KR19990022406A - 종양 관련 에피토프 - Google Patents

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엠. 버틀러 산드라
포마토 니콜라스
보스 에보
지. 한나 쥬니어 마이클
브이. 하스펠 마틴
씨. 후버 쥬니어 허버트
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이.에이치. 리링크
악조 노벨 엔.브이.
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Abstract

본 발명은 모노 클론 항체 88BV59 및 항체 16.88과 반응하는 에피토프에 관한 것이다. 이들 항체는 자가 종양 항원으로 면역된 암 환자의 B-세포에서 유도된 B-세포주에 의해 형성된다. 두 개의 에피토프는 모두 종양 조직의 동일한 항원에서 발견된다. 이들 에피토프는 인체 암의 진단 과정 및 치료에 사용할 수 있다.

Description

종양 관련 에피토프
특정 암에 관련된 항원과 특이적으로 반응하는 인체 모노클로날 항체의 표적이 되는 에피토프를 동정하였다. 본 발명은 표적 및 면역원의 활성 부분으로 이들 에피토프를 사용한 진단 방법, 항체 스크리닝 및 암 처치에 관한 것이다.
항체는 골수에 의해 형성된 B-세포 임파구에 의해 정상적으로 합성되어 혈액을 따라 이동하는 단백질 분자이다. 신체내의 임의의 항원, 즉, 간단한 유기 화합물에서 복합 단백질에 이르는 임의의 이종 분자 또는 비자가 분자에 대하여 특정 화학 구조를 인식하고 결합하는 항체가 생성된다. 특정 항체가 결합하는 항원의 특정 화학구조를 항원성 결정체 또는 에피토프라고 칭한다. 신체내의 B-세포, 임파구, 또는 백혈구라고 부르는 B-세포 임파구는 상이하게 유전학적으로 프로그램된 수억개의 세포로 존재하며, 각각은 상이한 에피토프에 대한 특정 항체를 형성시킨다. 항체 생성을 촉진하는 항원은 표면에 몇가지 에피토프를 갖을 수 있다. 항원과 만나게 되면, 이의 에피토프에 특이적인 항체를 항원 표면으로 운반하는 B-세포가 복제된다. 이 클론 확장은 혈액내로 항체를 분비하는 다수의 자손 세포를 형성시킨다.
항원을 인식하고 결합하는 항체의 특이성 때문에, 단일 에피토프에 특이적이고, 따라서 이 특별한 에피토프를 갖는 항원 또는 조직에만 결합하는 항체를 동정하는 것이 요구되었다. 일단 에피토프가 동정되면, 이는 세포주에 의해 생성된 항체를 스크린닝, 및 심지어 폴리클로날 혈장으로부터 항체를 면역정제하기 위해서 이용할 수 있었다. 합성 또는 천연의 거대 분자의 일부분으로서, 에피토프는 또한 효과적인 면역원으로 사용될 수 있다.
모노클로날 항체는 기타 면역글로블린으로 오염되지 않은 정제 형태로 합성된다. 모노클로날 항체를 생성하는 세포를 이용하여, 특정 항원의 에피토프에 특이적인 항체를 다량으로 생성할 수 있다. 특정 암에 특이적인 항체를 각종 치료 및 진단 방법에 사용할 수 있다.
모노클로날 항체는 화학치료 약물, 독성 및 방사성 동위원소의 특이성을 증가시키므로서 효과를 증가시키는 반면, 필요한 양을 급격히 감소시켜 독성은 감소시킨다. 추가로, 방사능핵종 또는 금속 추적자와 콘쥬게이트된 항체는 예를 들어, 양성자 방출(PET), 핵 자기 공명(NMR), 컴퓨터화된 단층 촬영기, 및 2차원 및 단일 양성자 방출 컴퓨터화된 단층 촬영기를 사용하여, 생체내 진단 및 전이의 위치를 영상화고, 프로브를 사용하여 수술 동안에 종양 조직을 확인하는데 사용할 수 있다. 암의 진단 및 예후 시험으로서 혈액에서 종양 항원의 존재를 검출하기 위해서 항체를 사용할 수 있다. 동물 종양 관련 항원의 존재는 지난 1세기 동안 문서화되었으며, 인체 암의 항원적 특성은 1차적으로 모노클로날 항체를 사용한 근래의 연구를 통하여 확립되었다. 그러나, 본 발명의 연구가 있기까지, 실제적으로 분자 측면에서 특성화된 암 항원은 거의 없으며, 단지 인체 암(B-세포 종양의 면역 글로블린 요오드형)과 관련된 항원 결정체의 한 그룹만이 유일하게 종양-특이적인 것(즉, 종양 세포에 고 빈도로 발생하나 정상 조직에서는 임의의 상당한 정도로 발생하지 않음)으로 알려져 왔다(Oldham and Smalley, J. Biol. Response Modifiers, 1983; Stratte 등, J. Biol. Response Modifiers, Volume 1, 1982).
인체 암에 특이한 모노클로날 항체를 유도하는 과거의 시도에서는 2가지 경로로 B-세포를 취하였다: 1) B-세포를 인체 종양에 면역된 마우스의 비장에서 추출, 미국 특허 4,172,124; 및 2) 인체 B-세포를 암환자의 말초 혈액 또는 종양을 배수(draing)시키는 림프절에서 추출. 2가지 방법 모두 만족스러운 결과를 주지 못했다.
인체 종양으로 면역된 마우스는 지나치게 광범위한 반응성을 갖는다. 즉, 대부분의 생성된 마우스 모노클로날 항체는 종양 조직 뿐만 아니라 정상 조직에 존재하는 인체 항원과도 반응한다. 단지 종양 세포에만 반응하는 항체를 다수의 각종 생성 항체에서 선택하기는 어렵다. 예를 들어, 인체 소세포 폐 육종으로 면역화된 마우스에서 유도한 20,000 하이브리도마를 종양 세포와의 반응성에 대해 스크리닝하였고(Science, 1982, 216:183), 그 결과 연구팀에 의해 관찰된 반응성이 매우 낮은 빈도(4% 이하)로 관찰되었다. 대조적으로, 본 발명은 면역화된 결장 환자에서 유도한 하이브리도마의 16%까지 종양 세포와 특이적으로 반응하는 모노클론 항체를 생성하는 결과를 얻었다. 추가로, 마우스 B-세포에서 유도된 모노클로날 항체는 암 치료의 응용에 가능성이 제한되어 왔다. 상기 항체를 반복 투여한 후에, 인체 면역 시스템을 자극하여 임상 시험에서 마우스 모노클로날 항체의 활성을 무효화시키는 항-마우스 항체를 생성한다. 본 발명의 인체 모노클로날 항체를 사용하면 이 난점을 극복할 수 있다.
인체 및 마우스 모노클로날 항체사이의 또 다른 분명한 차이점은 표식 패턴에 있다. 마우스 항체를 사용한 종래 연구에서는 종양 단면내에 종종 이종 세포의 표식을 나타내었다. 일부 연구자들은 이 반응성의 형태를 종양 세포의 항원성 이종에 의한 것으로 생각해왔다(Hand 등, Cancer Research, 43:728-735, 1983). 대조적으로, 본 발명의 계획에 의해 개발된 인체 모노클로날 항체는 반응하는 종양과의 반응성면에서 상동하였다. 마우스 모노클로날 항체의 이종 염색에 대한 그렇듯한 설명은 종양에 관련되는 것으로 추정되는 항원보다는 오히려 종양세포에 풍부한 상-사이클-특이 또는 세포-사이클-특이 분화 항원의 설치류 면역 인식 능력을 갖는다는 것을 반영하는 것이다. 인체 종양 세포로 마우스를 면역시켰을 때 실질적인 항원 경쟁이 발생하여, 이로인해 더 다량의 더 우세한 조직형 및 분화 항원이 숙주에 의한 면역 민감성에 대해 상당히 미량의 종양 관련 항원과 성공적으로 경쟁하는 것을 예상할 수 있다. 따라서, 인체의 자가 면역은 마우스에서 정상적으로 불량한 면역원성의 항원성 그룹에 대한 항체에서 유도할 수 있다. 이 자료는 인체 및 마우스는 상이한 종양 항원과 반응할 수 있다는 것을 제안한다. 우리의 발견은 이 가설에 보조하는 것으로 우리가 생성한 처음 36개의 인체 모노클로날 항체중 어느것도 육종배 항원(CEA)과의 반응을 나타내지 않으며, 설치류 모노클론 항체에 의해 빈번하게 인식되는 항원이 인체 종양 세포에 대하여 제조된다는 것이다.
인체 종양 항원에 특이적인 모노클로날 항체를 만드는 데 있어서 중요한 문제는 특이적으로 면역된 B-세포의 공급원을 찾을 수 없다는 것이다(Science, 1982, 215:285). 인체에서, 암 세포의 개시점을 인체 수명 1% 내지 10%의 장시간 동안 증식시킨 후, 이 질병의 임의의 명백한 임상적 증거가 나타나는 경향이 있다. 이 기간에, 환자는 종양에 대하여 면역학적으로 저반응성 또는 면역학적 내성을 갖을 가능성이 있다. 따라서, 본 발명이 전에 종양 관련 항원에 특이적인 인체 모노클로날 항체의 개발 및 이의 표적 에피토프의 동정을 재생적으로 수득할 수 없다.
특정 암 환자에게 면역 반응을 유도하는 종양-관련 항원과 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 개발하는 노력으로 시작된 연구로 본 발명의 종양 특이적 에피토프를 동정하였다. 이는 특정 백신 제제에서 자신의 종양 세포를 사용하여 면역시킨 환자로부터 말초 혈액 B-세포를 사용하여 모노클로날 항체를 수득할 수 있는 새롭고 효과적인 접근 방법이다. 활성 특이 면역 치료를 하기 위해서, 환자는 자신의 종양 세포로 면역시켰다. 종양 세포에 대하여 뚜렷한 면역 반응을 갖는 인체가 활성화된 B-세포의 우수한 공급원이 될 수 있다는 것을 발견하였다. 환자 자신의 종양으로 활성적으로 면역된 환자의 말초 혈액은 활성화된 B-세포의 풍부한 공급원이 되었다.
임상적 연구는 피부 시험(즉, 지연된 피부 과민성(DCH)하여 특정 암을 갖는 환자를 치료할 때 뚜렷한 면역 반응이 발생한다는 것을 보여준다. 면역화된 환자는 자신의 결장직장 암에 대해 지연된 피부 과민 반응을 나타내었다. 추가로, 면역화된 환자의 B-세포로부터 개발된 모노클로날 항체는 다른 환자의 동일한 조직학 형태의 종양과 반응하였다. 이들 결과로 항체를 생성하는 환자의 체액 면역 반응은 일반적으로 결장직장 암 항원에 대한 것이며, 면역화된 환자 자신의 종양에 유일하지 않다는 것을 알았다. 유일한 에피토프를 포함하는 종양과 관련된 특이 항원을 알려주는 일반적인 반응은 표준화된 백신을 개발하는데 특히 중요하다.
종양 세포와 관련된 항원, 특히 대다수의 경우에 세포 표면 항원에 대한 특정 에티토프에 특이적인 반응성을 갖는 항체를 생성하는 B-세포의 발생은 면역 연구를 개시했을 때는 기껏해야 추상적었던 유리한 결과이다. 따라서, 종양 세포에 의해 존재하고, 정상 조직에서 비교적 소량으로 발현되는 것으로 알려진 특정 에티토프를 또한 발견하였다. 인체 면역화 과정을 근거로 한 동물 연구 과정에서 종양 특이 항체의 생성이 아니라 면역화 처리만을 관찰 및 측정하였다.
대상 증상을 개선시키므로서 수반되는 일반적인 면역 반응은 대식세포 및 T -세포가 종양 세포 항원의 존재하에 활성화되고 종양 세포를 파괴하는 세포 반응을 나타낸한다. 항체 반응을 대부분의 조건하에서 면역화를 유발할 것으로 예상되지만, 항체 반응의 및 세포 반응의 시간 경과는 대부분의 경우에 상이하다. 더구나, 환자가 자가 이식 종양 세포(즉, 환자 자신의 종양 세포)로 면역화된다는 사실, 및 환자 자신의 종양에 의해서 유발된 항체 형성이 거의 또는 전혀 없다는 종래의 연구자들의 경험으로 종양에 특이적인 항체를 생성하는 B-세포가 면역화 후에 예상치 못했던 이익을 준다는 것을 발견하였다. 이어서, 우리는 유일하게 효과적인 표적 에피토프를 갖는 종양 특이 항원을 발견하였다.
일부 세포 및 체액 면역 반응은 서로 독립적으로 발생할 수 있다. 예를 들어, 논증할 수 있는 세포 면역성의 부재하에 체액 반응을 증가시킬 수 있다. 역으로, 잠재 세포 면역성, 특히 지연성 피부 과민 반응(DCH)은 최소 항체 반응에도 불구하고 개발될 수 있다. 따라서, 활성 면역 치료에 대해 양성 반응을 나타내는 대상이 종양 특이 항체를 생성하는 B-세포, 특히 세포 표면 항원의 우수한 공급원이었다는 것은 놀라운 일이었다.
성공적인 백신을 제조하는데 필요한 종양 특이 항체를 생성하는 B-세포의 분리하는 방법는 면역화된 인체 B-세포 추출, 세포주를 생성하는 모노클로날 항체의 생성 및 모노클로날 항체이다. 악성 종양은 효소 제제를 이용하여 분해할 수 있다. 수득한 세포를 처리하여 필수 세포 생존 능력을 갖는 비-종양형성 종양 세포 제제를 얻었으며, 종양 세포를 수득한 대상에게 이를 백신으로 주사하였다. 말초 혈액 B-세포는 미리 결정된 간격 후에 접종 대상으로부터 수득하고, 골수종 세포와 융합시키므로서 모노클로날 항체를 생성하는 세포를 제조하는데 사용하였으며, 후에 융합된 세포는 면역 글로블린의 합성을 위해서 스크리닝하였다. 모노클로날 항체를 생성하는 세포는 또한 연속 배양액에서 생존할 수 있도록 자발적으로 형질 전환된 B-세포를 선택하고, 엡스테인 바르 비루스(Epstein Var Virus)(EBV) 또는 기타 림포트로픽 비루스와 같이 세포를 형질 전환시킬 수 있는 제제에 B-세포를 노출시켜 수득할 수 있다.
다량의 항체는 EBV-형질 전환된 세포를 마우스 골수종 세포 및 인체-마우스 헤테로골수종과 융합시켜 수득하였다. 면역글로블린을 합성시키는 세포는 악성 조직의 특정 항원과 반응하는 항체를 생성하는 시험을 하였다. 선택된 항체들을 배양시켜 대상을 괴롭히는 특정 형태의 종양과 반응하는 모노클로날 항체를 생성시켰다. 이들 항체와 반응성이 있는 신규 에피토프는 가능한 기타 유용한 면역 글로블린을 직접 스크리닝하여 동정한다. 동정된 모노클로날 항체는 진단 및 1차 종양 및 전이 부위에 치료제를 전달하기 위한 방사면역신티그램 촬영(RIS) 제제로 사용할 수 있다. 에피토프는 또한 종양 항원에 대해 직접적인 항체를 분리하고, 생체내 영상화 및 처치를 위한 표적 및 시험관내 조직 분석을 위한 표적으로서 유용하다. 상기 에피토프는 거대 분자와 조합되어 사용하는 경우, 면역 처치 및 항체 생성을 위한 면역원으로서 사용할 수 있다.
항원 정보 자료를 정상적으로 이용할 수 없고, 항원은 단순 단백질이 아니며, 에피토프는 선형 배열에 반응성이 거의 또는 전혀 없는 3차원적 구조 에피토프일 수 있기 때문에 모노클로날 항체를 증가시킨 후에 에피토프의 동정은 성공을 확신할 수 없다. 본 발명의 에피토프는 단지 서열 정보를 이용할 수 있는 특정 시토케라틴과 반응시킨 16.88 및 88BV59를 발견한 후에 동정 및 서열화할 수 있었다.
이 출원은 1994년, 7월 8일에 출원된 미국 일련 번호 08/272,402 의 부분 연속 출원이며, 이 출원은 1992년 8월 13일에 출원되고 1994년 8월 16일에 미국 특허 5,338,832로 특허 허여된 미국 일련 번호 07/929,842의 부분 연속 출원이며, 현내는 포기된 1989년 2월 28일 출원된 미국 일련 번호 07/343,475의 연속이며, 현재는 포기된 1987년 7월 2일 출원된 미국 일련 번호 07/069,478의 부분 연속 출원이다.
본 출원은 또한 1994년 2월 4일에 출원된 미국 일련 번호 08/192,089의 부분 연속 출원이며, 이 출원은 1993년 5월 21에 출원된 미국 일련 번호 08/065,517의 부분 연속 출원이며, 현재는 포기된 1990년 12월 31에 출원된 미국 일련 번호 07/636,179의 연속이며, 1989년 1월 25일에 출원된 현재 미국 특허 제 5,106,738 호인 미국 일련 번호 07/302,155의 부분 연속 출원이며, 1985년 1월 31에 출원된 현 미국 특허 제 4,828,991 호인 미국 일련 번호 06/697,078의 부분 연속 출원이며, 현재는 포기된 1984년 1월 31에 출원한 06/575,533의 부분 연속 출원이다. 이 개시된 특허 출원은 본 명세서에서 참고로 인용하였다.
본 발명은 하이브리도마 또는 자가 종양 항원으로 면역된 암 환자의 B-세포에서 유도한 형질 전환 B-세포주에 의해서 생성된 모노 클론 항체의 표적이 되는 에피토프에 관한 것이다. 이들 에피토프는 항체 및 항원 단편의 스크리닝 뿐만 아니라 인체 암의 진단 과정 및 치료에도 사용할 수 있다.
도 1은 CATT 16.88의 역상 고 성능 액체 크로마토그래피(RPHPLC) 프로파일을 보여준다.
도 2는 RPHPLC에 의해 CTAA 16.88(CTA#)의 피크 1 및 피크 2를 갖는 MCA 16.88, MCA 88BV59, 항 시토8 항체, 항 시토 18 항체 및 항 시토 19 항체의 반응성을 예시한다.
도 3은 시토케라틴 8 부분적 서열 및 88BV59 에피토프 서열사이의 상동성을 예시한다.
도 4는 펩스칸(pepscan) 및 시토케라틴 8의 일부분과의 반응성에 의한 MCA 88BV59의 에피토프 특이성을 보여준다.
양태들의 상세한 설명
참고로 인용한 미국 출원 일련 번호 08/192,089(1994년 2월 4일 출원)에 개시된 모노클로날 항체 88BV59는 결장 종양 관련 항원(CTAA) 16.88, 또는 CTA #1로 명명되는 항원을 인식한다는 것을 보여주었다. 상기 항원은 참고로 인용한 1994년 8월 16일에 특허 허여된 미국 특허 출원 5,338,832에 청구되었다. CTAA 16.88은 참고로 인용한 1991년 3월 5일에 특허 허여된 미국 특허 4,997,762에 정의된 인체 IgM 항체 16.88(MCA 16.88)를 사용하여 처음 동정하였다. MCA 88BV59 및 MCA 16.88은 모두 동일한 종양 관련 항원을 인식하나, 항원의 상이한 에피토프와 반응한다.
본 발명의 에피토프(88BV59 에피토프 및 16.88 에피토프)을 표적으로 하여 암의 진단 및 치료의 수단을 제공한다. 방사성 동위원소 또는 금속 추적자를 이용하여 통상적으로 표지한 MCA 88BV59 및 MCA 16.88를 방사물질에 의한 스캐닝에 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 동위원소는 요오드-131, 요오드-125, 인듐-111 및 테크니튬-99m을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 방사능표지된 항체의 특이 활성은 특히 제한되지 않으며, 항체의 약 2 내지 약 4mCi/mg이 허용가능한 것으로 알려졌다. 예를 들어,99mTC-88BV59 약 15 내지 약 41mCi를 30분 동안 정맥으로 주입시켜, 우수한 영상을 얻었다. 환자의 체중 및 방사능 동위 원소의 형태와 같은 요소에 따라 그 양을 다양하게 할 수 있다. 체내로 방사능표지된 항체를 유입시키는 기타 방법은 예를 들어 임파구내 및 복막내 투여를 통하여 사용할 수 있다. 유사하게, MCA 16.88은 또한 종양 영상을 위해서 자체를 프로브로 사용한다. 유방내 경로를 통하여 투여되는111In-LiLo-16.88는 1차 유방암의 수술전 단계에서 사용하였다. 또한131I-16.88을 사용한 결장직장 암의 평면 영상은 2가지 연구에서 환자의 75% 이상이 양성을 나타내었다. 방사능 표지된 MCA 88BV59 및 MCA 16.88을 사용한 면역 감지에 대한 상세한 내용은 DeJager 등의 고찰 문헌[Current Status of Cancer Immunodetection with Radiolabeled Human Monoclonal Antibodies, Seminar in Nuclear Medicine, Volume XXIII, No. 2(4월), 1993: p 165-179]에 기재되어 있으며, 본 명세서에서 참고로 인용하였다. 방사능 표지된 MCA 88BV59 및 방사능 표지된 MCA 16.88의 투여는 모두 안전성을 나타내며, 보고된 부작용이 거의 없이 내성을 나타내었다.
지금까지 수집된 자료는 2차의 X선 단층 촬영을 사용하여99mTC-88BV59로 스케닝한 항체가 CT 스캐닝한 것 보다 복내 및 골반 전이를 감지하는데 우수하다는 것을 명백히 보여준다. 2개의 양식의 조합은 최적의 검출을 제공하는 것으로 나타난다. 추가로, 방사능을 검출하는 프로브는 수술 과정에서 종양을 확인하고 전이부를 절제하기 위해 사용된다. 88BV59 에피토프 또는 16.88 에피토프에 대해 특이성이 있는 항체는 종양 조직을 동정하는데 유용할 것이다. MCA 88BV59, MCA 16.88 및 이의 단편과 같은 인체 모노클로날 항체는 면역원성이 아니라는 장점을 제공한다.
88BV59 또는 16.88 에피토프의 추가의 중요한 용도는 임상내에서 치료학적 제제와 함께 종양을 영상화하고 종양을 추적하는데 유용한 항체를 동정하기 위해서 종양 조직에 대해 증가하는 항체를 스크리닝하는 것이다. 항체는 종양의 존재를 동정 또는 확인하기 위해서 임상 실험실에서 사용되는 스크리닝에 의해서 동정될 수 있다.
88BV59는 하기의 정상 인체 조직에 음성 반응을 나타낸다: 난소, 자궁, 고환, 질, 부신 분비선, 전립선, 갑상선, 흉선, 림프절, 비장, 골수, 심근층, 대뇌피질 세포, 피부, 근육 및 헤모포이에틴. 88BV59는 하기의 조직과 약간의 반응성을 나타낸다: 결장(쇄자연 및 포재성 분비선), 소장(쇄자연 및 포재성 분비선), 위(위점막소 및 표재성 분비선), 식도(분비선), 췌장(일부 관 및 외분비선 소포체), 신장(회수관의 50%), 경관(상피선(조직 2/3이 양성임), 유방(소피 및 유선 상피), 폐(일부 폐포 및 기관지 세포), 뇌(신경선상 세포(조직의 2/3 양성임)), 척수(신경망), 피부(진피 분비선의 50%) 및 간(담즙관). 인체 종양 세포주와 88BV59의 반응성은 하기 표 2에 나타나있다. 표 3은 종양 조직 견본과 88BV59의 반응성을 보여준다. 이들 연구 결과로 정상 조직에서도 88BV59 에피토프를 포함하는 천연 시토케라틴 8을 포함하는 것으로 예상되며, 에피토프는 종양 조직을 동정하는데 실질적인 유용성을 갖는다. 정상 및 종양 세포와 MCA 16.88의 반응성은 이미 미국 특허 4,997,762(예, 실시예 II) 및 미국 특허 5,338,832에 개시되어 있으며, 이는 참고로 인용하였다. 두 에피토프는 종양 세포에서 더 강력하게 발현되는 것으로 나타나거나, 또는 정상세포에서의 에피토프는 마스크(mask) 될 수 있다. 두 가지 경우에, 88BV59 및 16.88 에피토프 모두 종양 조직을 추적 및 동정하는데 유용하다.
CTAA 16.88은 35-43KD의 분자량의 폴리펩티드 복합체(변성 조건하에서)이다. 폴리펩티드의 상기 복합체는 중간 섬유 단백질, 특히 시토케라틴 8, 18 및 19과 관련된 에피토프이다. 시토케라틴에 특이적인 모노클로날 항체는 종양 관련 항원과 교차 반응을 나타낸다. MCA 88BV59는 CTAA 16.88(전술한 분자량)로 인식되는 폴리펩티드의 부분에 결합한다. 크기 배제 크로마토그래피 및 천연 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동과 같은 비-변성 조건하에서 단일 단백질로 행동하는 천연 항원을 역상 고 성능 액체 크로마토그래피에 의해 두 개의 성분으로 분리할 수 있다는 것을 보여준다. 이 크로마토그래피 프로파일은 도 1에 나타나있다.
간접 효소-결합된 면역 분석법(EIA)으로 MCA 88BV59가 역상 크로마토그래피 프로파일에서 수득한 제 1 피크를 주로 인식한다는 것을 알 수 있다. 이 자료는 도 2에 나타나있다.
CTAA 16.88 및 MCA 88BV59의 면역 활성의 특징을 추가로 특성화시키기 위해서, N-말단 단백질 서열 분석을 수행하였다. 도 3에 도시된 바와 같이, 역상 HPLC 피크 1에 위치한 폴리펩티드로부터 얻은 주 서열은 중간 섬유 단백질 시토케라틴8과 강한 상동성을 갖는다. CTAA 16.88로 부터의 재조합체를 수득할 수 없고 MCA 88BV59가 천연 시토케라틴 8과 반응하기 때문에, MCA 88BV59의 에피토프 특이성을 결정하기 위해서 시토케라틴 8에 대해 이전에 확정된 단백질을 사용하였다.
항체에 의해 인식되는 에피토프를 규정하기 위한 한 가지 방법은 박테리아 발현 시스템을 사용하여 반응성 단백질의 절편을 합성시킨 후 이들 펩티드를 대상 항체와 반응시키는 것이다. 상기 방법을 사용하여, 시토케라틴 8의 카르복시기 말단이 88BV59에 의해서 인식되는 에피토프를 포함한다는 것을 았았으며, 이는 도 4A에 예시되어 있다.
항체에 의해 인식되는 에피토프를 규정하는 또 다른 접근 방법은 PEPSCAN 방법이며, 이는 대상 단백질의 길이에 따라 각 위치에서 시작되는 규정 길이의 단 펩티드를 합성한 후 대상 항체와 펩티드를 반응시키는 것을 포함한다. 이 방법을 사용하여, 항체 88BV59는, 시토케라틴 8 미부의 넓은 부분, 아미노산 417-464 (437-453 아미노산 부분에서 가장 높은 반응성을 갖음)과 반응한다는 것을 알았다. 3개의 소부분은 또한 항체, 아미노산 353-366, 아미노산 400-411 및 아미노산 469-483 부분과 상당한 반응성을 나타낸다. 반응 프로파일의 이러한 형태는 구조적 에피토프의 전형적인 것이다. 이 결과는 도 4B에 나타나있다.
모노클로날 항체 16.88에 의해 표적이 되는 에피토프는 시토케라틴 8, 18 및 19와 관련된 에피토프이며, 16.88은 결합 활성을 보여주기 위해서 나타내었다. 특히, 에피토프는 아미노산 서열 ThrLeuGlnGlyLeuGluIleGluLeuGlnSerGlnLeuSerMetLys 또는 이의 작용성 단편 등가체를 포함하는 폴리펩티드이다.
단편이라는 용어는 88BV59 또는 16.88 에피토프의 아미노산 서열에 의해서 규정되는 폴리펩티드의 일부분을 포함하는 임의의 아미노산 서열을 말하며, 공통 구조 요소 및 항체 결합 특이성을 갖는다. 본 발명의 교시에 따라서 당업자들은 이를 제조할 수 있기 때문에 이 단편들은 본 발명의 범주에 있다.
본 명세서의 작용성 등가체는 88BV59 및 16.88 에피토프의 나열된 아미노산 서열의 항체 결합 특성을 유지하는 나열된 서열의 변형체를 의미한다. 이들의 기능적 특성은 항체 16.88과 반응할 수 있는 능력이다. 서열내에서 반응할 수 있는 변형체 및 남아있는 작용성 등가체는 결실, 치환, 삽입, 전환 또는 첨가에 의해서 생기는 하나 이상의 차이를 포함한다. 생물학적 및 면역학적 특성을 거의 변화시키지 않는 것으로 예상되는 아미노산 치환체가 개시되어 있다. 관련 아미노산 사이의 아미노산 치환체 또는 전개상에서 종종 발견되는 치환체는 Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, Ile/Val이다(Dayhof, M.D., Atlas of Protein Sequence and Structure, Nat. Biomed. Res. Found., 워싱톤 D.C., 1978, 5권, suppl.3). 이 정보에 기초하여 Lipman 및 Pearson 은 신속하고 감응성이 있는 단백질 비교(Science 227, 1435-1441, 1985) 및 상동 폴리펩티드 사이의 기능적 유사성을 결정하는 방법을 개발하였다. 기능적 등가체는 또한 나열된 아미노산 서열의 다량체를 포함하며, 이는 콘쥬게이션을 위한 다수의 결합 부위 또는 부위들을 제공한다. 에피토프의 아미노산 서열을 나열하므로서 본 발명을 청구하는 것은, 청구항이 본 명세서에서 정의한 작용적 단편 및 작용적 등가체를 포함하도록 하기 위해서이다.
발명의 개요
본 발명은 종양 항원 CTAA 16.88에서 발견되는 종양 관련 에피토프에 관한 것이다. 이들은 CTAA 16.88 및 천연 시토케라틴 8상에서 발견되고, 아미노산 서열 TyrSerLeuGlySerSerPheGlySerGlyAlaGlySerSerSerPheSer을 포함하는 88BV59 에피토프; 및 시토케라틴 8, 18 및 19에서 발견되는 에피토프와 동종이고 아미노산 서열 ThrLeuGlnGlyLeuGluIleGluleuGlnSerGlnLeuSerMetLys를 포함하는 CATT 16.88상에서 발견되는 16.88 에피토프; 및 이의 작용성 단편 및 등가체이다.
실시예 1
CTAA16.88은 HT-29 결장 종양 세포의 미정제 용해질로부터 황산 암모늄 침전, 겔 여과 크로마토그래피, 및 친화 또는 이온 교환 크로마토그래피로 정제한다(미국 특허 5,338,832 호에 개시). 정제된 항원을 Vydac C4역상 크로마토그래피 칼럼을 사용하여 크로마토그래피하며, 이를 Waters 고 성능 액체 크로마토그래피 시스템에서 분석한다. 칼럼을 0.1% 트리플루오로아세트산(TEA)을 포함하는 물에 서 평형시켰다. 시료를 평형 칼럼상으로 적재하고, 동일한 완충액으로 세척한 후 0.1% TFA를 포함하는 물에서 시작하고 0.1㎖/min의 유속으로 30분 동안 0.1% TFA를 포함하는 물중의 70% 아세토니트릴로 전개시킨 선형 구배를 사용하여 용출한다. 도 1에 도시된 바와 같이, 이들 조건하에서, 정제된 항원에 대하여 2개의 단백질 피크가 수득된다.
실시예 2
88BV59(시험되는 기타 항체 뿐만 아니라)의 면역 반응성을 측정하기 위해서, 효소 면역 분석을 실시하였다. 이 분석에서, 미세역가 플레이트를 칼럼의 피크 1 또는 칼럼의 피크 2에서 수득한 항체로 코팅시켰다. 코팅에 사용되는 항원의 농도는 포스페이트 완충액 염수중에서 10㎍/㎖였다. 플레이트를 2시간 동안 37℃에서 코팅하였다. 0.05% Tween을 함유하는 PBS 용액으로 세척한 후, 플레이트를 5㎍/㎖의 농도에서 MCA 88BV59를 비롯한 각종 항체와 함께 배양시켰다. 항체를 실온에서 2시간 동안 플레이트상에서 배양시켰다. 이어서 플레이트를 PBS-Tween 용액으로 세척한 후 KPL Laboratories(매릴랜드, 록빌 소재)에서 수득한 HRP-표지된 고우트 항-인체 Ig(G,A,M) 콘쥬게이트를 1:10.000의 희석액으로 처리하였다. 콘쥬게이트를 1시간 동안 실온의 플레이트 상에서 배양시킨 후 플레이트를 PBS-Tween 용액으로 세척하였다. 이어서, KPL Laboratories의 TMB 기질 시스템을 사용하여 색생을 전개시켰다. 도 2에 도시된 바와 같이, 효소 분석 결과는 88BV59을 역상 HPLC 의 피크 1과 강하게 반응하며, 피크 2와는 더 강하게 반응한다. 추가로, 상기 분석에서 피크 1은 시토케라틴 8에 특이적인 모노클로날 항체와 강하게 반응하였다.
실시예 3
MCA 88BV59에 의해서 인식되는 CTAA 16.88 항원의 부분을 특성화하기 위해서, 역상 HPLC 분석에서 피크 1으로 나타나는 항원을 단백질 서열 분석에 사용하였다. 이를 위하여, 어플라이드 바이오시스템즈, 인코오포레이티드(캘리포니아, 포스터 시티)의 기체 상 단백질 서열자 모델 470A를 사용하였다. 간단히, 500pm의 항원을 폴리브렌-코팅된 필터상에 놓고 단위체로 삽입시켰다. 아미노산을 PTH로 유도하고 서열적으로 분해시켰다. 아미노산을 유도하는 분열된 PTH는 microbore HPLC 유닛(모델 120A) 온라인을 사용하여 분석하였다. 단백질 서열 분석의 결과는 도 3에 도시되어 있으며, MCA 88BV59와 반응하는 CTAA 16.88의 피크 1에서 수득한 서열이 시토케라틴 8 중간 섬유 단백질과 높은 상동성을 갖는다는 것을 보여준다.
실시예 4
시토케라틴 8 유전자의 암호 부분에 상응하는 DNA를 공고된 서열2에 기초하여 나타낸 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 HT29 cDNA에서 증폭시켰다. 상기 DNA는 폴리머라아제 쇄 반응(PCR)에서 주형으로 사용되어 유전자의 3 단편을 증폭시키며, 상기 유전자는 도 4에 도시된 바와 같이 아미노산 83-483(코일 I, II, III 및 꼬리), 329-483(코일 III의 C-말단 1/2 및 꼬리) 및 400-483(꼬리)에 상응한다. EcoRI 및 BamHI 제한 부위를 사용하여 이들 단편을 이. 콜리 발현/융합 백터 pMLB1113내로 클론하였으며, 상기 방법에서는 시토케라틴 서열은 β-갈락토시다아제의 아미노 말단에 융합 발현되었다. 시료는 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS 폴리아크릴아미드 겔로 분석하므로서 발현 농도를 시험하였다. 융합 단백질의 정상화된 양은 웨스턴 블롯 분석에 의해 88BV59 항체에 대한 반응성으로 시험하였다. 간단히, 융합 단백질을 생성하는 클론의 세포 용해물 시료를 8% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하고 니트로셀룰로스로 이동시켰다. 웨스턴 블롯을 88BV59(5㎍/㎖)와 반응시킨 후 호스래디시(horseradish) 퍼옥시다아제에 콘쥬게이트된 고우트 항-인체 IgG 항체를 사용하여 검출하였다. 융합 단백질 3개 모두 항체와 반응하였고, 따라서 분자의 C-말단 부분이 에피토프를 포함하다는 것을 알았다. 이들 자료는 도 4A에 나타나있다.
실시예 5
88BV59와 반응하는 에피토프를 추가로 규정하기 위해서, 소위 PEPSCAN3방법을 사용하였다. 간단히, 시토케라틴 분자의 제 3 코일 및 꼬리 부분에 상응하는 서열을 사용하여 단백질 절편을 따라 각 위치에서 시작하는 12-mer 펩티드를 발생시켰다. 이들 펩티드 각각은 하이브리드화의 액체/액체 형태에서 88BV59와 반응시킬 수 있다. 양성 반응성은 간접 효소 결합 분석으로 분석하였다. 상기 방법으로 88BV59는 구조 에피토프의 전형적인 시토케라틴 부분, 아미노산 417-464의 넓은 부분과 반응한다는 것을 알았다. 아미노산 437-453의 부분에서 고 반응성을 갖는다. 추가적으로, 3개의 소부분은 또한 항체, 아미노산 353-366, 아미노산 400-411, 및 아미노산 469-483과 상당한 반응성을 보여주었다. 이들 자료는 도 4B에 나타나있다.
가장 높은 반응 영역은 아미노산 437-453에서 발견된다: Tyr Ser Leu Gly Ser Ser Phe Gly Ser Gly Ala Gly, Ser Ser Ser Phe Ser.
단독으로는 개개의 결합 부위이며 함께 구조적 에피토프를 형성하는 88BV59와 반응성이 있는 기타 부분은 하기의 아미노산을 포함한다:
아미노산 353-366:
Leu Ser Glu Leu Glu Ala Ala Leu Gln Arg Ala Lys Gln Asp,
아미노산 400-411:
Ser Arg Leu Glu Ser Gly, Met Gln Asn Met Ser Ile,
아미노산 417-436:
Gly Gly Tyr Ala Gly Gly Leu Ser Ser Ala Try Gly Asp Leu Thr Asp Pro Gly Leu Ser,
아미노산 454-464:
Arg Thr Ser Ser Ser Arg Ala Val Val Val Ile
및 아미노산 469-483:
Arg Asp Gly Lys Leu Val Ser Glu Ser Ser Asp Val Leu Pro Lys.
활성 특이 면역 치료를 위한 성공적인 백신의 요건
보조제 (a) BCG(Phipps, Tice, Connaught); 냉동 건조, 동결(투여량-기준 106(107-108))
(b) C. parvum(Wellcome Labs) (투여량-기준7㎍(70㎍-700㎍))
종양세포 (a) 효소적 분해(1) 콜라게나제 타입 I (1.5-2.0 U/㎖ HBSS)(2) DNAase (450 D.U./㎖ HBSS)(3) 교반하의 37℃
(b) 저온 보관(1) 조절된 냉동 속도(-1℃/분) (7.5% DMSO, 5% HSA, HBSS)(2) 생육도 80%
(c) X-조사(1) 12,000-20,000R에서 비-종양원이 됨
조성및투여1) (a) 종양 세포에 대한 보조제의 비율-10:1-1:1(최적)
(b) 107종양 세포(최적)
(c) 1주 간격으로 2 내지 3회 피내 백신 주사.제 3회 백신 주사는 종양 세포만을 포함
1)임의의 BCG 감염의 이소니아지드 화학 예방BCG-바실러스 칼메트 구에린HBSS-행크스' 벨란스드 생리 염수DMSO-디메틸설폭시드HSA-인체 혈청 알부민R-라즈(Rads)PBS-포스페이트 완충 염수EDTA-에틸렌디아민테트라아세트산
인체 모노클로날 항체 88BV59의 반응성
아세톤-충진의 종양 세포a)를 이용한 간접적인 면역 형광
세포주 종양 종류 형광 강도a)
Ht-29 결장암 3+
SKCO-1c) 결장암 3+
LS174 결장암 4+
WiDr 결장암 N.T.e)
HCT-8 결장암 -
Bt-20b) 유방암 3+
EPb) 유방암 2+
MCF-7 유방암 4+
SKBR-III 유방암 -
CaLu-1c) 폐암 4+
A2780 자궁암 -
Ovcar3c) 자궁암 4+(30%)d)
WI-38 정상 섬유 아세포 -
a)형광 강도: 4+ 강, 3+ 중, 2+ 약 내지 중, 1+ 약, - 음성.88BV59의 농도는 10㎍/㎖였다. 대조군 인체 IgG 10ηg/㎖로 염색한 것은 모든 세포에서 음성이었다.b)유사 분열시 세포상에서 염색이 우세하게 나타남.c)염색은 섬유질 세포 골격 염색 패턴을 나타냄.d)형광 강도를 나타내는 세포의 백분율은 다른 언급이 없는 한 100%임.e)NT-시험하지 않음
각종 종양 형태와 88BV59의 반응성
종양 형태 반응성 조직의 수 시험조직의 총 수 백분율
결장 17 23 74
유방 19 19 100
난소 13 17 76
췌장 3 9 33
폐 3 4 75
전립선 4 6 67
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Claims (3)

  1. 하기의 아미노산 서열을 포함하는 MCA 88BV59와 반응성이 있는 에피토프:
  2. 로 구성된 군에서 선택된 하나이상의 아미노산 서열을 포함하는 MCA 88BV59와 반응성이 있는 에피토프.
  3. 제 1 항에 있어서,
    로 구성된 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열을 추가로 포함하는 에피토프.
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