋白质样品进行SDS-PAGE分析，并将蛋白质转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用CBB将PVDF膜染色，然后切取迁移在78kDa附近的被染色条带。用G1005A蛋白质测序系统(Hewlett-packard公司制造)测定此条带的N-端氨基酸序列。
(2)试验结果
作为对来源于乳中的被染色78kDa条带氨基酸序列的测定结果，发现此78KDa染色条带的N-端氨基酸序列，与序列表SEQ ID No.2中描述的牛乳铁传递蛋白相应序列完全一致。因此，本试验结果和试验实施例1都揭示，牛乳铁传递蛋白具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
[试验实施例3]
实施本试验，以便确定牛乳铁传递蛋白对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(1)试验方法
用市场购买到的牛乳铁传递蛋白(Morinaga乳业公司制品)作为试验样品，测定其对包括木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L和组织蛋白酶S(这些蛋白酶均从Wako纯化学工业公司获得)的半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。参照如下述Barrett等(“酶学方法”.Vol 80，P 535-561)的方法测定其抑制活性。即，将z-phe-Arg-MCA(最后浓度20mM，Peptide Institute，Inc.制造)作为底物加入到其中以不同浓度溶解有试验样品的0.1M乙酸缓冲液(pH 5.5)中。然后，加入半胱氨酸蛋白酶溶液(在本试验为选自木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L和组织蛋白酶S的蛋白酶，均为Wako纯化学工业公司制品，最后浓度为15单位/ml)，使整个溶液混匀，反应在37℃进行10分钟。随后用荧光分光计(Hitachi公司制造)测量从被消化底物释放的AMC(7-氨基-4-甲基-香豆素)的荧光强度(激发波长370nm，发射波长460nm)。
(2)试验结果
本试验的结果被显示在表1中。表1显示牛乳铁传递蛋白对木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L和组织蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。结果表明，木瓜蛋白酶和组织蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶活性被10-6M的牛乳铁传递蛋白完全抑制，而组织蛋白酶B和组织蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶活性被10-5M的牛乳铁传递蛋白抑制70％以上，被10-4M的牛乳铁传递蛋白完全抑制。从而发现牛乳铁传递蛋白对木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L和组织蛋白酶S具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
[表1]
Figure C20038010062800211
[试验实施例4]
实施本试验以便确定人乳铁传递蛋白对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(1)试验方法
用市场购买到的人乳铁传递蛋白(Morinaga乳业公司制品)作为试验样品，测定其对包括木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L和组织蛋白酶S(这些蛋白酶均从Wako纯化学工业公司获得)的半胱氨酸蛋白酶的抑制活性，按照与试验实施例3中所述测定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的相同方法进行测定。
(2)试验结果：
如图2中显示了本试验的结果。图2显示出人乳铁传递蛋白对木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L和组织蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。结果表明，木瓜蛋白酶和组织蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶活性被10-6M的人乳铁传递蛋白完全抑制，组织蛋白酶B和组织蛋白酶S的半胱氨酸蛋白酶活性被10-5M的人乳铁传递蛋白抑制了80％以上，而被10-4M的人乳铁传递蛋白几乎完全抑制。从而发现人乳铁传递蛋白对木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B，组织蛋白酶L和组织蛋白酶S具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
[试验实施例5]
实施本试验以便确定乳铁传递蛋白的肽片段对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(1)试验方法
按照与试验实施例3中所述测定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的相同方法，用具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序号679-695氨基酸序列的肽(此后用人乳铁传递蛋白肽Y679-K695表示，图3)作为试验样品，测定其对包括木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B和组织蛋白酶L(这些蛋白酶均从Wako纯化学工业公司获得)的半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(2)试验结果
如图4中显示了本试验的结果。图4显示出人乳铁传递蛋白肽Y679-K695对木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B和组织蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。结果表明，木瓜蛋白酶和组织蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶活性被10-4M的人乳铁传递蛋白肽Y679-K695抑制了50％以上，而被10-3M的人乳铁传递蛋白肽Y679-K695几乎完全抑制，并表明组织蛋白酶B的半胱氨酸蛋白酶活性，被10-3M的人乳铁传递蛋白肽Y679-K695抑制了将近60％。从而发现人乳铁传递蛋的肽Y679-K695对木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B和组织蛋白酶L具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。进而用具有序列表中SEQ ID No.2的氨基酸序号676-692氨基酸序列的肽(此后用牛乳铁传递蛋白肽Y676-K692表示，图3)，进行了测定半胱氨酸蛋白酶抑制活性的类似试验，并且发现，牛乳铁传递蛋白肽Y676-K692具有与人乳铁传递蛋白肽Y679-K695几乎相同的活性。
[试验实施例6]
实施本试验以便确定转铁蛋白对半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(1)试验方法
按照与试验实施例3中所述测定半胱氨酸蛋白酶抑制活性相同的方法，用市场购买到的牛转铁蛋白(Nihon制药公司产品)作为试验样品，测定其对包括木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B和组织蛋白酶L(这些蛋白酶均从Wako纯化学工业公司获得)的半胱氨酸蛋白酶的抑制活性。
(2)试验结果
如图5中显示了本试验的结果。图5显示出转铁蛋白对木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B和组织蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶抑制活性。结果表明，木瓜蛋白酶的半胱氨酸蛋白酶活性被10-4M的转铁蛋白抑制了40％，而被10-3M的转铁蛋白完全抑制，并且表明组织蛋白酶B和组织蛋白酶L的半胱氨酸蛋白酶活性被10-4的转铁蛋白抑制了30％以上。从而发现牛转铁蛋白对木瓜蛋白酶，组织蛋白酶B和组织蛋白酶L具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性。
实施例
下面将通过所示实施例对本发明作更具体的说明。但是本发明并不局限于下面的实施例。
[实施例1]
按照如下步骤产生具有序列表中SEQ ID No.1的氨基酸序号679-695氨基酸序列的肽(图3，人乳铁传递蛋白肽Y679-K695)。
通过用自动化肽合成仪(应用生物系统公司制造，433A型)合成产生本发明的上述肽。
用含有20％哌啶的N-甲基吡咯烷酮(应用生物系统公司产品，此后缩写为NMP)，使HMP树脂(用于肽合成的固化树脂，应用生物系统公司产品)的氨基保护基团Fmoc-基团断开，并以NMP洗此树脂。然后，应用FastMoc(注册商标)试剂盒(应用生物系统公司产品)使Fmoc-苏氨酸[准确地说，是相当于将被合成肽的C-端氨基酸的Fmoc-氨基酸(应用生物系统公司产品)]缩合于此树脂上，并以NMP洗此树脂。然后再使Fmoc基团断开，缩合相当于C-端第二个氨基酸的Fmoc-丙氨酸，随后洗此树脂。通过进一步重复缩合Fmoc-氨基酸和漂洗步骤，制备了保护肽树脂，并从此树脂中回收粗制肽。
应用高效液相色谱技术(此后缩写为HPLC)从粗制肽使肽纯化。反相柱C18-ODS(Merck & 公司产品)被用作层析柱。借助于HPLC对所获得的纯化肽进行分析，以便进一步证实此纯化产物是单一肽。通过使用气相自动化氨基酸测序仪(应用生物系统公司制造型号473A)测定此纯化肽的氨基酸序列，发现它具有SEQ ID No.1中氨基酸序号679-695的氨基酸序列。
按照类似的方法，产生了具有SEQ ID No.2中所示氨基酸序号676-692氨基酸序列的肽(图3，牛乳铁传递蛋白肽Y676-K692)。
[实施例2]
(制备以乳铁传递蛋白配制的片剂)
按照如下步骤产生了含有如下组合物的半胱氨酸蛋白酶抑制剂片剂。
牛乳铁传递蛋白(Morinaga乳业公司产品)40.0％
乳糖(Morinaga乳业公司产品)18.5％
玉米淀粉(Nisshin粉碾磨公司产品)30.7％
硬脂酸镁(Taihei化学工业公司产品)1.4％
羧甲基纤维素钙(Gotokn化学公司产品)9.4％
加入适量的无菌纯化水将牛乳铁传递蛋白，乳糖，玉米淀粉和羧甲基纤维素钙的混合物揉和均匀)，并在50℃使被揉和物干燥3小时。然后对获得的干燥产物加入硬脂酸镁并混匀，随之按照常规程序压片，从而获得片剂。
[实施例3]
(制备乳铁传递蛋白胶囊)
用50目的筛子(Yamato科学公司产品)将600克乳糖(Wako纯化学工业公司产品)，400g玉米淀粉(Nissnin粉碾磨公司产品)，400克结晶纤维素(Wako纯化学工业公司产品)和600克牛乳铁传递蛋白(Morinaga乳业公司产品)过筛，并装入具有0.5mm厚度的聚乙烯袋中，反复上下颠倒使之混匀。使用完全自动化的胶囊装填机(CeserePedini制造，压装型)，以275mg的容量将得到的粉末装入胶囊(Shionogi Qualicaps公司产品，1号明胶胶囊，OP黄色6号壳体，空重量75mg)中，从而获得7000个胶囊，每个含有牛乳铁传递蛋白82mg。
[实施例4]
(制备其中加入牛乳铁传递蛋白的饮料)
将90克脱脂乳(Morinaga乳业公司产品)溶解于温度50℃的热水800ml中，并相继加入30克糖(Nissin制糖公司产品)，14克速溶咖啡(Nestle产品)，2克焦糖(Showa kako公司产品)和0.01克咖啡调味剂(San-Ei Gen F.F.I公司产品)，搅拌使之溶解于此溶液中。然后，使此混合液冷却至10℃，加入1克牛乳铁传递蛋白(Sigma公司产品)，从而制成了含有大约0.1％牛乳铁传递蛋白，具有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的乳饮料。
[实施例5]
(制备其中加入了牛乳铁传递蛋白的肠营养配方粉剂)
在容器中，将10.8
kg乳清蛋白的酶降解产物(Morinaga乳业公司)，36kg糊精(Showa Sangyo公司产品)以及少量水溶性维生素和矿物质，溶解于200kg水中制备成水相。除此之外，还将3kg大豆色拉油(Taiyo Yushi公司产品)，8.5kg棕榈油(Taiyo Yushi公司产品)，2.5kg红花油(TaiyoYushi公司产品)，0.2kg卵磷脂(Ajinomoto公司产品)，0.2kg脂肪酸单酸甘油酯(Kao公司产品)以及少量脂溶性维生素混合在一起并使之溶解，制备成油相。将此油相加入容器内的水相中，并通过搅拌使之全部混匀，随后加热至70℃，在14.7MPa的压力下用匀浆器制成匀浆。接下来是在90℃将此生成物灭菌10分钟。并浓缩和喷雾干燥，从而得到大约59kg中间产品粉末。然后，将6.8kg蔗糖(Hokuren农业合作社联盟产品)，167g混合氨基酸粉末(Ajinomoto公司产品)以及60g牛乳铁传递蛋白(Sigma公司产品)加入到50kg中间产品粉末中，混合均匀，从而获得大约57kg含有牛乳铁传递蛋白并且有半胱氨酸蛋白酶抑制活性的肠营养配方粉剂。
产业适用性：
如上面详细论述的，本发明是关于一种半胱氨酸蛋白酶抑制剂，它包含乳铁传递蛋白，乳铁传递蛋白的肽片段以及转铁蛋白中的一种或多种作为活性成分。本发明可发挥如下作用：
(1)极好的安全性，能够长期每日给药或食用，因为它是由可用作食品原料的蛋白质或其部分肽制成。
(2)具有对多种半胱氨酸蛋白酶的广谱抑制活性。
(3)可用作对与半胱氨酸蛋白酶有关疾病的预防或治疗剂。
(4)可用于生产包括特定健康用途的功能性食品，以及营养增补食品。
(5)可在食品加工领域用作食品物理特性的调节剂。
序列表
<110>Morinaga Milk Industry Co.，Ltd.
<120>蛋白酶抑制剂
<130>FP1470P1610
<150>JP 2002/347802
<151>2002-11-29
<160>4
<170>PatentIn Ver.2.1
<210>1
<211>711
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>信号肽
<222>(1)...(19)
<223>乳铁传递蛋白
<400>1
Met Lys Leu Val Phe Leu Val Leu Leu Phe Leu Gly Ala Leu Gly Leu
  1               5                  10                  15
Cys Leu Ala Gly Arg Arg Arg Arg Ser Val Gln Trp Cys Ala Val Ser
             20                  25                  30
Gln Pro Glu Ala Thr Lys Cys Phe Gln Trp Gln Arg Asn Met Arg Lys
         35                  40                  45
Val Arg Gly Pro Pro Val Ser Cys Ile Lys Arg Asp Ser Pro Ile Gln
     50                  55                  60
Cys Ile Gln Ala Ile Ala Glu Asn Arg Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp
 65                  70                  75                  80
Gly Gly Phe Ile Tyr Glu Ala Gly Leu Ala Pro Tyr Lys Leu Arg Pro
                 85                  90                  95
Val Ala Ala Glu Val Tyr Gly Thr Glu Arg Gln Pro Arg Thr His Tyr
            100                 105                 110
Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Gly Ser Phe Gln Leu Asn Glu
        115                 120                 125
Leu Gln Gly Leu Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Arg Arg Thr Ala Gly
    130                 135                 140
Trp Asn Val Pro Ile Gly Thr Leu Arg Pro Phe Leu Asn Trp Thr Gly
145                 150                 155                 160
Pro Pro Glu Pro Ile Glu Ala Ala Val Ala Arg Phe Phe Ser Ala Ser
                165                 170                 175
Cys Val Pro Gly Ala Asp Lys Gly Gln Phe Pro Asn Leu Cys Arg Leu
            180                 185                 190
Cys Ala Gly Thr Gly Glu Asn Lys Cys Ala Phe Ser Ser Gln Glu Pro
        195                 200                 205
Tyr Phe Ser Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Arg Asp Gly Ala Gly
    210                 215                 220
Asp Val Ala Phe Ile Arg Glu Ser Thr Val Phe Glu Asp Leu Ser Asp
225                 230                 235                 240
Glu Ala Glu Arg Asp Glu Tyr Glu Leu Leu Cys Pro Asp Asn Thr Arg
                245                 250                 255
Lys Pro Val Asp Lys Phe Lys Asp Cys His Leu Ala Arg Val Pro Ser
            260                 265                 270
His Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asn Gly Lys Glu Asp Ala Ile Trp
        275                 280                 285
Asn Leu Leu Arg Gln Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asp Lys Ser Pro
    290                 295                 300
Lys Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Ser Gly Gln Lys Asp Leu Leu Phe
305                 310                 315                 320
Lys Asp Ser Ala Ile Gly Phe Ser Arg Val Pro Pro Arg Ile Asp Ser
                325                 330                 335
Gly Leu Tyr Leu Gly Ser Gly Tyr Phe Thr Ala Ile Gln Asn Leu Arg
            340                 345                 350
Lys Ser Glu Glu Glu Val Ala Ala Arg Arg Ala Arg Val Val Trp Cys
        355                 360                 365
Ala Val Gly Glu Gln Glu Leu Arg Lys Cys Asn Gln Trp Ser Gly Leu
    370                 375                 380
Ser Glu Gly Ser Val Thr Cys Ser Ser Ala Ser Thr Thr Glu Asp Cys
385                 390                 395                 400
Ile Ala Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly
                405                 410                 415
Gly Tyr Val Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala
            420                 425                 430
Glu Asn Tyr Lys Ser Gln Gln Ser Ser Asp Pro Asp Pro Asn Cys Val
        435                 440                 445
Asp Arg Pro Val Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Arg Arg Ser
    450                 455                 460
Asp Thr Ser Leu Thr Trp Asn Ser Val Lys Gly Lys Lys Ser Cys His
465                 470                 475                 480
Thr Ala Val Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Leu
                485                 490                 495
Phe Asn Gln Thr Gly Ser Cys Lys Phe Asp Glu Tyr Phe Ser Gln Ser
            500                 505                 510
Cys Ala Pro Gly Ser Asp Pro Arg Ser Asn Leu Cys Ala Leu Cys Ile
        515                 520                 525
Gly Asp Glu Gln Gly Glu Asn Lys Cys Val Pro Asn Ser Ash Glu Arg
    530                 535                 540
Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asn Ala Gly
545                 550                 555                 560
Asp Val Ala Phe Val Lys Asp Val Thr Val Leu Gln Asn Thr Asp Gly
                565                 570                 575
Asn Asn Asn Glu Ala Trp Ala Lys Asp Leu Lys Leu Ala Asp Phe Ala
            580                 585                 590
Leu Leu Cys Leu Asp Gly Lys Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Arg Ser
        595                 600                 605
Cys His Leu Ala Met Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Met Asp
    610                 615                 620
Lys Val Glu Arg Leu Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Lys Phe
625                 630                 635                 640
Gly Arg Asn Gly Ser Asp Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Gln Ser
                645                 650                 655
Glu Thr Lys Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Arg
            660                 665                 670
Leu His Gly Lys Thr Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Pro Gln Tyr Val
        675                 680                 685
Ala Gly Ile Thr Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu
    690                 695                 700
Ala Cys Glu Phe Leu Arg Lys
705                 710
<210>2
<211>708
<212>PRT
<213>牛
<220>
<221>信号肽
<222>(1)(19)
<223>乳铁传递蛋白
<400>2
Met Lys Leu Phe Val Pro Ala Leu Leu Ser Leu Gly Ala Leu Gly Leu
  1               5                  10                  15
Cys Leu Ala Ala Pro Arg Lys Asn Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Gln
             20                  25                  30
Pro Glu Trp Phe Lys Cys Arg Arg Trp Gln Trp Arg Met Lys Lys Leu
         35                  40                  45
Gly Ala Pro Ser Ile Thr Cys Val Arg Arg Ala Phe Ala Leu Glu Cys
     50                  55                  60
Ile Arg Ala Ile Ala Glu Lys Lys Ala Asp Ala Val Thr Leu Asp Gly
 65                  70                  75                  80
Gly Met Val Phe Glu Ala Gly Arg Asp Pro Tyr Lys Leu Arg Pro Val
                 85                  90                  95
Ala Ala Glu Ile Tyr Gly Thr Lys Glu Ser Pro Gln Thr His Tyr Tyr
            100                 105                 110
Ala Val Ala Val Val Lys Lys Gly Ser Asn Phe Gln Leu Asp Gln Leu
        115                 120                 125
Gln Gly Arg Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala Gly Trp
    130                 135                 140
Ile Ile Pro Met Gly Ile Leu Arg Pro Tyr Leu Ser Trp Thr Glu Ser
145                 150                 155                 160
Leu Glu Pro Leu Gln Gly Ala Val Ala Lys Phe Phe Ser Ala Ser Cys
                165                 170                 175
Val Pro Cys Ile Asp Arg Gln Ala Tyr Pro Asn Leu Cys Gln Leu Cys
            180                 185                 190
Lys Gly Glu Gly Glu Asn Gln Cys Ala Cys Ser Ser Arg Glu Pro Tyr
        195                 200                 205
Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Gln Asp Gly Ala Gly Asp
    210                 215                 220
Val Ala Phe Val Lys Glu Thr Thr Val Phe Glu Asn Leu Pro Glu Lys
225                 230                 235                 240
Ala Asp Arg Asp Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asn Asn Ser Arg Ala
                245                 250                 255
Pro Val Asp Ala Phe Lys Glu Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His
            260                 265                 270
Ala Val Val Ala Arg Ser Val Asp Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Lys
        275                 280                 285
Leu Leu Ser Lys Ala Gln Glu Lys Phe Gly Lys Asn Lys Ser Arg Ser
    290                 295                 300
Phe Gln Leu Phe Gly Ser Pro Pro Gly Gln Arg Asp Leu Leu Phe Lys
305                 310                 315                 320
Asp Ser Ala Leu Gly Phe Leu Arg Ile Pro Ser Lys Val Asp Ser Ala
                325                 330                 335
Leu Tyr Leu Gly Ser Arg Tyr Leu Thr Thr Leu Lys Asn Leu Arg Glu
            340                 345                 350
Thr Ala Glu Glu Val Lys Ala Arg Tyr Thr Arg Val Val Trp Cys Ala
        355                 360                 365
Val Gly Pro Glu Glu Gln Lys Lys Cys Gln Gln Trp Ser Gln Gln Ser
    370                 375                 380
Gly Gln Asn Val Thr Cys Ala Thr Ala Ser Thr Thr Asp Asp Cys Ile
385                 390                 395                 400
Val Leu Val Leu Lys Gly Glu Ala Asp Ala Leu Asn Leu Asp Gly Gly
                405                 410                 415
Tyr Ile Tyr Thr Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu
            420                 425                 430
Asn Arg Lys Ser Ser Lys His Ser Ser Leu Asp Cys Val Leu Arg Pro
        435                 440                 445
Thr Glu Gly Tyr Leu Ala Val Ala Val Val Lys Lys Ala Asn Glu Gly
    450                 455                 460
Leu Thr Trp Asn Ser Leu Lys Asp Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val
465                 470                 475                 480
Asp Arg Thr Ala Gly Trp Asn Ile Pro Met Gly Leu Ile Val Asn Gln
                485                 490                 495
Thr Gly Ser Cys Ala Phe Asp Glu Phe Phe Ser Gln Ser Cys Ala Pro
            500                 505                 510
Gly Ala Asp Pro Lys Ser Arg Leu Cys Ala Leu Cys Ala Gly Asp Asp
        515                 520                 525
Gln Gly Leu Asp Lys Cys Val Pro Asn Ser Lys Glu Lys Tyr Tyr Gly
    530                 535                 540
Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Ala Glu Asp Val Gly Asp Val Ala
545                 550                 555                 560
Phe Val Lys Asn Asp Thr Val Trp Glu Asn Thr Asn Gly Glu Ser Thr
                565                 570                 575
Ala Asp Trp Ala Lys Asn Leu Asn Arg Glu Asp Phe Arg Leu Leu Cys
            580                 585                 590
Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Thr Glu Ala Gln Ser Cys His Leu
        595                 600                 605
Ala Val Ala Pro Asn His Ala Val Val Ser Arg Ser Asp Arg Ala Ala
    610                 615                 620
His Val Lys Gln Val Leu Leu His Gln Gln Ala Leu Phe Gly Lys Asn
625                 630                 635                 640
Gly Lys Asn Cys Pro Asp Lys Phe Cys Leu Phe Lys Ser Glu Thr Lys
                645                 650                 655
Asn Leu Leu Phe Asn Asp Asn Thr Glu Cys Leu Ala Lys Leu Gly Gly
            660                 665                 670
Arg Pro Thr Tyr Glu Glu Tyr Leu Gly Thr Glu Tyr Val Thr Ala Ile
        675                 680                 685
Ala Asn Leu Lys Lys Cys Ser Thr Ser Pro Leu Leu Glu Ala Cys Ala
    690                 695                 700
Phe Leu Thr Arg
705
<210>3
<211>698
<212>PRT
<213>人类
<220>
<221>信号肽
<222>(1)(19)
<223>转铁蛋白
<400>3
Met Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Leu Val Cys Ala Val Leu Gly Leu
  1              5                  10                  15
Cys Leu Ala Val Pro Asp Lys Thr Val Arg Trp Cys Ala Val Ser Glu
             20                  25                  30
His Glu Ala Thr Lys Cys Gln Ser Phe Arg Asp His Met Lys Ser Val
         35                  40                  45
Ile Pro Ser Asp Gly Pro Ser Val Ala Cys Val Lys Lys Ala Ser Tyr
     50                  55                  60
Leu Asp Cys Ile Arg Ala Ile Ala Ala Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr
 65                  70                  75                  80
Leu Asp Ala Gly Leu Val Tyr Asp Ala Tyr Leu Ala Pro Asn Asn Leu
                 85                  90                  95
Lys Pro Val Val Ala Glu Phe Tyr Gly Ser Lys Glu Asp Pro Gln Thr
            100                 105                 110
Phe Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Ser Gly Phe Gln Met
        115                 120                 125
Asn Gln Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser
    130                 135                 140
Ala Gly Trp Asn Ile Pro Ile Gly Leu Leu Tyr Cys Asp Leu Pro Glu
145                 150                 155                 160
Pro Arg Lys Pro Leu Glu Lys Ala Val Ala Asn Phe Phe Ser Gly Ser
                165                 170                 175
Cys Ala Pro Cys Ala Asp Gly Thr Asp Phe Pro Gln Leu Cys Gln Leu
            180                 185                 190
Cys Pro Gly Cys Gly Cys Ser Thr Leu Asn Gln Tyr Phe Gly Tyr Ser
        195                 200                 205
Gly Ala Phe Lys Cys Leu Lys Asp Gly Ala Gly Asp Val Ala Phe Val
    210                 215                 220
Lys His Ser Thr Ile Phe Glu Asn Leu Ala Asn Lys Ala Asp Arg Asp
225                 230                 235                 240
Gln Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Asn Thr Arg Lys Pro Val Asp Glu
                245                 250                 255
Tyr Lys Asp Cys His Leu Ala Gln Val Pro Ser His Thr Val Val Ala
            260                 265                 270
Arg Ser Met Gly Gly Lys Glu Asp Leu Ile Trp Glu Leu Leu Asn Gln
        275                 280                 285
Ala Gln Glu His Phe Gly Lys Asp Lys Ser Lys Glu Phe Gln Leu Phe
    290                 295                 300
Ser Ser Pro His Gly Lys Asp Leu Leu Phe Lys Asp Ser Ala His Gly
305                 310                 315                 320
Phe Leu Lys Val Pro Pro Arg Met Asp Ala Lys Met Tyr Leu Gly Tyr
                325                 330                 335
Glu Tyr Val Thr Ala Ile Arg Asn Leu Arg Glu Gly Thr Cys Pro Glu
            340                 345                 350
Ala Pro Thr Asp Glu Cys Lys Pro Val Lys Trp Cys Ala Leu Ser His
        355                 360                 365
His Glu Arg Leu Lys Cys Asp Glu Trp Ser Val Asn Ser Val Gly Lys
    370                 375                 380
Ile Glu Cys Val Ser Ala Glu Thr Thr Glu Asp Cys Ile Ala Lys Ile
385                 390                 395                 400
Met Asn Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly Phe Val Tyr
                405                 410                 415
Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu Asn Tyr Asn
            420                 425                 430
Lys Ser Asp Asn Cys Glu Asp Thr Pro Glu Ala Gly Tyr Phe Ala Val
        435                 440                 445
Ala Val Val Lys Lys Ser Ala Ser Asp Leu Thr Trp Asp Asn Leu Lys
    450                 455                 460
Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Gly Arg Thr Ala Gly Trp Asn
465                 470                 475                 480
Ile Pro Met Gly Leu Leu Tyr Asn Lys Ile Asn His Cys Arg Phe Asp
                485                 490                 495
Glu Phe Phe Ser Glu Gly Cys Ala Pro Gly Ser Lys Lys Asp Ser Ser
            500                 505                 510
Leu Cys Lys Leu Cys Met Gly Ser Gly Leu Asn Leu Cys Glu Pro Asn
        515                 520                 525
Asn Lys Glu Gly Tyr Tyr Gly Tyr Thr Gly Ala Phe Arg Cys Leu Val
    530                 535                 540
Glu Lys Gly Asp Val Ala Phe Val Lys His Gln Thr Val Pro Gln Asn
545                 550                 555                 560
Thr Gly Gly Lys Asn Pro Asp Pro Trp Ala Lys Asn Leu Asn Glu Lys
                565                 570                 575
Asp Tyr Glu Leu Leu Cys Leu Asp Gly Thr Arg Lys Pro Val Glu Glu
            580                 585                 590
Tyr Ala Asn Cys His Leu Ala Arg Ala Pro Asn His Ala Val Val Thr
        595                 600                 605
Arg Lys Asp Lys Glu Ala Cys Val His Lys Ile Leu Arg Gln Gln Gln
    610                 615                 620
His Leu Phe Gly Ser Asn Val Thr Asp Cys Ser Gly Asn Phe Cys Leu
625                 630                 635                 640
Phe Arg Ser Glu Thr Lys Asp Leu Leu Phe Arg Asp Asp Thr Val Cys
                645                 650                 655
Leu Ala Lys Leu His Asp Arg Asn Thr Tyr Glu Lys Tyr Leu Gly Glu
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Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe Arg Arg Pro
    690                 695
<210>4
<211>704
<212>PRT
<213>牛
<220>
<221>信号肽
<222>(1)(19)
<223>转铁蛋白
<400>4
Met Arg Pro Ala Val Arg Ala Leu Leu Ala Cys Ala Val Leu Gly Leu
  1              5                  10                  15
Cys Leu Ala Asp Pro Glu Arg Thr Val Arg Trp Cys Thr Ile Ser Thr
             20                  25                  30
His Glu Ala Asn Lys Cys Ala Ser Phe Arg Glu Asn Val Leu Arg Ile
         35                  40                  45
Leu Glu Ser Gly Pro Phe Val Ser Cys Val Lys Lys Thr Ser His Met
     50                  55                  60
Asp Cys Ile Lys Ala Ile Ser Asn Asn Glu Ala Asp Ala Val Thr Leu
 65                  70                  75                  80
Asp Gly Gly Leu Val Tyr Glu Ala Gly Leu Lys Pro Asn Asn Leu Lys
                 85                  90                  95
Pro Val Val Ala Glu Phe His Gly Thr Lys Asp Asn Pro Gln Thr His
            100                 105                 110
Tyr Tyr Ala Val Ala Val Val Lys Lys Asp Thr Asp Phe Lys Leu Asn
        115                 120                 125
Glu Leu Arg Gly Lys Lys Ser Cys His Thr Gly Leu Gly Arg Ser Ala
    130                 135                 140
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145                 150                 155                 160
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                165                 170                 175
Val Pro Cys Ala Asp Gln Ser Ser Phe Pro Lys Leu Cys Gln Leu Cys
            180                 185                 190
Ala Gly Lys Gly Thr Asp Lys Cys Ala Cys Ser Asn His Glu Pro Tyr
        195                 200                 205
Phe Gly Tyr Ser Gly Ala Phe Lys Cys Leu Met Glu Gly Ala Gly Asp
    210                 215                 220
Val Ala Phe Val Lys His Ser Thr Val Phe Asp Asn Leu Pro Asn Pro
225                 230                 235                 240
Glu Asp Arg Lys Asn Tyr Glu Leu Leu Cys Gly Asp Asn Thr Arg Lys
                245                 250                 255
Ser Val Asp Asp Tyr Gln Glu Cys Tyr Leu Ala Met Val Pro Ser His
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Ala Val Val Ala Arg Thr Val Gly Gly Lys Glu Asp Val Ile Trp Glu
        275                 280                 285
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305                 310                 315                 320
Ser Ala Asp Gly Phe Leu Lys Ile Pro Ser Lys Met Asp Phe Glu Leu
                325                 330                 335
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            340                 345                 350
Lys Pro Pro Asp Ser Ser Lys Asp Glu Cys Met Val Lys Trp Cys Ala
        355                 360                 365
Ile Gly His Gln Glu Arg Thr Lys Cys Asp Arg Trp Ser Gly Phe Ser
    370                 375                 380
Gly Gly Ala Ile Glu Cys Glu Thr Ala Glu Asn Thr Glu Glu Cys Ile
385                 390                 395                 400
Ala Lys Ile Met Lys Gly Glu Ala Asp Ala Met Ser Leu Asp Gly Gly
                405                 410                 415
Tyr Leu Tyr Ile Ala Gly Lys Cys Gly Leu Val Pro Val Leu Ala Glu
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        435                 440                 445
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    450                 455                 460
Asn Asn Leu Lys Asp Lys Lys Ser Cys His Thr Ala Val Asp Arg Thr
465                 470                 475                 480
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                485                 490                 495
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            500                 505                 510
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        515                 520                 525
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                565                 570                 575
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    610                 615                 620
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        675                 680                 685
Gln Cys Ser Thr Ser Lys Leu Leu Glu Ala Cys Thr Phe His Lys Pro
    690                 695                 700

Claims (4)

1.乳铁传递蛋白在半胱氨酸蛋白酶抑制剂制备中的用途。
2.根据权利要求1的用途，其中乳铁传递蛋白是金属饱和形式、部分金属饱和形式和脱金属形式中的一种或多种。
3.乳铁传递蛋白的肽片段在半胱氨酸蛋白酶抑制剂制备中的用途，其中所述乳铁传递蛋白的肽片段是如下面(a)或(b)中所示的肽中的一种或多种：
(a)由序列表SEQ ID No.1中显示的氨基酸序号679-695的氨基酸序列组成的肽，
(b)由序列表SEQ ID No.2中显示的氨基酸序号676-692的氨基酸序列组成的肽。
4.根据权利要求1-3中任何之一的用途，其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂是与半胱氨酸蛋白酶有关疾病的预防和治疗剂。
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