ES2281179T3

ES2281179T3 - Nuevos peptidos del virus de la hepatitis c y usos de los mismos.

Info

Publication number: ES2281179T3
Application number: ES99928495T
Authority: ES
Inventors: Andrea D. Branch; Jose L. Walewski; Decherd D. Stump
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1998-06-09
Filing date: 1999-06-09
Publication date: 2007-09-16
Anticipated expiration: 2019-06-09
Also published as: DE69934810T2; EP1113777A4; EP1113777A2; DE69934810D1; WO1999063941A3; WO1999063941A2; EP1113777B1; AU4554899A

Abstract

Un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos, donde a) el polipéptido aislado, sintético o recombinante es inmunorreactivo con un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico obtenida a partir de HCV y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, b) la secuencia de aminoácidos está codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 y donde el polipéptido se traduce en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, y c) donde el polipéptido no procede de la fase de lectura abierta de HCV convencional.

Description

Nuevos péptidos del virus de la hepatitis C y usos de los mismos.

Financiación gubernamental

Este trabajo se financió, en parte, por subvenciones NIH DK 50795 y DK 52071. Por lo tanto, el gobierno puede tener ciertos derechos sobre esta invención.

Antecedentes de la invención

El virus de la Hepatitis C (HCV) está estrechamente relacionado con los géneros pestivirus y flavivirus de la familia Flaviviridae. El HCV es un virus de ARN de cadena sencilla. El genoma viral es de aproximadamente 9,5 kb. El ARN de HCV es de sentido positivo y tiene una única fase de lectura abierta que codifica una única poliproteína (Clarke. 1997. J. Gen. Virol. 78: 2397). La poliproteína se procesa de forma proteolítica para producir las proteínas virales maduras que incluyen: la proteína de la nucleocápsida, proteína 1 de la envuelta, proteína 2 de la envuelta, metaloproteasa, serina proteasa, helicasa de ARN, cofactor, y ARN polimerasa.

El HCV es un importante patógeno del ser humano. Se descubrió que el virus es la causa de la mayoría de los casos de hepatitis que no podían atribuirse al virus de la hepatitis A, de la hepatitis B, o al virus de la hepatitis delta (Clarke, supra). Más del cincuenta por ciento de los pacientes con el virus de la hepatitis C (HCV) se vuelven portadores crónicos del virus; puede haber hasta 500 millones de portadores crónicos por todo el mundo (Dhillon y Ducheiko. 1995. Histopathology 26: 297). La infección persistente con el virus causa hepatitis crónica y puede conducir finalmente a cirrosis y/o cáncer (Kuo. et al. 1989. Science 244: 362). Las terapias actuales para HCV son ineficaces, por consiguiente existe la necesidad de nuevos enfoques para tratar la infección por HCV.

El documento WO-A-96/05315 describe las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos deducidas de ADNc que codifican los genes de la envuelta (1) y los genes del núcleo de aislados de virus de la hepatitis C (HCV), y el uso de los oligonucleótidos, péptidos y proteínas recombinantes de la envuelta (1) y del núcleo en métodos de diagnóstico y vacunas.

El documento US-A-5443965 describe antígenos peptídicos que son inmunorreactivos con sueros de individuos infectados con el virus de la hepatitis C (HCV). Varios de los antígenos reaccionan inmunológicamente con anticuerpos presentes en individuos identificados como pacientes que tienen la infección por HCV crónica y aguda. Los antígenos son útiles en métodos de diagnóstico para detectar la infección por HCV en seres humanos. También se describen clones de fragmentos genómicos correspondientes que contienen polinucleótidos que codifican las secuencias de las fases de lectura abiertas para los péptidos antigénicos.

El documento J Mol Evol (1994) 38: 50-56 (Ina Y et al) describe la reducción de sustituciones sinónimas en el gen de la proteína del núcleo del virus de la hepatitis C.

Compendio

La invención se refiere a un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1, 2, 7, 8 ó 9, reivindicándose las características preferidas del polipéptido en las reivindicaciones 3, 4, 5, 6 ó 10.

En otro aspecto, la invención se refiere a una vacuna de acuerdo con la reivindicación 11, reivindicándose las características preferidas de la vacuna en las reivindicaciones 12, 13 ó 14.

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 15, reivindicándose las características preferidas del anticuerpo en las reivindicaciones 16-19.

En otro aspecto, la invención se refiere a un kit de acuerdo con la reivindicación 20 ó 21.

En otro aspecto, la invención se refiere al uso de acuerdo con la reivindicaciones 22, 23 ó 25, reivindicándose las características preferidas de uso en las reivindicaciones 24 ó 26-35.

En otro aspecto, la invención se refiere al método de acuerdo con la reivindicación 36, reivindicándose las características preferidas del método en las reivindicaciones 37 ó 38.

La presente invención es un avance importante en la batalla contra la hepatitis C. Se ha demostrado que los nuevos péptidos de la invención, que no se codifican por la fase de lectura de poliproteínas de HCV convencionales, inducen una respuesta inmune en pacientes infectados con HCV y, por lo tanto, se producen durante la infección por HCV. Por consiguiente, la invención proporciona nuevos polipéptidos de HCV que no proceden de la poliproteína de HCV y métodos para su uso.

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En un aspecto, la invención se refiere a un polipéptido aislado o recombinante o un fragmento del mismo codificado por una molécula de ácido nucleico obtenida a partir de un virus de la hepatitis C, teniendo dicho polipéptido al menos una de las siguientes características:

1) al menos una parte del polipéptido está codificada por una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura abierta del virus de la hepatitis C convencional;

2) al menos una parte del polipéptido está codificada por una fase de lectura que corresponde a la fase de lectura de la SEC ID Nº 1 en la que el primer nucleótido de la SEC ID Nº 1 es el primer nucleótido de un codón;

3) al menos una parte del polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2; y

4) al menos una parte del polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 1.

En ciertas realizaciones de la invención, los nuevos polipéptidos de HCV o partes de los mismos de la reivindicación 1 tienen una longitud de al menos aproximadamente 8 aminoácidos a al menos aproximadamente 100 aminoácidos. En otras realizaciones, los polipéptidos o partes de los mismos tienen una longitud de al menos aproximadamente 14 aminoácidos a al menos aproximadamente 30 aminoácidos.

En una realización, los nuevos polipéptidos de HCV o partes de los mismos están codificados por una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura del virus de la hepatitis C convencional. En realizaciones preferidas, los polipéptidos están codificados por una fase de lectura correspondiente a la fase de lectura de la SEC ID Nº 1 en la que el primer nucleótido de la SEC ID Nº 1 es el primer nucleótido de un codón. En otras realizaciones preferidas, los polipéptidos están codificados, en parte, por la molécula de ácido nucleico de la SEC ID Nº 1 y causan una respuesta inmune en un sujeto.

En otras realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 80% con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2 y causa una respuesta inmune en un sujeto. En realizaciones preferidas, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 90% con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2 y causan una respuesta inmune en un sujeto. En otras realizaciones preferidas, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2 y causan una respuesta inmune en un sujeto.

En otras realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones de alta rigurosidad con la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 1.

En otras realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden al menos una parte de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo constituido por SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7 y SEC ID Nº 8 y causan una respuesta inmune en un sujeto.

En otras realizaciones adicionales, la invención se refiere a polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) y AAHRT(X4)SSR(X5)(X6)VR, donde X1 es N o K, X2 es V o E, X3 es A o V, X4 es L o S, X5 es A o V y X6 es A o V. En otras realizaciones adicionales, los nuevos polipéptidos de HCV consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en LNLKEKPNVTPTAC y AAHRTSSSRAVVRC.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición de vacuna para prevenir la infección por hepatitis C en un sujeto. En una realización, dicha vacuna comprende un nuevo polipéptido de HCV. En otra realización, dicha vacuna comprende un ácido nucleico que codifica un nuevo polipéptido de HCV.

En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo que se une a un nuevo polipéptido de HCV.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un kit para detectar una infección por el virus de la hepatitis C. En una realización, dicho kit comprende un nuevo polipéptido de HCV. En otro aspecto, el kit comprende un anticuerpo que se une a un nuevo polipéptido de HCV.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un método para prevenir la infección por HCV administrando un nuevo polipéptido de HCV a un sujeto o haciendo que dicho polipéptido se sintetice en un sujeto antes de la infección por HCV, de modo que se prevenga la infección por HCV.

La invención también se refiere a métodos para diagnosticar una infección por HCV. En una realización, el método comprende detectar la presencia o ausencia de anticuerpos que reaccionan con un nuevo polipéptido de HCV en el fluido corporal de un sujeto, donde la presencia de anticuerpos que se unen al polipéptido es indicativa de una infección con HCV. En otra realización, el método comprende detectar la presencia o ausencia de un nuevo polipéptido de HCV en el fluido corporal o tejido de un sujeto, donde la presencia de un polipéptido de HCV es indicativa de una infección con HCV.

En otro aspecto más, la invención se refiere a un método para identificar un compuesto que interacciona con un nuevo polipéptido de HCV poniendo en contacto el polipéptido con un compuesto en un sistema sin células en condiciones que permitan la interacción del compuesto con el polipéptido de modo que se forme un complejo; separando los compuestos que no forman complejos con un polipéptido de HCV de los que forman complejos con un polipéptido de HCV; y aislando e identificando los compuestos que forman complejos con un polipéptido de HCV para identificar un compuesto que interacciona con un nuevo polipéptido de HCV.

Descripción detallada

La presente invención es un avance importante en la prevención de la infección de la hepatitis C (HCV), en el tratamiento de la infección en curso y en la mejora de las técnicas de diagnóstico existentes. La invención se basa, en parte, en la identificación de nuevos polipéptidos codificados por el genoma del virus de la hepatitis C. Estos nuevos polipéptidos no están codificados por la fase de lectura de la poliproteína de HCV convencional.

Antes de describir adicionalmente la invención, a continuación se recogen ciertos términos empleados en la memoria descriptiva, ejemplos y reivindicaciones adjuntas, por comodidad.

I. Definiciones

Como se usa en este documento, la expresión "polipéptido aislado o recombinante" incluye un polipéptido que está sustancialmente libre de material celular o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante, o de precursores químicos u otros productos químicos cuando se sintetiza químicamente.

Como se usa en este documento, la expresión "polipéptido o fragmento del mismo" incluye molécula polipeptídicas de longitud completa (desde el primer aminoácido de inicio de la traducción hasta el último aminoácido antes del fin de la traducción) y partes peptídicas de dichas moléculas. Preferiblemente, los nuevos polipéptidos de HCV o fragmentos de los mismos tienen una longitud de al menos aproximadamente 8 aminoácidos al menos aproximadamente 100 aminoácidos. Más preferiblemente, los polipéptidos o fragmentos de los mismos tienen una longitud de al menos aproximadamente 14 aminoácidos a al menos aproximadamente 30 aminoácidos. En realizaciones preferidas, los nuevos polipéptidos de HCV de la invención comprenden una secuencia de aminoácidos que está conservada entre diferentes aislados de HCV. Dicha secuencia conservada puede determinarse fácilmente usando una alineación tal como la que se proporciona en la Tabla 1. En otras realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una parte de una nueva secuencia de aminoácidos de HCV que es distal (carboxi terminal) con respecto a un codón de terminación en la fase de lectura +1 (con respecto a la ORF principal) que incluye el "UG" del "AUG" que es el codón de iniciación de la ORF principal. En una realización más preferida, los polipéptidos o fragmentos de los mismos producen una respuesta inmune en un sujeto.

Como se usa en este documento, la expresión "molécula de ácido nucleico" pretende incluir moléculas de ADN (por ejemplo, ADNc o ADN genómico) y moléculas de ARN (por ejemplo, ARN genómico o ARNm viral). La molécula de ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de cadena doble.

Como se usa en este documento, la expresión "la fase de lectura abierta del virus de la hepatitis C convencional" es la fase de lectura abierta (ORF) del ARN viral que codifica la poliproteína de HCV bien conocida. La ORF convencional representa la ORF más grande del genoma viral. En el clon infeccioso (GenBank, número de acceso AF011751), la ORF convencional usa el nucleótido 342 como el primer nucleótido de un codón y continúa hasta el nucleótido 9377. En diferentes aislados de HCV, el nucleótido que es el primer nucleótido de un codón de la ORF convencional puede estar en una posición ligeramente diferente. El nucleótido que es el primer nucleótido de un codón para cualquier aislado puede obtenerse fácilmente para producir la ORF de HCV convencional. Por ejemplo, en el caso de aislados conocidos, puede accederse al GenBank (o a otra base de datos que contenga la información de la secuencia de nucleótidos para el aislado) y puede obtenerse información de la secuencia codificante (CDS). Como alternativa, para determinar la ORF convencional de un aislado conocido o nuevo, la secuencia de ácido nucleico del aislado conocido o nuevo puede alinearse con una secuencia conocida para proporcionar la mayor homología (por ejemplo, usando un programa tal como BLAST). Puede realizarse una búsqueda BLAST ejemplar, por ejemplo, usando la secuencia encontrada en el GenBank con el número de acceso AF011751, como secuencia de consulta (query). En esta búsqueda, se usaron los nucleótidos 342-940 de AF011751 para buscar la base de datos de secuencias no redundantes. La ORF de otros aislados de HCV que corresponde a la ORF de HCV convencional de AF011751 (donde el codón de iniciación está en la posición 342, que se lee en la posición 1 de la secuencia de consulta) puede leerse a partir de la alineación de BLAST. Por ejemplo, el primer nucleótido correspondiente de un codón para el número de acceso del GenBank HPCCGAA es 342. Otra manera de encontrar la ORF convencional sería usar un programa, tal como Edit. Seq. (DNASTAR) que está diseñado para identificar ORF usando el AUG alineado con la posición 342 de AF011751 con codón de inicio.

La expresión "porcentaje (%) de identidad", como se usa en el contexto de secuencias de nucleótidos y de aminoácidos (por ejemplo, cuando se dice que una secuencia de aminoácidos tiene una identidad de X% con otra secuencia de aminoácidos), se refiere al porcentaje de restos idénticos compartidos entre las dos secuencias, cuando se alinean de forma óptima. Para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos, las secuencias se alinean para poder realizar una comparación óptima (por ejemplo, pueden introducirse huecos en una secuencia para conseguir una alineación óptima con la otra secuencia). Después se comparan los restos en las posiciones correspondientes y cuando una posición en una secuencia está ocupada por el mismo resto que la posición correspondiente en la otra secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esta posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias, por lo tanto, es una función de la cantidad de posiciones idénticas compartidas por dos secuencias (es decir, porcentaje de identidad = número de posiciones idénticas/número total de posiciones x 100).

Pueden usarse algoritmos informáticos conocidos en la técnica para alinear y comparar de forma óptima dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos para definir el porcentaje de identidad entre las dos secuencias. Un ejemplo preferido, no limitante, de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de dos secuencias es el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, modificado como se indica en Karlin y Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77. Dicho algoritmo se incorpora en los programas NBLAST y XBLAST de Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10. Para obtener alineaciones con huecos con fines comparativos, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Research 25(17):3389-3402. Cuando se utilizan los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden usarse los parámetros por defecto de los programas respectivos (por ejemplo, XBLAST y NBLAST). Véase http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Otro ejemplo preferido no limitante de un algoritmo matemático utilizado para la comparación de secuencias es el algoritmo de Myers y Miller, CABIOS (1989). Este algoritmo se incorpora en el programa ALIGN (versión 2.0), que es parte del paquete de software de alineación de secuencias GCG. Cuando se utiliza el programa ALIGN para comparar secuencias de aminoácidos, puede usarse una tabla de peso de restos PAM120, una penalización de la longitud de hueco de 12, y una penalización de hueco de 4. Si se usan múltiples programas para comparar secuencias, se usa el programa que proporciona la alineación óptima (es decir, el mayor porcentaje de identidad entre las dos secuencias) con fines comparativos.

Como se usa en este documento, la expresión "+1 con respecto a la fase de lectura abierta del virus de la hepatitis C convencional" incluye fases de lectura en las cuales el primer nucleótido de un codón está desplazado +1 nucleótido con respecto a la ORF convencional. Las fases de lectura que codifican los nuevos polipéptidos no contienen necesariamente un codón de iniciación en fase.

Como se usa en este documento, la expresión "la fase de lectura de la SEC ID Nº 1" significa que los 3 primeros nucleótidos de la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº 1 son el primer, segundo y tercer nucleótidos de un codón para la traducción en un aminoácido de un polipéptido. La fase de lectura de la SEC ID Nº 1 es +1 con respecto a la ORF de HCV convencional. La expresión "una fase de lectura correspondiente a la fase de lectura de la SEC ID Nº 1" significa que cuando una secuencia de un aislado de HCV diferente del aislado AF011751 que se muestra en la SEC ID Nº 1 se alinea con la secuencia de la SEC ID Nº 1 para dar la mayor homología, por ejemplo usando el programa BLAST, ésta se lee después en la misma fase de lectura que la SEC ID Nº 1 para dar la fase de lectura correspondiente a la fase de lectura de la SEC ID Nº 1. La posición de nucleótidos de un primer nucleótido de un codón de un aislado de HCV que corresponde al de la SEC ID Nº 1 puede variar de un aislado a otro. Una búsqueda en BLAST ejemplar que ilustra este principio se proporciona como Apéndice B. Por ejemplo, para el número de acceso del GenBank AF009606, un primer nucleótido de un codón en una fase de lectura que corresponde a la fase de lectura de la SEC ID Nº 1 es el nucleótido 346.

Como se usa en este documento, la expresión "hibrida en condiciones de alta rigurosidad" pretende describir condiciones de hibridación y lavado en las que las secuencias de nucleótidos con una homología de al menos 70% entre sí típicamente permanecen hibridadas. Preferiblemente, las condiciones son tales que secuencias con una identidad de al menos 75% 85% o 95% entre sí típicamente permanecen hibridadas. Estas condiciones rigurosas son conocidas por los especialistas en la técnica y puede encontrarse en el documento Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6. Un ejemplo preferido no limitante de condiciones de hibridación rigurosas son la hibridación en 6X cloruro sódico/citrato sódico (SSC) a aproximadamente 45ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2 X SSC, SDS al 0,1% a 50-65ºC.

Como se usa en este documento, el término "anticuerpo" pretende incluir moléculas de inmunoglobulina y partes inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulina, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente a (reacciona inmunológicamente con) un antígeno, tal como fragmentos Fab y F(ab')2. Las expresiones "anticuerpos monoclonales" y "composición de anticuerpo monoclonal", como se usan en este documento, se refieren a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de un sitio de unión a antígeno capaz de reaccionar inmunológicamente con un epítopo particular de un antígeno, mientras que las expresiones "anticuerpos policlonales" y "composición de anticuerpo policlonal" se refieren a una población de moléculas de anticuerpo que contienen múltiples especies de sitios de unión a antígenos capaces de interaccionar con un antígeno particular. De esta manera, una composición de anticuerpo monoclonal muestra típicamente una única afinidad de unión para un antígeno particular con el que reacciona inmunológicamente.

Como se usa en este documento, el término "adyuvante" incluye agentes que potencian la respuesta inmune a un antígeno. Pueden administrarse adyuvantes junto con los polipéptidos objeto de la presente invención para aumentar adicionalmente la respuesta inmune.

Como se usa en este documento, la expresión "potenciar una respuesta inmune" incluye aumentar las respuestas de células T y/o B, es decir, las respuestas inmunes celular y/o humoral, mediante el tratamiento de un sujeto usando los métodos reivindicados. En una realización, pueden usarse los métodos reivindicados para potenciar las respuestas de células T auxiliares. En otra realización, pueden usarse los métodos reivindicados para potenciar la respuesta de células T citotóxicas. Los métodos reivindicados pueden usarse para potenciar respuestas inmunes tanto primarias como secundarias. Preferiblemente, la respuesta inmune aumenta en comparación con la respuesta de células inmunes al antígeno en ausencia de tratamiento con los métodos reivindicados. La respuesta inmune de un sujeto puede determinarse, por ejemplo, ensayando la producción de anticuerpos, la proliferación de células inmunes, la liberación de citoquinas, la expresión de marcadores de la superficie celular, citotoxicidad, aumento de la capacidad para eliminar la infección por HCV, etc.

II. Nuevos Polipéptidos de HCV

Los nuevos polipéptidos de HCV de la invención no se obtienen a partir de una poliproteína de HCV, es decir, los polipéptidos de la presente invención no están codificados por la ORF de HCV convencional. Estos polipéptidos de fase de lectura alternativa se traducen a partir de (o se sintetizan basándose en) una fase de lectura que es +1 con respecto a la ORF de HCV convencional. La posición del primer nucleótido de una ORF en la que se traducen estos polipéptidos variará ligeramente dependiendo del aislado estudiado. Por ejemplo, para el clon infeccioso (número de acceso del GenBank AF011751), el primer nucleótido de la ORF en la que se traducen los nuevos polipéptidos de HCV es el nucleótido 346, que es +5 con respecto a la ORF de HCV convencional. El primer nucleótido de un codón o de otros aislados conocidos o nuevos que da como resultado una fase de lectura que corresponde a la fase de lectura de la SEC ID Nº 1 puede determinarse, por ejemplo, realizando una búsqueda en BLAST usando la secuencia de ácidos nucleicos de la SEC ID Nº 1 como la secuencia de consulta según se ha descrito anteriormente.

La traducción de los nuevos polipéptidos de HCV de la invención no tiene que comenzar necesariamente en un codón de inicio AUG. Por ejemplo, ciertos trabajos anteriores han demostrado que el inicio AUG de HCV podría mutarse a AUU o CUG con poco efecto sobre la eficacia de traducción (Clarke, supra). Como alternativa, la edición de ARN puede estar implicada en la generación de un codón iniciador. La traducción de los nuevos polipéptidos de HCV también puede comenzar en el sitio de iniciación de la ORF de HCV convencional con un desplazamiento de fase a una fase de lectura diferente. Finalmente, la traducción puede iniciarse en posición 5' con respecto al codón de inicio AUG de la ORF convencional en cualquiera de las tres fases de lectura, pero desplazada a la fase de lectura +1 (con respecto a la ORF convencional) para dar la producción de péptidos que tienen, en parte, una identidad de al menos 80% con una parte de la SEC ID Nº 2. El sitio interno de entrada de ribosomas (IRES) es un elemento estructural de ARN complejo que incluye parte de la región no traducida 5' de ARN de HCV y parte de la región codificante adyacente. Puede inducir desplazamiento de fase o desviación de la traducción.

En realizaciones preferidas, los polipéptidos están codificados por una fase de lectura correspondiente a la fase de lectura de la SEC ID Nº 1, en la que el primer nucleótido de la SEC ID Nº 1 es el primer nucleótido de un codón. Este fase de lectura puede codificar un polipéptido de al menos aproximadamente 126 aminoácidos de longitud antes de que se alcance un codón de terminación. La Tabla 1 presenta una alineación de nuevos polipéptidos de HCV que están codificados en este fase de lectura a partir de diversos aislados de HCV, junto con una secuencia mayoritaria obtenida usando el método Clustal de alineación de secuencia. Los codones de terminación aparecen en ciertos aislados después del aminoácido 126. Sin embargo, la traducción puede continuar más allá de estos codones de terminación. Por ejemplo, en ciertos casos, estos codones de terminación pueden ser errores de secuenciación. Como alternativa, puede producirse una traducción ininterrumpida por mutación, transcripción alterada, edición del ARN, desplazamiento de fase o deslizamiento ribosómico. Por lo tanto, incluso en los polipéptidos en los que aparece un codón de terminación, en ciertas realizaciones de la invención, el nuevo polipéptido de HCV puede ser más largo, es decir, la traducción puede continuar pasado un codón de terminación. Por lo tanto, en el caso de, por ejemplo, el clon infeccioso AF011751, la traducción del polipéptido podría terminar, por ejemplo, en la posición 163 ó 186 de la SEC ID Nº 2. Cuando se sintetizan los nuevos polipéptidos de HCV de la invención, estos codones de terminación pueden ignorarse.

En otras realizaciones, los polipéptidos de la invención tienen algún porcentaje de identidad con la secuencia que se muestra en la SEC ID Nº 2. El porcentaje de identidad entre dos secuencias de ácido nucleico o de aminoácidos puede calcularse fácilmente dividiendo la cantidad de bases o aminoácidos idénticos por la cantidad total de bases o aminoácidos. Las secuencias se alinean para dar el porcentaje de identidad más alto proporcionando al mismo tiempo una alineación que tenga un significado biológico. Las secuencias pueden alinearse de forma manual o, preferiblemente, usando un algoritmo. Por ejemplo, en el caso de secuencias de aminoácidos, puede realizarse una búsqueda con FASTA en la base de datos Swiss Protein usando Biosum50.Cmp (matriz de puntuación). La penalización de creación de huecos puede establecerse, por ejemplo, a 12 y la penalización de la extensión puede establecerse, por ejemplo, a 2. El umbral de unión puede establecerse, por ejemplo, a 36; el umbral de optimización puede establecerse, por ejemplo, a 24; y la amplitud de optimización puede establecerse, por ejemplo, a 16.

En ciertas realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos aproximadamente 80-90% con la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2. En otra realización preferida, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2.

En realizaciones preferidas, los polipéptidos de la invención tienen el porcentaje de identidad descrito en una longitud de al menos aproximadamente 10 aminoácidos. En realizaciones más preferidas, el porcentaje de identidad de los polipéptidos se extiende en una longitud de al menos aproximadamente 20-30 aminoácidos. En una realización más preferida, el porcentaje de identidad de los polipéptidos se extiende en una longitud de al menos aproximadamente 30-40 aminoácidos. En una realización más preferida, el porcentaje de identidad de los polipéptidos se extiende en una longitud de al menos aproximadamente 40-50 aminoácidos. En otra realización más preferida, el porcentaje de identidad de los polipéptidos se extiende en una longitud de más de 50 aminoácidos. En otras realizaciones preferidas, el porcentaje de identidad de los polipéptidos se extiende en una longitud de más de 100 aminoácidos.

En otras realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que tiene algún porcentaje de identidad con la molécula de ácido nucleico que se muestra en la SEC ID Nº 1. En realizaciones preferidas, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico con una identidad de al menos 80% con la que se muestra en la SEC ID Nº 1, donde el polipéptido está codificado por la fase de lectura que se muestra en la SEC ID Nº 1. En realizaciones más preferidas, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico con una identidad de al menos 90% con la que se muestra en la SEC ID Nº 1, donde el polipéptido está codificado por la fase de lectura que se muestra en la SEC ID Nº 1. En otras realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico que se muestra en la SEC ID Nº 1, donde el polipéptido está codificado por la fase de lectura que se muestra en la SEC ID Nº 1.

En ciertas realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV de la invención están codificados por una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de ácido nucleico que se muestra en la SEC ID Nº 1. Las condiciones de hibridación rigurosas se conocen en la técnica. En realizaciones preferidas, dichos polipéptidos están codificados por una molécula de ácido nucleico que hibrida en condiciones rigurosas con una molécula de ácido nucleico de cualquier aislado de HCV, pero que se lee o se sintetiza como si se leyera en la fase de lectura de la SEC ID Nº 1.

En otras realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV comprenden al menos una parte de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en las SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5, SEC ID Nº 6, SEC ID Nº 7 y SEC ID Nº 8 y causan una respuesta inmune en un sujeto. Otros nuevos polipéptidos de HCV pueden identificarse usando una secuencia de ácido nucleico de HCV y determinando los aminoácidos que están codificados en la fase de lectura +1. Pueden prepararse polipéptidos que comprenden estas secuencias y puede ensayarse su reactividad con anticuerpos de sujetos infectados. Los polipéptidos que se unen a anticuerpos, es decir, que han provocado una respuesta inmune en sujetos infectados se producen por el virus durante el transcurso de la infección y representan nuevos polipéptidos de HCV preferidos.

En otras realizaciones adicionales, la invención se refiere a polipéptidos aislados o recombinantes que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en: LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) y AAHRT(X4)SSR(X5)(X6)VR, donde X1 es N o K, X2 es V o E, X3 es A o V, X4 es L o S, X5 es A o V, y X6 es A o V. En otras realizaciones más, los nuevos polipéptidos de HCV consisten en una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo que consiste en LNLKEKPNVTPTAC y AAHRTSSSRAVVRC.

En ciertas realizaciones de la invención, los nuevos polipéptidos de HCV de la invención tienen una longitud de al menos aproximadamente 8 aminoácidos a al menos aproximadamente 100 aminoácidos. En otras realizaciones, los polipéptidos de la invención son tienen una longitud de al menos aproximadamente 10 aminoácidos a al menos aproximadamente 50 aminoácidos. En otras realizaciones, los polipéptidos de la invención tienen una longitud de al menos 14 a al menos 25 aminoácidos.

En realizaciones preferidas, los nuevos polipéptidos de HCV tienen una longitud suficiente para causar una respuesta inmune en un sujeto. Dicha respuesta inmune puede medirse usando técnicas que se conocen en la técnica. Por ejemplo, la respuesta inmune inducida por los polipéptidos de HCV de la invención puede ser una respuesta mediada por células T que puede medirse, por ejemplo, por la producción de citoquinas y/o la proliferación celular o citotoxicidad celular y/o una respuesta mediada por células B que puede medirse, por ejemplo, por la producción de anticuerpos.

En ciertas realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV de la invención se preparan como proteínas de fusión. Además de utilizar proteínas de fusión para potenciar la inmunogenicidad, las proteínas de fusión también pueden facilitar la expresión de proteínas, incluyendo los nuevos polipéptidos de HCV de la presente invención. Por ejemplo, el nuevo polipéptido de HCV puede generarse como una proteína de fusión a glutatión-S-transferasa (proteína de fusión a GST). Dichas proteínas de fusión a GST pueden facilitar la purificación del nuevo polipéptido de HCV, por ejemplo, mediante el uso de matrices derivatizadas con glutatión (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. (N.Y.: John Wiley & Sons, 1991)). En otra realización, un gen de fusión que codifica una secuencia líder de purificación, tal como una secuencia del sitio de escisión poli-(His)/enteroquinasa puede fusionarse al nuevo polipéptido de HCV, para permitir la purificación del nuevo polipéptido de HCV-poli(His) mediante cromatografía de afinidad usando una resina con metal Ni^{2+}. La secuencia líder de purificación puede retirarse posteriormente mediante tratamiento con enteroquinasa (por ejemplo, véase Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411: 177; y Janknecht et al. PNAS 88: 8972).

Las técnicas para preparar genes de fusión son conocidas por los especialistas en la técnica. Esencialmente, la unión de diversos fragmentos de ADN que codifican diferentes secuencias polipeptídicas se realiza de acuerdo con técnicas convencionales, empleando extremos romos o escalonados para el ligamiento, digestión con enzimas de restricción para proporcionar extremos apropiados, rellenado de extremos cohesivos según sea apropiado, tratamiento con fosfatasa alcalina para evitar una unión no deseable, y ligamiento enzimático. En otra realización, el gen de fusión puede sintetizarse mediante técnicas convencionales que incluyen sintetizadores de ADN automáticos. Como alternativa, puede realizarse amplificación por PCR de fragmentos génicos usando cebadores de anclaje que dan lugar a salientes complementarios entre dos fragmentos génicos consecutivos que pueden hibridarse posteriormente para generar una secuencia génica quimérica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).

Se entenderá que las anteriores características de los polipéptidos de HCV no son excluyentes entre sí.

III. Producción de Nuevos Polipéptidos de HCV

Pueden producirse nuevos polipéptidos de HCV mediante técnicas de ADN recombinante. Por ejemplo, una molécula de ácido nucleico que codifica dicho polipéptido se clona en un vector de expresión, el vector de expresión se introduce en una célula hospedadora y el nuevo polipéptido de HCV se expresa en la célula hospedadora. Posteriormente, el nuevo polipéptido de HCV puede aislarse de las células mediante un esquema de purificación apropiado usando técnicas de purificación de proteínas convencionales. Como alternativa a la expresión recombinante, puede sintetizarse un nuevo polipéptido de HCV químicamente usando técnicas de síntesis peptídica convencionales o puede adquirirse en el mercado. Además, pueden aislarse nuevos polipéptidos de HCV nativos de células (por ejemplo, células humanas cultivadas infectadas con HCV), por ejemplo usando un anticuerpo.

A. Producción Recombinante de Nuevos Polipéptidos de HCV

En ciertas realizaciones, los nuevos polipéptidos de HCV están codificados por una molécula de ácido nucleico de HCV de origen natural. Como se usa en este documento, una molécula de ácido nucleico "de origen natural" se refiere a una molécula de ARN (o a una molécula de ADN obtenida a partir de la misma) que tiene una secuencia de nucleótidos que se origina en la naturaleza (por ejemplo, codifica una proteína producida por un aislado de HCV de origen natural).

Además de los aislados de origen natural de los nuevos polipéptidos de HCV, el especialista en la técnica debe entender que pueden introducirse cambios adicionales mediante mutación, por ejemplo, en una secuencia de nucleótidos de HCV, produciéndose de este modo cambios en la secuencia de aminoácidos de los polipéptidos de HCV codificados.

Por ejemplo, puede crearse una molécula de ácido nucleico aislada que codifica un nuevo polipéptido de HCV homólogo al polipéptido de la SEC ID Nº 2, es decir, que tiene un cierto porcentaje de identidad con respecto al polipéptido de la SEC ID Nº 2 introduciendo una o más sustituciones, adiciones o deleciones de nucleótidos en la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1, de modo que se introducen una o más sustituciones, adiciones o deleciones de aminoácidos en el polipéptido codificado. Pueden introducirse mutaciones en la SEC ID Nº 1 mediante técnicas convencionales, tales como mutagénesis de localización y mutagénesis mediada por PCR. Como alternativa, dicho polipéptido puede sintetizarse químicamente para producir un polipéptido con un cambio en la secuencia de aminoácidos con respecto a la del polipéptido de origen natural.

Preferiblemente, no se realizan sustituciones o se realizan sustituciones de aminoácidos conservativas donde existe una alta homología o identidad de restos aminoacídicos entre los diversos aislados. Una "sustitución de aminoácidos conservativa" es una en la que el resto aminoacídico se sustituye con un resto aminoacídico que tiene una cadena lateral similar. Las familias de restos aminoacídicos que tienen cadenas laterales similares se han identificado en la técnica, incluyendo cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales ramificadas beta (por ejemplo, treonina, valina e isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano e histidina).

Como alternativa, en otra realización, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente a lo largo de toda o parte de una secuencia codificante de un nuevo polipéptido de HCV, tal como mediante mutagénesis de saturación, y pueden seleccionarse los mutantes resultantes, por ejemplo, ensayando la reactividad con anticuerpos de un individuo con una infección por HCV pasada o presente.

B. Vectores de Expresión y Células Hospedadoras

Las moléculas de ácido nucleico descritas en este documento pueden expresarse en un vector de expresión para producir un nuevo polipéptido de HCV. Como se usa en este documento, el término "vector" se refiere a una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico al que se ha unido. Un tipo de vector es un "plásmido", que se refiere a un bucle de ADN de doble cadena circular al que pueden unirse segmentos adicionales de ADN. Otro tipo de vector es un vector viral, pudiendo unirse segmentos de ADN adicionales al genoma viral. Ciertos vectores son capaces de realizar replicación autónoma en una célula hospedadora en la que se introducen (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores de mamífero episomales). Otros vectores (por ejemplo, vectores de mamífero no episomales) se integran en el genoma de una célula hospedadora después de la introducción en la célula hospedadora y de este modo se replican junto con el genoma del hospedador. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes a los que se unen de forma operativa. Dichos vectores se denominan en este documento "vectores de expresión". En general, los vectores de expresión de utilidad en técnicas de ADN recombinante están a menudo en forma de plásmidos. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" pueden usarse indistintamente ya que el plásmido es la forma de vector usada más comúnmente. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores de expresión tales como vectores virales (por ejemplo, retrovirus de replicación defectuosa, adenovirus y virus adeno-asociados) que tienen funciones equivalentes.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención comprenden una molécula de ácido nucleico como se describe en este documento en una forma adecuada para la expresión del ácido nucleico en una célula hospedadora, lo que significa que los vectores de expresión recombinantes incluyen una o más secuencias reguladoras, seleccionadas basándose en las células hospedadoras a usar para la expresión, que está unida de forma operativa a la secuencia de ácido nucleico a expresar. Dentro de un vector de expresión recombinante, se entiende que "unido de forma operativa" significa que la secuencia de nucleótidos de interés está unida a la secuencia o secuencias reguladoras de manera que permite la expresión de la secuencia de nucleótidos (por ejemplo, en un sistema de transcripción/traducción in vitro o en una célula hospedadora cuando el vector se introduce en la célula hospedadora). La expresión "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, potenciadores y otros elementos de control de la expresión (por ejemplo, señales de poliadenilación). Dichas secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en el documento Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Las secuencias reguladoras incluyen las que dirigen la expresión constitutiva de una secuencia de nucleótidos en muchos tipos de células hospedadoras y las que dirigen la expresión de la secuencia de nucleótidos solamente en ciertas células hospedadoras (por ejemplo, secuencias reguladoras con especificidad de tejido). Los especialistas en la técnica entenderán que el diseño del vector de expresión puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedadora a transformar, el nivel de expresión de la proteína deseada, etc. Los vectores de expresión de la invención pueden introducirse en células hospedadoras para producir de este modo nuevos polipéptidos de HCV, incluyendo proteínas de fusión que comprenden dichos polipéptidos.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden diseñarse para la expresión de nuevos polipéptidos de HCV en células procariotas o eucariotas. Por ejemplo, pueden expresarse nuevos polipéptidos de HCV en células bacterianas tales como E. coli, células de insectos (usando vectores de expresión de baculovirus), células de levadura o células de mamífero. Las células hospedadoras adecuadas se describen adicionalmente en Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990). Como alternativa, el vector de expresión recombinante puede transcribirse y traducirse in vitro, por ejemplo usando secuencias reguladoras del promotor de T7 y polimerasa de T7.

La expresión de proteínas en procariotas la mayoría de las veces se realiza en E. coli con vectores que contiene promotores constitutivos o inducibles que dirigen la expresión de proteínas de fusión o proteínas que no son de fusión. Los vectores de fusión añaden varios aminoácidos a una proteína codificada en su interior, normalmente al extremo amino de la proteína recombinante. Dichos vectores de fusión sirven típicamente para tres fines: 1) para aumentar la expresión de la proteína recombinante; 2) para aumentar la solubilidad de la proteína recombinante; y 3) para ayudar a la purificación de la proteína recombinante actuando como un ligando en la purificación por afinidad. A menudo, en los vectores de expresión de fusión se introduce un sitio de escisión proteolítica en la unión del resto de fusión y la proteína recombinante para permitir la separación de la proteína recombinante del resto de fusión después de la purificación de la proteína de fusión. Dichas enzimas, y sus secuencias de reconocimiento afines, incluyen el factor Xa, trombina y enteroquinasa. Los vectores de expresión de fusión típicos incluyen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. y Johnson, K.S. (1988) Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) y pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) que se unen a glutatión S-transferasa (GST), proteína de unión a maltosa E o proteína A, respectivamente, con la proteína recombinante diana.

Los ejemplos de vectores de expresión de E. coli inducibles que no son de fusión adecuados incluyen pTrc (Amann et al, (1988) Gene 69:301-315) y pET 11d (Studier et al, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60-89). La expresión de los genes diana a partir del vector pTrc se basa en la transcripción de la ARN polimerasa del hospedador a partir de un promotor de fusión híbrido trp-lac. La expresión del gen diana a partir del vector pET 11d se basa en la transcripción a partir de un promotor de fusión T7 gn10-lac mediada por una ARN polimerasa viral coexpresada (T7 gn1). Esta polimerasa viral se suministra por cepas hospedadoras BL21 (DE3) o HMS174(DE3) de un profago \lambda residente que tiene un gen T7 gn1 bajo el control transcripcional del promotor de lacUV 5.

Una estrategia para maximizar la expresión de proteínas recombinantes en E. coli es expresar la proteína en una bacteria hospedadora con una capacidad disminuida para escindir proteolíticamente la proteína recombinante (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119-128). Otra estrategia es alterar la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico a insertar en un vector de expresión de modo que los codones individuales para cada aminoácido sean los que se utilizan preferentemente en E. coli (Wada et al, (1992) Nuc. Acids Res. 20:2111-2118). Dicha alteración de secuencias de ácido nucleico de la invención puede realizarse mediante técnicas de síntesis de ADN convencionales.

En otra realización, el vector de expresión de los nuevos polipéptidos de HCV es un vector de expresión de levadura. Los ejemplos de vectores para la expresión en levadura S. cerevisiae incluyen pYepSec1 (Baldari. et al., (1987) Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan y Herskowitz, (1982) Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., (1987) Gene 54:113-123) y pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA).

Como alternativa, los nuevos polipéptidos de HCV pueden expresarse en células de insecto usando vectores de expresión de baculovirus. Los vectores de baculovirus disponibles para la expresión de proteínas en células de insecto cultivadas (por ejemplo, células Sf 9) incluyen la serie pAc (Smith et al., (1983) Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) y la serie pVL (Lucklow, V.A., y Summers, M.D., (1989) Virology 170:31-39).

En otra realización más, una molécula de ácido nucleico que codifica nuevos polipéptidos de HCV de la invención se expresa en células de mamífero usando un vector de expresión de mamífero. Los ejemplos de vectores de expresión de mamíferos incluyen pCDM8 (Seed, B., (1987) Nature 329:840) y pMT2PC (Kaufman et al. (1987), EMBO J. 6:187-195). Cuando se usan en células de mamífero, las funciones de control del vector de expresión se proporcionan a menudo mediante elementos reguladores virales. Por ejemplo, los promotores usados comúnmente se obtienen a partir de polioma, Adenovirus 2, citomegalovirus y Virus de Simio 40.

En otra realización, el vector de expresión recombinante de mamífero es capaz de dirigir la expresión del ácido nucleico preferentemente en un tipo celular particular (por ejemplo, se usan elementos reguladores con especificidad de tejido para expresar el ácido nucleico). Los elementos reguladores con especificidad de tejido se conocen en la técnica. Los ejemplos no limitantes de promotores con especificidad de tejido adecuados incluyen el promotor de albúmina (específico del hígado; Pinkert et al. (1987) Genes Dev. 1:268-277), promotores con especificidad de tejido linfoide (Calame y Eaton (1988) Adv. Immunol. 43:235-275), en particular promotores de receptores de células T (Winoto y Baltimore (1989) EMBO J. 8:729-733) e inmunoglobulinas (Banerji et al. (1983) Cell 33:729-740; Queen y Baltimore (1983) Cell 33:741-748), promotores específicos de neuronas (por ejemplo, el promotor del neurofilamento; Byrne y Ruddle (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477), promotores específicos de páncreas (Edlund et al. (1985) Science 230:912-916) y promotores específicos de las glándulas mamarias (por ejemplo, promotor del suero de la leche; Patente de Estados Unidos Nº 4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea Nº 264.166). También se incluyen promotores regulados en el desarrollo, por ejemplo, los promotores hox murinos (Kessel y Gruss (1990) Science 249:374-379) y el promotor de la \alpha-fetoproteína (Campes y Tilghman (1989) Genes Dev. 3:537-546).

Se introduce un vector de expresión recombinante en una célula hospedadora adecuada. Las expresiones "célula hospedadora" y "célula hospedadora recombinante" se usan indistintamente en este documento. Se entiende que dichas expresiones se refieren no sólo a la célula objeto particular, sino a la progenie o progenie potencial de dicha célula. Puesto que pueden producirse ciertas modificaciones en las generaciones posteriores debido a mutación o influencias medioambientales, es posible que dicha progenie, de hecho, no sea idéntica a la célula parental, pero también se incluye dentro del alcance de la expresión como se usa en este documento.

Una célula hospedadora puede ser cualquier célula procariota o eucariota. Por ejemplo, pueden expresarse nuevos polipéptidos de HCV en células bacterianas tales como E. coli, células de insecto, levadura o células de mamífero (tales como células de ovario de hámster chino (CHO) o células COS). Los especialistas en la técnica conocerán otras células hospedadoras adecuadas.

El ADN del vector puede introducirse en las células procariotas o eucariotas mediante técnicas de transformación o transfección convencionales. Como se usa en este documento, los términos "transformación" y "transfección" pretenden referirse a diversas técnicas reconocidas en la técnica para introducir un ácido nucleico extraño (por ejemplo ADN) en una célula hospedadora, incluyendo precipitación con fosfato cálcico o cloruro cálcico, transfección mediada con DEAE-dextrano, lipofección o electroporación. Los métodos adecuados para transformar o transfectar células hospedadoras pueden encontrarse en Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Edición, Cold Spring Harbor Laboratory press (1989)), y otros manuales de laboratorio.

Para la transfección estable de células de mamífero, se sabe que, dependiendo del vector de expresión y la técnica de transfección usada, sólo una pequeña fracción de células puede integrar el ADN extraño en su genoma. Para identificar y seleccionar estos integrantes, generalmente se introduce un gen que codifica un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a antibióticos) en las células hospedadoras junto con el gen de interés. Los marcadores seleccionables preferidos incluyen los que confieren resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina y metotrexato. Un ácido nucleico que codifica un marcador seleccionable puede introducirse en una célula hospedadora en el mismo vector que codifica el polipéptido o puede introducirse en un vector diferente. Las células transfectadas de forma estable con el ácido nucleico introducido pueden identificarse mediante selección con el fármaco (por ejemplo, las células que han incorporado el marcado seleccionable sobrevivirán mientras que las otras células morirán).

Una célula hospedadora de la invención, tal como una célula hospedadora procariota o eucariota en cultivo, puede usarse para producir (es decir, expresar) nuevos polipéptidos de HCV. Por consiguiente, la invención proporciona además métodos para producir nuevos polipéptidos de HCV usando estas células hospedadoras. En una realización, el método comprende cultivar la célula hospedadora de la invención (en la cual se ha introducido un vector de expresión recombinante que codifica nuevos polipéptidos de HCV) en un medio adecuado hasta que se produce un nuevo polipéptido de HCV. En otra realización, el método comprende además aislar nuevos polipéptidos de HCV a partir del medio o la célula hospedadora.

C. Síntesis Química de Nuevos Polipéptidos de HCV

Los nuevos polipéptidos de HCV pueden sintetizarse químicamente como es bien conocido en la técnica. Además, el péptido puede sustituirse y/o derivatizarse para optimizar la estabilidad. Los polipéptidos objeto también pueden sintetizarse como polipéptidos ramificados, particularmente para aplicaciones de vacuna como se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Peptides. Editado por Bemd Gutte Academic Press 1995. pág. 456-493).

IV. Anticuerpos que reaccionan con Nuevos Polipéptidos de HCV

En otro aspecto adicional, la invención se refiere a un anticuerpo que se une a un nuevo polipéptido de HCV. Un nuevo polipéptido de HCV, o un fragmento del mismo, puede usarse como inmunógeno para generar anticuerpos que se unen a dicho polipéptido usando técnicas convencionales para la preparación de anticuerpos policlonales y monoclonales. La invención proporciona numerosos fragmentos peptídicos antigénicos de nuevos polipéptidos de HCV para uso como inmunógenos. Preferiblemente, un péptido antigénico de dicho polipéptido comprende al menos 8 restos aminoacídicos de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2 o en las secuencias consenso del polipéptido ARF Nº 1 o el polipéptido ARF Nº 2. Preferiblemente, el péptido antigénico comprende al menos 10 restos aminoacídicos, más preferiblemente al menos 14 restos aminoacídicos, aún más preferiblemente al menos 18 restos aminoacídicos. Los polipéptidos preferidos comprenden la secuencia consenso ARF Nº 1: LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) o la secuencia consenso ARF Nº 2 AAHRT(X4)SSR(X5)(X6)VR, en la que X1 es N o K, X2 es V o E, X3 es A o V, X4 es L o S, X5 es A o V y X6 es A o V. Otros polipéptidos de HCV preferidos comprenden o consisten en la secuencia LNLKEKPNVTPTAC o AAHRTSSSRAWRC.

Los polipéptidos de HCV objeto se usan para preparar anticuerpos inmunizando un sujeto adecuado (por ejemplo, conejo, cabra, ratón u otro mamífero) con el inmunógeno. Una preparación inmunogénica apropiada puede contener, por ejemplo, nuevos polipéptidos de HCV expresados de forma recombinante o puede usarse un nuevo polipéptido de HCV sintetizado químicamente. La preparación puede incluir además un adyuvante, tal como adyuvante completo o incompleto de Freund, o un agente inmunoestimulador similar. La inmunización de un sujeto adecuado con una preparación de polipéptidos de HCV inmunogénica induce una respuesta de anticuerpos policlonales para polipéptidos de HCV.

Por consiguiente, otro aspecto de la invención se refiere anticuerpos que reaccionan con los nuevos polipéptidos de HCV. El término "anticuerpo", como se usa en este documento, se refiere a moléculas de inmunoglobulina y partes de moléculas de inmunoglobulina inmunológicamente activas, es decir, moléculas que contienen un sitio de unión a antígeno que se une específicamente (reacciona inmunológicamente con) un polipéptido de HCV. La invención proporciona anticuerpos policlonales y monoclonales que se unen a polipéptidos de HCV. La expresión "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal", como se usa en este documento, se refiere a una población de moléculas de anticuerpo que contienen solamente una especie de un sitio de unión a antígeno capaz de reaccionar inmunológicamente con un epítopo particular de un nuevo polipéptido de HCV. Por lo tanto, una composición de anticuerpos monoclonales típicamente presenta una única afinidad de unión para un polipéptido de HCV particular con el que el reacciona.

Pueden prepararse anticuerpos policlonales anti-polipéptido de HCV como se ha descrito anteriormente inmunizando un sujeto adecuado con un inmunógeno de polipéptido de HCV o un virus HCV atenuado, o pueden obtenerse a partir de un individuo infectado. El título de anticuerpos anti-polipéptido de HCV en el sujeto inmunizado puede controlarse a lo largo del tiempo por técnicas convencionales tales como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) usando un polipéptido de HCV inmovilizado. Si se desea, las moléculas de anticuerpo dirigidas contra el polipéptido de HCV pueden aislarse a partir del animal (por ejemplo, a partir de la sangre) y purificarse adicionalmente mediante técnicas bien conocidas, tales como cromatografía en proteína A para obtener la fracción de IgG. En un momento apropiado después de la inmunización, por ejemplo, cuando los títulos de anticuerpo son los más altos, pueden obtenerse células que producen anticuerpos del sujeto y usarse para preparar anticuerpos monoclonales mediante técnicas convencionales, tales como la técnica de hibridoma descrita originalmente por Kohler y Milstein (1975, Nature 256:495-497) (véase también, Brown et al. (1981) J. Immunol 127:539-46; Brown et al. (1980) J Biol Chem 255:4980-83; Yeh et al. (1976) PNAS 76:2927-31; y Yeh et al. (1982) Int. J. Cancer 29:269-75), la técnica de hibridoma de células B humanas más reciente (Kozbor et al. (1983) Immunol Today 4:72), la técnica de EBV-hibridoma (Cole et al. (1985), Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) o técnicas de trioma. La tecnología para producir hibridomas de anticuerpos monoclonales se conoce bien (véase, en general, R. H. Kenneth, en Monoclonal Antibodies: A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); E. A. Lemer (1981) Yale J. Biol. Med, 54:387-402; M. L. Gefter et al. (1977) Somatic Cell Genet., 3:231-36). En resumen, una línea celular inmortal (típicamente un mieloma) se fusiona a linfocitos (típicamente esplenocitos) de un mamífero inmunizado con un inmunógeno de polipéptido de HCV como se ha descrito anteriormente, y los sobrenadantes de cultivo de las células de hibridoma resultantes se seleccionan para identificar un hibridoma que produzca un anticuerpo monoclonal que se une al polipéptido de HCV.

Cualquiera de los muchos protocolos bien conocidos usados para fusionar linfocitos y líneas celulares inmortalizadas puede aplicarse para generar un anticuerpo monoclonal anti-polipéptido de HCV (véase, por ejemplo, G. Galfre et al. (1977) Nature 266: 55052; Gefter et al. Somatic Cell Genet., mencionado supra; Lerner, Yale J. Biol. Med., mencionado supra; Kenneth, Monoclonal Antibodies, mencionado supra). Además, el especialista habitual en la técnica entenderá que existen muchas variaciones de estos métodos que también podrían ser útiles. Típicamente, la línea celular inmortal (por ejemplo, una línea celular de mieloma) procede de la misma especie de mamífero que los linfocitos. Por ejemplo, pueden prepararse hibridomas murinos fusionando linfocitos de un ratón inmunizado con una preparación inmunogénica de la presente invención con una línea celular de ratón inmortalizada. Son líneas celulares inmortalizadas preferidas líneas celulares de mieloma de ratón que son sensibles al medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"). Puede usarse cualquiera de varias líneas celulares de mieloma como compañero de fusión de acuerdo con técnicas convencionales, por ejemplo, las líneas de mieloma P3-NS1/1-Ag4-1, P3-x63-Ag8.653 o Sp2/O-Ag14. Estas líneas de mieloma están disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md. Típicamente, las células de mieloma de ratón sensibles a HAT se fusionan con esplenocitos de ratón usando polietilenglicol ("PEG"). Las células de hibridoma resultantes de la fusión se seleccionan después usando medio HAT, que destruye a las células de mieloma no fusionadas y fusionadas de forma no productiva (los esplenocitos no fusionados mueren después de varios días puesto que no se han transformado).

Las células de hibridoma que producen un anticuerpo monoclonal de la invención se detectan explorando los sobrenadantes del cultivo de hibridoma para encontrar anticuerpos que se unan a polipéptidos de HCV, por ejemplo, usando un ensayo ELISA convencional.

Como alternativa a la preparación de hibridomas que secretan anticuerpos monoclonales, puede identificarse un anticuerpo monoclonal anti-polipéptido de HCV y aislarse explorando una biblioteca combinatoria de inmunoglobulinas recombinante (por ejemplo, una biblioteca de presentación de anticuerpos en fagos) con polipéptidos de HCV para aislar de este modo miembros de la biblioteca de inmunoglobulina que se unen a polipéptidos de HCV. Los kits para generar y explorar bibliotecas de exposición de fagos están disponibles en el mercado (por ejemplo, el Recombinant Phage Antibody System de Pharmacia, Nº de catálogo 27-9400-01; y el SurfZAP™ phage Display Kit de Stratagene, Nº de catálogo 240612). Adicionalmente, pueden encontrarse ejemplos de métodos y reactivos particularmente adecuados para uso para generar y explorar bibliotecas de presentación de anticuerpos en, por ejemplo, Ladner et al. Patente de Estados Unidos Nº 5.223.409; Kang et al. Publicación Internacional Nº WO 92/18619; Dower et al. Publicación Internacional Nº WO 91/17271; Winter et al. Publicación Internacional WO 92/20791; Markland et al. Publicación Internacional Nº WO 92/15679; Breitling et al. Publicación Internacional WO 93/01288; McCafferty et al. Publicación Internacional Nº WO 92/01047; Garrard et al. Publicación Internacional Nº WO 92/09690; Ladner et al. Publicación Internacional Nº WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibody Hybridomas 3: 81-85; Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281; Griffiths et al. (1993) EMBO J 12: 725-734; Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226: 889-896; Clarkson et al. (1991) Nature 352: 624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19: 4133-4137; Barbas et al. (1991) PNAS 88: 7978-7982; y McCafferty et al. Nature (1990) 348: 552-554.

Adicionalmente, dentro del alcance de la invención se incluyen anticuerpos recombinantes anti-polipéptidos de HCV, tales como anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados, que comprenden partes humanas y no humanas, que pueden prepararse usando técnicas de ADN recombinante convencionales. Dichos anticuerpos monoclonales quiméricos y humanizados pueden producirse mediante técnicas de ADN recombinante conocidas en la técnica, por ejemplo usando métodos descritos en Robinson et al. Publicación de Patente Internacional PCT/US86/02269; Akira, et al. Solicitud de Patente de Europea 184.187; Taniguchi, M., Solicitud de Patente de Europea 171.496; Morrison et al. Solicitud de Patente Europea 173.494; Neuberger et al. Solicitud PCT WO 86/01533; Cabilly et al. Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567; Cabilly et al. Solicitud de Patente Europea 125.023; Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) PNAS 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) PNAS 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Canc. Res. 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449; y Shaw et al. (1988) J. Natl Cancer Inst. 80: 1553-1559); Morrison, S. L. (1985) Science 229: 1202-1207; Oi et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Winter Patente de Estados Unidos 5.225.539; Jones et al. (1986) Nature 321: 552-525; Verhoeyan et al. (1988) Science 239: 1534; y Beidler et al. (1988) J. Immunol. 141: 4053-4060.

Puede usarse un anticuerpo anti-polipéptido de HCV (por ejemplo, anticuerpo monoclonal) para aislar o detectar polipéptidos de HCV mediante técnicas convencionales, tales como cromatografía de afinidad, inmunoprecipitación, ELISA, o RIA como se conoce bien en la técnica. Un anticuerpo anti-polipéptido de HCV puede facilitar la purificación del polipéptido de HCV natural a partir de células y de polipéptidos de HCV producidos de forma recombinante expresados en células hospedadoras. Además, puede usarse un anticuerpo anti-polipéptido de HCV para detectar polipéptidos de HCV de un fluido corporal de un sujeto que se sospecha que tiene una infección por HCV. La detección puede facilitarse acoplando (es decir, uniendo físicamente) el anticuerpo a una sustancia detectable. Los ejemplos de sustancias detectables incluyen diversas enzimas, grupos prostéticos, materiales fluorescentes, materiales luminiscentes y materiales radiactivos. Los ejemplos de enzimas adecuadas incluyen peroxidasa de rábano picante, fosfatasa alcalina, \beta-galactosidasa o acetilcolinesterasa; los ejemplos de complejos de grupos prostéticos adecuados incluyen estreptavidina/biotina y avidina/biotina; los ejemplos de materiales fluorescentes adecuados incluyen umbeliferona, fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, diclorotriazinilamina fluoresceína, cloruro de dansilo o ficoeritrina; un ejemplo de un material luminiscente incluye luminol; y los ejemplos de material radiactivo adecuado incluyen ^{125}I,^{131}I,^{35}S o ^{3}H.

Dichos anticuerpos pueden incorporarse en kits de diagnóstico y también son útiles en la inmunización pasiva contra HCV en pacientes que tienen una infección por HCV activa o es probable que estén expuestos a HCV.

IV. Usos de Nuevos Polipéptidos de HCV

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición de vacuna que se administra a un sujeto antes de la exposición a HCV para prevenir la infección por el virus de la hepatitis C en el sujeto. En una realización, la vacuna comprende un nuevo polipéptido de HCV de la invención. En otra realización, la vacuna hace que se sintetice un nuevo polipéptido de HCV de la invención en un sujeto.

A. Vacunas

Las secuencias de los nuevos polipéptidos de HCV apropiados para uso en composiciones de vacuna para la prevención de HCV en un sujeto pueden determinarse fácilmente. Por ejemplo, pueden identificarse epítopos que inducen una respuesta inmune por selección en un inmunoensayo contra suero de pacientes con una infección por HCV pasada o en curso. Como alternativa, pueden identificarse polipéptidos inmunogénicos mediante análisis informático para identificar epítopos inmunogénicos. Finalmente, podría usarse en una vacuna el nuevo polipéptido de longitud completa.

En otra realización, pueden administrarse agentes que son adyuvantes conocidos con los polipéptidos objeto. En este momento, el único adyuvante usado ampliamente en seres humanos ha sido alumbre (fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio). La saponina y su componente purificado Quil A, el adyuvante completo de Freund y otros adyuvantes usados en investigación y aplicaciones veterinarias podrían usarse en vacunas humanas. Sin embargo, también pueden usarse nuevas preparaciones definidas químicamente tales como muramil dipéptido, monofosforil lípido A, conjugados de fosfolípidos tales como los descritos por Goodman-Snitkoff et al. J. Immunol. 147: 410-415 (1991), resorcinoles, tensioactivos no iónicos tales como polioxietilen oleil éter y n-hexadecil polietilen éter, inhibidores de enzimas que incluyen inhibidor de la tripsina pancreática, diisopropilfluorofosfato (DEP) y trasilol. En realizaciones en las que se administra el antígeno, el antígeno puede, por ejemplo, encapsularse en un proteoliposoma según lo descrito por Miller et al., J. Exp. Med. 176: 1739-1744 (1992), o en vesículas lipídicas, tales como vesículas lipídicas Novasome TM (Micro Vascular Systems, Inc., Nashua, N. H.), para potenciar adicionalmente las respuestas inmunes.

En otras realizaciones adicionales, como alternativa a administrar el nuevo polipéptido de HCV, el polipéptido puede sintetizarse por el sujeto. Esto puede conseguirse usando una construcción de ADN plasmídico que es similar a las usadas para suministrar genes indicadores o terapéuticos. Dicha construcción comprende preferiblemente un origen de replicación bacteriano que permite la amplificación de grandes cantidades del ADN plasmídico; un gen marcador seleccionable procariota; una secuencia de ácido nucleico que codifica un nuevo polipéptido de HCV o una parte del mismo; elementos reguladores de la transcripción en eucariotas para dirigir la expresión génica en la célula hospedadora; y una secuencia de poliadenilación para asegurar la terminación apropiada del ARNm expresado (Davis. 1997. Curr. Opin. Biotechnol. 8: 635). Los vectores usados para la inmunización de ADN pueden comprender opcionalmente una secuencia señal (Michel et al. 1995. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 92: 5307; Donnelly et al. 1996. J. Infect Dis. 173: 314). Las vacunas de ADN pueden administrarse por diversos medios, por ejemplo, por inyección (por ejemplo, intramuscular, intradérmica, o la inyección biolística de partículas de oro revestidas con ADN en la epidermis mediante una pistola génica que usa un acelerador de partículas o un gas comprimido para inyectar las partículas en la piel (Haynes et al. 1996. J. Biotechnol. 44: 37)). Como alternativa, las vacunas de ADN pueden administrarse por medios no invasivos. Por ejemplo, puede suministrarse ADN puro o formulado con lípidos al sistema respiratorio o dirigirse a cualquier otro sitio, por ejemplo, a las placas de Peyer, mediante suministro oral de ADN (Schubbert. 1997. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 961). Pueden usarse microorganismos atenuados para la administración en superficies mucosas (Sizemore et al. 1995. Science. 270: 29).

Cualquiera de las presentes composiciones de vacuna puede comprender (o codificar) uno o más epítopos (contiguos o no contiguos) de un nuevo polipéptido de HCV. Dichas preparaciones pueden comprender además secuencias polipeptídicas obtenidas a partir de una secuencia de poliproteína de HCV. En otras realizaciones, dicha composición de vacuna puede comprender además un compuesto que potenciará la reactividad inmunológica del epítopo del nuevo polipéptido de HCV. Por ejemplo, la inmunogenicidad de los nuevos polipéptidos de HCV puede potenciarse preparando una proteína de fusión que comprende un nuevo polipéptido de HCV fusionado a un polipéptido diferente, es decir, un polipéptido que no es un nuevo polipéptido de HCV. Las técnicas para preparar dichas proteínas de fusión se conocen en la técnica. Como alternativa, una vacuna puede comprender una molécula inmunorreguladora, tal como una citoquina. Por ejemplo, en una realización, los plásmidos para la vacunación con ADN pueden expresar un único inmunógeno, o pueden co-expresarse dos secuencias. En una realización, las secuencias adicionales pueden ser inmunógenos adicionales (nuevos polipéptidos de HCV, polipéptidos de poliproteína de HCV u otros polipéptidos) o pueden codificar moduladores de las respuestas inmunes tales como genes de linfoquina o moléculas coestimuladoras (Iwasaki et al. 1997. J. Immunol. 158: 4591).

Típicamente, las composiciones de vacuna de la presente invención se preparan como inyectables, como soluciones o suspensiones líquidas. También pueden prepararse formas sólidas adecuadas para solución en, o suspensión en un líquido antes de la inyección. La composición también puede emulsionarse, o el polipéptido puede encapsularse en liposomas. El polipéptido puede mezclarse con excipientes farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, agua, solución salina, dextrosa, glicerol, etanol o similares. La composición también puede comprender cantidades minoritarias de, por ejemplo, agentes humectantes, agentes reguladores del pH y/o adyuvantes, tales como hidróxido de aluminio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637 o nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicerol-3-hidroxifosforiloxi)etilamina (CGP 19835A o MTP-PE), o componentes bacterianos.

Dichas composiciones de vacuna se administran generalmente por vía parenteral, mediante inyección, normalmente por vía subcutánea o intramuscular. Otras formulaciones pueden administrarse por vía oral, mediante inhalación o en forma de supositorios.

Los polipéptidos pueden incorporarse en la vacuna en forma neutra o de sal. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen las sales de adición de ácidos (formadas con grupos amino libres del polipéptido) y que se forman con ácidos inorgánicos tales como, por ejemplo, ácido clorhídrico o fosfórico, o ácidos orgánicos tales como ácido acético, oxálico, tartárico o maleico, o similares. También pueden obtenerse sales formadas con los grupos carboxilo libres a partir de bases inorgánicas tales como, por ejemplo, hidróxidos de sodio, potasio, amonio, calcio o férricos, y bases orgánicas tales como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, histidina, procaína o similares.

Las vacunas se administran para ser compatibles con la formulación de dosificación, y en una cantidad tal que sea profiláctica y/o terapéuticamente eficaz. La cantidad a administrar depende del sujeto a tratar, la capacidad del sistema inmune del sujeto para montar una respuesta inmune a la vacuna, y el grado de protección deseado. Sin embargo, a menudo es apropiado el intervalo de 5 \mug a 250 \mug de antígeno por dosis. Las composiciones de vacuna pueden administrarse en una única dosis o en dosis múltiples. Las dosis apropiadas pueden determinarse bien por un especialista en la técnica, y no constituyen experimentación indebida.

En otra realización más, la invención se refiere a un método para prevenir HCV en un sujeto por medio de la administración de un nuevo polipéptido de HCV al sujeto o haciendo que se exprese un nuevo polipéptido de HCV en el sujeto.

B. Kits de Diagnóstico

En otro aspecto de la invención, se proporcionan métodos para diagnosticar una infección por HCV, por ejemplo, una infección pasada o presente, y kits de diagnóstico para detectar una infección con HCV.

En una realización, la invención proporciona un método para diagnosticar infección por HCV detectando la presencia o ausencia de anticuerpos en el fluido corporal de un sujeto que se unen a un nuevo polipéptido de HCV. En una realización, el método comprende incubar una muestra de ensayo en condiciones que permitan la unión de un nuevo polipéptido de HCV y un anticuerpo en la muestra de ensayo de fluido corporal y detectar la unión del polipéptido y el anticuerpo.

Pueden obtenerse muestras de ensayo de cualquier preparación de fluido corporal o tejido apropiada, por ejemplo, preparación de sangre entera, plasma, suero, fluido espinal, fluido linfático, lágrimas, saliva, leche o tejido hepático.

La detección de la unión entre un nuevo polipéptido de HCV de la invención y un anticuerpo puede realizarse usando una técnica que se conoce en la técnica y puede facilitarse usando anticuerpos marcados como se ha descrito anteriormente.

Los anticuerpos que se unen al nuevo polipéptido de HCV pueden detectarse usando varios ensayos de selección diferentes conocidos en la técnica, tales como un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), un radioinmunoensayo (RIA), o un Ensayo de Transferencia de Western. Cada ensayo detecta generalmente la presencia de complejos proteína-anticuerpo de interés particular empleando un reactivo marcado (por ejemplo, un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por consiguiente, en la presente invención, se usan estos ensayos para detectar complejos de nuevo polipéptido de HCV-anticuerpo formados entre inmunoglobulinas (por ejemplo, IgG, IgM e IgA humanas) contenidas en una muestra biológica y un nuevo polipéptido de HCV. Como se describirá a continuación, estos complejos de proteína-anticuerpo se detectan preferiblemente usando un anticuerpo ligado a enzimas o un fragmento de anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo) que reconoce y se une específicamente a los complejos polipéptido-anticuerpo.

En una realización del método, se usa un ensayo ELISA de sándwich. Por ejemplo, un nuevo polipéptido de HCV con o sin conjugación a un vehículo, tal como BSA activado se inmoviliza en una placa. Se pone en contacto una muestra de fluido corporal de un individuo con un nuevo polipéptido de HCV en condiciones que permiten la unión de los anticuerpos presentes en la muestra a los polipéptidos. Después se retira la muestra y todo el anticuerpo que se ha unido al polipéptido de HCV se detecta poniendo en contacto la muestra con un anticuerpo secundario o fragmento de anticuerpo secundario marcado que se une al anticuerpo que puede estar presente en la muestra del sujeto, por ejemplo, un anticuerpo anti-humano. El anticuerpo secundario no unido se retira, y se detecta la presencia de anticuerpo secundario que permanece unido, por ejemplo, usando un marcador como se ha descrito anteriormente. Los posibles controles para su uso en el método incluyen fluidos corporales de sujetos no infectados y polipéptidos que no son nuevos polipéptidos de HCV. De acuerdo con la presente invención, la presencia de dicho anticuerpo indica una infección con HCV.

En otra realización del ensayo, puede ensayarse la presencia de nuevos polipéptidos de HCV en la muestra de ensayo usando anticuerpos conocidos. En estas realizaciones, se usan anticuerpos que se unen a nuevos polipéptidos de HCV para detectar la presencia de nuevos polipéptidos de HCV en el fluido corporal de un sujeto o en una célula de un sujeto. Para realizar dicho ensayo, los anticuerpos que se unen a un nuevo polipéptido de HCV se ponen en contacto con una célula o fluido corporal de un sujeto en condiciones en las que un nuevo polipéptido de HCV en la muestra del sujeto pueda unirse al anticuerpo. Se retira el anticuerpo no unido y se detecta el anticuerpo unido. Para poner en práctica este método puede usarse cualquiera de los anticuerpos descritos anteriormente. Los anticuerpos preferidos para uso en los métodos de esta realización son altamente específicos, incluyendo anticuerpos monoespecíficos y, más preferiblemente, anticuerpos monoclonales o fragmentos de los mismos. En realizaciones preferidas, dichos anticuerpos están marcados. En otras realizaciones, dichos anticuerpos se detectan empleando un anticuerpo secundario que se une a ellos y no a la muestra de ensayo de un sujeto. La presencia de un nuevo polipéptido de HCV en la muestra del sujeto indica una infección con HCV.

En otro aspecto más, la presente invención proporciona un kit de ensayo para diagnosticar infección por HCV en un sujeto. Preferiblemente, el kit contiene un soporte sólido (por ejemplo, una placa de ELISA) capaz de adsorber inmunoglobulina (por ejemplo, IgG, IgM e IgA) de la muestra de un sujeto (preferiblemente una muestra biológica humana, tal como un fluido corporal) y un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo específico para un nuevo polipéptido de HCV. En otra realización, el soporte sólido puede omitirse del kit. En otra realización, el kit contiene un soporte sólido (por ejemplo, una placa de ELISA o un portaobjetos) y un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo específico para un nuevo polipéptido de HCV. En otras realizaciones, puede omitirse el soporte sólido. El kit de ensayo puede incluir opcionalmente instrucciones, o reactivos adicionales tales como una solución para lavar proteínas no unidas del soporte sólido, y materiales necesarios para realizar un ensayo de detección.

C. Dianas para Intervención Terapéutica

Los nuevos polipéptidos de HCV de la invención son también dianas para terapia anti-HCV. Como tal, la invención proporciona métodos para identificar compuestos que interaccionan con un nuevo polipéptido de HCV, y por lo tanto, es probable que interfieran con la infección. En una realización, el método implica poner en contacto el polipéptido con un compuesto en un sistema sin células en condiciones que permitan la interacción del compuesto con el polipéptido de modo que se forme un complejo. Los complejos de polipéptido y compuesto pueden separarse después de los compuestos que no se unan al polipéptido de HCV, y después pueden aislarse e identificarse los compuestos que se unen a polipéptidos de HCV.

Los compuestos ejemplares para los que se puede explorar la actividad en los ensayos objeto incluyen, pero sin limitación, péptidos, ácidos nucleicos, carbohidratos, moléculas orgánicas pequeñas y bibliotecas de extractos de productos naturales. La expresión "compuesto no peptídico" pretende incluir compuestos que están compuestos, al menos en parte, de estructuras moleculares diferentes de restos de L-aminoácidos de origen natural unidos mediante enlaces peptídicos naturales. Sin embargo, "compuestos no peptídicos" pretende incluir compuestos formados, en su totalidad o en parte, por estructuras peptidomiméticas, tales como D-aminoácidos, L-aminoácidos no naturales, estructuras peptídicas modificadas y similares, así como compuestos que están formados, en su totalidad o en parte, por estructuras moleculares no relacionadas con restos L-aminoacídicos de origen natural unidos mediante enlaces peptídicos naturales. "Compuestos no peptídicos" también pretende incluir productos naturales.

Una tendencia actual en la química médica incluye la producción de mezclas de compuestos, denominadas bibliotecas. Aunque el uso de bibliotecas de péptidos está bien establecido en la técnica, se han desarrollado nuevas técnicas que han permitido la producción de mezclas de otros compuestos, tales como benzodiacepinas (Bunin et al. 1992. J. Am. Chem. Soc. 114: 10987; DeWitt et al. 1993. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6909), peptoides (Zuckermann. 1994. J. Med. Chem. 37: 2678), oligocarbamatos (Cho et al. 1993. Science. 261: 1303) e hidantoínas (DeWitt et al. supra). Rebek et al. han descrito un enfoque para la síntesis de bibliotecas moleculares de moléculas orgánicas pequeñas con una diversidad de 104-105 (Carell et al. 1994. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33: 2059; Carell et al. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1994. 33: 2061).

Los compuestos de la presente invención pueden obtenerse usando cualquiera de los numerosos enfoques en los métodos de bibliotecas combinatorias conocidos en la técnica, incluyendo, bibliotecas biológicas; bibliotecas en fase de solución o en fase sólida paralelas dirigibles espacialmente, métodos de bibliotecas sintéticas que requieren desconvolución, el método de biblioteca "una perla un compuesto" y métodos de bibliotecas sintéticas que usan selección por cromatografía de afinidad. El enfoque de bibliotecas biológicas se limita a bibliotecas de péptidos, mientras que los otros cuatro enfoques son aplicables a bibliotecas de compuestos de péptidos, oligómeros no peptídicos o pequeñas moléculas (Lam, K.S. Anticancer Drug Des. 1997. 12: 145).

En una realización, el compuesto de ensayo es un péptido o peptidomimético. En otra realización preferida, los compuestos son compuestos orgánicos no peptídicos pequeños.

En la técnica pueden encontrarse otros métodos ejemplares para la síntesis de bibliotecas moleculares, por ejemplo en Erb et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 11422; Horwell et al. 1996 Immunopharmacology 33: 68; y en Gallop et al. 1994. J. Med. Chem. 37: 1233.

Las bibliotecas de compuestos pueden presentarse en solución (por ejemplo, Houghten (1992) Biotechniques 13: 412-421), o en perlas (Lam (1991) Nature 354: 82-84), chips (Fodor (1993) Nature 364: 555-556), bacterias (Ladner, Patente de Estados Unidos 5.223.409), esporas (Ladner Patente de Estados Unidos 5.223.409), plásmidos (Cull et al. (1992) Proc Natl Acad Sci USA 89: 1865-1869) o en fagos (Scott y Smith (1990) Science 249: 386-390); (Devlin (1990) Science 249: 404-406); (Cwirla et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87: 6378-6382); (Felici (1991) J. Mol Biol. 222: 301-310); (Ladner supra.).

En muchos programas de selección de fármacos que ensayan bibliotecas de compuestos y extractos naturales, son deseables ensayos de alta producción para maximizar la cantidad de compuestos inspeccionados en un período de tiempo dado. Los ensayos se realizan en sistemas sin células, tales como los que pueden obtenerse con proteínas purificadas o semipurificadas, se prefieren a menudo como exploraciones "primarias", ya que pueden generarse para permitir el desarrollo rápido y una detección relativamente rápida de una alteración en una diana molecular que está mediada por un compuesto de ensayo. Por consiguiente, en un ensayo de exploración ejemplar de la presente invención, el compuesto interés se pone en contacto con un nuevo polipéptido de HCV. La detección y cuantificación de complejos de nuevos polipéptidos de HCV/compuesto identifica el compuesto como un modulador potencial de un nuevo polipéptido de HCV. La eficacia del compuesto puede evaluarse generando curvas de dosis-respuesta a partir de datos obtenidos usando diversas concentraciones del compuesto de ensayo. Además, también puede realizarse un control, por ejemplo, usando un polipéptido diferente para proporcionar un punto de referencia para comparación.

La formación de complejos entre el nuevo polipéptido de HCV y un compuesto puede detectarse mediante diversas técnicas. Por ejemplo, puede cuantificarse la modulación de la formación de complejos usando, por ejemplo, proteínas marcadas de forma detectable tales como nuevos polipéptidos de HCV radiomarcados, marcados con fluorescencia o marcados enzimáticamente, mediante inmunoensayo, o mediante detección cromatográfica.

Típicamente, será deseable inmovilizar el nuevo polipéptido de HCV o el compuesto o facilitar la separación de complejos de compuesto/nuevo HCV de formas no complejadas, así como acomodar la automatización del ensayo. En una realización, puede proporcionarse una proteína de fusión que añade un dominio que permite que el polipéptido se una a una matriz. Por ejemplo, las formas de proteína de fusión de glutatión-S-transferasa/receptor (GST/receptor) de los nuevos polipéptidos pueden adsorberse en perlas de glutatión sepharose (Sigma Chemical, St. Louis, MO) o placas de microtitulación derivatizadas con glutatión, que después se combinan con el compuesto de ensayo que se une a las perlas y se incuba en condiciones que conducen a la formación de complejos, por ejemplo, en condiciones fisiológicas para sal y pH, aunque pueden desearse condiciones ligeramente más rigurosas, por ejemplo a 4ºC en un tampón que contiene NaCl 0,6 M o un detergente tal como Triton X-100 al 0,1%. Después de la incubación, las formas no complejadas se retiran mediante lavado y se identifican los compuestos que se une a los nuevos polipéptidos de HCV.

Otras técnicas para inmovilizar proteínas sobre matrices también están disponibles para su uso en el ensayo objeto. Por ejemplo, los nuevos polipéptidos de HCV pueden inmovilizarse usando conjugación de biotina y estreptavidina. Por ejemplo, pueden prepararse nuevos polipéptidos de HCV biotinilados a partir de biotina-NHS (N-hidroxi-succinimida) usando técnicas bien conocidas en la técnica (por ejemplo, kit de biotinilación, Pierce Chemicals, Rockford, IL), e inmovilizarse en los pocillos de placas de 96 pocillos revestidas con estreptavidina (Pierce Chemical). Como alternativa, pueden derivatizarse anticuerpos reactivos con los nuevos polipéptidos de HCV en los pocillos de la placa, y los nuevos polipéptidos de HCV pueden quedar atrapados en los pocillos mediante conjugación con los anticuerpos. Como anteriormente, las preparaciones de un nuevo polipéptido de HCV y un compuesto de ensayo se incuban en los pocillos de la placa, y puede determinarse la cantidad de complejo de nuevos polipéptidos de HCV/compuesto atrapado en el pocillo.

Otros métodos ejemplares para detectar dichos complejos, además de los descritos anteriormente para los complejos inmovilizados con GST, incluyen inmunodetección de complejos usando anticuerpos reactivos con los nuevos polipéptidos de HCV, o que son reactivos con la proteína receptora y compiten por la unión con el nuevo polipéptido de HCV; así como ensayos ligados a enzima que se basan en la detección de una actividad enzimática asociada con el nuevo polipéptido de HCV. En este último caso, la enzima puede conjugarse químicamente o proporcionarse como una proteína de fusión con el nuevo polipéptido de HCV. Como ilustración, el nuevo polipéptido HCV puede formar enlaces químicos cruzados o fusionarse genéticamente con fosfatasa alcalina, y la cantidad de nuevo polipéptido de HCV atrapado en el complejo puede evaluarse con un sustrato cromogénico de la enzima, por ejemplo, paranitrofenilfosfato. Del mismo modo, puede proporcionarse una proteína de fusión que comprende el nuevo polipéptido de HCV y glutatión S-transferasa, y puede cuantificarse la formación del complejo detectando la actividad GST usando 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (Habig et al (1974) J Biol Chem 249:7130).

Para los procesos que se basan en la inmunodetección para cuantificar una de las proteínas atrapadas en el complejo, pueden usarse anticuerpos contra la proteína, tales como los anticuerpos anti-nuevos HCV descritos en este documento. Como alternativa, la proteína a detectar en el complejo puede tener "marca de epítopo" en forma de una proteína de fusión que incluye, además del nuevo polipéptido HCV, un segundo polipéptido para el cual se pueden adquirir fácilmente anticuerpos (por ejemplo, en fuentes comerciales). Por ejemplo, las proteínas de fusión de GST descritas anteriormente también pueden usarse para la cuantificación de la unión usando anticuerpos contra el resto GST. Otras marcas de epítopo útiles incluyen epítopos myc (por ejemplo, véase Ellison et al. (1991) J Biol Chem 266:21150-21157) que incluye una secuencia de 10 restos de c-rnyc, así como el sistema pFLAG (International Biotechnologies, Inc.) o el sistema pEZZ-proteína A (Pharmacia, NJ).

La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique otra cosa, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro del alcance de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véase, por ejemplo, Genetics; Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ª Ed., ed. por Sambrook, J. et al. (Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)); Short Protocols in Molecular Biology, 3ª Ed., ed. por Ausubel, F. et al. (Wiley, NY (1995)); DNA Cloning, Volumes I y II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. (1984)); Mullis et al. Patente de Estados Unidos Nº 4.683.195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. (1984)); el tratado
Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N. Y.); Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London (1987)); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir y C. C. Blackwell, eds. (1986)); and Miller, J. Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1972)).

La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos, que no deben considerarse limitantes.

Ejemplos

Ejemplo 1

La detección de anticuerpos contra nuevos polipéptidos de HCV

Se sintetizaron polipéptidos consenso basándose en la homología de secuencia entre nuevos polipéptidos de HCV que se muestran en la Tabla 1. Los siguientes polipéptidos se prepararon usando técnicas convencionales de Biosynthesis Corp. (Lewisville, TX): LNLKEKPNVTPTAC y AAHRTSSSRAWRC (fase de lectura alternativa (ARF) polipéptidos 1 y 2, respectivamente). Se usaron como controles los siguientes polipéptidos obtenidos de la proteína CORE de HCV: PTDPRRRSRNLGKVIDTC y GCATRKTSERSQPRGRRAPI. Los péptidos se conjugaron con albúmina de suero bovino activada dando hasta 4 moléculas peptídicas para cada molécula de BSA. Los conjugados de péptido-BSA a una concentración de aproximadamente 0,5 mg/ml se pusieron en hielo en 3 ml de solución salina tamponada con fosfato, 0,1 M, pH 7,4. Se pusieron en alícuotas y se almacenaron a -20ºC hasta su uso.

Se realizaron ensayos ELISA según lo descrito por Kirkegaard y Perry Laboratories, Inc. (Gaithersburg, MD). Para su uso en el ELISA, los polipéptidos se disolvieron en "tampón de revestimiento" 1X para dar una concentración de péptido-BSA de 1 \mug/ml. Se añadieron 100 \mul a placas de microtitulación de 96 pocillos (Falcon 3072, Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora o durante una noche a 4ºC. La solución de revestimiento se retiró y posteriormente se bloquearon las placas añadiendo 300 \mul de BSA al 1% en solución salina tamponada con fosfato (como se preparó por Kirkegaard y Perry) e incubando durante 30 min a temperatura ambiente. La solución de bloqueo se retiró y se añadieron 100 \mul de BSA al 1% (1X).

Se obtuvieron sueros de pacientes que se sabía que tenían o habían tenido previamente una infección por HCV. Las muestras de suero se diluyeron 1:100 en BSA 1X y se añadieron 100 \mul al primer pocillo de cada placa (produciendo un total de 200 \mul). Las muestras de suero se diluyeron después en serie (dos veces en cada etapa). Los pocillos de control contenían solamente BSA. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con agitación moderada para permitir la unión. Las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado 1X (PBS y Tween al 0,02%). Después del lavado, se añadieron inmediatamente 100 \mul del anticuerpo secundario y se dejaron reaccionar durante 1 hora a temperatura ambiente. El anticuerpo secundario era el fragmento Fab de IgG anti-humana conjugada con peroxidasa de rábano picante (HRP) a una dilución de 1:1000, o IgG anti-humana (en PBS con BSA al 1%). Las placas se lavaron 5 veces con solución de lavado 1X, y después se añadieron 100 \mul de peróxido de hidrógeno y TMB y se dejaron reaccionar durante 10 a 30 min a temperatura ambiente. Para detener la reacción, se añadieron 100 \mul de ácido fosfórico 1 M. Las mediciones de la D.O. se obtuvieron usan un explorador de longitud de onda dual: valores de 450 nm-valores de 650 nm.

Resultados de los Ensayos ELISA para Anticuerpos de Polipéptidos Específicos de HCV

1

Ejemplo 2

Desarrollo de un ensayo de transferencia de western para detectar la producción de anticuerpos contra proteínas con fase de lectura de HCV alternativa

Se desnaturalizaron cinco microgramos de conjugados de péptido de fase de lectura alternativa-BSA y controles apropiados (BSA inactivada, conjugados de BSA-péptido BSA) incubando en un tampón de carga Lamelli convencional (con beta-mercaptoetanol y SDS) a 100ºC durante tres minutos. Después, las muestras se enfriaron y se centrifugaron en una microcentrífuga antes de cargarlas en un gel de SDS-PAGE discontinuo de 1,5 mm de espesor (gel concentrador al 4% [pH 6,8] y gel de resolución al 12,5% [pH 8,4]). El tampón del procesamiento fue TRIS-glicina/SDS (0,1%), con un pH sin ajustar de aproximadamente 8,4.

Las muestras se desplazaron a través del gel concentrador (1 cm) durante aproximadamente 45 min a 90 voltios. Después de que el azul de bromofenol (BB) entrara en el gel de resolución, se aumentó el voltaje a 160 V. Los geles se dejaron desplazar durante aproximadamente 1,5 horas, o hasta que el BB estaba a 2/3 del camino del gel. Después de interrumpir la carrera, los geles se tiñeron con azul de coomassie, o se equilibraron durante 15 minutos con el tampón de transferencia (CAPS 1X, pH 11,0, MeOH al 10%). Se humedecieron membranas PVDF (Immobilon-P [tamaño del poro 0,45 micrómetros] en MeOH al 100% durante 1 min, después en MeOH:agua doblemente destilada 50:50 durante 5 min, y finalmente se equilibraron con el tampón transferencia. La transferencia se preparó en tampón de transferencia (papel de filtro, gel, membrana PVDF y papel de filtro), y se dejó deslizar hacia el tanque de transferencia BIO-RAD. La transferencia se realizó a 20 voltios, durante una noche (aproximadamente 10 h), a 4ºC, con agitación.

Después de la transferencia, se desmontó el tanque, la membrana se empapó en MeOH al 100% durante un minuto y después se dejó secar al aire. Para visualizar la eficacia de la transferencia, las membranas (después del rehumedecimiento en MeOH y después en agua) se incubaron con tinción de rojo de Ponceau-S al 1% y se aclararon en agua doblemente destilada. Después de explorar la imagen, se retiró el tinte en una solución de NaOH diluido (1 ml de NaOH saturado en 100 ml de agua doblemente destilada).

Las membranas se bloquearon después en NFDM al 3% (6 gramos de leche desnatada en polvo en 200 ml de TBS 1x [solución salina tamponada con TRIS, pH 7,4)] durante una hora. Después del bloqueo, las membranas se aclararon en dos lavados de TBS 1x, 200 ml cada uno.

Las membranas se incubaron después con la solución del anticuerpo primario: 4 ml de una dilución 1/200 de suero del paciente en NFDM al 1% en 1X TTBS (TBS con Tween 20 al 0,025%). Esta incubación duró una hora, a 30ºC, en vidrio con una rotación lenta del tubo o vaso de precipitados. Después de esta incubación, las membranas se lavaron tres veces en 200 ml de TTBS 1X.

La solución de anticuerpo secundario era 200 ml de una solución 1/3000 del conjugado de fosfatasa alcalina-anticuerpo de cabra anti-humano BIO-RAD, en NFDM al 1% en TTBS 1X. Esta incubación duró 1 h, a 30ºC, con agitación suave.

Después de esta incubación, las membranas se lavaron dos veces con 200 ml de TTBS 1X (5 min cada una), y una vez con 200 ml de TBS 1X.

Las bandas se visualizaron con el kit de sustrato AP BIO-RAD (200 ml en total), con agitación suave ocasional. Después de la visualización, las membranas se lavaron varias veces con agua doblemente destilada, seguido por un lavado con MeOH, después se secaron al aire y se fotografiaron o exploraron.

<110> Andrea Branch, Jose Walewski, y Dechard Stump

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<120> NUEVOS PÉPTIDOS DEL VIRUS DE LA HEPATITIS C Y USOS DE LOS MISMOS

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<130> RII-003PC

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<140>

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<141>

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<160> 8

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<170> PatentIn Ver. 2.0

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<210> 1

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<211> 595

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<212> ADN

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<213> virus de la hepatitis C

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<400> 1

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5

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<210> 2

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<211> 196

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<212> PRT

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<213> virus de la hepatitis C

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<400> 2

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6

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<210> 3

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Virus de la hepatitis C

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<220>

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<223> en el punto 8, X es N o K

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<220>

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<223> en el punto 9, X es V o E

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<220>

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<223> en el punto 13, X es A o V

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<400> 3

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\sa{Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Xaa Xaa Thr Pro Thr Xaa}

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<210> 4

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> virus de la hepatitis C

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<220>

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<223> en el punto 6, X es L o S

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<220>

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<223> en el punto 10, X es A o V

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<220>

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<223> en el punto 11, X es A o V

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<400> 4

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\sa{Ala Ala His Arg Thr Xaa Ser Ser Arg Xaa Xaa Val Arg}

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<210> 5

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> virus de la hepatitis C

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<400> 5

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\sa{Leu Asn Leu Lys Glu Lys Pro Asn Val Thr Pro Thr Ala Cys}

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<210> 6

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> virus de la hepatitis C

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<400> 6

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\sa{Ala Ala His Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Arg Cys}

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<210> 7

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> virus de la hepatitis C

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<400> 7

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\sa{Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp}

\sac{Thr Cys}

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<210> 8

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> virus de la hepatitis C

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<400> 8

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\sa{Gly Cys Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Arg}

\sac{Arg Ala Pro Ile}

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Claims

1. Un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos, donde a) el polipéptido aislado, sintético o recombinante es inmunorreactivo con un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico obtenida a partir de HCV y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, b) la secuencia de aminoácidos está codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 y donde el polipéptido se traduce en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, y c) donde el polipéptido no procede de la fase de lectura abierta de HCV convencional.

2. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de al menos 90% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos que se representa en la SEC ID Nº 1.

3. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos está codificada por una secuencia de nucleótidos que se muestra en la SEC ID Nº 1 traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional.

4. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de acuerdo con cualquier reivindicación anterior, que comprende una secuencia de aminoácidos con una longitud de al menos 8 a 100 aminoácidos.

5. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de acuerdo con cualquiera de la reivindicaciones anteriores, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos con una identidad de al menos 80-90% con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2 usando alineación FASTA.

6. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2 usando alineación FASTA.

7. El polipéptido de la reivindicación 6, en el que la secuencia de aminoácidos tiene una longitud de al menos 14 a al menos 30 aminoácidos.

8. Un polipéptido aislado, sintético o recombinante donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en: SEC ID Nº 3, SEC ID Nº 4, SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 6.

9. Un polipéptido aislado, sintético o recombinante de acuerdo con la reivindicación 8, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en: LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) y AAHRT(X4)SSR(X5)CX6)VR, donde X1 es N o K, X2 es V o E, X3 es A o V, X4 es L o

\hbox{S, X5 es A
o V y X6 es A  o V.}

10. Un polipéptido aislado, sintético o recombinante de acuerdo con la reivindicación 9, donde el polipéptido comprende al menos 8 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en: AAHRTSSSRAVVRC.

11. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones anteriores que es una proteína de fusión.

12. Una composición de vacuna para prevenir la infección por HCV en un sujeto, que comprende un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, en la que:

a) el polipéptido no se obtiene a partir de la poliproteína de HCV convencional; y

b) el polipéptido causa una respuesta inmune en el sujeto.

13. La composición de vacuna de la reivindicación 12, en la que el polipéptido es una proteína de fusión.

14. La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en la que la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de al menos 90% con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

15. La composición de vacuna de acuerdo con la reivindicación 12 ó 13, en la que la secuencia de nucleótidos es idéntica a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

16. Un anticuerpo que se une a un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, donde el polipéptido no procede de la poliproteína de HCV convencional.

17. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de al menos 90% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

18. El anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 16, en el que la secuencia de nucleótidos es idéntica a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

19. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 16-18, donde el anticuerpo es policlonal.

20. El anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 16-18, donde el anticuerpo es monoclonal.

21. Un kit para detectar una infección por HCV que comprende un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, en el que:

a) el polipéptido no procede de la poliproteína de HCV convencional y

b) el polipéptido es inmunorreactivo con un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico obtenida a partir de HCV y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV.

22. Un kit para detectar una infección por HCV que comprende un anticuerpo que se une específicamente a una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional.

23. Uso de un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, donde el polipéptido no procede de la poliproteína de HCV convencional, para la fabricación de un medicamento para prevenir la infección por HCV.

24. Un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura abierta +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, donde el polipéptido no procede de la poliproteína de HCV convencional, para uso en un método de diagnóstico de infección por HCV, donde el método comprende detectar la presencia o ausencia de anticuerpos en el fluido corporal de un sujeto que se unen al polipéptido, y donde la presencia de los anticuerpos indica una infección con HCV.

25. El polipéptido aislado, sintético o recombinante de la reivindicación 24, donde la presencia o ausencia del anticuerpo se detecta poniendo en contacto una muestra de ensayo que comprende fluido corporal de un sujeto con un polipéptido aislado, sintético o recombinante que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, donde el polipéptido no procede de la poliproteína de HCV convencional, en condiciones que permiten la unión del polipéptido al anticuerpo y donde la unión del polipéptido a un anticuerpo en la muestra indica la presencia de un polipéptido de fase de lectura alternativa de HCV.

26. Un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una molécula de ácido nucleico consistente en una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% idéntica con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, donde el polipéptido no procede de la poliproteína de HCV convencional, para uso en un método de diagnóstico de infección por HCV donde el método comprende detectar la presencia o ausencia del polipéptido en las células o fluido corporal de un sujeto, donde la presencia del polipéptido indica una infección con HCV.

27. El polipéptido de la reivindicación 26, en el que la presencia o ausencia del polipéptido se detecta poniendo en contacto una muestra de ensayo que comprende fluido corporal o células de un sujeto con un anticuerpo que se une específicamente a un polipéptido consistente en una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, donde el polipéptido no procede de la poliproteína HCV convencional, en condiciones que permiten la unión del polipéptido al anticuerpo y donde la unión del anticuerpo al polipéptido en la muestra indica la presencia de un polipéptido de fase de lectura alternativa de HCV.

28. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de al menos 90% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

29. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la secuencia de nucleótidos es idéntica a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

30. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el polipéptido tiene una longitud de al menos 8 aminoácidos a al menos 100 aminoácidos.

31. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el polipéptido tiene una longitud de al menos 14 aminoácidos a al menos 30 aminoácidos.

32. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que la secuencia de aminoácidos tiene una identidad de al menos el 90% con la longitud completa de la secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2, usando alineación FASTA.

33. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos que se muestra en la SEC ID Nº 2.

34. El uso de acuerdo con la reivindicación 23, en el que el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en: SEC ID Nº 3, SEQ ID Nº 4, SEC ID Nº 5 y SEC ID Nº 6.

35. Los polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24-26, donde el polipéptido comprende al menos 8 aminoácidos de una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en: LNLKEKP(X1)(X2)TPT(X3) y AAHRT(X4)SSR(X5)(X6)VR, donde X1 es N o K, X2 es V o E, X3 es A o V, X4 es L o S, X5 es A o V y X6 es A o V.

36. Los polipéptidos de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 24-26, donde el polipéptido comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo consistente en: LNLKEKPNVTPTAC y AAHRTSSSRAVVRC.

37. Un método para identificar un compuesto que interacciona con un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de nucleótidos con una identidad de al menos 80% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1 y traducida en una fase de lectura +1 con respecto a la fase de lectura de HCV convencional, donde el polipéptido no procede de la poliproteína de HCV convencional, que comprende:

poner en contacto el polipéptido con un compuesto en un sistema sin células en condiciones que permitan la interacción del compuesto con el polipéptido de modo que se forme un complejo;

separar los compuestos que no forman complejos con el polipéptido de los que forman complejos con el polipéptido; y

aislar e identificar los compuestos que forman complejos con el polipéptido para identificar de este modo un compuesto que interacciona con el polipéptido.

38. El método de la reivindicación 37, en el que la secuencia de nucleótidos tiene una identidad de al menos 90% con la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.

39. El método de la reivindicación 37, en el que la secuencia de nucleótidos es idéntica a la longitud completa de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº 1.