JPWO2002077239A1 - Ｈｃｖ結合性ポリペプチド - Google Patents
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Abstract
生体へのＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させるための手段を提供すること。配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分又は該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有した、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチド及びその誘導体；該ポリペプチドを含有したポリペプチド；ポリペプチドを有効成分として含有した、ＨＣＶ感染防御剤；該ポリペプチドを有効成分として含有した慢性Ｃ型肝炎治療剤又は予防剤；該ポリペプチドをコードしたポリヌクレオチド；該ポリペプチドを、細胞へのＨＣＶの結合を妨げるに十分な治療上有効量、投与対象物に投与する、慢性Ｃ型肝炎治療又は予防方法；並びに該ＨＣＶ感染防御剤、該治療剤又は該予防剤を製造するための該ポリペプチドの使用。
Description
技術分野
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染を阻害、抑制又は低減させることが可能な技術に関する。具体的には、本発明は、ＨＣＶとの結合活性、特に、ＨＣＶのＥ２（エンベロープ２）タンパク質との結合活性を有するＨＣＶ結合性ポリペプチド；ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させることが可能なＨＣＶの感染防御剤；慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防に用いうる、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤；該ポリペプチドをコードしたポリヌクレオチド；慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防方法；並びに該慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤を製造するための該ポリペプチドの使用などに関する。
背景技術
現在、ＨＣＶが主要な原因となり年間の死者が三万人を超える肝がんの発症を抑制するために、インターフェロン以外の抗ＨＣＶ薬の開発が嘱望されている。
これに関して、本発明者らは、近年、ＨＣＶとヒト肝細胞由来培養細胞とを用いるＨＣＶ感染系において、ＨＣＶ初乳中に豊富に含まれ、鉄のトランスポーターファミリーの一員であるラクトフェリンが、ヒト肝細胞由来培養細胞へのＨＣＶの感染を防御することを見出している［Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２４５（２），５４９−５５３（１９９８）；Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６６（１），５１−６３（２０００）］。また、本発明者らは、実際に、慢性Ｃ型肝炎患者にウシラクトフェリンを経口投与し、効果を認めた症例を報告している［Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９０（４）：３６７−３７１（１９９９）］。
また、最近、本発明者らは、前記ＨＣＶ感染系を用いて、細胞へのＨＣＶの吸着とラクトフェリンとの相互作用の時間的関係を解析した。その結果、本発明者らは、ラクトフェリンとＨＣＶとを混合し、直ちに細胞に添加した場合でもＨＣＶ感染が完全に阻害されることを見出し、それにより、ＨＣＶとラクトフェリンとの相互作用は、ＨＣＶの細胞への吸着よりも早く起こることを明らかにした［第５８回日本癌学会総会要旨集、１４５頁 Ｎｏ．２２３，（１９９９）］。
さらに、本発明者らは、ＨＣＶのどのタンパク質がラクトフェリンとの相互作用に関与しているのかを解析した結果、ラクトフェリンはＨＣＶのＥ２タンパク質に直接結合することを明らかにした［第５８回日本癌学会総会要旨集、１４５頁，Ｎｏ．２２３，（１９９９）］。
以上のように、ラクトフェリンとＨＣＶのＥ２タンパク質との相互作用が、ＨＣＶの感染防御に重要であることが示されている。しかしながら、約７００アミノ酸からなるラクトフェリン中のどの限定領域がＨＣＶのＥ２タンパク質との結合に必須の領域であるかについては、未だ十分に明らかにされていないのが現状である。
発明の開示
本発明は、生体へのＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させるための手段を提供することを目的とする。具体的には、本発明は、ＨＣＶとの結合活性を有するＨＣＶ結合性ポリペプチド及びその応用を提供することを目的とする。さらに詳しくは、本発明は、ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させることが可能であり、かつ生体への取り込みにより適したサイズである、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するＨＣＶ結合性ポリペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させることが可能な、ＨＣＶの感染防御剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防に有用である、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを効率よく供給することを可能にしうる、ポリヌクレオチドを提供することを目的とする。また、本発明は、慢性Ｃ型肝炎の症状の緩和、予防などを可能にしうる、慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防方法を提供することを目的とする。
即ち本発明の要旨は、
〔１〕 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分又は該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有してなる、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチド、
〔２〕 （Ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の全長、又は
（ＩＩ）前記（Ｉ）記載のアミノ酸配列の一部からなる配列であって、かつ該配列が、アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分若しくは該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を含有するものである配列、
を少なくとも含有してなる、前記〔１〕記載のＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチド、
〔３〕 配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分を少なくとも含有してなる、前記〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド、
〔４〕 配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有してなる、前記〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド、
〔５〕 下記（ａ）〜（ｘ）：
（ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位、
（ｂ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位、
（ｃ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位、
（ｄ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位、
（ｅ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位、
（ｆ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位、
（ｇ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位、
（ｈ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位、
（ｉ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位、
（ｊ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位、
（ｋ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位、
（ｌ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位、
（ｍ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位、
（ｎ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位、
（ｏ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位、
（ｐ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位、
（ｑ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位、
（ｒ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位、
（ｓ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位、
（ｔ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位、
（ｕ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位、
（ｖ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位、
（ｗ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位、及び
（ｘ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位
からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなる、前記〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド、
〔６〕 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性を有するポリペプチド、
〔７〕 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列の全長からなり、かつ下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性を有するポリペプチド、
〔８〕 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の一部からなる配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列の全長からなり、かつ下記（ｉ）又は（ｉ’）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉ’）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
の特性と、
下記（ｉｉ）：
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性とを有するポリペプチド、
〔９〕 置換位置が、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第４位、第５位、第７位、第８位、第９位、第１０位、第１１位、第１３位、第１６位、第１７位、第２０位、第２１位、第２４位、第２７位、第２８位、第３１位、第３７位、第５４位、第５６位、第５８位、第５９位、第６３位、第６７位、第６８位、第７１位、第７２位、第７４位、第７７位、第７８位、第８１位、第８９位、第９２位及び第９３位から選ばれるものである、前記〔７〕又は〔８〕記載のポリペプチド、
〔１０〕 前記置換位置において置換されるアミノ酸が、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上の当該置換位置に存在するアミノ酸の中から選ばれるものである、前記〔９〕記載のポリペプチド、
〔１１〕 細胞へのＨＣＶの感染に対する阻害能を有する、前記〔１〕〜〔１０〕いずれか１項に記載のポリペプチド、
〔１２〕 前記〔１〕〜〔１１〕いずれか１項に記載のポリペプチドを含有してなるポリペプチド（ただしジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１、Ｍ６３５０２及びＡＪ０１０９３０のそれぞれに示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）、
〔１３〕 前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、ＨＣＶの感染防御剤、
〔１４〕 前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤、
〔１５〕 前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドをコードしてなるポリヌクレオチド、
〔１６〕 前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドを、細胞へのＨＣＶの結合を妨げるに十分な治療上有効量、投与対象物に投与することを特徴とする、慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防方法、並びに
〔１７〕 ＨＣＶの感染防御剤、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤を製造するための前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドの使用、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の１つの態様としては、細胞へのＨＣＶの吸着を阻害、抑制又は低減させることが可能であり、かつ生体への取り込みにより適したサイズである、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するラクトフェリン由来ポリペプチドが挙げられる。
具体的には、本発明のポリペプチドは、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分又は該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有することに１つの大きな特徴がある。
したがって、本発明のポリペプチドは、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を呈するという優れた性質を発現する。
さらに、本発明のポリペプチドによれば、全長ラクトフェリンよりも短い長さであるにもかかわらず、ＨＣＶの感染を実際に阻害、抑制又は低減することができるという優れた性質を発現する。
また、本発明のポリペプチドは、国際公開第０１／７２３２２号パンフレット及び国際公開第０１／４７５４５号パンフレットのそれぞれに開示された、ＨＣＶへの結合活性を示しうる特定の配列からなるラクトフェリン由来部分ポリペプチドの配列〔ＧＲＲＲＲＳＶＱＷＣ ＡＶＳＱＰＥＡＴＫＣ ＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶ ＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ ＤＳＰＩＱＣＩ（配列番号：９）；ＤＰＤＰＮＣＶＤＲＰ ＶＥＧＹＬＡＶＡＶＶ ＲＲＳＤＴＳＬＴＷＮ ＳＶＫＧＫＫＳＣＨＴ ＡＶＤ（配列番号：１０）〕とは、異なるものであるにもかかわらず、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を呈し、さらには、ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減することができるという驚くべき性質を発現する。
本明細書において、「ラクトフェリン」のアミノ酸配列を表記する場合、シグナル配列がプロセッシングされた成熟ラクトフェリンタンパク質のアミノ酸配列を指すものとする。すなわち、ラクトフェリンのアミノ酸配列の「６１０番目〜６５２番目」といった表記をする場合、当該アミノ酸配列は、ラクトフェリンの成熟タンパク質のＮ末端のアミノ酸を１番目のアミノ酸とした場合の数を示す。
また、以下、本明細書において、「ヒトラクトフェリン（Ｘ−Ｙ）」の表記は、特に断りのない限り、ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１に記載のヒトラクトフェリンのアミノ酸配列におけるＸ番目〜Ｙ番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す。さらに、本明細書において、「ウシラクトフェリン（Ｘ−Ｙ）」の表記は、特に断りのない限り、ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２に記載のウシラクトフェリンのアミノ酸配列におけるＸ番目〜Ｙ番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す。さらに、本明細書において、「ウマラクトフェリン（Ｘ−Ｙ）」の表記は、特に断りのない限り、ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０に記載のウシラクトフェリンのアミノ酸配列におけるＸ番目〜Ｙ番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す。
前述のように、近年、ラクトフェリンが、ＨＣＶの感染防御に効果を有することが示されている［Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２４５（２），５４９−５５３（１９９８）；Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６６（１），５１−６３（２０００）；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９０（４），３６７−３７１（１９９９）］。また両者の相互作用に関して、ラクトフェリンはＨＣＶのＥ２タンパク質に結合することが明らかにされている（第５８回日本癌学会総会要旨集、１４５頁Ｎｏ．２２３，１９９９）。しかしながら、ラクトフェリン中のどの限定領域がＨＣＶのＥ２タンパク質との結合に必須であるかについては明らかにされていなかった。
本発明者らは、ラクトフェリン中のどの領域がＨＣＶのＥ２タンパク質に結合活性を有するのか、またその結合の強さはどの程度であるのかにつき鋭意検討を進めた。
すなわち、本発明は、ヒト、ウシおよびウマラクトフェリンそれぞれのカルボキシル末端９３アミノ酸部分からなるポリペプチド、具体的には、下記３つの配列：
▲１▼配列番号：２に示されるヒトラクトフェリンのＣ末端９３アミノ酸部分、
ヒトラクトフェリンのアミノ酸配列（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）における第６００番目〜第６９２番目の部分（配列番号：２）、
▲２▼配列番号：４に示されるウシラクトフェリンのＣ末端９３アミノ酸部分、
ウシラクトフェリンのアミノ酸配列（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）における第５９９番目〜第６９１番目の部分（配列番号：４）、
並びに
▲３▼配列番号：６に示されるウマラクトフェリンのＣ末端９３アミノ酸部分、
ウマラクトフェリンのアミノ酸配列（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）における第５９９番目〜第６９１番目の部分（配列番号：６）、が、いずれも、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有し、９３アミノ酸部分の中にＨＣＶのＥ２タンパク質との結合領域が存在するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。しかも、これらのポリペプチドによれば、その結合の強さは、ＨＣＶの本来の受容体であるＣＤ８１ラージエクストラループへのＨＣＶの結合活性と比較して２倍程度強いという、予想外の効果を発揮する。
さらに、本発明は、ヒトラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸のうちのどの限定領域がＨＣＶのＥ２タンパク質との結合に必須であるのかについて、前記９３アミノ酸部分（配列番号：２）をさらに限定した何種類かのポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を調べた結果、ヒトラクトフェリンの６００番目〜６３２番目（配列番号：２の第１位〜第３３位）の３３アミノ酸部分、若しくはヒトラクトフェリンの６１０番目〜６５２番目（配列番号：２の第１１位〜第５３位）の４３アミノ酸部分を有していれば、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。また、本発明は、ヒトラクトフェリンの第６３５番目（配列番号：２の第３６位）のフェニルアラニンが保持されていることが、ＨＣＶのＥ２タンパク質への結合にとって重要であるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
また、これら３つの配列（配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６）間のアミノ酸の同一性は、それぞれ７４．２％（ヒト−ウシ）および７１％（ヒト−ウマ）であったことから、この程度の配列同一性を保持する程度にアミノ酸残基が置換されていても、ＨＣＶのＥ２タンパク質への結合活性を有することが明らかとなった。本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
従って、本発明によれば、具体的には、（Ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の全長（９３アミノ酸）、又は
（ＩＩ）前記（Ｉ）記載のアミノ酸配列の一部からなる配列であって、かつ該配列が、アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分若しくは該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を含有するものである配列、
を少なくとも含有した、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドが提供される。
ここで、本発明のポリペプチドの長さは、前記（Ｉ）を含有する場合、少なくとも９３アミノ酸残基、好ましくは、９３〜５００残基、より好ましくは、９３〜３００残基、さらに好ましくは、９３〜２００残基、よりさらに好ましくは、９３〜１００残基であるか、あるいは配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の全長そのものであることが望ましい。
また、前記（ＩＩ）における「アミノ酸配列の一部」に関して、前記アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分を含有する場合、本発明のポリペプチドの長さは、少なくとも３３アミノ酸残基、好ましくは、３３〜９２残基、より好ましくは、３３〜８０残基、さらに好ましくは、３３〜６０残基、よりさらに好ましくは、３３〜５０残基であることが望ましく、第１１位〜第５３位の部分を含有する場合、本発明のポリペプチドの長さは、少なくとも４３アミノ酸残基、好ましくは、４３〜９２残基、より好ましくは、４３〜８０残基、さらに好ましくは、４３〜６０残基、よりさらに好ましくは、４３〜５０残基であることが望ましい。
なお、前記（ＩＩ）においては、アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分と該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分との両方を含有するもの、すなわち、第１位〜第５３位を含有するものも包含される。
ここで、本発明においては、ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１、Ｍ６３５０２及びＡＪ０１０９３０のそれぞれに示されたアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドは除外される。
好ましくは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の全長、
又は
該アミノ酸配列の一部からなる配列であって、かつ該配列が、アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分若しくは該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を含有するものである配列、
を少なくとも含有した、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドが挙げられ、具体的には、配列番号：２に示されたアミノ酸配列の全長又はその一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分を少なくとも含有するポリペプチド、又は配列番号：２に示されたアミノ酸配列の全長又はその一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有するポリペプチドが挙げられる。より具体的には、
▲１▼配列番号：２に示されたアミノ酸配列の全長からなるポリペプチド、
▲２▼配列番号：２に示されたアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分を少なくとも含有するポリペプチド、
▲３▼配列番号：２に示されたアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有するポリペプチド、
▲４▼配列番号：２において、第１位〜第３３位の部分若しくは第１１位〜第５３位の部分が少なくとも保存されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
などが挙げられる。
前記において、「アミノ酸配列の一部からなるポリペプチド」とは、
▲１▼配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分、若しくは第１１位〜第５３位の部分からなるポリペプチド、又は、
▲２▼当該部分を含み、かつこの位置より配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上、Ｎ末端方向及び／又はＣ末端方向に伸長したポリペプチド、すなわち、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸残基が付加されたポリペプチド
を意味する。
ここで、前記▲２▼において、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端におけるアミノ酸残基の付加数は、ポリペプチドが、前記結合活性を呈し、ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させる能力を発揮する範囲であればよい。また、付加されるアミノ酸残基は、天然のアミノ酸配列、具体的には、配列番号：２、４及び６からなる群より選択されたアミノ酸配列における該当部分と同じアミノ酸残基であればよく、ポリペプチドの前記結合活性及びＨＣＶ感染を阻害、抑制又は低減させる能力を発揮させるに適した物理化学的性質を有するアミノ酸であればよい。さらにかかるアミノ酸残基は、生体への親和性を付与しうる種々の修飾残基であってもよい。
これら本発明のポリペプチドの具体例としては、例えば、
（ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位からなるポリペプチド、〔配列番号：７に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド〕
（ｆ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位からなるポリペプチド、
（ｇ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位からなるポリペプチド、
（ｈ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位からなるポリペプチド、
（ｉ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｊ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｋ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｌ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｍ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位からなるポリペプチド、〔配列番号：８に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド〕
（ｎ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位からなるポリペプチド、
（ｏ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位からなるポリペプチド、
（ｐ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位からなるポリペプチド、
（ｑ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｒ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｓ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｔ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｕ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位からなるポリペプチド、
（ｖ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位からなるポリペプチド、
（ｗ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位からなるポリペプチド、
（ｘ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位からなるポリペプチド、
などが例示される。
これらのポリペプチドは、化学的合成法又は遺伝子工学的手法のいずれでも作製されうる。すなわち、慣用の化学合成法により、ペプチド合成機などを用いて前記ポリペプチドを合成することもできれば、慣用の遺伝子工学的手法により、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させることによって、該ポリペプチドを調製することもできる。
ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該公知方法としては文献［ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９６６）；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７６）；ペプチド合成，丸善（株），（１９７５）；ペプチド合成の基礎と実験，丸善（株），（１９８５）；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，（１９９１）］などに記載されている方法が挙げられる。
他方、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させて当該ポリペプチドを調製する手法としては、現在では当業者に周知の種々の手法が確立されており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）などの基本書に従って行うことができる。以下、具体例を記述する。
まず、前記の種々のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ヒトラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）、ウシラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）、あるいはウマラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）のｃＤＮＡ配列上の所望の部分をＰＣＲにより増幅することによって単離することができる。なお、前記配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の一例として、それぞれ配列番号：１、配列番号：３及び配列番号：５に記載の塩基配列を例示することができる。なお、当業者であれば、かかる塩基配列が、縮重若しくは核酸多型を介して異なる配列であってもよいことが理解されるであろう。
前記ＤＮＡを挿入する発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて、適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシン及びＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
次いで、前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換・形質導入する。ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞や形質導入細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞又は形質導入細胞を、例えば、ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のポリペプチドを得ることができる。得られたポリペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
このようにして調製された本発明のポリペプチドがＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有することは、例えば、慣用の免疫学的手法、例えば、ファーウエスタンブロッティングなどあるいは物理学的手法、例えば、表面プラズモン解析などにより解析することができる。
前記ファーウエスタンブロッティングについては実施例に詳細に記載されているが、原理を簡単に述べると以下のようになる。
すなわち、まず、本発明のポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、これをメンブレン（ＰＶＤＦ膜）に転写する。このメンブレンとＨＣＶのＥ２タンパク質［Ｖａｃｃｉｎｅ，１４（１７／１８），１５９０−１５９６（１９９６）］とを結合反応させ、その後、抗ＨＣＶＥ２（ＨＣＶのＥ２タンパク質）抗体を反応させる。ここで用いられる抗ＨＣＶＥ２抗体としては、例えばラット抗ＨＣＶＥ２モノクローナル抗体Ｍｏ−１２［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２（１２），８７５−８７７（１９９８）］が挙げられる。その後、標識二次抗体をさらに反応させる。ここで用いられる標識二次抗体としては、例えば、ラット抗ＨＣＶＥ２モノクローナル抗体を用いた場合、ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ二次抗体〔例えば、アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製、カタログ番号：ＮＡ９３５など〕が挙げられる。反応後、化学発光などの手法で標識を検出し、これをＸ線フィルムに感光させることなどにより、本発明のポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を測定することができる。
表面プラズモン解析により、本発明のポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を測定する場合、例えば、
ＨＣＶのＥ２タンパク質を固定化したセンサーチップに、本発明のポリペプチドを含有した溶液を接触又は一定の流速で送液するステップ、
ここで、本ステップにおいて、センサーチップにおけるＨＣＶのＥ２タンパク質のかわりに、本発明のポリペプチドを用い、ＨＣＶのＥ２タンパク質を含有した溶液を用いることもできる、
及び
適切な検出手段により、光学的変動又は質量の変動として相互作用を検出するステップ；
を含む方法を行なえばよい。ここで、検出手段としては、例えば、蛍光度、蛍光偏向度等の光学的検出手段；マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）等の質量分析計との組み合わせによる検出手段；水晶などの物質の固有振動数の変化による検出手段などが挙げられる。また、結合は、本発明のポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との複合体の形成を示すセンサーグラムの提示、例えば、送液によるタンパク質の導入により変動した光学的センサーグラム又は質量センサーグラムを指標として測定できる。また、結合速度により、ＨＣＶのＥ２タンパク質に対する本発明のポリペプチドの親和性等を推測することもできる。
また、本発明のポリペプチドが、肝細胞由来細胞へのＨＣＶの感染を防御することを調べる手法としては、例えばＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２４５（２），５４９−５５３（１９９８）やＶｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６６（１）：５１−６３（２０００）などを参考にして行うことができる。以下に一例を示す。
まず、ヒト肝細胞株ＰＨ５ＣＨ８を、肝細胞培養用培地〔組成：Ｆ１２培地５００ｍｌ，Ｄ−ＭＥＭ ５００ｍｌ，１％ウシ胎仔血清，１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ，２００μｇ／ｍｌ カナマイシン，１０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン〕の入った２４穴プレートにまき、３７℃で２日程度培養する。他方、ＨＣＶウイルス（例えば、Ｓｅｒｕｍ １Ｂ−２ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｂ）と本発明のポリペプチドとを混合し、４℃で６０分程度反応させる。この反応物を先のＰＨ５ＣＨ８細胞に添加し、３７℃で９０分間インキュベートする。その後ＰＢＳで細胞を洗浄し、３２℃で８日間程度培養する。得られた細胞から常法によりＲＮＡを回収する。このＲＮＡに対し、例えば、ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うことによりＨＣＶゲノムの一部を増輻し、得られた産物を電気泳動に供することにより増幅断片を検出する。増幅断片が検出されないか、又は検出されたとしても極めて弱いことにより、本発明のポリペプチドがＨＣＶの感染防御効果を有することが確認される。増幅断片の量は、電気泳動後のゲル上の核酸を慣用の手段により染色し、バンドの強度をデンシトメーターなどにより測定することにより評価されうる。
さらに、本発明のポリペプチドの別の態様として、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列のラクトフェリンの配列に対して類似の構造（配列）を有し、かつＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドが提供される。
本発明者らは、ＨＣＶが、ヒト及びチンパンジーにしか感染しないことが知られているにもかかわらず、前記配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるポリペプチドが該ＨＣＶに結合すること及び配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６に示されたアミノ酸配列間の配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、それぞれ、ヒト−ウシ間で７４．２％、またヒト−ウマ間で７１％であることを見い出した。すなわち、本発明者らは、このように、ヒトラクトフェリン、さらには、該ヒトラクトフェリン由来のポリペプチドのみならず、ヒトラクトフェリンに対して前記の同一性を保つ程度のアミノ酸残基が置換されたポリペプチドであっても、ＨＣＶのＥ２タンパク質への結合活性を保持することを明らかとした。
従って、かかる知見に基づき、本発明のポリペプチドの別の態様として、本発明は、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（以下、「相同的アミノ酸配列」と称する）の全長又はその一部からなり、かつ、
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有する、
という特性を有する、相同的ポリペプチドを提供するものである。
ここで、「相同的アミノ酸配列の一部からなるポリペプチド」とは、
▲１▼相同的アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、又は、
▲２▼当該部分を含み、かつ相同的アミノ酸配列上の該当位置よりＮ末端方向及び／又はＣ末端方向に伸長したポリペプチド、
であって、かつ、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドを意味する。
より具体的には、前記相同的アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第３８位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第４３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第４８位に該当する部分からなるポリペプチド、第１１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１１位〜第９３位に該当する部分からなるポリペプチド、又は第１位〜第９３位に該当する部分からなるポリペプチドであって、かつ前記活性を有するものが例示される。
ここで、相同的アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の特定の部分に「該当する部分」とは、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と比較すべき配列とを、以下に述べるような手法を用いてアライメントした際に、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上の該当部分に一致する配列部分を指す。
本発明においてアミノ酸配列の「配列同一性」とは、２つのポリペプチド間の残基の同一性および相同性をいう。すなわち、比較する２つの配列間でアミノ酸残基が完全に一致する場合（同一性）のみならず、アミノ酸残基の性質の類似性（相同性）も考慮に入れて、前記配列同一性が決定される場合もある。このような「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアライメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のポリペプチドは、２つの配列の最適なアライメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していても良い。
このようなアミノ酸配列の同一性に関しては、例えば、ソフトウェアＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ〔インフォマックス，インコーポレティッド（ＩｎｆｏＭａｘ，Ｉｎｃ）社製〕を用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））を利用してアライメントを作成することにより、算出することができる。なお、ポリペプチド間の配列同一性は、配列解析ソフト、具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ〔（株）ゼネティックス社製）や公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えばホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般に利用可能である。
前記の配列同一性に関して、少なくとも７１％、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
また、アミノ酸の置換される位置及びアミノ酸の種類に関しては、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第３６位のフェニルアラニンが置換されずに保持されていることが望ましく、それ以外の点については、後述する本発明の改変ポリペプチドの項を参照されたい。
以上のような本発明の相同的ポリペプチドの具体例として、ラクダラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ１３１６７４）、ブタラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ９２０８９）、ヤギラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ７８９０２）、あるいはマウスラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００８５２２）のＣ末端９３アミノ酸の全長又はその一部（第１位〜第３３位、若しくは第１１位〜第５３位の部分を含む）からなるポリペプチドが例示され得る。これら他種ラクトフェリンのＣ末端９３アミノ酸部分と、配列番号：２に示されたアミノ酸配列との配列同一性を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩを用いて算出した結果を以下に示す。いずれもこの領域において、７１％以上の配列同一性を保持するものである。
本発明の相同的ポリペプチドの作製法及び活性測定法は、前述の本発明のポリペプチドと同様である。
さらに本発明のポリペプチドの別の態様として、本発明は、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列（以下、改変アミノ酸配列と称する）の全長又はその一部からなり、かつ、
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有する、
という特性を有する改変ポリペプチドを提供するものである。
ここで、「改変アミノ酸配列の一部からなるポリペプチド」とは、
▲１▼改変アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、又は、
▲２▼当該部分を含み、かつ改変アミノ酸配列上の該当位置よりＮ末端方向及び／又はＣ末端方向に伸長したポリペプチド、
であって、かつ、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドを意味する。
かかる改変ポリペプチドとしては、具体的には、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性を有する改変ポリペプチド；並びに、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の一部からなる配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｉ）又は（ｉ’）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉ’）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
の特性と、
下記（ｉｉ）：
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性とを有する改変ポリペプチドが挙げられる。
より具体的には、前記改変アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第３８位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第４３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第４８位に該当する部分からなるポリペプチド、第１１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１１位〜第９３位に該当する部分からなるポリペプチド、又は第１位〜第９３位に該当する部分からなるポリペプチドであって、かつ前記活性を有するものが例示される。
ここで、改変アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の特定の部分に「該当する部分」とは、前記相同的アミノ酸配列の場合と同様のアライメントを行った結果、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上の該当部分に一致する配列部分を指す。
前記においてアミノ酸配列の改変に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させることにより得ることができる。ここで、部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４）〕、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、例えば、前記ＨＣＶのＥ２との結合活性測定法に従って活性を測定することにより、当該活性を見出すことのできる範囲であれば良い。好ましくは、前記「相同的ポリペプチド」の項で述べたような範囲、すなわち、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有する範囲内で改変の行われることが望ましい。
また、前記置換、欠失、付加又は挿入のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。
アミノ酸の置換を有する改変ポリペプチドにおいて、かかる置換の局在位置は、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６相互においてアミノ酸残基の一致していない部位（第２図参照）が好ましい。すなわち、具体的には、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第４位、第５位、第７位、第８位、第９位、第１０位、第１１位、第１３位、第１６位、第１７位、第２０位、第２１位、第２４位、第２７位、第２８位、第３１位、第３７位、第５４位、第５６位、第５８位、第５９位、第６３位、第６７位、第６８位、第７１位、第７２位、第７４位、第７７位、第７８位、第８１位、第８９位、第９２位、第９３位が挙げられる。なお、第３６位のフェニルアラニンは置換しないことが望ましい。
また、前記置換位置において置換されるアミノ酸の種類は、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上の当該置換位置に存在するアミノ酸残基の中から選ばれることが好ましい。すなわち一例を示すと、配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第４位のアルギニンからグルタミン（ヒト→ウマ型）への置換や、第７位のリジンからアルギニン（ヒト→ウシおよびウマ型）への置換などが挙げられる。
さらに前記置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸との置換をも包含する。このような置換としては、例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
以上のような本発明の改変ポリペプチドの具体例としては、ラクダラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ１３１６７４）、ブタラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号；Ｍ９２０８９）、ヤギラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ７８９０２）、あるいはマウスラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００８５２２）のＣ末端９３アミノ酸の全長又はその一部（第１位〜第３３位、若しくは第１１位〜第５３位の部分を含む）からなるポリペプチドが例示され得る。
以上のような改変ポリペプチドの作製法及び活性測定法は、前述の本発明のポリペプチドと同様である。
さらに、ラクトフェリンの特定のアミノ酸残基をアシル化又はアミノ化することにより、ラクトフェリンの抗ＨＩＶ及び抗ＨＣＶ活性が高まるという報告がなされており［Ｊ．ｐｅｐｔ．ｓｃｉ．，５（１２），５６３−５７６（１９９９）］、本発明のポリペプチドにおいても、同様のアシル化およびアミノ化により活性の上昇することが期待される。
本発明はまた、本発明のポリペプチド（前記相同的ポリペプチドや改変ポリペプチドを含む）を含有するポリペプチドをも提供するものである。すなわち、前述のポリペプチドは、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性がある以上、当該ポリペプチドを含むポリペプチドにも、同様の結合活性の存することは明らかである。
好ましくは、ヒトラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）、ウシラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）、及びウマラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）上の該当位置であるＣ末端９３アミノ酸部分より、Ｎ末端方向に伸長したポリペプチドが挙げられる。ただし、新規性の観点から、ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１、Ｍ６３５０２及びＡＪ０１０９３０のそれぞれに示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本発明の範疇から除かれる。
前記したように、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分、及び第１１位〜第５３位の部分がＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を保持することが示された。従って、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１１位〜第３３位（ヒトラクトフェリンの第６１０番目〜第６３２番目）の間に結合に重要な領域があると考えられる。
したがって、本発明により、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の全長又はその一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１１位〜第３３位の部分を少なくとも含有することを特徴とする、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドも提供され得る。
以上述べた本発明の全てのポリペプチドは、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するものであり、さらには、ＨＣＶ感染を阻害、抑制又は低減させる性質を有するため、ＨＣＶの感染防御剤として有効に使用することができる。すなわち本発明は、本発明のポリペプチドを有効成分とする、ＨＣＶの感染防御剤を提供するものである。
本発明のＨＣＶ感染防御剤のうち好ましいものは、ＨＣＶへの結合に重要な配列部分を有する、より短いポリペプチドを有効成分とするものである。すなわち、前記した本発明のポリペプチド、特に、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位からなるポリペプチドや、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位からなるポリペプチドが、本発明のＨＣＶ感染防御剤の好ましい有効成分として例示される。このようなポリペプチドは、ラクトフェリンそのものを投与する場合と比較して、より投与量が低減できるという効果や、経口投与時における吸収中のタンパク質の分解、及び静脈内注射時における副作用を低減させるといった効果を有し得る。
有効成分である本発明のポリペプチドは、そのまま投与することも出来るが、粒子状の剤形にして投与することもできる。剤形として、より具体的には、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤等の剤形にすることができる。投与量は、症状の程度、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．００１ｍｇ／ｋｇ／回〜１０００ｍｇ／ｋｇ／回であり、これを投与初期には連日投与し、その後、細胞内のウイルス量に応じて数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。投与形態としては、剤形に応じて経口投与、動脈注射、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、皮内投与、肝臓に対する局所注射などが可能である。
また、有効成分である本発明のポリペプチドは血中で安定であることが好ましいが、その為に当該ポリペプチドを修飾しても良い。例えば、当該ポリペプチドとポリエチレングリコールとを結合させて血中半減期を長くすることが可能である。また、ポリペプチドのＮ末端への修飾やＤ−アミノ酸への置換によって、血中で安定なポリペプチドを作製することができる。
本発明のＨＣＶ感染防御剤は、具体的には、Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤として使用される。したがって、本発明により、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤が提供される。より具体的には、慢性Ｃ型肝炎や急性Ｃ型肝炎に使用される。特に、既存のインターフェロン療法に対して抵抗性を示すＣ型慢性肝炎の治療または予防において、有効に用いられる。
また、本発明のＨＣＶ感染防御剤は、インターフェロンと併用して使用することもできる。本発明のポリペプチドは、ＨＣＶと標的細胞との結合を直接阻害するものであるため、例えばインターフェロン投与終了時におけるインターフェロン抵抗性ウイルスの再燃を、より減少させることが可能となる。
さらに、本発明によれば、慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防方法が提供される。かかる治療又は予防方法は、本発明のポリペプチドを、細胞へのＨＣＶの結合を妨げるに十分な治療上有効量、投与対象物に投与することを１つの特徴とする。本発明の治療又は予防方法においては、本発明のＨＣＶ感染防御剤、本発明の慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤を治療上有効量投与してもよい。また、本発明の治療又は予防方法においては、インターフェロンをさらに併用投与してもよい。
前記投与対象物としては、慢性Ｃ型肝炎を罹患した個体、慢性Ｃ型肝炎を罹患する恐れのある個体などが挙げられる。
本発明はまた、前記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供するものである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であってもよい。これら本発明のポリヌクレオチドは、ヒトラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）、ウシラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）、あるいはウマラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）のｃＤＮＡ配列を基にして、当業者であれば容易に製造することできる。詳しくは、前記本発明のポリペプチドの項を参照されたい。
このような本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、前述の本発明のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１、配列番号：３及び配列番号：５からなる群より選ばれた塩基配列からなるポリヌクレオチド、該塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。また、本発明のポリヌクレオチドには、前記配列番号：１、配列番号：３及び配列番号：５からなる群より選ばれた塩基配列などと、縮重若しくは核酸多型を介して異なる配列からなるポリヌクレオチド、又は該塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドも含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの長さは、前記アミノ酸配列の全長を含有したポリペプチドの場合、少なくとも２７９ヌクレオチド、好ましくは、２７９〜１５００ヌクレオチド、より好ましくは、２７９〜９００ヌクレオチド、さらに好ましくは、２７９〜６００ヌクレオチド、さらに好ましくは、２７９〜３００ヌクレオチドが望ましい。かかるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの製造、前記治療又は予防剤への応用などに用いられうる。
また、「塩基配列の一部」は、本発明のポリペプチドの製造、前記治療又は予防剤への応用などに用いる場合、前記アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分を含有するポリペプチドに対応して、少なくとも９９ヌクレオチド、好ましくは、９９〜２７６ヌクレオチド、より好ましくは、９９〜２４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、９９〜１８０ヌクレオチド、さらに好ましくは、９９〜１５０ヌクレオチドが望ましく、第１１位〜第５３位の部分を含有するポリペプチドに対応して、少なくとも１２９ヌクレオチド、好ましくは、１２９〜２７６ヌクレオチド、より好ましくは、１２９〜２４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１２９〜１８０ヌクレオチドが望ましい。
さらに、「塩基配列の一部」は、ポリヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いて、本発明のポリペプチドを製造する場合、少なくとも１２ヌクレオチド、好ましくは、１５〜２００ヌクレオチド、より好ましくは、１５〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜５０ヌクレオチドが望ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを製造する際に有効に用いられ、該ポリペプチドを効率よく供給することを可能にしうる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
発現ベクターの構築と組換えタンパク質の発現及び精製
１）ヒトラクトフェリンの部分ポリペプチドを発現する発現ベクターの構築
白人種正常ヒト乳腺組織よりＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡと、オリゴｄＴプライマー［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製］とを用いて逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（Ｇｉｂｃｏ社製）による逆転写反応を行ない、引き続き、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いて完全長のヒトラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）ｃＤＮＡを増幅した。なお、塩基配列に関して、配列番号：１に記載の塩基配列の第２７０位が、ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１ではｃであるが、実際に得られたｃＤＮＡではｔであった。これは遺伝子多型によるものと考えられる。
さらに、発現させたい領域（以下の▲１▼〜▲６▼）を、それぞれに増幅するためのプライマーセットと、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとを用いたＰＣＲにより増幅した。増幅産物を、ＩＰＴＧ誘導により還元タンパク質のチオレドキシン及びＨｉｓ ｔａｇとの融合タンパク質として発現させることのできるｐＥＴ３２ａ［ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製］のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅに組み込んだ。以上の操作により、ヒトラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸（以下の▲１▼）と、それをさらに小さくした５種類の領域（以下の▲２▼〜▲６▼）を大腸菌で発現させるための発現ベクターを作製した。
▲１▼ヒトラクトフェリン（６００−６９２）
（アミノ酸配列；配列番号：２、塩基配列；配列番号：１）
▲２▼ヒトラクトフェリン（６００−６５２）
（配列番号：２の第１位〜第５３位、配列番号：１の第１位〜第１５９位）
▲３▼ヒトラクトフェリン（６１０−６９２）
（配列番号：２の第１１位〜第９３位、配列番号：１の第３１位〜第２７９位）
▲４▼ヒトラクトフェリン（６２４−６９２）
（配列番号：２の第２５位〜第９３位、配列番号：１の第７３位〜第２７９位）
▲５▼ヒトラクトフェリン（６４０−６９２）
（配列番号：２の第４１位〜第９３位、配列番号：１の第１２１位〜第２７９位）
▲６▼ヒトラクトフェリン（６５３−６９２）
（配列番号：２の第５４位〜第９３位、配列番号：１の第１６０位〜第２７９位）
２）ウマ及びウシラクトフェリンの部分ポリペプチドを発現する発現ベクターの構築
前記１）と同様の方法で、ウマ末梢血リンパ球から抽出したＲＮＡを用いて逆転写反応を行い、ウマラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）のｃＤＮＡをＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにより増幅した。得られた増幅産物を鋳型としてカルボキシル末端９３アミノ酸をコードする領域（アミノ酸配列；配列番号：６、塩基配列；配列番号：５）をさらに増幅し、ｐＥＴ３２ａのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅへ組み込んだ。
また、ウシ乳腺組織より抽出したＲＮＡを用いて同じく逆転写反応を行い、ウシラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）ｃＤＮＡを増幅した。得られた増幅産物を鋳型としてカルボキシル末端９３アミノ酸をコードする領域（アミノ酸配列；配列番号：４、塩基配列；配列番号：３）をさらに増幅し、ｐＥＴ３２ａのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅに組込み込んだ。
３）ヒトＣＤ８１のラージエクストラループを発現する発現ベクターの構築
ヒトＣＤ８１のラージエクストラループはＨＣＶのＥ２タンパク質と結合することが知られており、ＨＣＶ受容体の候補となっている［Ｐｉｌｅｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２（５３９０），９３８−９４１（１９９８）］。
ラクトフェリンとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合の強さと比較するため、ＳＶ４０ラージＴ抗原で不死化したヒト肝細胞であるＰＨ５ＣＨ８細胞よりＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴプライマーとを用いて逆転写反応を行い、ヒトＣＤ８１（ジーンバンクアクセッション番号：ＸＭ＿００６４７５）を含むｃＤＮＡをＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。得られた増幅産物を鋳型としてさらに１１３番目から２０１番目のアミノ酸を含む領域をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、その増幅産物をｐＥＴ３２ａのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅに組込み、ヒトＣＤ８１ラージエクストラループの発現ベクターを構築した。
４）組換えタンパク質の発現及び精製
前記１）〜３）で得られた発現ベクターを宿主大腸菌ＡＤ４９４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。その後１０ｍｌのＬＢ培地で３７度で１６時間培養したものを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１５μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した２００ｍｌのＬＢ培地に加え３７度で４時間培養した。その後、培養物に、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに４〜５時間培養した。得られた培養物を、３０００×ｇで１０分遠心分離した。ついで、−８０度でペレットを一晩冷凍し、１０ｍｌのＢ−ＰＥＲ登録商標〔ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕にてペレットを溶解し、室温で１５分攪拌した。その後、得られた混合物を、２００００×ｇで３０分遠心分離した。得られた上清を可溶性画分、ペレットを不溶性画分として取り扱った。
不溶性分画は、再度、２００μｇ／ｍｌのｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ）を含むＢ−ＰＥＲ登録商標１０ｍｌでペレットを溶解し、室温で攪拌した。ついで、得られた混合物を、２００００×ｇで３０分遠心分離した。その後ペレットを、２０ｍｌの１０倍希釈Ｂ−ＰＥＲ登録商標で溶解し、２００００×ｇで３０分遠心分離する操作を３回繰り返し、最終的に得られたペレットを６Ｍの尿素を含んだＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ〔ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕にて溶解して精製に用いた。
精製は、Ｈｉｓ−ｂｉｎｄ ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とＨｉｓ・Ｂｉｎｄ登録商標Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用い、製造者のマニュアルに従って行った。不溶性分画ではすべてのステップを、６Ｍ尿素存在下で行い、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認を行った。
実施例２
ファーウェスタンブロッティング（１）
実施例１で得られた精製ヒトラクトフェリン断片タンパク質が、ＨＣＶのエンベロープタンパク質であるＥ２タンパク質と結合するかをファーウェスタンブロッティングにて検討した。プローブとして、ＣＨＯ細胞にて培養液中に分泌させたＥ２タンパク質［Ｉｎｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１４（１７／１８），１５９０−１５９６（１９９６）］を用いた。
実施例１で得られた精製タンパク質をそれぞれ２μｇ用いて１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いＰＶＤＦ膜に転写した。その後、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したＮ−ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，０．２５％ｇｅｌａｔｉｎ］にて１時間ブロッキングした。
Ｅ２タンパク質を含むＣＨＯ細胞の培養上清（総タンパク質量２５０μｇ）を、同じくＢＳＡを添加したＮ−ｂｕｆｆｅｒ ５ｍｌで希釈した。得られた溶液と前記ＰＤＶＦ膜とを接触させて、室温で６０分結合反応させた。前記ＰＤＶＦ膜を、Ｎ−ｂｕｆｆｅｒで１０分ｘ３回洗浄後、再び２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＮ−ｂｕｆｆｅｒで１時間ブロッキングした。
その後、ラット抗ＨＣＶＥ２モノクローナル抗体（Ｍｏ−１２）［Ｉｎｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２（１２），８７５−８７７（１９９８）］を５ｍｌのＮ−ｂｕｆｆｅｒで１０００倍希釈した溶液と前記ＰＶＤＦ膜とを接触させ、６０分反応を行った。前記ＰＶＤＦ膜を、０．１％Ｔｒｉｓ−ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０］にて５分ｘ３回洗浄後、１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ラット二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｃａｔ．ＮＡ９３５）を加えた０．１％Ｔｒｉｓ−ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎと接触させて、３０分反応を行った。ついで、前記ＰＤＶＦ膜を、０．１％Ｔｒｉｓ−ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎにて２０分ｘ３回洗浄した。ルネッサンスＴＭルミノールウェスタンブロット化学発光検出試薬プラス（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にて化学発光させ、Ｘ線フィルム（ＫＯＤＡＫ ＢｉｏＭａｘ）で感光した。
ヒト、ウシ、ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸部分のファーウエスタンブロッティングの結果を第１図に示す。第１図のレーン１〜７は以下の結果を示す。
レーン１：空ベクターｐＥＴ３２ａを発現させ得られたチオレドキシンタグ（２２ｋＤａ）
レーン２：ヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｌ３７７０）
レーン３：ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｔ６５４９，８０ｋＤａ）
レーン４：ヒトラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸
レーン５：ウシラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸
レーン６：ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸
レーン７：ヒトＣＤ８１の１１３番目から２０１番目のアミノ酸
（このうちレーン４〜７はｐＥＴ３２ａで発現させ精製したタンパク質を使用）
その結果、ネガティブコントロールのチオレドキシンタグと全長のヒトトランスフェリンは、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合が認められなかったが、ヒト、ウシ、ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸は、ポジティブコントロールのヒトラクトフェリン同様にＨＣＶのＥ２タンパク質と結合し、その強度はヒトＣＤ８１に比べ二倍程度強いことが示された。
第２図は、ヒト、ウシ、ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸配列のアミノ酸の同一性を示したものである。図中、＊で表示されるアミノ酸はヒトラクトフェリンに対して同一のアミノ酸であることを示す。ヒトラクトフェリン（１００％）に対する配列同一性は、ウシラクトフェリンで７４．２％、ウマラクトフェリンで７１．０％であった。この値は、ヒトトランスフェリン（５９．１％）に対する配列同一性及びウシトランスフェリン（５１．６％）に対する配列同一性と比べて高いものであった。
実施例３
ファーウェスタンブロッティング（２）
ヒトラクトフェリンの種々の部分ポリペプチド（実施例１−１）の▲１▼〜▲６▼参照）につき、実施例２と同様のファーウエスタンブロッティングを行った結果を第３図に示す。第３図のレーン１〜８は以下の結果を示す。
レーン１：ヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｌ３７７０）
レーン２：ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｔ６５４９，８０ｋＤａ）
レーン３：ヒトラクトフェリン（６００−６９２）
レーン４：ヒトラクトフェリン（６００−６５２）
レーン５：ヒトラクトフェリン（６１０−６９２）
レーン６：ヒトラクトフェリン（６２４−６９２）
レーン７：ヒトラクトフェリン（６４０−６９２）
レーン８：ヒトラクトフェリン（６５３−６９２）
〔レーン３〜８のうちレーン４のみ部分精製、他はそれぞれをｐＥＴ３２ａで発現させ精製したタンパク質を使用。なお部分精製とは、実施例１−４）の第１段落までの工程を行ったものを指す〕
この結果をまとめたものを第４図に示す。ヒトラクトフェリンとＨＣＶのＥ２タンパク質の結合には、少なくともヒトラクトフェリンの６１０番目から６５２番目のアミノ酸（配列番号：２の第１１位〜第５３位）の間に結合に重要な領域があることが予想された。
実施例４
ファーウェスタンブロッティング（３）
ヒトラクトフェリンの６１０番目〜６５２番目のアミノ酸配列及びその前後の配列につき、実施例３と同様のファーウエスタンブロッティングを行った結果を第５図に示す。第５図のレーン１〜１０は以下の結果を示す。
レーン１：ヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｌ３７７０）
レーン２：ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｔ６５４９，８０ｋＤａ）
レーン３：ヒトラクトフェリン（６００−６９２）
レーン４：ヒトラクトフェリン（６００−６５２）
レーン５：ヒトラクトフェリン（６１０−６５２）
レーン６：ヒトラクトフェリン（６１０−６５２）
（６３５番目のフェニルアラニンをロイシンに置換したもの）
レーン７：ヒトラクトフェリン（６１０−６４２）
レーン８：ヒトラクトフェリン（６２０−６５２）
レーン９：ヒトラクトフェリン（６２０−６４２）
レーン１０：空ベクターを発現させ得られたチオレドキシンタグ（２２ｋＤａ）
（レーン３〜１０はそれぞれｐＥＴ３２ａで発現させ精製したタンパク質を使用）
この結果より、実施例３で予測したヒトラクトフェリン６１０番目から６５２番目（配列番号：２の第１１位〜第５３位）の領域がＨＣＶのＥ２タンパク質と結合することが明らかになった。
さらに、６３５番目（配列番号：２の第３６位）のフェニルアラニンをロイシンに置換することにより結合がほとんど認められなくなったことより、この結合にはヒトラクトフェリンの６３５番目のフェニルアラニンが重要であることが示された。
実施例５
ファーウェスタンブロッティング（４）
ヒトラクトフェリンの６００番目〜６５２番目のアミノ酸配列及びさらにそれを縮めた配列につき、実施例２〜４と同様のファーウエスタンブロッティングを行った結果を第６図に示す。第６図のレーン１〜７は以下の結果を示す。
レーン１：ヒトラクトフェリン（６００−６２２）
レーン２：ヒトラクトフェリン（６００−６２７）
レーン３：ヒトラクトフェリン（６００−６３２）
レーン４：ヒトラクトフェリン（６００−６３７）
レーン５：ヒトラクトフェリン（６００−６４２）
レーン６：ヒトラクトフェリン（６００−６４７）
レーン７：ヒトラクトフェリン（６００−６５２）
（レーン１〜７はそれぞれｐＥＴ３２ａで発現させ精製したタンパク質を使用）
この結果より、ヒトラクトフェリン６００番目から６３２番目のアミノ酸（配列番号：２の第１位〜第３３位）を有していればＨＣＶのＥ２タンパク質と結合することが明らかとなった。
実施例６
前記実施例５などにおいて、ＨＣＶのＥ２蛋白質との結合が認められたヒトラクトフェリン（６００−６３２）：
ＶＶＳＲＭＤＫＶＥＲ ＬＫＱＶＬＬＨＱＱＡ ＫＦＧＲＮＧＳＤＣＰ ＤＫＦ（配列番号：７）と、
該ポリペプチドに相当する配列部分であるウシラクトフェリン（５９９−６３１）：
ＶＶＳＲＳＤＲＡＡＨ ＶＫＱＶＬＬＨＱＱＡ ＬＦＧＫＮＧＫＮＣＰ ＤＫＦ（配列番号：８）
とを合成した。
前記ポリペプチドを用い、培養肝細胞へのＨＣＶの感染に対する防御活性を検討した。
ヒト肝細胞株ＰＨ５ＣＨ８を、肝細胞培養用培地〔組成：Ｆ１２培地５００ｍｌ，Ｄ−ＭＥＭ ５００ｍｌ，１％ウシ胎仔血清，１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ，２００μｇ／ｍｌ カナマイシン，１０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン〕１００μｌを含むコラーゲン処理９６穴プレートに、５ｘ１０４細胞／ウエルとなるように播種し、３７℃で２日間培養した。他方、ＨＣＶウイルス陽性ヒト血清（１Ｂ−２／ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｂ：２ｘ１０４コピーＨＣＶＲＮＡを含む）と、前記ヒトラクトフェリン由来ポリペプチド又はウシラクトフェリン由来ポリペプチドとを混合し、４℃で６０分間反応させた。
得られた混合物を、ＰＨ５ＣＨ８細胞に添加して３７℃で９０分間インキュベートした。ついで、ＰＨ５ＣＨ８細胞を、前記肝細胞培養用培地で３回洗浄し、さらに３２℃で２４時間培養した。
その後、細胞から常法によりＲＮＡを回収し、０．５μｇＲＮＡ中に含まれるＨＣＶ ＲＮＡをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて以下の文献（Ｎｏｚａｋｉ Ａ．ａｎｄ Ｋａｔｏ Ｎ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲ．Ａｃｔａ Ｍｅｄｉｃａ Ｏｋａｙａｍａ，５６（２），１０７−１１０（２００２））に従い定量した。
その結果、第７図のパネルＡに示すように、ヒトラクトフェリン（６００−６３２）は、濃度依存的にＨＣＶの培養肝細胞への吸着を防御し、実際に、感染をも防御することが明らかとなった。また、第７図のパネルＢに示すように、ウシラクトフェリン（５９９−６３１）も、濃度依存的にＨＣＶの培養肝細胞への吸着を防御し、感染を防御する活性があることがわかったが、その活性は、ヒト由来のものと比べて低かった。
産業上の利用可能性
本発明により、ＨＣＶのＥ２タンパク質に結合活性を有するＨＣＶ結合性ポリペプチドが提供される。本発明によれば、ＨＣＶのＥ２タンパク質に結合することにより、ＨＣＶの肝細胞への結合を防ぎ、さらには、感染を防御することができ、それにより慢性Ｃ型肝炎などを治療または予防することが可能になる。したがって、慢性Ｃ型肝炎の治療剤または予防剤、慢性Ｃ型肝炎の治療または予防方法が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒト、ウシ及びウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸部分とＨＣＶのＥ２タンパク質との結合を調べたファーウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中、レーン１は、空ベクターｐＥＴ３２ａを発現させて得られたチオレドキシンタグ（２２ｋＤａ）の結果を、レーン２は、ヒトラクトフェリンの結果を、レーン３は、ヒトトランスフェリンの結果を、レーン４は、ヒトラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸の結果を、レーン５は、ウシラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸の結果を、レーン６は、ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸の結果を、レーン７は、ヒトＣＤ８１（ジーンバンクアクセッション番号：ＸＭ＿００６４７５）の１１３番目〜２０１番目のアミノ酸の結果を示す。
第２図は、ヒト、ウシ及びウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸配列のアミノ酸の同一性を示したものである。図中、＊で表示されるアミノ酸はヒトラクトフェリンと同一のアミノ酸であることを示す。
第３図は、ヒトラクトフェリンの種々の部分ポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合を調べたファーウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中、レーン１は、全長のヒトラクトフェリンの結果を、レーン２は、全長のヒトトランスフェリンの結果を、レーン３は、ヒトラクトフェリン（６００−６９２）の結果を、レーン４は、ヒトラクトフェリン（６００−６５２）の結果を、レーン５は、ヒトラクトフェリン（６１０−６９２）の結果を、レーン６は、ヒトラクトフェリン（６２４−６９２）の結果を、レーン７は、ヒトラクトフェリン（６４０−６９２）の結果を、レーン８は、ヒトラクトフェリン（６５３−６９２）の結果を示す。
第４図は、第２図および第３図に示される結果をまとめた図である。図中の数値はヒトラクトフェリンおよびヒトＣＤ８１のアミノ酸番号を示す。
第５図は、ヒトラクトフェリンの種々の部分ポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合を調べたファーウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中、レーン１は、全長のヒトラクトフェリンの結果を、レーン２は、全長のヒトトランスフェリンの結果を、レーン３は、ヒトラクトフェリン（６００−６９２）の結果を、レーン４は、ヒトラクトフェリン（６００−６５２）の結果を、レーン５は、ヒトラクトフェリン（６１０−６５２）の結果を、レーン６は、ヒトラクトフェリン（６１０−６５２）（ただし６３５番目のフェニルアラニンをロイシンに置換）の結果を、レーン７は、ヒトラクトフェリン（６１０−６４２）の結果を、レーン８は、ヒトラクトフェリン（６２０−６５２）の結果を、レーン９は、ヒトラクトフェリン（６２０−６４２）の結果を、レーン１０は、空ベクターを発現させ得られたチオレドキシンタグ（２２ｋＤａ）の結果を示す。
第６図は、ヒトラクトフェリンの種々の部分ポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合を調べたファーウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中、レーン１は、ヒトラクトフェリン（６００−６２２）の結果を、レーン２は、ヒトラクトフェリン（６００−６２７）の結果を、レーン３は、ヒトラクトフェリン（６００−６３２）の結果を、レーン４は、ヒトラクトフェリン（６００−６３７）の結果を、レーン５は、ヒトラクトフェリン（６００−６４２）の結果を、レーン６は、ヒトラクトフェリン（６００−６４７）の結果を、レーン７は、ヒトラクトフェリン（６００〜６５２）の結果を示す。
第７図は、培養肝細胞へのＨＣＶの感染に対するヒトラクトフェリン（６００−６３２）及びウシラクトフェリン（５９９−６３１）それぞれの影響を調べた結果を示す図である。図中、パネルＡは、ヒトラクトフェリン（６００−６３２）、パネルＢは、ウシラクトフェリン（５９９−６３１）の結果を示す。
本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の感染を阻害、抑制又は低減させることが可能な技術に関する。具体的には、本発明は、ＨＣＶとの結合活性、特に、ＨＣＶのＥ２（エンベロープ２）タンパク質との結合活性を有するＨＣＶ結合性ポリペプチド；ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させることが可能なＨＣＶの感染防御剤；慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防に用いうる、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤；該ポリペプチドをコードしたポリヌクレオチド；慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防方法；並びに該慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤を製造するための該ポリペプチドの使用などに関する。
背景技術
現在、ＨＣＶが主要な原因となり年間の死者が三万人を超える肝がんの発症を抑制するために、インターフェロン以外の抗ＨＣＶ薬の開発が嘱望されている。
これに関して、本発明者らは、近年、ＨＣＶとヒト肝細胞由来培養細胞とを用いるＨＣＶ感染系において、ＨＣＶ初乳中に豊富に含まれ、鉄のトランスポーターファミリーの一員であるラクトフェリンが、ヒト肝細胞由来培養細胞へのＨＣＶの感染を防御することを見出している［Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２４５（２），５４９−５５３（１９９８）；Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６６（１），５１−６３（２０００）］。また、本発明者らは、実際に、慢性Ｃ型肝炎患者にウシラクトフェリンを経口投与し、効果を認めた症例を報告している［Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，９０（４）：３６７−３７１（１９９９）］。
また、最近、本発明者らは、前記ＨＣＶ感染系を用いて、細胞へのＨＣＶの吸着とラクトフェリンとの相互作用の時間的関係を解析した。その結果、本発明者らは、ラクトフェリンとＨＣＶとを混合し、直ちに細胞に添加した場合でもＨＣＶ感染が完全に阻害されることを見出し、それにより、ＨＣＶとラクトフェリンとの相互作用は、ＨＣＶの細胞への吸着よりも早く起こることを明らかにした［第５８回日本癌学会総会要旨集、１４５頁 Ｎｏ．２２３，（１９９９）］。
さらに、本発明者らは、ＨＣＶのどのタンパク質がラクトフェリンとの相互作用に関与しているのかを解析した結果、ラクトフェリンはＨＣＶのＥ２タンパク質に直接結合することを明らかにした［第５８回日本癌学会総会要旨集、１４５頁，Ｎｏ．２２３，（１９９９）］。
以上のように、ラクトフェリンとＨＣＶのＥ２タンパク質との相互作用が、ＨＣＶの感染防御に重要であることが示されている。しかしながら、約７００アミノ酸からなるラクトフェリン中のどの限定領域がＨＣＶのＥ２タンパク質との結合に必須の領域であるかについては、未だ十分に明らかにされていないのが現状である。
発明の開示
本発明は、生体へのＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させるための手段を提供することを目的とする。具体的には、本発明は、ＨＣＶとの結合活性を有するＨＣＶ結合性ポリペプチド及びその応用を提供することを目的とする。さらに詳しくは、本発明は、ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させることが可能であり、かつ生体への取り込みにより適したサイズである、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するＨＣＶ結合性ポリペプチドを提供することを目的とする。また、本発明は、ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させることが可能な、ＨＣＶの感染防御剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防に有用である、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤を提供することを目的とする。さらに、本発明は、本発明のポリペプチドを効率よく供給することを可能にしうる、ポリヌクレオチドを提供することを目的とする。また、本発明は、慢性Ｃ型肝炎の症状の緩和、予防などを可能にしうる、慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防方法を提供することを目的とする。
即ち本発明の要旨は、
〔１〕 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分又は該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有してなる、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチド、
〔２〕 （Ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の全長、又は
（ＩＩ）前記（Ｉ）記載のアミノ酸配列の一部からなる配列であって、かつ該配列が、アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分若しくは該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を含有するものである配列、
を少なくとも含有してなる、前記〔１〕記載のＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチド、
〔３〕 配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分を少なくとも含有してなる、前記〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド、
〔４〕 配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有してなる、前記〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド、
〔５〕 下記（ａ）〜（ｘ）：
（ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位、
（ｂ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位、
（ｃ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位、
（ｄ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位、
（ｅ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位、
（ｆ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位、
（ｇ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位、
（ｈ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位、
（ｉ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位、
（ｊ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位、
（ｋ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位、
（ｌ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位、
（ｍ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位、
（ｎ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位、
（ｏ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位、
（ｐ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位、
（ｑ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位、
（ｒ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位、
（ｓ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位、
（ｔ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位、
（ｕ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位、
（ｖ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位、
（ｗ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位、及び
（ｘ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位
からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなる、前記〔１〕又は〔２〕記載のポリペプチド、
〔６〕 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性を有するポリペプチド、
〔７〕 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列の全長からなり、かつ下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性を有するポリペプチド、
〔８〕 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の一部からなる配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列の全長からなり、かつ下記（ｉ）又は（ｉ’）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉ’）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
の特性と、
下記（ｉｉ）：
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性とを有するポリペプチド、
〔９〕 置換位置が、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第４位、第５位、第７位、第８位、第９位、第１０位、第１１位、第１３位、第１６位、第１７位、第２０位、第２１位、第２４位、第２７位、第２８位、第３１位、第３７位、第５４位、第５６位、第５８位、第５９位、第６３位、第６７位、第６８位、第７１位、第７２位、第７４位、第７７位、第７８位、第８１位、第８９位、第９２位及び第９３位から選ばれるものである、前記〔７〕又は〔８〕記載のポリペプチド、
〔１０〕 前記置換位置において置換されるアミノ酸が、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上の当該置換位置に存在するアミノ酸の中から選ばれるものである、前記〔９〕記載のポリペプチド、
〔１１〕 細胞へのＨＣＶの感染に対する阻害能を有する、前記〔１〕〜〔１０〕いずれか１項に記載のポリペプチド、
〔１２〕 前記〔１〕〜〔１１〕いずれか１項に記載のポリペプチドを含有してなるポリペプチド（ただしジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１、Ｍ６３５０２及びＡＪ０１０９３０のそれぞれに示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）、
〔１３〕 前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、ＨＣＶの感染防御剤、
〔１４〕 前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤、
〔１５〕 前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドをコードしてなるポリヌクレオチド、
〔１６〕 前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドを、細胞へのＨＣＶの結合を妨げるに十分な治療上有効量、投与対象物に投与することを特徴とする、慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防方法、並びに
〔１７〕 ＨＣＶの感染防御剤、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤を製造するための前記〔１〕〜〔１２〕いずれか１項に記載のポリペプチドの使用、
に関する。
発明を実施するための最良の形態
本発明の１つの態様としては、細胞へのＨＣＶの吸着を阻害、抑制又は低減させることが可能であり、かつ生体への取り込みにより適したサイズである、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するラクトフェリン由来ポリペプチドが挙げられる。
具体的には、本発明のポリペプチドは、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分又は該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有することに１つの大きな特徴がある。
したがって、本発明のポリペプチドは、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を呈するという優れた性質を発現する。
さらに、本発明のポリペプチドによれば、全長ラクトフェリンよりも短い長さであるにもかかわらず、ＨＣＶの感染を実際に阻害、抑制又は低減することができるという優れた性質を発現する。
また、本発明のポリペプチドは、国際公開第０１／７２３２２号パンフレット及び国際公開第０１／４７５４５号パンフレットのそれぞれに開示された、ＨＣＶへの結合活性を示しうる特定の配列からなるラクトフェリン由来部分ポリペプチドの配列〔ＧＲＲＲＲＳＶＱＷＣ ＡＶＳＱＰＥＡＴＫＣ ＦＱＷＱＲＮＭＲＫＶ ＲＧＰＰＶＳＣＩＫＲ ＤＳＰＩＱＣＩ（配列番号：９）；ＤＰＤＰＮＣＶＤＲＰ ＶＥＧＹＬＡＶＡＶＶ ＲＲＳＤＴＳＬＴＷＮ ＳＶＫＧＫＫＳＣＨＴ ＡＶＤ（配列番号：１０）〕とは、異なるものであるにもかかわらず、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を呈し、さらには、ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減することができるという驚くべき性質を発現する。
本明細書において、「ラクトフェリン」のアミノ酸配列を表記する場合、シグナル配列がプロセッシングされた成熟ラクトフェリンタンパク質のアミノ酸配列を指すものとする。すなわち、ラクトフェリンのアミノ酸配列の「６１０番目〜６５２番目」といった表記をする場合、当該アミノ酸配列は、ラクトフェリンの成熟タンパク質のＮ末端のアミノ酸を１番目のアミノ酸とした場合の数を示す。
また、以下、本明細書において、「ヒトラクトフェリン（Ｘ−Ｙ）」の表記は、特に断りのない限り、ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１に記載のヒトラクトフェリンのアミノ酸配列におけるＸ番目〜Ｙ番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す。さらに、本明細書において、「ウシラクトフェリン（Ｘ−Ｙ）」の表記は、特に断りのない限り、ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２に記載のウシラクトフェリンのアミノ酸配列におけるＸ番目〜Ｙ番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す。さらに、本明細書において、「ウマラクトフェリン（Ｘ−Ｙ）」の表記は、特に断りのない限り、ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０に記載のウシラクトフェリンのアミノ酸配列におけるＸ番目〜Ｙ番目のアミノ酸残基からなるポリペプチドを示す。
前述のように、近年、ラクトフェリンが、ＨＣＶの感染防御に効果を有することが示されている［Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２４５（２），５４９−５５３（１９９８）；Ｉｋｅｄａ ｅｔ ａｌ，Ｖｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６６（１），５１−６３（２０００）；Ｔａｎａｋａ ｅｔ ａｌ，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．９０（４），３６７−３７１（１９９９）］。また両者の相互作用に関して、ラクトフェリンはＨＣＶのＥ２タンパク質に結合することが明らかにされている（第５８回日本癌学会総会要旨集、１４５頁Ｎｏ．２２３，１９９９）。しかしながら、ラクトフェリン中のどの限定領域がＨＣＶのＥ２タンパク質との結合に必須であるかについては明らかにされていなかった。
本発明者らは、ラクトフェリン中のどの領域がＨＣＶのＥ２タンパク質に結合活性を有するのか、またその結合の強さはどの程度であるのかにつき鋭意検討を進めた。
すなわち、本発明は、ヒト、ウシおよびウマラクトフェリンそれぞれのカルボキシル末端９３アミノ酸部分からなるポリペプチド、具体的には、下記３つの配列：
▲１▼配列番号：２に示されるヒトラクトフェリンのＣ末端９３アミノ酸部分、
ヒトラクトフェリンのアミノ酸配列（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）における第６００番目〜第６９２番目の部分（配列番号：２）、
▲２▼配列番号：４に示されるウシラクトフェリンのＣ末端９３アミノ酸部分、
ウシラクトフェリンのアミノ酸配列（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）における第５９９番目〜第６９１番目の部分（配列番号：４）、
並びに
▲３▼配列番号：６に示されるウマラクトフェリンのＣ末端９３アミノ酸部分、
ウマラクトフェリンのアミノ酸配列（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）における第５９９番目〜第６９１番目の部分（配列番号：６）、が、いずれも、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有し、９３アミノ酸部分の中にＨＣＶのＥ２タンパク質との結合領域が存在するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。しかも、これらのポリペプチドによれば、その結合の強さは、ＨＣＶの本来の受容体であるＣＤ８１ラージエクストラループへのＨＣＶの結合活性と比較して２倍程度強いという、予想外の効果を発揮する。
さらに、本発明は、ヒトラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸のうちのどの限定領域がＨＣＶのＥ２タンパク質との結合に必須であるのかについて、前記９３アミノ酸部分（配列番号：２）をさらに限定した何種類かのポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を調べた結果、ヒトラクトフェリンの６００番目〜６３２番目（配列番号：２の第１位〜第３３位）の３３アミノ酸部分、若しくはヒトラクトフェリンの６１０番目〜６５２番目（配列番号：２の第１１位〜第５３位）の４３アミノ酸部分を有していれば、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するという本発明者らの驚くべき知見に基づく。また、本発明は、ヒトラクトフェリンの第６３５番目（配列番号：２の第３６位）のフェニルアラニンが保持されていることが、ＨＣＶのＥ２タンパク質への結合にとって重要であるという本発明者らの驚くべき知見に基づく。
また、これら３つの配列（配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６）間のアミノ酸の同一性は、それぞれ７４．２％（ヒト−ウシ）および７１％（ヒト−ウマ）であったことから、この程度の配列同一性を保持する程度にアミノ酸残基が置換されていても、ＨＣＶのＥ２タンパク質への結合活性を有することが明らかとなった。本発明は、以上のような知見に基づき完成するに至ったものである。
従って、本発明によれば、具体的には、（Ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の全長（９３アミノ酸）、又は
（ＩＩ）前記（Ｉ）記載のアミノ酸配列の一部からなる配列であって、かつ該配列が、アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分若しくは該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を含有するものである配列、
を少なくとも含有した、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドが提供される。
ここで、本発明のポリペプチドの長さは、前記（Ｉ）を含有する場合、少なくとも９３アミノ酸残基、好ましくは、９３〜５００残基、より好ましくは、９３〜３００残基、さらに好ましくは、９３〜２００残基、よりさらに好ましくは、９３〜１００残基であるか、あるいは配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の全長そのものであることが望ましい。
また、前記（ＩＩ）における「アミノ酸配列の一部」に関して、前記アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分を含有する場合、本発明のポリペプチドの長さは、少なくとも３３アミノ酸残基、好ましくは、３３〜９２残基、より好ましくは、３３〜８０残基、さらに好ましくは、３３〜６０残基、よりさらに好ましくは、３３〜５０残基であることが望ましく、第１１位〜第５３位の部分を含有する場合、本発明のポリペプチドの長さは、少なくとも４３アミノ酸残基、好ましくは、４３〜９２残基、より好ましくは、４３〜８０残基、さらに好ましくは、４３〜６０残基、よりさらに好ましくは、４３〜５０残基であることが望ましい。
なお、前記（ＩＩ）においては、アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分と該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分との両方を含有するもの、すなわち、第１位〜第５３位を含有するものも包含される。
ここで、本発明においては、ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１、Ｍ６３５０２及びＡＪ０１０９３０のそれぞれに示されたアミノ酸配列の全長からなるポリペプチドは除外される。
好ましくは、配列番号：２に示されるアミノ酸配列の全長、
又は
該アミノ酸配列の一部からなる配列であって、かつ該配列が、アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分若しくは該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を含有するものである配列、
を少なくとも含有した、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドが挙げられ、具体的には、配列番号：２に示されたアミノ酸配列の全長又はその一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分を少なくとも含有するポリペプチド、又は配列番号：２に示されたアミノ酸配列の全長又はその一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有するポリペプチドが挙げられる。より具体的には、
▲１▼配列番号：２に示されたアミノ酸配列の全長からなるポリペプチド、
▲２▼配列番号：２に示されたアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分を少なくとも含有するポリペプチド、
▲３▼配列番号：２に示されたアミノ酸配列の一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有するポリペプチド、
▲４▼配列番号：２において、第１位〜第３３位の部分若しくは第１１位〜第５３位の部分が少なくとも保存されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、
などが挙げられる。
前記において、「アミノ酸配列の一部からなるポリペプチド」とは、
▲１▼配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分、若しくは第１１位〜第５３位の部分からなるポリペプチド、又は、
▲２▼当該部分を含み、かつこの位置より配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上、Ｎ末端方向及び／又はＣ末端方向に伸長したポリペプチド、すなわち、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端にアミノ酸残基が付加されたポリペプチド
を意味する。
ここで、前記▲２▼において、前記アミノ酸配列のＮ末端及び／又はＣ末端におけるアミノ酸残基の付加数は、ポリペプチドが、前記結合活性を呈し、ＨＣＶの感染を阻害、抑制又は低減させる能力を発揮する範囲であればよい。また、付加されるアミノ酸残基は、天然のアミノ酸配列、具体的には、配列番号：２、４及び６からなる群より選択されたアミノ酸配列における該当部分と同じアミノ酸残基であればよく、ポリペプチドの前記結合活性及びＨＣＶ感染を阻害、抑制又は低減させる能力を発揮させるに適した物理化学的性質を有するアミノ酸であればよい。さらにかかるアミノ酸残基は、生体への親和性を付与しうる種々の修飾残基であってもよい。
これら本発明のポリペプチドの具体例としては、例えば、
（ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｂ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｃ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｄ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｅ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位からなるポリペプチド、〔配列番号：７に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド〕
（ｆ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位からなるポリペプチド、
（ｇ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位からなるポリペプチド、
（ｈ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位からなるポリペプチド、
（ｉ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｊ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｋ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｌ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｍ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位からなるポリペプチド、〔配列番号：８に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド〕
（ｎ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位からなるポリペプチド、
（ｏ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位からなるポリペプチド、
（ｐ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位からなるポリペプチド、
（ｑ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｒ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位からなるポリペプチド、
（ｓ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｔ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位からなるポリペプチド、
（ｕ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位からなるポリペプチド、
（ｖ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位からなるポリペプチド、
（ｗ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位からなるポリペプチド、
（ｘ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位からなるポリペプチド、
などが例示される。
これらのポリペプチドは、化学的合成法又は遺伝子工学的手法のいずれでも作製されうる。すなわち、慣用の化学合成法により、ペプチド合成機などを用いて前記ポリペプチドを合成することもできれば、慣用の遺伝子工学的手法により、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させることによって、該ポリペプチドを調製することもできる。
ここで、ペプチドの合成については、通常のペプチド化学において用いられる方法に準じて行うことができる。該公知方法としては文献［ペプタイド・シンセシス（Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ），Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９６６）；ザ・プロテインズ（Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ），Ｖｏｌ ２，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９７６）；ペプチド合成，丸善（株），（１９７５）；ペプチド合成の基礎と実験，丸善（株），（１９８５）；医薬品の開発 続 第１４巻・ペプチド合成，広川書店，（１９９１）］などに記載されている方法が挙げられる。
他方、前記ポリペプチドをコードするＤＮＡを発現させて当該ポリペプチドを調製する手法としては、現在では当業者に周知の種々の手法が確立されており、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｔ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）などの基本書に従って行うことができる。以下、具体例を記述する。
まず、前記の種々のポリペプチドをコードするＤＮＡは、ヒトラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）、ウシラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）、あるいはウマラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）のｃＤＮＡ配列上の所望の部分をＰＣＲにより増幅することによって単離することができる。なお、前記配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６に記載のポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列の一例として、それぞれ配列番号：１、配列番号：３及び配列番号：５に記載の塩基配列を例示することができる。なお、当業者であれば、かかる塩基配列が、縮重若しくは核酸多型を介して異なる配列であってもよいことが理解されるであろう。
前記ＤＮＡを挿入する発現ベクターとしては、用いる宿主や目的等に応じて、適宜選択することができ、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター等が挙げられる。
例えば、宿主が大腸菌の場合、ベクターとしては、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９、ｐＢＲ３２２、ｐＣＲ３等のプラスミドベクター、λＺＡＰＩＩ、λｇｔ１１などのファージベクターが挙げられる。宿主が酵母の場合、ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＹＥＵｒａ３などが挙げられる。宿主が昆虫細胞の場合には、ｐＡｃＳＧＨｉｓＮＴ−Ａなどが挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、ｐＫＣＲ、ｐＣＤＭ８、ｐＧＬ２、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＲｃ／ＲＳＶ、ｐＲｃ／ＣＭＶなどが挙げられる。
前記ベクターは、発現誘導可能なプロモーター、選択用マーカー遺伝子、ターミネーターなどの因子を適宜有していても良い。
また、単離精製が容易になるように、チオレドキシン、Ｈｉｓタグ、あるいはＧＳＴ（グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ）等との融合タンパク質として発現する配列が付加されていても良い。この場合、宿主細胞内で機能する適切なプロモーター（ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ｔｒｐ、ＣＭＶ、ＳＶ４０初期プロモーターなど）を有するＧＳＴ融合タンパクベクター（ｐＧＥＸ４Ｔなど）や、Ｍｙｃ、Ｈｉｓなどのタグ配列を有するベクター（ｐｃＤＮＡ３．１／Ｍｙｃ−Ｈｉｓなど）、さらにはチオレドキシン及びＨｉｓタグとの融合タンパク質を発現するベクター（ｐＥＴ３２ａ）などを用いることができる。
次いで、前記で作製された発現ベクターで宿主を形質転換・形質導入する。ここで用いられる宿主としては、大腸菌、酵母、昆虫細胞、動物細胞などが挙げられる。大腸菌としては、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｋ−１２系統のＨＢ１０１株、Ｃ６００株、ＪＭ１０９株、ＤＨ５α株、ＡＤ４９４（ＤＥ３）株などが挙げられる。また酵母としては、サッカロミセス・セルビジエなどが挙げられる。動物細胞としては、Ｌ９２９細胞、ＢＡＬＢ／ｃ３Ｔ３細胞、Ｃ１２７細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞などが挙げられる。昆虫細胞としてはｓｆ９などが挙げられる。
宿主細胞への発現ベクターの導入方法としては、前記宿主細胞に適合した通常の導入方法を用いれば良い。具体的にはリン酸カルシウム法、ＤＥＡＥ−デキストラン法、エレクトロポレーション法、遺伝子導入用リピッド（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ；Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ社）を用いる方法などが挙げられる。導入後、選択マーカーを含む通常の培地にて培養することにより、前記発現ベクターが宿主細胞中に導入された形質転換細胞や形質導入細胞を選択することができる。
以上のようにして得られた形質転換細胞又は形質導入細胞を、例えば、ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養し続けることにより、本発明のポリペプチドを得ることができる。得られたポリペプチドは、一般的な生化学的精製手段により、さらに単離・精製することができる。ここで精製手段としては、塩析、イオン交換クロマトグラフィー、吸着クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー等が挙げられる。また本発明のポリペプチドを、前述のチオレドキシンやＨｉｓタグ、ＧＳＴ等との融合タンパク質として発現させた場合は、これら融合タンパク質やタグの性質を利用した精製法により単離・精製することができる。
このようにして調製された本発明のポリペプチドがＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有することは、例えば、慣用の免疫学的手法、例えば、ファーウエスタンブロッティングなどあるいは物理学的手法、例えば、表面プラズモン解析などにより解析することができる。
前記ファーウエスタンブロッティングについては実施例に詳細に記載されているが、原理を簡単に述べると以下のようになる。
すなわち、まず、本発明のポリペプチドをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、これをメンブレン（ＰＶＤＦ膜）に転写する。このメンブレンとＨＣＶのＥ２タンパク質［Ｖａｃｃｉｎｅ，１４（１７／１８），１５９０−１５９６（１９９６）］とを結合反応させ、その後、抗ＨＣＶＥ２（ＨＣＶのＥ２タンパク質）抗体を反応させる。ここで用いられる抗ＨＣＶＥ２抗体としては、例えばラット抗ＨＣＶＥ２モノクローナル抗体Ｍｏ−１２［Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２（１２），８７５−８７７（１９９８）］が挙げられる。その後、標識二次抗体をさらに反応させる。ここで用いられる標識二次抗体としては、例えば、ラット抗ＨＣＶＥ２モノクローナル抗体を用いた場合、ＨＲＰ標識抗ラットＩｇＧ二次抗体〔例えば、アマシャム・ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）社製、カタログ番号：ＮＡ９３５など〕が挙げられる。反応後、化学発光などの手法で標識を検出し、これをＸ線フィルムに感光させることなどにより、本発明のポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を測定することができる。
表面プラズモン解析により、本発明のポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を測定する場合、例えば、
ＨＣＶのＥ２タンパク質を固定化したセンサーチップに、本発明のポリペプチドを含有した溶液を接触又は一定の流速で送液するステップ、
ここで、本ステップにおいて、センサーチップにおけるＨＣＶのＥ２タンパク質のかわりに、本発明のポリペプチドを用い、ＨＣＶのＥ２タンパク質を含有した溶液を用いることもできる、
及び
適切な検出手段により、光学的変動又は質量の変動として相互作用を検出するステップ；
を含む方法を行なえばよい。ここで、検出手段としては、例えば、蛍光度、蛍光偏向度等の光学的検出手段；マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型質量分析計（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳ）、エレクトロスプレー・イオン化質量分析計（ＥＳＩ−ＭＳ）等の質量分析計との組み合わせによる検出手段；水晶などの物質の固有振動数の変化による検出手段などが挙げられる。また、結合は、本発明のポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との複合体の形成を示すセンサーグラムの提示、例えば、送液によるタンパク質の導入により変動した光学的センサーグラム又は質量センサーグラムを指標として測定できる。また、結合速度により、ＨＣＶのＥ２タンパク質に対する本発明のポリペプチドの親和性等を推測することもできる。
また、本発明のポリペプチドが、肝細胞由来細胞へのＨＣＶの感染を防御することを調べる手法としては、例えばＢｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｒｅｓ Ｃｏｍｍｕｎ．，２４５（２），５４９−５５３（１９９８）やＶｉｒｕｓ Ｒｅｓ．，６６（１）：５１−６３（２０００）などを参考にして行うことができる。以下に一例を示す。
まず、ヒト肝細胞株ＰＨ５ＣＨ８を、肝細胞培養用培地〔組成：Ｆ１２培地５００ｍｌ，Ｄ−ＭＥＭ ５００ｍｌ，１％ウシ胎仔血清，１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ，２００μｇ／ｍｌ カナマイシン，１０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン〕の入った２４穴プレートにまき、３７℃で２日程度培養する。他方、ＨＣＶウイルス（例えば、Ｓｅｒｕｍ １Ｂ−２ Ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｂ）と本発明のポリペプチドとを混合し、４℃で６０分程度反応させる。この反応物を先のＰＨ５ＣＨ８細胞に添加し、３７℃で９０分間インキュベートする。その後ＰＢＳで細胞を洗浄し、３２℃で８日間程度培養する。得られた細胞から常法によりＲＮＡを回収する。このＲＮＡに対し、例えば、ＲＴ−ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲを行うことによりＨＣＶゲノムの一部を増輻し、得られた産物を電気泳動に供することにより増幅断片を検出する。増幅断片が検出されないか、又は検出されたとしても極めて弱いことにより、本発明のポリペプチドがＨＣＶの感染防御効果を有することが確認される。増幅断片の量は、電気泳動後のゲル上の核酸を慣用の手段により染色し、バンドの強度をデンシトメーターなどにより測定することにより評価されうる。
さらに、本発明のポリペプチドの別の態様として、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列のラクトフェリンの配列に対して類似の構造（配列）を有し、かつＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドが提供される。
本発明者らは、ＨＣＶが、ヒト及びチンパンジーにしか感染しないことが知られているにもかかわらず、前記配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなるポリペプチドが該ＨＣＶに結合すること及び配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６に示されたアミノ酸配列間の配列同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）は、それぞれ、ヒト−ウシ間で７４．２％、またヒト−ウマ間で７１％であることを見い出した。すなわち、本発明者らは、このように、ヒトラクトフェリン、さらには、該ヒトラクトフェリン由来のポリペプチドのみならず、ヒトラクトフェリンに対して前記の同一性を保つ程度のアミノ酸残基が置換されたポリペプチドであっても、ＨＣＶのＥ２タンパク質への結合活性を保持することを明らかとした。
従って、かかる知見に基づき、本発明のポリペプチドの別の態様として、本発明は、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列（以下、「相同的アミノ酸配列」と称する）の全長又はその一部からなり、かつ、
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有する、
という特性を有する、相同的ポリペプチドを提供するものである。
ここで、「相同的アミノ酸配列の一部からなるポリペプチド」とは、
▲１▼相同的アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、又は、
▲２▼当該部分を含み、かつ相同的アミノ酸配列上の該当位置よりＮ末端方向及び／又はＣ末端方向に伸長したポリペプチド、
であって、かつ、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドを意味する。
より具体的には、前記相同的アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第３８位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第４３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第４８位に該当する部分からなるポリペプチド、第１１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１１位〜第９３位に該当する部分からなるポリペプチド、又は第１位〜第９３位に該当する部分からなるポリペプチドであって、かつ前記活性を有するものが例示される。
ここで、相同的アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の特定の部分に「該当する部分」とは、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と比較すべき配列とを、以下に述べるような手法を用いてアライメントした際に、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上の該当部分に一致する配列部分を指す。
本発明においてアミノ酸配列の「配列同一性」とは、２つのポリペプチド間の残基の同一性および相同性をいう。すなわち、比較する２つの配列間でアミノ酸残基が完全に一致する場合（同一性）のみならず、アミノ酸残基の性質の類似性（相同性）も考慮に入れて、前記配列同一性が決定される場合もある。このような「配列同一性」は、比較対象の配列の領域にわたって、最適な状態にアライメントされた２つの配列を比較することにより決定される。ここで、比較対象のポリペプチドは、２つの配列の最適なアライメントにおいて、付加又は欠失（例えばギャップ等）を有していても良い。
このようなアミノ酸配列の同一性に関しては、例えば、ソフトウェアＶｅｃｔｏｒ ＮＴＩ〔インフォマックス，インコーポレティッド（ＩｎｆｏＭａｘ，Ｉｎｃ）社製〕を用いて、ＣｌｕｓｔａｌＷアルゴリズム（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．，２２（２２）：４６７３−４６８０（１９９４））を利用してアライメントを作成することにより、算出することができる。なお、ポリペプチド間の配列同一性は、配列解析ソフト、具体的には、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、ＧＥＮＥＴＹＸ−ＭＡＣ〔（株）ゼネティックス社製）や公共のデータベースで提供される解析ツールを用いて測定される。前記公共データベースは、例えばホームページアドレスｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｄｂｊ．ｎｉｇ．ａｃ．ｊｐにおいて、一般に利用可能である。
前記の配列同一性に関して、少なくとも７１％、好ましくは７５％以上、より好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列が挙げられる。
また、アミノ酸の置換される位置及びアミノ酸の種類に関しては、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第３６位のフェニルアラニンが置換されずに保持されていることが望ましく、それ以外の点については、後述する本発明の改変ポリペプチドの項を参照されたい。
以上のような本発明の相同的ポリペプチドの具体例として、ラクダラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ１３１６７４）、ブタラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ９２０８９）、ヤギラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ７８９０２）、あるいはマウスラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００８５２２）のＣ末端９３アミノ酸の全長又はその一部（第１位〜第３３位、若しくは第１１位〜第５３位の部分を含む）からなるポリペプチドが例示され得る。これら他種ラクトフェリンのＣ末端９３アミノ酸部分と、配列番号：２に示されたアミノ酸配列との配列同一性を、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩを用いて算出した結果を以下に示す。いずれもこの領域において、７１％以上の配列同一性を保持するものである。
さらに本発明のポリペプチドの別の態様として、本発明は、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列（以下、改変アミノ酸配列と称する）の全長又はその一部からなり、かつ、
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有する、
という特性を有する改変ポリペプチドを提供するものである。
ここで、「改変アミノ酸配列の一部からなるポリペプチド」とは、
▲１▼改変アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、又は、
▲２▼当該部分を含み、かつ改変アミノ酸配列上の該当位置よりＮ末端方向及び／又はＣ末端方向に伸長したポリペプチド、
であって、かつ、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドを意味する。
かかる改変ポリペプチドとしては、具体的には、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性を有する改変ポリペプチド；並びに、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の一部からなる配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｉ）又は（ｉ’）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉ’）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
の特性と、
下記（ｉｉ）：
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性とを有する改変ポリペプチドが挙げられる。
より具体的には、前記改変アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第３８位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第４３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第４８位に該当する部分からなるポリペプチド、第１１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１位〜第５３位に該当する部分からなるポリペプチド、第１１位〜第９３位に該当する部分からなるポリペプチド、又は第１位〜第９３位に該当する部分からなるポリペプチドであって、かつ前記活性を有するものが例示される。
ここで、改変アミノ酸配列において、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の特定の部分に「該当する部分」とは、前記相同的アミノ酸配列の場合と同様のアライメントを行った結果、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上の該当部分に一致する配列部分を指す。
前記においてアミノ酸配列の改変に係るポリペプチドは、当該ポリペプチドをコードするＤＮＡを用いて慣用の部位特異的変異導入を施し、その後このＤＮＡを常法により発現させることにより得ることができる。ここで、部位特異的変異導入法としては、例えば、アンバー変異を利用する方法〔ギャップド・デュプレックス法、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１２，９４４１−９４５６（１９８４）〕、変異導入用プライマーを用いたＰＣＲによる方法等が挙げられる。
前記で改変されるアミノ酸の数については、少なくとも１残基、具体的には１若しくは数個、又はそれ以上である。かかる改変の数は、例えば、前記ＨＣＶのＥ２との結合活性測定法に従って活性を測定することにより、当該活性を見出すことのできる範囲であれば良い。好ましくは、前記「相同的ポリペプチド」の項で述べたような範囲、すなわち、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と７１％以上の配列同一性を有する範囲内で改変の行われることが望ましい。
また、前記置換、欠失、付加又は挿入のうち、特にアミノ酸の置換に係る改変が好ましい。
アミノ酸の置換を有する改変ポリペプチドにおいて、かかる置換の局在位置は、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６相互においてアミノ酸残基の一致していない部位（第２図参照）が好ましい。すなわち、具体的には、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第４位、第５位、第７位、第８位、第９位、第１０位、第１１位、第１３位、第１６位、第１７位、第２０位、第２１位、第２４位、第２７位、第２８位、第３１位、第３７位、第５４位、第５６位、第５８位、第５９位、第６３位、第６７位、第６８位、第７１位、第７２位、第７４位、第７７位、第７８位、第８１位、第８９位、第９２位、第９３位が挙げられる。なお、第３６位のフェニルアラニンは置換しないことが望ましい。
また、前記置換位置において置換されるアミノ酸の種類は、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上の当該置換位置に存在するアミノ酸残基の中から選ばれることが好ましい。すなわち一例を示すと、配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第４位のアルギニンからグルタミン（ヒト→ウマ型）への置換や、第７位のリジンからアルギニン（ヒト→ウシおよびウマ型）への置換などが挙げられる。
さらに前記置換は、疎水性、電荷、ｐＫ、立体構造上における特徴等の類似した性質を有するアミノ酸との置換をも包含する。このような置換としては、例えば、▲１▼グリシン、アラニン；▲２▼バリン、イソロイシン、ロイシン；▲３▼アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、▲４▼セリン、スレオニン；▲５▼リジン、アルギニン；▲６▼フェニルアラニン、チロシンのグループ内での置換が挙げられる。
以上のような本発明の改変ポリペプチドの具体例としては、ラクダラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ１３１６７４）、ブタラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号；Ｍ９２０８９）、ヤギラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ７８９０２）、あるいはマウスラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＮＭ＿００８５２２）のＣ末端９３アミノ酸の全長又はその一部（第１位〜第３３位、若しくは第１１位〜第５３位の部分を含む）からなるポリペプチドが例示され得る。
以上のような改変ポリペプチドの作製法及び活性測定法は、前述の本発明のポリペプチドと同様である。
さらに、ラクトフェリンの特定のアミノ酸残基をアシル化又はアミノ化することにより、ラクトフェリンの抗ＨＩＶ及び抗ＨＣＶ活性が高まるという報告がなされており［Ｊ．ｐｅｐｔ．ｓｃｉ．，５（１２），５６３−５７６（１９９９）］、本発明のポリペプチドにおいても、同様のアシル化およびアミノ化により活性の上昇することが期待される。
本発明はまた、本発明のポリペプチド（前記相同的ポリペプチドや改変ポリペプチドを含む）を含有するポリペプチドをも提供するものである。すなわち、前述のポリペプチドは、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性がある以上、当該ポリペプチドを含むポリペプチドにも、同様の結合活性の存することは明らかである。
好ましくは、ヒトラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）、ウシラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）、及びウマラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）上の該当位置であるＣ末端９３アミノ酸部分より、Ｎ末端方向に伸長したポリペプチドが挙げられる。ただし、新規性の観点から、ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１、Ｍ６３５０２及びＡＪ０１０９３０のそれぞれに示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドは、本発明の範疇から除かれる。
前記したように、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分、及び第１１位〜第５３位の部分がＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を保持することが示された。従って、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１１位〜第３３位（ヒトラクトフェリンの第６１０番目〜第６３２番目）の間に結合に重要な領域があると考えられる。
したがって、本発明により、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の全長又はその一部からなるポリペプチドであって、かつ当該アミノ酸配列の第１１位〜第３３位の部分を少なくとも含有することを特徴とする、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチドも提供され得る。
以上述べた本発明の全てのポリペプチドは、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合活性を有するものであり、さらには、ＨＣＶ感染を阻害、抑制又は低減させる性質を有するため、ＨＣＶの感染防御剤として有効に使用することができる。すなわち本発明は、本発明のポリペプチドを有効成分とする、ＨＣＶの感染防御剤を提供するものである。
本発明のＨＣＶ感染防御剤のうち好ましいものは、ＨＣＶへの結合に重要な配列部分を有する、より短いポリペプチドを有効成分とするものである。すなわち、前記した本発明のポリペプチド、特に、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位からなるポリペプチドや、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位からなるポリペプチドが、本発明のＨＣＶ感染防御剤の好ましい有効成分として例示される。このようなポリペプチドは、ラクトフェリンそのものを投与する場合と比較して、より投与量が低減できるという効果や、経口投与時における吸収中のタンパク質の分解、及び静脈内注射時における副作用を低減させるといった効果を有し得る。
有効成分である本発明のポリペプチドは、そのまま投与することも出来るが、粒子状の剤形にして投与することもできる。剤形として、より具体的には、リポソーム製剤、直径数μｍのビーズに結合させた粒子状の製剤、リピッドを結合させた製剤等の剤形にすることができる。投与量は、症状の程度、患者の年齢、体重等により適宜調整することができるが、通常０．００１ｍｇ／ｋｇ／回〜１０００ｍｇ／ｋｇ／回であり、これを投与初期には連日投与し、その後、細胞内のウイルス量に応じて数日ないし数ヶ月に１回投与するのが好ましい。投与形態としては、剤形に応じて経口投与、動脈注射、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、皮内投与、肝臓に対する局所注射などが可能である。
また、有効成分である本発明のポリペプチドは血中で安定であることが好ましいが、その為に当該ポリペプチドを修飾しても良い。例えば、当該ポリペプチドとポリエチレングリコールとを結合させて血中半減期を長くすることが可能である。また、ポリペプチドのＮ末端への修飾やＤ−アミノ酸への置換によって、血中で安定なポリペプチドを作製することができる。
本発明のＨＣＶ感染防御剤は、具体的には、Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤として使用される。したがって、本発明により、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤が提供される。より具体的には、慢性Ｃ型肝炎や急性Ｃ型肝炎に使用される。特に、既存のインターフェロン療法に対して抵抗性を示すＣ型慢性肝炎の治療または予防において、有効に用いられる。
また、本発明のＨＣＶ感染防御剤は、インターフェロンと併用して使用することもできる。本発明のポリペプチドは、ＨＣＶと標的細胞との結合を直接阻害するものであるため、例えばインターフェロン投与終了時におけるインターフェロン抵抗性ウイルスの再燃を、より減少させることが可能となる。
さらに、本発明によれば、慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防方法が提供される。かかる治療又は予防方法は、本発明のポリペプチドを、細胞へのＨＣＶの結合を妨げるに十分な治療上有効量、投与対象物に投与することを１つの特徴とする。本発明の治療又は予防方法においては、本発明のＨＣＶ感染防御剤、本発明の慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤を治療上有効量投与してもよい。また、本発明の治療又は予防方法においては、インターフェロンをさらに併用投与してもよい。
前記投与対象物としては、慢性Ｃ型肝炎を罹患した個体、慢性Ｃ型肝炎を罹患する恐れのある個体などが挙げられる。
本発明はまた、前記本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも提供するものである。本発明のポリヌクレオチドは、ＤＮＡの形態であってもＲＮＡの形態であってもよい。これら本発明のポリヌクレオチドは、ヒトラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）、ウシラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）、あるいはウマラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）のｃＤＮＡ配列を基にして、当業者であれば容易に製造することできる。詳しくは、前記本発明のポリペプチドの項を参照されたい。
このような本発明のポリヌクレオチドの具体例としては、例えば、前述の本発明のポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド、配列番号：１、配列番号：３及び配列番号：５からなる群より選ばれた塩基配列からなるポリヌクレオチド、該塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドなどが挙げられる。また、本発明のポリヌクレオチドには、前記配列番号：１、配列番号：３及び配列番号：５からなる群より選ばれた塩基配列などと、縮重若しくは核酸多型を介して異なる配列からなるポリヌクレオチド、又は該塩基配列の一部からなるポリヌクレオチドも含まれる。
本発明のポリヌクレオチドの長さは、前記アミノ酸配列の全長を含有したポリペプチドの場合、少なくとも２７９ヌクレオチド、好ましくは、２７９〜１５００ヌクレオチド、より好ましくは、２７９〜９００ヌクレオチド、さらに好ましくは、２７９〜６００ヌクレオチド、さらに好ましくは、２７９〜３００ヌクレオチドが望ましい。かかるポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの製造、前記治療又は予防剤への応用などに用いられうる。
また、「塩基配列の一部」は、本発明のポリペプチドの製造、前記治療又は予防剤への応用などに用いる場合、前記アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分を含有するポリペプチドに対応して、少なくとも９９ヌクレオチド、好ましくは、９９〜２７６ヌクレオチド、より好ましくは、９９〜２４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、９９〜１８０ヌクレオチド、さらに好ましくは、９９〜１５０ヌクレオチドが望ましく、第１１位〜第５３位の部分を含有するポリペプチドに対応して、少なくとも１２９ヌクレオチド、好ましくは、１２９〜２７６ヌクレオチド、より好ましくは、１２９〜２４０ヌクレオチド、さらに好ましくは、１２９〜１８０ヌクレオチドが望ましい。
さらに、「塩基配列の一部」は、ポリヌクレオチドをプローブ又はプライマーとして用いて、本発明のポリペプチドを製造する場合、少なくとも１２ヌクレオチド、好ましくは、１５〜２００ヌクレオチド、より好ましくは、１５〜１００ヌクレオチド、さらに好ましくは、１５〜５０ヌクレオチドが望ましい。
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドを製造する際に有効に用いられ、該ポリペプチドを効率よく供給することを可能にしうる。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によりなんら限定されるものではない。
実施例１
発現ベクターの構築と組換えタンパク質の発現及び精製
１）ヒトラクトフェリンの部分ポリペプチドを発現する発現ベクターの構築
白人種正常ヒト乳腺組織よりＩＳＯＧＥＮ（日本ジーン社製）を用いてＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡと、オリゴｄＴプライマー［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社製］とを用いて逆転写酵素ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＴＭＩＩ（Ｇｉｂｃｏ社製）による逆転写反応を行ない、引き続き、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡社製）を用いて完全長のヒトラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１）ｃＤＮＡを増幅した。なお、塩基配列に関して、配列番号：１に記載の塩基配列の第２７０位が、ジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１ではｃであるが、実際に得られたｃＤＮＡではｔであった。これは遺伝子多型によるものと考えられる。
さらに、発現させたい領域（以下の▲１▼〜▲６▼）を、それぞれに増幅するためのプライマーセットと、ＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼとを用いたＰＣＲにより増幅した。増幅産物を、ＩＰＴＧ誘導により還元タンパク質のチオレドキシン及びＨｉｓ ｔａｇとの融合タンパク質として発現させることのできるｐＥＴ３２ａ［ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製］のＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅに組み込んだ。以上の操作により、ヒトラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸（以下の▲１▼）と、それをさらに小さくした５種類の領域（以下の▲２▼〜▲６▼）を大腸菌で発現させるための発現ベクターを作製した。
▲１▼ヒトラクトフェリン（６００−６９２）
（アミノ酸配列；配列番号：２、塩基配列；配列番号：１）
▲２▼ヒトラクトフェリン（６００−６５２）
（配列番号：２の第１位〜第５３位、配列番号：１の第１位〜第１５９位）
▲３▼ヒトラクトフェリン（６１０−６９２）
（配列番号：２の第１１位〜第９３位、配列番号：１の第３１位〜第２７９位）
▲４▼ヒトラクトフェリン（６２４−６９２）
（配列番号：２の第２５位〜第９３位、配列番号：１の第７３位〜第２７９位）
▲５▼ヒトラクトフェリン（６４０−６９２）
（配列番号：２の第４１位〜第９３位、配列番号：１の第１２１位〜第２７９位）
▲６▼ヒトラクトフェリン（６５３−６９２）
（配列番号：２の第５４位〜第９３位、配列番号：１の第１６０位〜第２７９位）
２）ウマ及びウシラクトフェリンの部分ポリペプチドを発現する発現ベクターの構築
前記１）と同様の方法で、ウマ末梢血リンパ球から抽出したＲＮＡを用いて逆転写反応を行い、ウマラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：ＡＪ０１０９３０）のｃＤＮＡをＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼにより増幅した。得られた増幅産物を鋳型としてカルボキシル末端９３アミノ酸をコードする領域（アミノ酸配列；配列番号：６、塩基配列；配列番号：５）をさらに増幅し、ｐＥＴ３２ａのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅへ組み込んだ。
また、ウシ乳腺組織より抽出したＲＮＡを用いて同じく逆転写反応を行い、ウシラクトフェリン（ジーンバンクアクセッション番号：Ｍ６３５０２）ｃＤＮＡを増幅した。得られた増幅産物を鋳型としてカルボキシル末端９３アミノ酸をコードする領域（アミノ酸配列；配列番号：４、塩基配列；配列番号：３）をさらに増幅し、ｐＥＴ３２ａのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅに組込み込んだ。
３）ヒトＣＤ８１のラージエクストラループを発現する発現ベクターの構築
ヒトＣＤ８１のラージエクストラループはＨＣＶのＥ２タンパク質と結合することが知られており、ＨＣＶ受容体の候補となっている［Ｐｉｌｅｒｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８２（５３９０），９３８−９４１（１９９８）］。
ラクトフェリンとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合の強さと比較するため、ＳＶ４０ラージＴ抗原で不死化したヒト肝細胞であるＰＨ５ＣＨ８細胞よりＲＮＡを抽出した。得られたＲＮＡを鋳型とし、オリゴｄＴプライマーとを用いて逆転写反応を行い、ヒトＣＤ８１（ジーンバンクアクセッション番号：ＸＭ＿００６４７５）を含むｃＤＮＡをＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅した。得られた増幅産物を鋳型としてさらに１１３番目から２０１番目のアミノ酸を含む領域をＫＯＤ ＤＮＡポリメラーゼを用いて増幅し、その増幅産物をｐＥＴ３２ａのＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ ｓｉｔｅに組込み、ヒトＣＤ８１ラージエクストラループの発現ベクターを構築した。
４）組換えタンパク質の発現及び精製
前記１）〜３）で得られた発現ベクターを宿主大腸菌ＡＤ４９４（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）に形質転換した。その後１０ｍｌのＬＢ培地で３７度で１６時間培養したものを、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンと１５μｇ／ｍｌのカナマイシンを添加した２００ｍｌのＬＢ培地に加え３７度で４時間培養した。その後、培養物に、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、さらに４〜５時間培養した。得られた培養物を、３０００×ｇで１０分遠心分離した。ついで、−８０度でペレットを一晩冷凍し、１０ｍｌのＢ−ＰＥＲ登録商標〔ピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）社製〕にてペレットを溶解し、室温で１５分攪拌した。その後、得られた混合物を、２００００×ｇで３０分遠心分離した。得られた上清を可溶性画分、ペレットを不溶性画分として取り扱った。
不溶性分画は、再度、２００μｇ／ｍｌのｌｙｓｏｚｙｍｅ（Ｓｉｇｍａ）を含むＢ−ＰＥＲ登録商標１０ｍｌでペレットを溶解し、室温で攪拌した。ついで、得られた混合物を、２００００×ｇで３０分遠心分離した。その後ペレットを、２０ｍｌの１０倍希釈Ｂ−ＰＥＲ登録商標で溶解し、２００００×ｇで３０分遠心分離する操作を３回繰り返し、最終的に得られたペレットを６Ｍの尿素を含んだＢｉｎｄｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒ〔ノバージェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）社製〕にて溶解して精製に用いた。
精製は、Ｈｉｓ−ｂｉｎｄ ｒｅｓｉｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）とＨｉｓ・Ｂｉｎｄ登録商標Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を用い、製造者のマニュアルに従って行った。不溶性分画ではすべてのステップを、６Ｍ尿素存在下で行い、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて確認を行った。
実施例２
ファーウェスタンブロッティング（１）
実施例１で得られた精製ヒトラクトフェリン断片タンパク質が、ＨＣＶのエンベロープタンパク質であるＥ２タンパク質と結合するかをファーウェスタンブロッティングにて検討した。プローブとして、ＣＨＯ細胞にて培養液中に分泌させたＥ２タンパク質［Ｉｎｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ，Ｖａｃｃｉｎｅ，１４（１７／１８），１５９０−１５９６（１９９６）］を用いた。
実施例１で得られた精製タンパク質をそれぞれ２μｇ用いて１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行いＰＶＤＦ膜に転写した。その後、２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ社製）を添加したＮ−ｂｕｆｆｅｒ［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ，０．２５％ｇｅｌａｔｉｎ］にて１時間ブロッキングした。
Ｅ２タンパク質を含むＣＨＯ細胞の培養上清（総タンパク質量２５０μｇ）を、同じくＢＳＡを添加したＮ−ｂｕｆｆｅｒ ５ｍｌで希釈した。得られた溶液と前記ＰＤＶＦ膜とを接触させて、室温で６０分結合反応させた。前記ＰＤＶＦ膜を、Ｎ−ｂｕｆｆｅｒで１０分ｘ３回洗浄後、再び２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）を添加したＮ−ｂｕｆｆｅｒで１時間ブロッキングした。
その後、ラット抗ＨＣＶＥ２モノクローナル抗体（Ｍｏ−１２）［Ｉｎｕｄｏｈ ｅｔ ａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，４２（１２），８７５−８７７（１９９８）］を５ｍｌのＮ−ｂｕｆｆｅｒで１０００倍希釈した溶液と前記ＰＶＤＦ膜とを接触させ、６０分反応を行った。前記ＰＶＤＦ膜を、０．１％Ｔｒｉｓ−ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．１％Ｔｗｅｅｎ２０］にて５分ｘ３回洗浄後、１０００倍希釈したＨＲＰ標識抗ラット二次抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ ｃａｔ．ＮＡ９３５）を加えた０．１％Ｔｒｉｓ−ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎと接触させて、３０分反応を行った。ついで、前記ＰＤＶＦ膜を、０．１％Ｔｒｉｓ−ｓａｌｉｎｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎにて２０分ｘ３回洗浄した。ルネッサンスＴＭルミノールウェスタンブロット化学発光検出試薬プラス（ＮＥＮ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にて化学発光させ、Ｘ線フィルム（ＫＯＤＡＫ ＢｉｏＭａｘ）で感光した。
ヒト、ウシ、ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸部分のファーウエスタンブロッティングの結果を第１図に示す。第１図のレーン１〜７は以下の結果を示す。
レーン１：空ベクターｐＥＴ３２ａを発現させ得られたチオレドキシンタグ（２２ｋＤａ）
レーン２：ヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｌ３７７０）
レーン３：ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｔ６５４９，８０ｋＤａ）
レーン４：ヒトラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸
レーン５：ウシラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸
レーン６：ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸
レーン７：ヒトＣＤ８１の１１３番目から２０１番目のアミノ酸
（このうちレーン４〜７はｐＥＴ３２ａで発現させ精製したタンパク質を使用）
その結果、ネガティブコントロールのチオレドキシンタグと全長のヒトトランスフェリンは、ＨＣＶのＥ２タンパク質との結合が認められなかったが、ヒト、ウシ、ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸は、ポジティブコントロールのヒトラクトフェリン同様にＨＣＶのＥ２タンパク質と結合し、その強度はヒトＣＤ８１に比べ二倍程度強いことが示された。
第２図は、ヒト、ウシ、ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸配列のアミノ酸の同一性を示したものである。図中、＊で表示されるアミノ酸はヒトラクトフェリンに対して同一のアミノ酸であることを示す。ヒトラクトフェリン（１００％）に対する配列同一性は、ウシラクトフェリンで７４．２％、ウマラクトフェリンで７１．０％であった。この値は、ヒトトランスフェリン（５９．１％）に対する配列同一性及びウシトランスフェリン（５１．６％）に対する配列同一性と比べて高いものであった。
実施例３
ファーウェスタンブロッティング（２）
ヒトラクトフェリンの種々の部分ポリペプチド（実施例１−１）の▲１▼〜▲６▼参照）につき、実施例２と同様のファーウエスタンブロッティングを行った結果を第３図に示す。第３図のレーン１〜８は以下の結果を示す。
レーン１：ヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｌ３７７０）
レーン２：ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｔ６５４９，８０ｋＤａ）
レーン３：ヒトラクトフェリン（６００−６９２）
レーン４：ヒトラクトフェリン（６００−６５２）
レーン５：ヒトラクトフェリン（６１０−６９２）
レーン６：ヒトラクトフェリン（６２４−６９２）
レーン７：ヒトラクトフェリン（６４０−６９２）
レーン８：ヒトラクトフェリン（６５３−６９２）
〔レーン３〜８のうちレーン４のみ部分精製、他はそれぞれをｐＥＴ３２ａで発現させ精製したタンパク質を使用。なお部分精製とは、実施例１−４）の第１段落までの工程を行ったものを指す〕
この結果をまとめたものを第４図に示す。ヒトラクトフェリンとＨＣＶのＥ２タンパク質の結合には、少なくともヒトラクトフェリンの６１０番目から６５２番目のアミノ酸（配列番号：２の第１１位〜第５３位）の間に結合に重要な領域があることが予想された。
実施例４
ファーウェスタンブロッティング（３）
ヒトラクトフェリンの６１０番目〜６５２番目のアミノ酸配列及びその前後の配列につき、実施例３と同様のファーウエスタンブロッティングを行った結果を第５図に示す。第５図のレーン１〜１０は以下の結果を示す。
レーン１：ヒトラクトフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｌ３７７０）
レーン２：ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇｍａ社製，Ｔ６５４９，８０ｋＤａ）
レーン３：ヒトラクトフェリン（６００−６９２）
レーン４：ヒトラクトフェリン（６００−６５２）
レーン５：ヒトラクトフェリン（６１０−６５２）
レーン６：ヒトラクトフェリン（６１０−６５２）
（６３５番目のフェニルアラニンをロイシンに置換したもの）
レーン７：ヒトラクトフェリン（６１０−６４２）
レーン８：ヒトラクトフェリン（６２０−６５２）
レーン９：ヒトラクトフェリン（６２０−６４２）
レーン１０：空ベクターを発現させ得られたチオレドキシンタグ（２２ｋＤａ）
（レーン３〜１０はそれぞれｐＥＴ３２ａで発現させ精製したタンパク質を使用）
この結果より、実施例３で予測したヒトラクトフェリン６１０番目から６５２番目（配列番号：２の第１１位〜第５３位）の領域がＨＣＶのＥ２タンパク質と結合することが明らかになった。
さらに、６３５番目（配列番号：２の第３６位）のフェニルアラニンをロイシンに置換することにより結合がほとんど認められなくなったことより、この結合にはヒトラクトフェリンの６３５番目のフェニルアラニンが重要であることが示された。
実施例５
ファーウェスタンブロッティング（４）
ヒトラクトフェリンの６００番目〜６５２番目のアミノ酸配列及びさらにそれを縮めた配列につき、実施例２〜４と同様のファーウエスタンブロッティングを行った結果を第６図に示す。第６図のレーン１〜７は以下の結果を示す。
レーン１：ヒトラクトフェリン（６００−６２２）
レーン２：ヒトラクトフェリン（６００−６２７）
レーン３：ヒトラクトフェリン（６００−６３２）
レーン４：ヒトラクトフェリン（６００−６３７）
レーン５：ヒトラクトフェリン（６００−６４２）
レーン６：ヒトラクトフェリン（６００−６４７）
レーン７：ヒトラクトフェリン（６００−６５２）
（レーン１〜７はそれぞれｐＥＴ３２ａで発現させ精製したタンパク質を使用）
この結果より、ヒトラクトフェリン６００番目から６３２番目のアミノ酸（配列番号：２の第１位〜第３３位）を有していればＨＣＶのＥ２タンパク質と結合することが明らかとなった。
実施例６
前記実施例５などにおいて、ＨＣＶのＥ２蛋白質との結合が認められたヒトラクトフェリン（６００−６３２）：
ＶＶＳＲＭＤＫＶＥＲ ＬＫＱＶＬＬＨＱＱＡ ＫＦＧＲＮＧＳＤＣＰ ＤＫＦ（配列番号：７）と、
該ポリペプチドに相当する配列部分であるウシラクトフェリン（５９９−６３１）：
ＶＶＳＲＳＤＲＡＡＨ ＶＫＱＶＬＬＨＱＱＡ ＬＦＧＫＮＧＫＮＣＰ ＤＫＦ（配列番号：８）
とを合成した。
前記ポリペプチドを用い、培養肝細胞へのＨＣＶの感染に対する防御活性を検討した。
ヒト肝細胞株ＰＨ５ＣＨ８を、肝細胞培養用培地〔組成：Ｆ１２培地５００ｍｌ，Ｄ−ＭＥＭ ５００ｍｌ，１％ウシ胎仔血清，１００ｎｇ／ｍｌ ＥＧＦ，２００μｇ／ｍｌ カナマイシン，１０μｇ／ｍｌ ゲンタマイシン〕１００μｌを含むコラーゲン処理９６穴プレートに、５ｘ１０４細胞／ウエルとなるように播種し、３７℃で２日間培養した。他方、ＨＣＶウイルス陽性ヒト血清（１Ｂ−２／ｇｅｎｏｔｙｐｅ １ｂ：２ｘ１０４コピーＨＣＶＲＮＡを含む）と、前記ヒトラクトフェリン由来ポリペプチド又はウシラクトフェリン由来ポリペプチドとを混合し、４℃で６０分間反応させた。
得られた混合物を、ＰＨ５ＣＨ８細胞に添加して３７℃で９０分間インキュベートした。ついで、ＰＨ５ＣＨ８細胞を、前記肝細胞培養用培地で３回洗浄し、さらに３２℃で２４時間培養した。
その後、細胞から常法によりＲＮＡを回収し、０．５μｇＲＮＡ中に含まれるＨＣＶ ＲＮＡをＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて以下の文献（Ｎｏｚａｋｉ Ａ．ａｎｄ Ｋａｔｏ Ｎ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ＲＮＡ ｕｓｉｎｇ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ＰＣＲ．Ａｃｔａ Ｍｅｄｉｃａ Ｏｋａｙａｍａ，５６（２），１０７−１１０（２００２））に従い定量した。
その結果、第７図のパネルＡに示すように、ヒトラクトフェリン（６００−６３２）は、濃度依存的にＨＣＶの培養肝細胞への吸着を防御し、実際に、感染をも防御することが明らかとなった。また、第７図のパネルＢに示すように、ウシラクトフェリン（５９９−６３１）も、濃度依存的にＨＣＶの培養肝細胞への吸着を防御し、感染を防御する活性があることがわかったが、その活性は、ヒト由来のものと比べて低かった。
産業上の利用可能性
本発明により、ＨＣＶのＥ２タンパク質に結合活性を有するＨＣＶ結合性ポリペプチドが提供される。本発明によれば、ＨＣＶのＥ２タンパク質に結合することにより、ＨＣＶの肝細胞への結合を防ぎ、さらには、感染を防御することができ、それにより慢性Ｃ型肝炎などを治療または予防することが可能になる。したがって、慢性Ｃ型肝炎の治療剤または予防剤、慢性Ｃ型肝炎の治療または予防方法が提供される。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は、ヒト、ウシ及びウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸部分とＨＣＶのＥ２タンパク質との結合を調べたファーウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中、レーン１は、空ベクターｐＥＴ３２ａを発現させて得られたチオレドキシンタグ（２２ｋＤａ）の結果を、レーン２は、ヒトラクトフェリンの結果を、レーン３は、ヒトトランスフェリンの結果を、レーン４は、ヒトラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸の結果を、レーン５は、ウシラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸の結果を、レーン６は、ウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸の結果を、レーン７は、ヒトＣＤ８１（ジーンバンクアクセッション番号：ＸＭ＿００６４７５）の１１３番目〜２０１番目のアミノ酸の結果を示す。
第２図は、ヒト、ウシ及びウマラクトフェリンのカルボキシル末端９３アミノ酸配列のアミノ酸の同一性を示したものである。図中、＊で表示されるアミノ酸はヒトラクトフェリンと同一のアミノ酸であることを示す。
第３図は、ヒトラクトフェリンの種々の部分ポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合を調べたファーウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中、レーン１は、全長のヒトラクトフェリンの結果を、レーン２は、全長のヒトトランスフェリンの結果を、レーン３は、ヒトラクトフェリン（６００−６９２）の結果を、レーン４は、ヒトラクトフェリン（６００−６５２）の結果を、レーン５は、ヒトラクトフェリン（６１０−６９２）の結果を、レーン６は、ヒトラクトフェリン（６２４−６９２）の結果を、レーン７は、ヒトラクトフェリン（６４０−６９２）の結果を、レーン８は、ヒトラクトフェリン（６５３−６９２）の結果を示す。
第４図は、第２図および第３図に示される結果をまとめた図である。図中の数値はヒトラクトフェリンおよびヒトＣＤ８１のアミノ酸番号を示す。
第５図は、ヒトラクトフェリンの種々の部分ポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合を調べたファーウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中、レーン１は、全長のヒトラクトフェリンの結果を、レーン２は、全長のヒトトランスフェリンの結果を、レーン３は、ヒトラクトフェリン（６００−６９２）の結果を、レーン４は、ヒトラクトフェリン（６００−６５２）の結果を、レーン５は、ヒトラクトフェリン（６１０−６５２）の結果を、レーン６は、ヒトラクトフェリン（６１０−６５２）（ただし６３５番目のフェニルアラニンをロイシンに置換）の結果を、レーン７は、ヒトラクトフェリン（６１０−６４２）の結果を、レーン８は、ヒトラクトフェリン（６２０−６５２）の結果を、レーン９は、ヒトラクトフェリン（６２０−６４２）の結果を、レーン１０は、空ベクターを発現させ得られたチオレドキシンタグ（２２ｋＤａ）の結果を示す。
第６図は、ヒトラクトフェリンの種々の部分ポリペプチドとＨＣＶのＥ２タンパク質との結合を調べたファーウエスタンブロッティングの結果を示す図である。図中、レーン１は、ヒトラクトフェリン（６００−６２２）の結果を、レーン２は、ヒトラクトフェリン（６００−６２７）の結果を、レーン３は、ヒトラクトフェリン（６００−６３２）の結果を、レーン４は、ヒトラクトフェリン（６００−６３７）の結果を、レーン５は、ヒトラクトフェリン（６００−６４２）の結果を、レーン６は、ヒトラクトフェリン（６００−６４７）の結果を、レーン７は、ヒトラクトフェリン（６００〜６５２）の結果を示す。
第７図は、培養肝細胞へのＨＣＶの感染に対するヒトラクトフェリン（６００−６３２）及びウシラクトフェリン（５９９−６３１）それぞれの影響を調べた結果を示す図である。図中、パネルＡは、ヒトラクトフェリン（６００−６３２）、パネルＢは、ウシラクトフェリン（５９９−６３１）の結果を示す。
Claims (17)
- 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分又は該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有してなる、ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチド。
- （Ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の全長、又は
（ＩＩ）前記（Ｉ）記載のアミノ酸配列の一部からなる配列であって、かつ該配列が、アミノ酸配列における第１位〜第３３位の部分若しくは該アミノ酸配列における第１１位〜第５３位の部分を含有するものである配列、
を少なくとも含有してなる、請求項１記載のＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有するポリペプチド。 - 配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位の部分を少なくとも含有してなる、請求項１又は２記載のポリペプチド。
- 配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位の部分を少なくとも含有してなる、請求項１又は２記載のポリペプチド。
- 下記（ａ）〜（ｘ）：
（ａ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位、
（ｂ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位、
（ｃ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位、
（ｄ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位、
（ｅ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位、
（ｆ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位、
（ｇ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位、
（ｈ）配列番号：２に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位、
（ｉ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位、
（ｊ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位、
（ｋ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位、
（ｌ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位、
（ｍ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位、
（ｎ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位、
（ｏ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位、
（ｐ）配列番号：４に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位、
（ｑ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第５３位、
（ｒ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第５３位、
（ｓ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１１位〜第９３位、
（ｔ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第９３位、
（ｕ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３３位、
（ｖ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第３８位、
（ｗ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４３位、及び
（ｘ）配列番号：６に示されたアミノ酸配列の第１位〜第４８位
からなる群より選ばれたアミノ酸配列からなる、請求項１又は２記載のポリペプチド。 - 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列と少なくとも７１％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつ下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性を有するポリペプチド。 - 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列の全長からなり、かつ下記（ｉ）及び（ｉｉ）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性を有するポリペプチド。 - 配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の一部からなる配列において第３６位のフェニルアラニン以外の少なくとも１残基に、置換、欠失、付加又は挿入を有するアミノ酸配列の全長からなり、かつ下記（ｉ）又は（ｉ’）：
（ｉ）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第３３位に該当する部分、若しくは第１１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
（ｉ’）配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第１位〜第５３位に該当する部分を少なくとも含有する、
の特性と、
下記（ｉｉ）：
（ｉｉ）ＨＣＶ Ｅ２タンパク質との結合活性を有する、
の特性とを有するポリペプチド。 - 置換位置が、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列の第４位、第５位、第７位、第８位、第９位、第１０位、第１１位、第１３位、第１６位、第１７位、第２０位、第２１位、第２４位、第２７位、第２８位、第３１位、第３７位、第５４位、第５６位、第５８位、第５９位、第６３位、第６７位、第６８位、第７１位、第７２位、第７４位、第７７位、第７８位、第８１位、第８９位、第９２位及び第９３位から選ばれるものである、請求項７又は８記載のポリペプチド。
- 前記置換位置において置換されるアミノ酸が、配列番号：２、配列番号：４及び配列番号：６からなる群より選ばれたアミノ酸配列上の当該置換位置に存在するアミノ酸の中から選ばれるものである、請求項９記載のポリペプチド。
- 細胞へのＨＣＶの感染に対する阻害能を有する、請求項１〜１０いずれか１項に記載のポリペプチド。
- 請求項１〜１１いずれか１項に記載のポリペプチドを含有してなるポリペプチド（ただしジーンバンクアクセッション番号：Ｘ５２９４１、Ｍ６３５０２及びＡＪ０１０９３０のそれぞれに示されたアミノ酸配列からなるポリペプチドを除く）。
- 請求項１〜１２いずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、ＨＣＶの感染防御剤。
- 請求項１〜１２いずれか１項に記載のポリペプチドを有効成分として含有してなる、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤。
- 請求項１〜１２いずれか１項に記載のポリペプチドをコードしてなるポリヌクレオチド。
- 請求項１〜１２いずれか１項に記載のポリペプチドを、細胞へのＨＣＶの結合を妨げるに十分な治療上有効量、投与対象物に投与することを特徴とする、慢性Ｃ型肝炎の治療又は予防方法。
- ＨＣＶの感染防御剤、慢性Ｃ型肝炎の治療剤又は予防剤を製造するための請求項１〜１２いずれか１項に記載のポリペプチドの使用。
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