ES2202321T3 - Peptidos para uso en la vacunacion de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la inmunodeficiencia humana. - Google Patents

Peptidos para uso en la vacunacion de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la inmunodeficiencia humana.

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ES2202321T3 ES94912727T ES94912727T ES2202321T3 ES 2202321 T3 ES2202321 T3 ES 2202321T3 ES 94912727 T ES94912727 T ES 94912727T ES 94912727 T ES94912727 T ES 94912727T ES 2202321 T3 ES2202321 T3 ES 2202321T3
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Abstract

SE PRESENTAN NUEVOS PEPTIDOS QUE SE CORRESPONDEN CON EPITOPOS DE LA PROTEINA GP120 DEL HIV-1. ESTOS PEPTIDOS ANTIGENICOS INDUCEN CITOTOXICIDAD CELULAR DEPENDIENTE DE LOS ANTICUERPOS CONTRA EL HIV, Y DE ESTA FORMA SON UTILES EN LA INMUNIZACION CONTRA INFECCIONES POR HIV Y EN LA INDUCCION DE RESPUESTAS INMUNES REFORZADAS CONTRA EL HIV.

Description

Péptidos para uso en la vacunación de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la inmunodeficiencia humana.
Antecedentes de la invención
La presente invención se refiere a péptidos apropiados para utilizar en la vacunación contra el SIDA.
El virus de inmunodieficiencia humana (VIH) es responsable de la enfermedad conocida como síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Aunque se reconoció inicialmente en 1981, no se ha hallado una cura aún para esta enfermedad inevitablemente fatal. El VIH se propaga por una variedad de medios tales como el contacto sexual, la sangre o los productos sanguíneos infectados y en forma perinatal. Debido a la complejidad de la invección por VIH y la escasez de terapias efectivas, la erradicación del SIDA probablemente se dará previniendo nuevas infecciones más que curando a aquellas personas ya infectadas. Con este objetivo se ha destinado una gran cantidad de esfuerzos para desarrollar métodos para la detección y prevención de la infección. Se han desarrollado procedimientos diagnósticos para identificar a personas, sangre y otros productos biológicos infectados.
Como la mayoría de los virus, el VIH a menudo desencadena la producción de anticuerpos neutralizantes. A diferencia de muchos otros virus y otros agentes infecciosos para los cuales la infección conduce a la inmunidad protectora, sin embargo, los anticuerpos específicos mdel VIH son insuficientes para detener el avance de la enfermedad. Por lo tanto, en el caso del VIH, una vacuna que desarrolle la inmunidad de la infección natural podría resultar ineficaz. De hecho, las vacunas preparadas a partir de la proteína gp160 del VIH parecen aportar escasa inmunidad a la infección por VIH aunque producen anticuerpos neutralizantes. El fracaso en producir una vacuna anti-VIH efectiva ha llevado a la predicción de que no se dispondrá de una vacuna efectiva hasta fines de la década de 1990.
El genoma del VIH ha sido bien caracterizado. Sus aproximadamente 10kb codifican secuencias que contienen segmentos regulatorios para la replicación del VIH como así también los genes gag, pol y env que codifican las proteínas nucleares, la transcriptasa-proteasa-endonucleasa reversa y las glicoproteínas de envoltura interna y externa, respectivamente.
El gen env del VIH codifica la glicoproteína intracelular, gp160, que normalmente es procesada por ruptura proteolítica a la forma gp120, la glicoproteína viral externa y a gp41, la glicoproteína viral transmembrana. La gp120 permanece asociada con los viriones del VIH por obra de interacciones no covalentes con gp41. Estas interacciones no covalentes son débiles, y, en consecuencia, la mayor parte de gp120 se libera de las células y los viriones en forma soluble.
Estudios previos han demostrado que las proteínas codificadas por las regiones gag y especialmente las env del genoma del VIH-1 son inmunogénicas ya que se encuentran anticuerpos para los productos de los genes gag y env en el suero de los pacientes de SIDA y ARC ("Condición Relacionada con el SIDA") infectados con VIH.
Se ha demostrado anteriormente que algunos anticuerpos obtenidos a partir del suero de pacientes de SIDA y ARC, como así también de individuos asintomáticos infectados con el virus, son específicos para gp120 y gp160. Ocasionalmente estos anticuerpos son neutralizantes. Las glicoproteínas de envoltura son el antígeno de VIH-1 reconocido en forma más consistente por los anticuerpos en el suero de los pacientes de SIDA y ARC. Allan et al., "Major Glycoprotein Antigens that Induce Antibodies in Aids Patients are Encoded by HTLV-III", Science, 228:1091-1094 (1985); y Barin et al., "Virus Envelope Protein of HTLV-III Represents Major Target Antigen for Antibodies in AIDS Patients", Science, 228:1094-1096 (1985). Además, los anticuerpos en sueros de pacientes también reconocen epitopos de las proteínas virales nucleares codificados por el gen gag.
Se han preparado antígenos del VIH-1 inmunológicamente importantes para utilizar en diagnóstico y como composiciones de vacunas potenciales, por clonación de porciones del genoma del VIH-1 en varios sistemas de expresión tales como bacterias, levaduras o vacunas. Cabradilla et al., "Serodiagnosis of Antibodies to the Human AIDS Retrovirus With a Bacterially Synthesized env Polypeptide", Biotechnology, 4:128-133 (1986); y Chang et al., "Detection of Antibodies to Human T-Cell Lymphotropic Virus III (HTLV-III) With an Immunoassay Employing a Recombinant Escherichia coli - Derived Viral Antigenic Peptide", Biotechnology, 3:905-909 (1985). Los antígenos del
VIH-1 producidos por métodos de ADN recombinante, sin embargo, deben aún purificarse exhaustivamente para evitar reacciones adversas al vacunarse y reacciones falsas positivas en ensayos ELISA debido a cualquier reactividad de los anticuerpos frente a antígenos del sistema de expresión que pueden contaminar la preparación de antígeno de VIH-1. Asimismo, la desnaturalización de los antígenos de VIH-1 durante la purificación puede destruir una importante actividad de los antígenos. La preparación de proteínas a partir de virus intactos también puede dar lugar a contaminación por virus intactos.
Varias publicaciones han presentado datos que muestran la reactividad inmunológica de péptidos sintéticos seleccionados correspondientes a proteínas antigénicas del VIH-1. En un estudio, se sintetizó un péptido que tiene la secuencia de aminoácidos Tyr-Asp-Arg-Pro-Glu-Gly-Ile-Glu-Glu-Gly-Gly-Glu-Arg-Asp-Arg-Asp-Arg-Ser-Gly-Cys, que corresponde a los residuos de aminoácidos 735-752 del VIH-1. Kennedy et al., "Antiserum to a Synthetic Peptide Recognizes the HTLV-III Envelope Glycoprotein", Science, 231:1556-1559 (1986). Este péptido, derivado de una porción de gp41, se usó para inmunizar conejos en un intento por desarrollar una respuesta de anticuerpo neutralizante frente al VIH-1. Además, varios sueros de pacientes de SIDA que se sabía contenían anticuerpos anti-gp41 fueron débilmente reactivos con este péptido, indicando de este modo que este péptido contiene al menos un epitopo reconocido, en cierta medida, por los anticuerpos contra las gp160/gp41 nativas. Sin embargo, no se ha demostrado que este péptido desarrolle anticuerpos neutralizantes en mamíferos distintos de conejos ni se ha sugerido para su uso en una vacuna humana. En WO92/05800 se describen péptidos correspondientes a epitopos de la proteína gp120 del VIH-1 con coordenadas de aminoácidos 151-176, 192-218 y 205-230, para usar en la vacunación e inducción de anticuerpos neutralizantes contra el VIH. Otros péptidos correspondientes a regiones de la proteína gp120 del VIH para usar en la inducción de la activación de células T contra el VIH-1 se describen en WO92/21377. Se han descripto péptidos sintéticos con secuencias derivadas de la de la proteína gp120 del VIH-1 capaces de inducir la producción de anticuerpos neutralizantes en primates subhumanos, en Vahlne et al., "Immunizations of monkeys with synthetic peptides disclose conserved areas on. gp120 of human immunodeficiency virus type 1 associated with cross-neutralizing antibodies and T-cell recognition", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10744-10748 (1991).
En proteínas antigénicas del VIH-1 existen epitopos antigénicos reconocidos por anticuerpos, células T citotóxicas, células T ayudantes y también en la citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente (ADCC). Tradicionalmente, los anticuerpos neutralizantes se consideran esenciales en la prevención de la infección viral. Un agente neutralizante se une a una partícula infecciosa viral y en este proceso la infectividad de la partícula viral se destruye.
Los mecanismos celulares para la eliminación de células infectadas por virus involucran a células T citotóxicas, células T ayudantes y ADCC. Los epitopos involucrados en la neutralización y en los diversos mecanismos inmunes celulares no tienen que ser necesariamente iguales.
Se ha descubierto previamente que la ADCC es un mecanismo de defensa inmunológico que opera en infecciones virales. En esta reacción, anticuerpos antígeno-específicos se unirán a estructuras superficiales sobre la célula blanco e inducirán de este modo la destrucción mediada por el complejo de histocompatibilidad principal (MHC) - células efectoras CD16+ sin restricciones portadoras del receptor Fc. La citotoxicidad específica del VIH en la sangre periférica de la mayoría de los individuos seropositivos también es mediada por células efectoras de la ADCC no restringidas por MHC que están armadas con anticuerpos IgG específicos de env, Tyler et al., J. Immunol., 142:1177 (1989); Tanneau et al., J. Infect Dis., 162:837 (1990); Riviere et al., J. Virol., 63:2270 (1989). La actividad de ADCC específica del VIH se ha encontrado en la mayoría de los sueros de individuos infectados con VIH-1, Ljunggren et al., J. Immunol., 139:2263 (1987), Lyerly et al., AIDS Res. IFNB Hum. Retroviruses 3:409 (1987). Se han observado ADCC tanto tipo- como cepa-específica y los anticuerpos de algunos sueros mediaron la ADCC contra todas las cepas mientras que otros sueros carecían por completo de actividad de ADCC, Ljunggren et al., 63:3376 (1989). En la infección pediátrica por VIH-1, la presencia de anticuerpos mediadores de la ADCC se correlaciona significativamente con un estadío clínico mejor; Ljunggren et al., 161:198 (1990). La reacción de ADCC aparece tempranamente después de la infección por HIV y la ADCC ampliamente reactiva contra células blanco infectadas por el HIV-1_{HTLVIIIB} aparece entre 2 y 12 meses después de la seroconversión.
Las células activadas que expresan los antígenos de VIH sobre su superficie son posibles blancos para la ADCC. Se ha demostrado recientemente que los blastocitos T CD4+ autólogos infectados por VIH sirven como blancos para la lisis por ADCC, Tanneau et al., J. Infect Dis., 162:837 (1990). Las glicoproteínas de envoltura del VIH han sido propuestas como epitopos blanco en una cantidad de estudios. Evans et al., AIDS, 3:273 (1989) utilizaron Ig humana purificada por afinidad o sueros de conejo policlonales contra proteínas env del VIH-1 y encontraron anticuerpos mediadores de la ADCC contra gp120 y gp41. Koup et al., J Virol, 63:584 (1989), han utilizado vectores del virus vaccinia que expresan glicoproteínas de envoltura (gp160, gp120 y gp41) o proteínas gag (p55, p40, p24 y p17) en líneas celulares linfoblastoides. Se encontró que sólo el complejo de glicoproteínas de envoltura gp120/gp41 era el antígeno blanco para la ADCC específica de VIH, lo cual fue también confirmado en otro estudio utilizando un sistema similar, Tanneau et al., J. Infect Dis., 162:837 (1990).
Se han demostrado regiones más definidas en una cantidad de estudios. Un anticuerpo monoclonal murino dirigido a la región V3 (a.a. 309-318) de gp120 medió tanto la neutralización, con título 1:500, como la ADCC, con título 1:800, contra el HTLVIIIB. Broliden et al., J. Virol., 64:936 (1990). Asimismo, un anticuerpo humano quimérico de ratón dirigido contra la región V3 (a.a. 308-322) indujo la ADCC como así también la neutralización y la inhibición de la fusión, Liou et al., J. Immunol, 143:3967 (1989). Lyerly et al., AIDS Res IFNB humano de tipo salvaje Retroviruses, 3:409 (1987), han localizado un epitopo de ADCC en la parte C-terminal de gp120 (a.a. 467-511). Un resumen de epitopos conocidos del VIH-1, 2 y SIV para anticuerpos, ADCC, células T citotóxicas y células T ayudantes se ofrece en Nixon et al., "Cellular and humoral antigenic epitopes in HIV and SIV", Immunology 76:515-534 (1992).
Síntesis de la invención
De acuerdo con la presente invención, se presentan y describen péptidos novedosos correspondientes a epitopos de la proteína gp120 del VIH-1. cada péptido comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano, en donde el epitopo está ubicado dentro de la SEC. ID NO:41, y en donde el antisuero desarrollado en monos contra la secuencia epitópica tiene un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30.
En otra realización de la presente invención, cada péptido tiene una secuencia epitópica que posee una secuencia de aminoácidos que consiste esencialmente en la SEC. ID NO:41.
De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, los péptidos novedosos se utilizan para formular una composición para vacuna. La composición para vacuna comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano, en donde el epitopo está ubicado dentro de la SEC. ID NO:41, y en donde el antisuero desarrollado en monos contra la secuencia epitópica tiene un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30, en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune en un mamífero, junto con un vehículo aceptable para uso farmacéutico. En una realización preferida, la composición para vacuna comprende además un adyuvante tal como el adyuvante completo de Freund, el adyuvante incompleto de Freund, muramil dipéptido, levamisol, isoprinosina o tuftsina.
De acuerdo con aun otro aspecto de la presente invención, se utilizan al menos dos péptidos en la composición para vacuna, en donde cada péptido comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano, en donde el epitope está ubicado dentro de la SEC. ID NO:1, SEC. ID NO:5, SEC. ID NO:6, SEC. ID NO:7, SEC. ID NO:8, SEC. ID NO:12, SEC. ID NO:14, SEC. ID NO:19, SEC. ID NO:20, SEC. ID NO:21, SEC. ID NO:36 y SEC. ID NO:41, y en donde el antisuero desarrollado en monos contra la secuencia epitópica tiene un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30. Los péptidos están presentes en una cantidad efectiva como para inducir una respuesta inmune en un mamífero, y se combinan con un vehículo aceptable para uso farmacéutico.
En una realización preferida, esta composición para vacuna comprende además un adyuvante, tal como el adyuvante completo de Freund, el adyuvante incompleto de Freund, muramil dipéptido, levamisol, isoprinosina y tuftsina.
La presente invención es útil para ejecutar un método de protección de un mamífero de la infección con el virus de inmunodeficiencia humano, que comprende administrar al mamífero una de las composiciones de vacuna descriptas en la presente. La administración puede ser por inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal.
La presente invención también es útil para ejecutar un método para inducir anticuerpos anti-VIH neutralizantes en un mamífero, que comprende el paso de administrar una cantidad efectiva para inducir anticuerpos de una composición que comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano, en donde el epitopo se ubica dentro de la SEC. ID NO:41, y en donde el antisuero desarrollado en monos contra la secuencia epitópica tiene un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30, en una cantidad efectiva para inducir una respuesta inmune en un mamífero, junto con un vehículo aceptable para uso farmacéutico.
En otra realización de la invención, la composición para vacuna comprende al menos dos péptidos, en donde cada péptido comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano, en donde el epitopo está ubicado dentro de la SEC. ID NO:1, SEC. ID NO:5, SEC. ID NO:6, SEC. ID NO:7, SEC. ID NO:8, SEC. ID NO:12, SEC. ID NO:14, SEC. ID NO:19, SEC. ID NO:20, SEC. ID NO:21, SEC. ID NO:36 o SEC. ID NO:41, y en donde el antisuero desarrollado en monos contra la secuencia epitópica tiene un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30. Los péptidos están presentes en una cantidad efectiva como para inducir una respuesta inmune en un mamífero, y se combinan con un vehículo aceptable para uso farmacéutico.
Descripción detallada de la invención
La presente invención provee péptidos que se ha descubierto desarrollan la producción de anticuerpos neutralizantes del VIH por parte de sujetos primates. Los péptidos corresponden a regiones de la proteína gp120 con coordenadas definidas por Kennedy et al. Los péptidos de la presente invención se denominan gp120-12 (coordenadas de aminoácidos 159-183), gp120-15 (coordenadas de aminoácidos 200- 225), gp120-16 (coordenadas de aminoácidos 213-237) y gp120-19 (coordenadas de aminoácidos 255-276). Aunque el péptido gp120-19 es similar a un péptido que ha sido descripto (Ho et al., Science, 239:1021-1023 (1988)), se ha descubierto ahora que el gp120-19desarrolla anticuerpos neutralizantes enprimates. Los péptidos de la presente invención pueden usarse como inmunógenos en composiciones para vacuna y para desarrollar la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales; particularmente importantes son los anticuerpos neutralizantes del VIH.
Las proteínas contienen una cantidad de determinantes antigénicos o epitopos, que son las regiones de las proteínas que comprenden los sitios de reconocimiento y unión para anticuerpos específicos. En general, las proteínas contienen de 5 a 10 epitopos, cada uno de los cuales contiene una secuencia de 6 a 8 aminoácidos. Los epitopos pueden ser tanto continuos, en los cuales los 6 a 8 aminoácidos están presentes en secuencia lineal, o discontinuos, en los cuales los aminoácidos que forman el epitopo se aproximan por el plegamiento tridimensional de la proteína. Aunque un epitopo está constituido sólo por relativamente pocos aminoácidos, su reactividad con un anticuerpo puede verse influida por los aminoácidos de la proteína que rodean al epitopo.
Los estudios que apuntan a mapear sitios antigénicos o epitopos de proteínas también han sido auxiliados por el uso de péptidos sintéticos correspondientes a diversas regiones de las proteínas de interés. Lerner et al., en The Biology of Immunological Disease: A Hospital Practice Book (Dixon y Fisher, eds.) páginas 331-338 (1983); y Lerner, Adv. Immunol., 36:1 (1984). Además de su utilidad en estudios de mapeo de epitopos, los péptidos sintéticos, si abarcan determinantes antigénicos principales de una proteína, tienen potencial como vacunas y reactivos de diagnóstico. Van Regenmortel, Ann. Inst. Pasteur/Virol 137E:497-528 (1986); y Van Regenmortel, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Buroden and Van Knippenburg editores, Vol. 19, synthetic Peptides as Antigens, Elsevier ISBN 0-444-80974-0 (1988).
Los péptidos sintéticos tienen varias ventajas con respecto a la producción y reactividad de los anticuerpos específicos. La secuencia exacta del péptido sintetizado puede seleccionarse de la secuencia de aminoácidos de la proteína determinada mediante secuenciación de la proteína o determinarse la secuencia de aminoácidos prevista a partir de la secuencia del ADN que codifica la proteína. El uso de péptidos sintéticos específicos elimina la necesidad de la proteína de longitud total en la vacunación y en la producción o el ensayo de anticuerpos. Además, las técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida de Merrifield y colaboradores permiten producir químicamente cantidades esencialmente ilimitadas del péptido sintetizado de interés. Erickson y Merrifield in The Proteins, 3ra. Edición, Vol. 2, Academic Press, New York, Capítulo 3 (1976). La disponibilidad de sintetizadores de péptidos automatizados ha hecho progresar aún más tales técnicas.
Aunque puede usarse una variedad de criterios para predecir las regiones antigénicas de las proteínas, los péptidos correspondientes a tales regiones pueden no siempre ser útiles como vacunas. Por ejemplo, la antigenicidad puede perderse pues el péptido no se encuentra en la orientación espacial apropiada para ser reconocido por los anticuerpos que reaccionan con la proteína. También se ha descubierto que ciertos péptidos derivados de retrovirus tipo C y del VIH actúan como agentes inmunosupresores tanto como el propio VIH. Cianciolo et al., J. Immunol., 124:2900-2905 (1980); y Cianciolo et al., Science, 230:453-455 (1985). Péptidos como éstos, que tienen un efecto deletéreo sobre el paciente, no serían adecuados para usar como vacunas.
Además, como es particularmente evidente con el VIH-1 y el VIH-2, existe una significativa variabilidad genética dentro de estos dos grupos de virus que conduce a muchos serotipos, o aislados, de los virus. Esto ha impuesto una limitación significativa sobre la elección de una región de una proteína de la cual derivar un péptido para utilizar en formulación de inmunógenos. Sin embargo, se ha descubierto que ciertas porciones inmunodominantes de las proteínas del VIH-1 y el VIH-2 son relativamente invariantes. Los péptidos sintéticos también pueden ser claves para las vacunas virales en el sentido que pueden inducir una respuesta inmune contra secuencias de tipo común normalmente no inmunogénicas en la molécula nativa. Estos epitopos de otro modo silenciosos pueden ser de especificidad ampliamente protectora. Steward et al., Immunol. Today, 8:51-58 (1987). Se han formulado varias vacunas experimentales con el objeto de prevenir la infección en aquellas personas con posibilidad de estar expuestas al virus. Berman et al., "Protection of Chimpanzees from Infection by HIV-2 After Vaccination With Recombinant Glycoprotein gp120 but Not gp160", Nature, 345:622-625 (1990). Péptidos sintéticos correspondientes a regiones de proteínas inmunológicamente importantes del VIH han encontrado ahora uso inmediato en métodos de diagnóstico para la detección del VIH, como potenciales vacunas para el VIH y para la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales.
Se han descubierto y definido por parte de diversos investigadores una cantidad de epitopos de neutralización sobre gp120; para una revisión, véase Bolognesi, AIDS (1989) 3 (supl. 1):S111-s118. En esta revisión, Bolognesi se refiere a cuatro epitopos de neutralización diferentes con las coordenadas de aminoácidos siguientes: 254- 274, 303-337, 458-484 y 491-523. el péptido con coordenadas de aminoácidos 254-274 se utilizó para inmunizar a conejos y se descubrió que el antisuero resultante neutralizaba al VIH-1 como se describió anteriormente. Ho et al.
Los péptidos abarcados por la invención comprenden secuencias de aminoácidos que contienen cada una al menos un epitopo continuo (lineal) que desarrolla la producción de anticuerpos específicos del VIH en el huésped inmunizado.
La invención abarca de este modo a péptidos inmunogénicos correspondientes a regiones de la proteína gp120 del VIH codificada por el gen de envoltura del HTLV III-B de VIH-1 descripto por Muesing et al., "Nucleic Acid Structure and Expression of the Human AIDS/Lymphadenopathy retrovirus", Nature, 313:450-458 (1985). La secuencia nucleotídica se da en la Salida 63 del Genbank bajo el nombre HIVPV22. La invención abarca además a variantes funcionalmente equivalentes de los péptidos que no afectan significativamente las propiedades inmunogénicas de los péptidos. Por ejemplo, la sustitución conservartiva de residuos de aminoácidos, uno o varios residuos de aminoácidos por análogos de aminoácidos, están dentro del alcance de la invención.
Los homólogos son péptidos que tienen residuos de aminoácidos sustituidos en forma conservativa. Los aminoácidos que pueden sustituirse mutuamente en forma conservativa incluyen, pero sin ser limitativos, a: glicina/alanina; valina/isoleucina/leucina; asparagina/glutamina; ácido aspártico/ácido glutámico; serina/treonina; lisina/arginina; y fenilalanina/tirosina. Los péptidos homólogos se consideran dentro del alcance de la invención si son reconocidos por anticuerpos que reconocen los péptidos denominados gp120-12, gp120-15, gp120-16 y gp120-19, cuyas secuencias se muestran más adelante. Además, todos los péptidos homólogos correspondientes a los péptidos de la presente invención pero derivados de diferentes aislados de VIH también están comprendidos por el alcance de esta invención.
Los análogos se definen como péptidos que son funcionalmente equivalentes a los péptidos de la presente invención pero que contienen ciertos residuos de aminoácidos no naturales o modificados. Además, los polímeros de uno o más de los péptidos y los análogos u homólogos de péptidos están dentro del alcance de la invención. También dentro del alcance de esta invención se encuentran péptidos de menos residuos de aminoácidos que gp120-12, gp120-15, gp120-16 y gp120-19, respectivamente, pero que abarcan a uno o más epitopos presentes en cualquiera de los péptidos y retienen de este modo las propiedades inmunogénicas del péptido base. Se describen más adelante técnicas analíticas para determinar la medida en que los péptidos en cuestión pueden acortarse en cada extremo, reteniendo al mismo tiempo el epitopo inmunogénico de la secuencia más larga.
El agregado de aminoácidos a cada extremo de los péptidos específicamente descriptos en la presente también se considera dentro del alcance de la presente invención, en tanto tal agregado no afecte en forma significativamente deletérea las propiedades inmunológicas de ese péptido. Pruebas de rutina pueden determinar si las propiedades inmunológicas deseadas son retenidas por dichos péptidos suplementados o truncados. Si se agregan aminoácidos, se prefiere que los péptidos resultantes sean aún relativamente cortos; por ejemplo, no más de aproximadamente 50 aminoácidos de largo, con preferencia no más de aproximadamente 40 ó 45 aminoácidos de largo, y por sobre todo con mayor preferencia no más de aproximadamente, 25, 30 ó 35 aminoácidos de longitud.
Los péptidos de la presente invención se sintetizaron mediante técnicas de síntesis de péptidos en fase sólida. Barany y Merrifield, The Peptides: Analysis, synthesis, Biology, Vol. 1, Gross y Meinenhofer, eds., Academic Press, New York, Capítulo 1 (1980). La síntesis también permite que uno o más aminoácidos que no corresponden a la secuencia original de la proteína se agreguen al extremo amino o carboxilo terminal del péptido. Tales aminoácidos adicionales son útiles para acoplar los péptidos a otro péptido, a una proteína transportadora voluminosa o a un soporte sólido. Aminoácidos que son útiles para estos fines incluyen, pero sin ser limitativos, a: tirosina, lisina, ácido glutámico, ácido aspártico, cisteína y derivados de los mismos. Pueden utilizarse técnicas de modificación de proteínas adicionales, por ejemplo la NH_{2}-acetilación o la amidación del COOH terminal, para conferir medios adicionales para acoplar los péptidos a otra proteína o molécula proteica o a un soporte. Son bien conocidos en el arte procedimientos para acoplar péptidos entre sí, proteínas transportadoras y soportes sólidos. Los péptidos que contienen los residuos de aminoácidos adicionales mencionados anteriormente, ya sea en el extremo carboxilo o amino terminal, no acoplados o acoplados a un soporte transportador o sólido están, en consecuencia, dentro del alcance de la invención. La referencia a los péptidos de la presente invención abarca todas las realizaciones discutidas en la presente.
Un método alternativo de producción de vacunas es utilizar técnicas de biología molecular para producir una proteína de fusión que contenga uno o más de los péptidos de la presente invención y una proteína altamente inmunogénica. Por ejemplo, se ha demostrado que proteínas de fusión que contienen el antígeno de interés y la subunidad B de la toxina del cólera inducen una respuesta inmune al antígeno de interés. Ver Sánchez et al., "Recombinant System fórmula Overexpression of Cholera Toxin B Subunit In Vibrio cholerae as a Basis for Vaccine Development", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:481-485 (1989). Dichos péptidos quiméricos pueden administrarse por vía oral. Se presentan más abajo secuencias de péptidos que pueden utilizarse de acuerdo con la presente invención. Los residuos de aminoácidos derivan de la secuencia nucleotídica descripta previamente por Muesing et al., "Nucleic Acid Structure and Express of the Human AIDS/Lymphadenopathy Retrovirus", Nature, 313:450-458 (1985). Se prefiere que los péptidos posean un grupo amida en su extremo carboxilo terminal más que un grupo carboxilo. El extremo carboxilo terminal también puede ser un grupo carboxilo como así también un resto descripto más abajo.
Gp120-12
X-Gly-Glu-Ile-Lys-Asn-Cys-Ser-Phe-Asn-Ile-Ser-Thr-Ser-Ile-Arg-Gly-Lys-Val-Gln- Lys-Glu-Tyr-Ala-Phe-Phe-Y-Z
Gp120-15
X-Leu-Thr-Ser-Cys-Asn-Thr-Ser-Val-Ile-Thr-Gln-Ala-Cys-Pro-Lys-Val-Ser-Phe-Glu- Pro-Ile-Pro-Ile-His-Tyr-Cys-Y-Z
Gp120-16
X-Pro-Lys-Val-Ser-Glu-Pro-Ile-Pro-Ile-His-Tyr-Cys-Ala-Pro-Ala-Gly-Phe-Ala-Ile- Leu-Lys-Cys-Asn-Asn-Y-Z
Gp120-19
X-Yhr-His-Gly-Ile-Arg-Pro-Val-Val-Ser-Thr-Gln-Leu-Leu-Leu-Asn-Gly-Ser-Leu-Ala- Glu-Glu-Y-Z
en donde X es o un átomo de hidrógeno del grupo NH_{2} terminal del péptido o un aminoácido adicional que se selecciona para facilitar el acoplamiento del péptido a un transportador; Y está ausente o es Cys; y Z es el grupo carboxilo del aminoácido carboxilo terminal o un grupo amida. Las abreviaturas de los aminoácidos se definen en la Tabla 2.
Los péptidos son útiles como vacunas para proteger contra una futura infección por VIH o para elevar la respuesta inmune al VIH en sujetos ya infectados por el VIH. Aunque cualquier primate o con preferencia un sujeto humano podrían vacunarse con los péptidos, los sujetos más indicados son personas en riesgo de contraer una infección por VIH. Dichos sujetos incluyen, aunque sin ser limitativos, a homosexuales, prostitutas, usuarios de drogas intravenosas y aquellos que se encuentran en las profesiones médicas que tienen contacto con pacientes o muestras biológicas. La invención también proporciona anticuerpos monoclonales y policlonales que reconocen específicamente a los péptidos. La invención provee además anticuerpos que neutralizan al VIH.
En la realización preferida de la presente invención, los péptidos se formulan en composiciones para utilizar cono inmunógenos. Estos inmunógenos pueden usarse como vacunas en mamíferos que incluyen a los primates y humanos o para desarrollar la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales en animales. Para la formulación de tales composiciones, una cantidad efectiva como inmunógeno de al menos uno de los péptidos se mezcla con un vehículo fisiológicamente aceptable adecuado para la administración a mamíferos incluyendo a humanos. Los péptidos pueden estar unidos covalentemente entre sí, a otros péptidos, a una proteína transportadora o a otros transportadores, incorporados a liposomas u otras vesículas semejantes y/o mezclarse con un adyuvante o adsorbente como se conoce en el arte de las vacunas. Por ejemplo, el péptido o péptidos pueden mezclarse con complejos de inmunoestimulación según describen Takahashi et al., "Induction of CD8+ Cytotoxic T Cells by Immunization With Purified HIV-1 Envelope Protein and ISCOMS", Nature, 344:873-875 (1990). Como alternativa, los péptido están desacoplados y se mezclan meramente con un vehículo fisiológicamente aceptable tal como una solución salina normal o un compuesto buffer adecuado para la administración a mamíferos, incluidos los humanos.
La respuesta inmune a los péptidos de la presente invención puede reforzarse mediante una amplia gama de agentes. La lista de adyuvantes disponibles es larga y crece rápidamente. En una realización preferida, el adyuvante completo de Freund se utiliza para incrementar la respuesta inmune del mamífero que recibe el péptido como vacuna.
Como con todas las composiciones para desarrollar anticuerpos, las cantidades efectivas como inmunógenos de los péptidos de la invención deben determinarse en forma empírica. Los factores a considerar incluyen la inmunogenicidad del péptido nativo, si el péptido se complejará o no con o se unirá o no covalentemente a un adyuvante o proteína transportadora u otro transportador y la vía de administración para la composición, es decir intravenosa, intramuscular, subcutánea, etc., y el número de dosis de inmunización a administrar. Dichos factores se conocen en el arte de la vacunación y está dentro de la capacidad de los inmunólogos realizar tales determinaciones sin experimentación indebida.
La invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos específicos que no pretenden de ningún modo limitar el alcance de la invención.
Ejemplo 1 Síntesis de péptidos
Se utilizó un sintetizador de péptidos Modelo 430 A de Applied Biosystems para la síntesis de los péptidos de la invención. Cada síntesis utilizó una resina soporte de p-metilbencil-hidrilamina de fase sólida (Peptides International, Louisville, KY). Los péptidos se sintetizaron de acuerdo con el Manual de Usuarios para el Modelo 430 A de Applied Biosystems, 1986.
Todos los aminoácidos para usar en la síntesis contenían grupos terbutilcarbonilo (t-Boc) que protegían al grupo \alpha-NH2 y se obtuvieron de Vovabiochem AG, Suiza. Los aminoácidos con grupos reactivos en la cadena lateral contenían grupos protectores adicionales para evitar reacciones no deseadas e indeseables en la cadena lateral. Los aminoácidos protegidos individuales usados en la síntesis de todos los péptidos se exponen en la Tabla 1.
TABLA 1 Aminoácidos usados en la síntesis de péptidos
Boc-Ala-OH
Boc-Arg- (Tos)-OH
Boc-Asn-OH
Boc-Asp (Obzl)-OH
Boc-Cys (Pmeobzl)-OH
Boc-Glu (Obzl)-OH
Boc-Gln-OH
Boc-Gly-OH
Boc-His-(Tos)-OH
Boc-Ile-OH ½ H_{2}O
Boc-Leu-OH H_{2}O
Boc-Lys (2-CI-Z)-OH (crist.)
Boc-Met-OH
Boc-Phe-OH
Boc-Pro-OH
Boc-Ser (Bzl)-OH DCHA
Boc-Thr (Bzl)-OH
Boc-Trp (Formil)-OH
Boc-Tyr (2-Br-Z)-OH
Boc-Val-OH
TABLA 1 (contiuación)
Tos: Tosilo o ácido p-toluen sulfónico
Obzl = Benciloxi
Pmeobzl = p-metilbenciloxi
2-Cl-Z = Carbobenzoxi cloruro
2-Br-Z = Carbobenzoxi bromuro
Después de completada una síntesis particular, los grupos protectores se eliminaron del péptido sintetizado y el péptido se escindió de la resina soporte sólida por tratamiento con Ácido Trifluorometan Sulfónico (TFMSA) de acuerdo con el método descripto por Bergot et al., "Utility of Trifluoromethane Sulfonic Acid as a Cleavage Reagent in Solid Phase Peptide Synthesis", Boletín del Usuario de Applied Biosystems, Sintetizador de Péptidos, Edición No. 16, Sept. 2, 1986. El siguiente es el protocolo detallado utilizado.
1. Para 1 gramo de péptido-resina, se agregaron 3 ml de tio-anisol/1,2-etanoditiol (2:1) como agente de captación y la mezcla se incubó con agitación continua durante 10 minutos a temperatura ambiente.
2. Se agregaron 10 ml de ácido trifluoroacético y se agitó continuamente durante 10 minutos a temperatura ambiente.
3. Se agregó 1 ml de TFMSA gota a gota con agitación forzada y se dejó reaccionar durante 25 minutos a temperatura ambiente.
4. A continuación de la ruptura, los péptidos se precipitaron y lavaron con éter anhidro.
5. Los péptidos precipitados y lavados se disolvieron en un pequeño volumen de TFA (aproximadamente 5 ml).
6. Los péptidos disueltos se precipitaron nuevamente y se lavaron como se indicó anteriormente en el paso 4 y el precipitado se secó bajo corriente de N_{2}.
Antes de utilizarse en ensayos específicos, los péptidos pueden purificarse adicionalmente, si se desea, por medio de cromatografía líquida en fase reversa de alta resolución (HPLC). Una columna particularmente adecuada para tal purificación es la columna de C18 de fase reversa Vydak™ que utiliza un gradiente de agua (TFA) - acetonitrilo (TFA) para eluir los péptidos. Se sintetizaron cuarenta péptidos que cubren la secuencia entera de la gp120 del VIH-1, que tienen las secuencias de aminoácidos que se muestran en la Tabla 2. También se sintetizó un péptido truncado gp120-16/B con las coordenadas de aminoácidos 213-224.
(Tabla pasa a página siguiente)
1
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Ejemplo 2 Reservas de células y virus
Todos los ensayos de neutralización se realizaron utilizando células H-9 y virus HTLV-1118 (originados en R.C. Gallo y provistos por el Dr. William Hall, North Shore Hospital, Manhasset, New York). Las células H-9 (denominadas (H9 NY) se mantuvieron en Medio RPMI (Gibco) suplementado con suero fetal de ternero (FCS) 20%, penicilina/estreptomicina (PEN/STREP, 50 \mug/ml de cada una y sin ningún fungicida). Las células se subcultivaron a una dilución de 1:3 cada 4 días.
\newpage
Las células se separaron por raspado de las placas y se peletizaron por centrifugación a 325 x g. Las células peletizadas se resuspendieron en 1 ml de virus de reserva previamente diluído 1/10 y se dejaron adsorbiendo durante 60 minutos a 37ºC con agitación frecuente. Después de la adsorción de los virus, las células se re-centrifugaron y resuspendieron en 10 ml de RPMI con 20% de FCS y polibreno (2 \mug/ml) (dando una concentración final de 5x10^{5} células/ml) y se incubaron a 37ºC en CO_{2} 5%.
Se demostró que las células infectadas eran detectables a los 4-5 días post-infección (p.i.) monitoreando la formación de sincicios, células positivas en inmunofluorescencia y producción de p-24 (ensayada mediante la prueba de antígeno p-24 de Abbott). El pico de producción de VIH se observó 10-15 días p.i., momento en el cual se recolectó el virus. Después de una centrifugación a baja velocidad para eliminar detritos, los sobrenadantes que contenían el virus recolectado de las células infectadas se congeló en reservas a -90ºC. Una reserva de virus con título de punto final de dosis infectiva de cultivo tisular del 50% (TCID_{50}) de 40.000 se utilizó a lo largo de los estudios (denominada
NT3-NT19).
Ejemplo 3 Preparación de péptidos para inmunización
Péptidos de acuerdo con la presente invención se acoplaron covalentemente a ovoalbúmina de grado V (Sigma, St. Louis, MO, USA) en una relación molar de aproximadamente 10:1 (péptido:ovoalbúmina) utilizando 3-(2-piridilditio)propionato de N-succinimidilo (SPDP) (Pharmacia, Uppsala, Suecia) como acoplante bifuncional de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Pharmacia), es decir, resumidamente, como sigue:
Se disolvió ovoalbúmina en buffer de acoplamiento (NaH_{2}PO_{4}, pH 8,5). La ovoalbúmina disuelta se corrió luego a través de una columna de Sephadex G-25M (Pharmacia, Suecia), usando el mismo buffer. La concentración de proteína se midió a 280 nm y se determinó la recuperación. Se disolvió SPDP en etanol 99,5% hasta una concentración final de 40 mM. Luego se agregó SPDP gota a gota a la solución de ovoalbúmina con agitación. La mezcla SPDP-ovoalbúmina se dejó luego a temperatura ambiente durante aproximadamente 30 minutos. El conjugado ovoalbúmina-SPDP se separó del SPDP no conjugado corriendo la mezcla a través de una columna de Sephadex G-25M, utilizando agua como eluyente. El grado de sustitución para el conjugado ovoalbúmina-SPDP se determinó después de diluir 50 \mul de conjugado en 2 ml de agua, midiendo el conjugado diluido a 280 nm y el conjugado diluido más 100 \mul de ditiotreitol (DTT) (Sigma) a 343 nm, con el fin de determinar la cantidad a agregar a la solución de péptido.
Finalmente, se disolvió el péptido sintético a acoplar al conjugado ovoalbúmina-SPDP en ácido acético 10% hasta una concentración final de 1 mg/ml y se agregó una cantidad adecuada de conjugado ovoalbúmina-SPDP (determinada por el grado de sustitución según lo indicado anteriormente) y se dejó en reposo toda la noche a temperatura ambiente.
Ejemplo 4 Protocolos de inmunización
Se utilizó la especie Maccaca fascicularis para generar anticuerpos. Antes de la inyección inicial de péptido, se extrajo una muestra de sangre de los monos. Esta muestra inicial de sangre se denomina "preinmune" (Tablas 3-6) y se utiliza como control interno y se analiza simultáneamente con el respectivo inmunosuero.
Se inyectó a los monos 100 \mug de péptido-SPDP-ovoalbúmina suspendido en solución salina bufferizada con fosfato (PBS). Los monos fueron inmunizados en forma intramuscular tres veces, cada tres semanas. Como adyuvante, se utilizó 0,5 ml de adyuvante completo de Freund para todas las inmunizaciones. Dos semanas después de la inmunización final, se extrajo sangre a los monos y los sueros preinmune e hiperinmune se sometieron a ensayos de neutralización según se describe en el Ejemplo 5.
Ejemplo 5 Ensayo de neutralización del VIH-1
Los sueros que contenían anticuerpos que neutralizan la infectividad del HTLV 11-B se detectaron por su capacidad para prevenir la formación del sincicio de VIH-1, la producción del antígeno p-24 y la cantidad disminuida de células infectadas según se determina con marcadores de inmunofluorescencia, comparado con infecciones control carentes de antisueros con péptidos específicos. El virus de reserva, descripto en el Ejemplo 2, se diluyó hasta una TCID_{50} de 100 y se mezcló con diluciones uno en cuatro (1/5, 1/20 y 1/80) de inmunosueros con complemento inactivado obtenidos de los monos inmunizados según se describe en el Ejemplo 4. Como control positivo, se incluyó en todos los experimentos un suero hiperinmune de cobayo (denominado MSV) con título neutralizante de VIH conocido de 1/40 - 1/160 (provisto gentilmente por el Prof. B. Morein, Departamento de Virología Veterinaria, BMC, Uppsala, Suecia). Después de la incubación durante 60 minutos a 37ºC ó 16 horas a 4ºC, la mezcla suero-virus se agregó a 1x10^{6} células H-9 y se incubó por otros 60 minutos a 37ºC. A continuación de la incubación, las células se lavaron una vez y se colocaron en placas multiplato de 24 pocillos con 2 ml de medio de crecimiento (RPMI, 10%, FCS, 2 \mug de polibreno/ml) por pocillo.
Las células se examinaron al microscopio (aumento de 200x) para determinar la presencia de sincicios los días 5-12 p.i. Se ensayaron los sobrenadantes de las células infectadas para determinar la presencia de antígeno p-24 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Abbott ag test HIVAG-1®, Inmunoensayo Enzimático para la Detección de Antígeno(s) del Virus de Inmunodeficiencia Humano Tipo I (VIH-1) en Suero o Plasma Humano) en diluciones uno en diez (1/10 - 1/1.000) 10 días p.i. Los resultados se presentan como valores de absorbancia a 454 nm, indicando los valores más altos de absorbancia mayor concentración de proteína y, por ende, infección por VIH. Las diluciones seriadas de los sobrenadantes se realizaron con el fin de detectar concentraciones de p-24 en el rango más preciso (<2,0 unidades de absorbancia).
El número de células infectadas se determinó al final del experimento (habitualmente el día 15 p.i.) por fijación con acetona de las células en portaobjetos adaptados para inmunofluorescencia (IF). Se utilizó un ensayo de IF indirecto de acuerdo con los procedimientos descriptos en Jeansson et al., "Elimination of Mycoplasmas from Cell Cultures Utilizing Hyperimmune Sera", Ex. Cell. Res., 1612:181-188 (1985), con sueros hiperinmunes a dilución 1/400 de individuos infectados con VIH y un anticuerpo IgG antihumano marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Bio-Merieux, Francia) diluido 1/100. Las Tablas 3-6 muestran los resultados obtenidos del screening de sueros hiperinmunes de monos inmunizados con los péptidos 1-40.
En las Tablas 3(A-D)-6 se analizó el contenido de antígeno p24 de los sobrenadantes mediante ELISA, según se describió anteriormente. La proporción relativa de células con antígeno positivo se indica como células AG POS en las cuales los porcentajes se representan mediante: - = 0%, + = >0-2%, ++ = 3-10% y +++ = 11- 20%, en donde el intervalo de porcentaje indica el número de células con antígeno positivo.
La Tabla 3A (HIVNT3P1.XLS) muestra los resultados obtenidos con sueros derivados de monos inmunizados con los péptidos gp120-1 - gp120-10. Las células utilizadas fueron H9 NY y el virus utilizado fue HTLV-IIIB, Lote 18, descripto en el Ejemplo 2. El protocolo de incubación fue (virus más suero) incubación a 37ºC durante una hora.
La Tabla 3B (HIVNT4P1.XLS) muestra los resultados obtenidos con sueros derivados de monos inmunizados con los péptidos gp120-11 - gp120-20. Las células utilizadas fueron H9 NY y el virus utilizado fue HTLV-IIIB, Lote 18, descripto en el Ejemplo 2. El protocolo de incubación fue (virus más suero) incubación a 37ºC durante una hora.
La Tabla 3C (HIVNT5P1.XLS) muestra los resultados obtenidos con sueros derivados de monos inmunizados con los péptidos gp120-21 - gp120-30. Las células utilizadas fueron H9 NY y el virus utilizado fue HTLV-IIIB, Lote 18, descripto en el Ejemplo 2. El protocolo de incubación fue (virus más suero) incubación a 37ºC durante una hora.
La Tabla 3D (HIVNT6P1.XLS) muestra los resultados obtenidos con sueros derivados de monos inmunizados con los péptidos gp120-31 - gp120-40. Las células utilizadas fueron H9 NY y el virus utilizado fue HTLV-IIIB, Lote 18, descripto en el Ejemplo 2. El protocolo de incubación fue (virus más suero) incubación a 37ºC durante una hora.
La Tabla 4 (HIVTAB4.XLS) muestra los resultados del primer re-ensayo de anticuerpos neutralizantes putativos determinados por el primer ensayo (Tablas 3A-D). En cada ensayo, el virus utilizado fue HTLV-IIIB, Lote 18, y las células utilizadas fueron H9 NY. Los resultados del Primer Re-ensayo en las filas 1-19 son los resultados del ensayo de neutralización número 5. El protocolo de incubación fue la incubación a 37ºC durante una hora. Los resultados del Primer Re-ensayo en las filas 20-32 son los resultados del ensayo de neutralización número 7. El protocolo de incubación fue la incubación a 37ºC durante una hora.
La Tabla 5 (HIVTAB5.XLS) muestra los resultados del segundo, tercero y cuarto re-ensayos de los péptidos positivos. En cada ensayo, el virus utilizado fue HTLV-IIIB, Lote 18, y las células utilizadas fueron H9 NY. Los resultados del Segundo Re- ensayo en las filas 1-4 son los resultados del ensayo de neutralización número 7. El protocolo de incubación fue la incubación a 37ºC durante una hora. Los resultados del Segundo Re-ensayo en las filas 5-13 son los resultados del ensayo de neutralización número 12. El protocolo de incubación fue la incubación a 37ºC durante una hora. Los resultados del Tercer Re-ensayo en las filas 14-16 son los resultados del ensayo de neutralización número 12. El protocolo de incubación fue la incubación a 37ºC durante una hora. Los resultados del Cuarto Re-ensayo en las filas 17-39 son los resultados del ensayo de neutralización número 16. El protocolo de incubación fue la incubación a 4ºC durante 16 horas. Los resultados del Segundo Re-ensayo en las filas 40-53 son el resultado del ensayo de neutralización número 19. El protocolo de incubación fue células más virus a 4ºC durante 16 horas.
La Tabla 6 (HIVKOMBP.XLS) muestra los resultados del ensayo de neutralización con sueros hiperinmunes combinados. Nótese que la incubación de los virus y células fue a 4ºC durante 16 horas.
Los resultados indicados en las Tablas 3(A-D)-6 indican que los péptidos de la presente invención desarrollan la producción de anticuerpos neutralizantes de VIH en sujetos primates. El uso de péptidos en la vacunación de sujetos humanos es aplicable, por lo tanto, para prevenir la infección por VIH o para inducir una respuesta inmune incrementada en sujetos ya infectados por el VIH.
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Ejemplo 6 La prueba de ADCC
El método utilizado para la determinación de la ADCC específica del VIH ha sido descripto por Ljunggren et al. J. Immunol. Meth. 1987, 104:7; J. Immunol., 139:2263 (1987). Resumidamente, la línea celular U937 clon 2, infectada en forma continua con VIH-1_{HTLVIIIB}, se utilizó como células blanco. Como células efectoras se usaron células mononucleadas de sangre periférica (PBMC) obtenidas de donantes de sangre con anticuerpos de VIH negativos. Las PBMC se recolectaron por centrifugación por densidad sobre Lymphoprep (Nykomed Pharma AS, Oslo, Noruega) y las células adherentes se eliminaron mediante la técnica de la lana de nylon lavada, Merril et al. Eur. J. Immunol., 11:536 (1981). 1 x 10^{4} células blanco marcadas con ^{51}Cr y 2 x 10^{5} linfocitos usados como células efectoras se mezclaron con diluciones de suero, en seis pasos de dilución en diluciones seriadas de 1 en 3 comenzando en 1:30. Los sobrenadantes se cosecharon después de tres horas y se calculó la radioactividad liberada. La liberación espontánea nunca excedió del 10%.
La ADCC específica del VIH se determinó de la siguiente manera: liberación específica de ^{51}Cr con sueros VIH positivos menos liberación específica de ^{51}Cr con sueros VIH negativos. Los sueros con un valor de Índice de ADCC Específico (SAI) > 0,5 a 1:30 se consideraron positivos para la ADCC específica del VIH, Ljunggren et al. J. Immunol. 1987. 139:2263. Este valor representa más de 3 DS por encima de la liberación específica de ^{51}Cr obtenida por sueros con anticuerpos de VIH negativos. Se incluyeron en cada prueba sueros con anticuerpos de VIH positivos de título de ADCC conocido. La recíproca del último paso de dilución con un valor de SAI > 0,5 se tomó como título de ADCC. No pudo detectarse ninguna actividad de ADCC en ningún suero contra células blanco ni en ningún suero de control con anticuerpos de VIH negativos.
Los sueros hiperinmunes determinados de acuerdo con el Ejemplo 5 anterior se ensayaron en una prueba de ADCC como la descripta más arriba. Los resultados para sueros sólo ADCC positivos se presentan en la Tabla 7 a continuación. Todos los demás sueros del grupo resultaron ADCC negativos. Todos los sueros preinmunes de monos 1-40 fueron negativos frente a células blanco infectadas excepto el suero no. 36, que tenía un título de 1:30. Todos los sueros preinmunes e hiperinmunes fueron ADCC negativos frente a células blanco no infectadas.
TABLA 7
Anti-sueros ADCC positivos producidos en monos contra péptidos que representan a gp120 de HVIH-1_{HTLVIIIB}
Anti-suero contra Aminoácidos # Título de ADCC
gp120-1 1-28 7290*
gp120-5 65-89 2430
gp120-6 75-100 2430
gp120-7 90-116 810
gp120-8 101-126 90
gp120-12 152-176 2430
gp120-14 177-205 90
gp120-16/B 213-224 2430
gp120-19 248-269 7290
gp120-20 258-282 2430
gp120-21 270-295 90
gp120-23 296-320 90
gp120-24 307-330 90
gp120-36 445-466 2430
* Este suero fue negativo en uno de tres experimentos; en dos experimentos el título de ADCC fue 7290.
Los resultados volcados en la tabla 7 indican que los péptidos de la presente invención incluyen epitopos de ADCC lineales específicos para gp120 de HVIH- 1_{HTLVIIIB}. Así, los péptidos de la presente invención pueden utilizarse para inducir citotoxicidad celular anticuerpo-dependiente para ayudar en la prevención de la infección por VIH o para inducir una respuesta inmune aumentada en sujetos ya infectados con VIH.
Para determinar los aminoácidos precisos necesarios para el epitopo activo para cada uno de los péptidos novedosos de la presente invención, puede realizarse el análisis de deleción como se describe en el siguiente ejemplo.
Ejemplo 7 Análisis de deleción de los péptidos
Los péptidos de la presente invención pueden utilizarse exactamente en la forma descripta en la presente, o pueden utilizarse en forma activa suplementada o truncada. Con el fin de determinar si la remoción o agregado de aminoácidos a la secuencia afecta las propiedades beneficiosas de esa secuencia según se describió anteriormente, puede realizarse experimentación de rutina para identificar aquella porción de la secuencia que contiene el epitopo activo. Por ejemplo, el análisis de deleción se efectúa sobre gp120-1 sintetizando péptidos que carecen de uno, dos, tres o más aminoácidos del extremo carboxilo terminal, del extremo amino terminal, o de ambos, y ensayando esos péptidos sistemáticamente de acuerdo con los Ejemplos 4-6. Si el péptido truncado resultante es inmunológicamente equivalente a la forma no truncada en la generación de anticuerpos protectores o neutralizantes, entonces se puede concluir que el epitopo responsable de las propiedades en cuestión se encuentra dentro de la secuencia truncada. De manera similar, las secuencias pueden ensayarse después del agregado de uno, dos, tres o más aminoácidos (seleccionados entre cualesquiera aminoácidos deseados) a cualquier extremo del péptido. Si el péptido resultante retiene sustancialmente las propiedades identificadas en los Ejemplos 4-6 para el péptido no modificado, el péptido modificado se considera inmunológicamente equivalente a los fines de la presente invención.
Además de sintetizar los péptidos a ensayar de novo, pueden eliminarse químicamente aminoácidos de los péptidos de cualquiera de las SEC. ID NOs. expuestas en la presente. Por ejemplo, pueden eliminarse aminoácidos utilizando el método descripto en Morrison y Boyd, Organic Chemistry, 3ra. Edición, páginas 1145-1146 (1976). Resumidamente, se utiliza fenil isotiocianato para formar una tiourea sustituida en el residuo N-terminal del péptido. La hidrólisis suave con ácido clorhídrico elimina selectivamente el residuo N-terminal en forma de feniltiohidantoína. La cadena del péptido remanente queda intacta y se investiga su actividad inmunológica de acuerdo con los métodos expuestos en los Ejemplos 4-6 descriptos anteriomente. Luego el procedimiento se repite, eliminando secuencialmente el residuo
N-terminal de la cadena del péptido remanente y ensayando en el péptido resultante su capacidad para inducir la ADCC específica de VIH, hasta que esta capacidad se pierde. De esta manera, se determina la secuencia de aminoácidos del epitopo activo.
En forma alternativa, el aminoácido C-terminal se elimina selectivamente usando la enzima carboxipeptidasa para escindir sólo los enlaces peptídicos adyacentes al grupo alfa-carboxilo libre. Además, pueden usarse enzimas tales como la tripsina, quimotripsina y pepsina para reducir los péptidos de la presente invención a fragmentos más pequeños, que luego se analizan de acuerdo con los métodos descriptos en los Ejemplos 4-6.
Aunque realizaciones particulares de la invención se han descripto en detalle, resultará evidente para aquellos con experiencia en el arte que estas realizaciones son ejemplificativas más que limitantes, y que el verdadero alcance de la invención es el definido por las reivindicaciones que siguen.
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE: Syntello Vaccine Development AB
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PÉPTIDOS PARA UTILIZAR EN VACUNACIÓN E INDUCCIÓN DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES CONTRA EL VIRUS DE INMUNODEFICIENCIA HUMANO
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 41
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
DIRECCIÓN DE CORRESPONDENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
DESTINATARIO: Syntello Vaccine Development AB
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
CALLE: Guldhedsgaten 10 B
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CIUDAD: S-411 46 Göteborg
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
ESTADO:
\vskip0.333000\baselineskip
(E)
PAÍS: Suecia
\vskip0.333000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
FORMA LEGIBLE EN COMPUTADORA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TIPO DE MEDIO: disco Floppy
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
COMPUTADORA: compatible con PC IBM
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Versión #1.25
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(vi)
DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
FECHA DE PRESENTACIÓN:
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CLASIFICACIÓN:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(viii)
INFORMACIÓN SOBRE EL APODERADO/AGENTE:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
NOMBRE: AWAPATENT AB, Stockholm
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
NÚMERO DE REGISTRO:
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
NÚMERO DE REFERENCIA/CASO: 2948411
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ix)
INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
TELÉFONO: +46 8 300545
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TELEFAX: +46 8 304989
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Arg Val Lys Glu Lys Tyr Gln His Leu Trp Arg Trp Gly Trp Arg}
\sac{Trp Gly Thr Met Leu Leu Gly Met Leu Met Ile Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Met Leu Met Ile Cys Ser Ala Thr Glu Lys Leu Trp Val Thr Val}
\sac{Tyr Tyr Gly Val Pro Val Trp Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:3:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Val Pro Val Trp Lys Glu Ala Thr Thr Thr Leu Phe Cys Ala Ser}
\sac{Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ala Ser Asp Ala Lys Ala Tyr Asp Thr Glu Val His Asn Val Trp}
\sac{Ala Thr His Ala Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val His Asn Val Trp Ala Thr His Ala Cys Val Pro Thr Asp Pro Asn}
\sac{Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Pro Thr Asp Pro Asn Pro Gln Glu Val Val Leu Val Asn Val Thr}
\sac{Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asp Met}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Glu Asn Phe Asn Met Trp Lys Asn Asp Met Val Glu Gln Met His}
\sac{Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Glu Gln Met His Glu Asp Ile Ile Ser Leu Trp Asp Gln Ser Leu}
\sac{Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Pro Cys Val Lys Leu Thr Pro Leu Cys Val Ser Leu Lys Cys Thr}
\sac{Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Ser Leu Lys Cys Thr Asp Leu Lys Asn Asp Thr Asn Thr Asn Ser}
\sac{Ser Ser Gly Arg Met Ile Met Glu Lys}
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:11:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Ser Ser Gly Arg Met Ile Met Glu Lys Gly Glu Ile Lys Asn Cys}
\sac{Ser Phe Asn Ile Ser Thr Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Gly Ile Lys Asn Cys Ser Phe Asn Ile Ser Thr Ser Ile Arg Gly}
\sac{Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 28 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Arg Gly Lys Val Gln Lys Glu Tyr Ala Phe Phe Tyr Lys Leu Asp}
\sac{Ile Ile Pro Ile Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Tyr Lys Leu Asp Ile Ile Pro Ile Asp Asn Asp Thr Thr Ser Tyr Thr}
\sac{Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Thr Ser Cys Asn Thr Ser Val Ile Thr Gln Ala Cys Pro Lys Val}
\sac{Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Pro Lys Val Ser Phe Glu Pro Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala}
\sac{Gly Phe Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 29 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:17:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ala Pro Ala Gly His Ala Ile Leu Lys Cys Asn Asn Lys Thr Phe Asn}
\sac{Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln Cys}
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:18:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Thr Phe Asn Gly Thr Gly Pro Cys Thr Asn Val Ser Thr Val Gln}
\sac{Cys Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:19:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr His Gly Ile Arg Pro Val Val Ser Thr Gln Leu Leu Leu Asn Gly}
\sac{Ser Leu Ala Glu Glu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Leu Leu Leu Asn Gly Ser Leu Ala Glu Glu Glu Val Val Ile Arg}
\sac{Ser Ala Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 26 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:21:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Val Ile Arg Ser Ala Asn Phe Thr Asp Asn Ala Lys Thr Ile Ile}
\sac{Val Gln Leu Asn Gln Ser Val Glu Ile Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:22:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Thr Ile Ile Val Gln Leu Asn Gln Ser Val Glu Ile Asn Cys Thr Arg}
\sac{Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 25 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Thr Arg Pro Asn Asn Asn Thr Arg Lys Ser Ile Arg Ile Gln Arg}
\sac{Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:24:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Arg Ile Gln Arg Gly Pro Gly Arg Ala Phe Val Thr Ile Gly Lys}
\sac{Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His}
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B) TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Lys Ile Gly Asn Met Arg Gln Ala His Cys Asn Ile Ser Arg Ala}
\sac{Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Asn Ile Ser Arg Ala Lys Trp Asn Asn Thr Leu Lys Gln Ile Asp}
\sac{Ser Lys Leu Arg Glu Gln Phe}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:27:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gln Ile Asp Ser Lys Leu Arg Glu Gln Phe Gly Asn Asn Lys Thr Ile}
\sac{Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:28:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asn Asn Lys Thr Ile Ile Phe Lys Gln Ser Ser Gly Gly Asp Pro}
\sac{Glu Ile Val Thr His Ser Phe Asn}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:29:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Asp Pro Gly Ile Val Thr His Ser Phe Asn Cys Gly Gly Glu Phe}
\sac{Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Gln}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:30:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Gly Gly Glu Phe Phe Tyr Cys Asn Ser Thr Gln Leu Phe Asn Ser}
\sac{Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:31:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Phe Asn Ser Thr Trp Phe Asn Ser Thr Trp Ser Thr Glu Gly Ser}
\sac{Asn Asn Thr Glu}
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:32:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ser Thr Glu Gly Ser Asn Asn Thr Glu Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu}
\sac{Pro}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 20 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:33:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Gly Ser Asp Thr Ile Thr Leu Pro Cys Arg Ile Lys Gln Phe Ile Asn}
\sac{Met Trp Gln Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 27 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:34:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Arg Ile Lys Gln Phe Ile Asn Met Trp Gln Glu Val Gly Lys Ala}
\sac{Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 24 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:35:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Gly Lys Ala Met Tyr Ala Pro Pro Ile Ser Gly Gln Ile Arg Cys}
\sac{Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:36:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Cys Ser Ser Asn Ile Thr Gly Leu Leu Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn}
\sac{Asn Asn Asn Glu Ser Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:37:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Leu Thr Arg Asp Gly Gly Asn Asn Asn Asn Glu Ser Glu Ile Phe Arg}
\sac{Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 22 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:38:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Phe Arg Pro Gly Gly Gly Asp Met Arg Asp Asn Trp Arg Ser Glu}
\sac{Leu Tyr Lys Tyr Lys Val}
\newpage
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 21 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi) DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:39:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asn Trp Arg Ser Glu Leu Tyr Lys Tyr Lys Val Val Lys Ile Glu}
\sac{Pro Leu Gly Val Ala}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 23 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Val Lys Ile Glu Pro Leu Gly Val Ala Pro Thr Lys Ala Lys Arg Arg}
\sac{Val Val Gln Arg Glu Lys Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEC. ID NO:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 12 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
(C)
CARÁCTER DE LA CADENA: única
\vskip0.333000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.666000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: péptido
\vskip0.666000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(iv)
ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
(v)
TIPO DE FRAGMENTO: interno
\vskip0.666000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC. ID NO:41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Ile Pro Ile His Tyr Cys Ala Pro Ala Gly Phe Ala}

Claims (10)

1. Un péptido para estimular una respuesta contra la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos específicos del virus de inmunodeficiencia humano en un mamífero, que comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano, en donde el epitopo está ubicado dentro de la SEC. ID NO:41 y en donde los antisueros producidos en monos contra dicha secuencia epitópica tienen un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos específicos mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30.
2. Una composición para vacuna que comprende un péptido, en donde dicho péptido comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano en donde el epitopo está ubicado dentro de la SEC. ID NO:41 y en donde los antisueros producidos en monos contra dicha secuencia epitópica tienen un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos específicos mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30, estando dicho péptido en una proporción efectiva como para inducir en un mamífero una respuesta inmune a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos específicos del VIH, junto con un vehículo aceptable para uso farmacéutico.
3. La composición para vacuna de la reivindicación 2, que comprende además un adyuvante.
4. La composición para vacuna de la reivindicación 3, en la cual dicho adyuvante se selecciona del grupo integrado por el adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, muramil dipéptido, levamisol, isoprinosina y tuftsina.
5. Uso de un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano, en donde el epitopo está ubicado dentro de la SEC. ID NO:41 y en donde los antisueros producidos en monos contra dicha secuencia epitópica tienen un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos específicos del VIH de mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30, para la fabricación de una composición farmacéutica para tratar a un mamífero infectado con el virus de inmunodeficiencia humano.
6. Uso de un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano, en donde el epitopo está ubicado dentro de la SEC. ID NO:1, SEC. ID NO:5, SEC. ID NO:6, SEC. ID NO:7, SEC. ID NO:8, SEC. ID NO:12, SEC. ID NO:14, SEC. ID NO:19, SEC. ID NO:20, SEC. ID NO:21, SEC. ID NO:36 ó SEC. ID NO:41, y en donde los antisueros producidos en monos contra dicha secuencia epitópica tienen un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos específicos mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30, para la fabricación de una composición farmacéutica para inducir en un mamífero una respuesta inmune a la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos específicos del VIH.
7. Uso de al menos dos péptidos, en donde cada uno de dichos péptidos comprende una secuencia de aminoácidos epitópica de la proteína gp120 del virus de inmunodeficiencia humano, en donde el epitopo está ubicado dentro de la SEC. ID NO:1, SEC. ID NO:5, SEC. ID NO:6, SEC. ID NO:7, SEC. ID NO:8, SEC. ID NO:12, SEC. ID NO:14, SEC. ID NO:19, SEC. ID NO:20, SEC. ID NO:21, SEC. ID NO:36 ó SEC. ID NO:41, y en donde los antisueros producidos en monos contra dicha secuencia epitópica tienen un valor del índice de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos específicos mayor de 0,5 a una dilución mayor de 1:30, para la fabricación de una vacuna y/o una composición farmacéutica para inducir en un mamífero una respuesta inmune de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos específicos del VIH y/o para tratar a un mamífero infectado con el virus de inmunodeficiencia humano.
8. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en donde la protección se logra administrando dicha composición farmacéutica por inyección intravenosa, intramuscular, subcutánea o intraperitoneal.
9. Uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a 8, en donde la composición farmacéutica comprende además un adyuvante.
10. Uso de acuerdo con la reivindicación 9, en donde dicho adyuvante se selecciona del grupo integrado por el adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, muramil dipéptido, levamisol, isoprinosina y tuftsina.
ES94912727T 1993-04-16 1994-04-15 Peptidos para uso en la vacunacion de anticuerpos neutralizantes contra el virus de la inmunodeficiencia humana. Expired - Lifetime ES2202321T3 (es)

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