RU2163243C2 - Белки из печени козы, обладающие противоопухолевой активностью, фармацевтическая композиция - Google Patents
Белки из печени козы, обладающие противоопухолевой активностью, фармацевтическая композиция Download PDFInfo
- Publication number
- RU2163243C2 RU2163243C2 RU97101876/04A RU97101876A RU2163243C2 RU 2163243 C2 RU2163243 C2 RU 2163243C2 RU 97101876/04 A RU97101876/04 A RU 97101876/04A RU 97101876 A RU97101876 A RU 97101876A RU 2163243 C2 RU2163243 C2 RU 2163243C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- proteins
- antitumor activity
- pharmaceutical composition
- amino acid
- protein
- Prior art date
Links
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 title claims abstract description 17
- 241000283707 Capra Species 0.000 title claims abstract description 8
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims abstract description 5
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims abstract description 5
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 2
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 claims 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 claims 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 claims 1
- 239000000076 hypertonic saline solution Substances 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 2
- 230000007721 medicinal effect Effects 0.000 abstract 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 6
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 238000011141 high resolution liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 102000005431 Molecular Chaperones Human genes 0.000 description 2
- 108010006519 Molecular Chaperones Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 2
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical class P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 229940040511 liver extract Drugs 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 102000002812 Heat-Shock Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010004889 Heat-Shock Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 239000000032 diagnostic agent Substances 0.000 description 1
- 229940039227 diagnostic agent Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 230000005965 immune activity Effects 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000010309 neoplastic transformation Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 1
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 210000004872 soft tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F01—MACHINES OR ENGINES IN GENERAL; ENGINE PLANTS IN GENERAL; STEAM ENGINES
- F01D—NON-POSITIVE DISPLACEMENT MACHINES OR ENGINES, e.g. STEAM TURBINES
- F01D25/00—Component parts, details, or accessories, not provided for in, or of interest apart from, other groups
- F01D25/28—Supporting or mounting arrangements, e.g. for turbine casing
- F01D25/285—Temporary support structures, e.g. for testing, assembling, installing, repairing; Assembly methods using such structures
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
- C07K14/4703—Inhibitors; Suppressors
-
- F—MECHANICAL ENGINEERING; LIGHTING; HEATING; WEAPONS; BLASTING
- F23—COMBUSTION APPARATUS; COMBUSTION PROCESSES
- F23R—GENERATING COMBUSTION PRODUCTS OF HIGH PRESSURE OR HIGH VELOCITY, e.g. GAS-TURBINE COMBUSTION CHAMBERS
- F23R3/00—Continuous combustion chambers using liquid or gaseous fuel
- F23R3/42—Continuous combustion chambers using liquid or gaseous fuel characterised by the arrangement or form of the flame tubes or combustion chambers
- F23R3/60—Support structures; Attaching or mounting means
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B23—MACHINE TOOLS; METAL-WORKING NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- B23P—METAL-WORKING NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; COMBINED OPERATIONS; UNIVERSAL MACHINE TOOLS
- B23P2700/00—Indexing scheme relating to the articles being treated, e.g. manufactured, repaired, assembled, connected or other operations covered in the subgroups
- B23P2700/13—Parts of turbine combustion chambers
Landscapes
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Mechanical Engineering (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Combustion & Propulsion (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Настоящее изобретение относится к белкам, имеющим молекулярный вес от приблизительно 10 до приблизительно 14 кДа и частичную аминокислотную последовательность. Последовательности с номером идентификации N 1, которые охарактеризованы в описании. Получение указанных последовательностей возможно путем экстрагирования из козьей печени хлорной кислотой. В данном изобретении описывается также получение фармацевтической композиции, обладающей противоопухолевой активностью для парентерального использования, включающей в качестве активного начала белки по п.1 в смеси с подходящим носителем. 2 с. и 2 з.п., 1 табл.
Description
Настоящее изобретение относится к белкам, выделяемым из тканей животных, в частности из печени млекопитающих, и их применение в онкологии.
В WO 92/10197 заявлены экстракты из органов млекопитающих, в частности печени козы, содержащие, по меньшей мере, три различных белка и отличающиеся необычными фармакологическими и иммунологическими свойствами. Однако в ней не приводится какой-либо информации о той роли, которую они играют, или о последовательности аминокислотных остатков индивидуальных компонентов белков.
Димерный белок размером 23 килодальтон, выделяемый с помощью экстракции 5%-ным раствором хлорной кислоты из печени и почки крысы, описывается в публикации Eur. J. Biochem. 272, 665, 1993. Соответствующая последовательность комплементарной ДНК депонирована в банке данных EMBL и получила при регистрации номер X70825.
Было высказано предположение, что этот белок, который, как указывается, экстрагируется совместно с группой белков высокой мобильности, играет определенную роль в процессе укладки цепи белков, так что его можно считать членом класса так называемых шаперонов.
В WO 93/18146 заявляется белок, экстрагированный из печени кролика и имеющий молекулярный вес 59 килодальтон, который способен образовывать комплексы с шаперонами и белками теплового шока с массой 90 килодальтон.
Было показано, что новый белок, выделенный путем очистки из экстракта, описанного в WO 92/10197, имеет частичную последовательность аминокислотных остатков, приведенную в виде последовательности с номером идентификации N 1.
Благодаря следующим свойствам этот белок применяют в онкологии:
- сыворотка животных после вакцинации белком проявляет цитотоксическую активность по отношению к культурам клеток опухоли человека;
- белок обладает ярко выраженной противоопухолевой активностью при дозах 0,015 мкг/кг у мышей Balb/c, страдающих от аденокарциономы мышей (с26), и у крыс, страдающих от внутриплевральной асцитной опухоли Yoshida;
- при назначении животным, в том числе человеку, белок приводит к увеличению количества антител, способных распознавать раковые клетки человека.
- сыворотка животных после вакцинации белком проявляет цитотоксическую активность по отношению к культурам клеток опухоли человека;
- белок обладает ярко выраженной противоопухолевой активностью при дозах 0,015 мкг/кг у мышей Balb/c, страдающих от аденокарциономы мышей (с26), и у крыс, страдающих от внутриплевральной асцитной опухоли Yoshida;
- при назначении животным, в том числе человеку, белок приводит к увеличению количества антител, способных распознавать раковые клетки человека.
Указанные свойства позволяют объяснить активность, наблюдаемую при проведении клинических испытаний, которые заключаются в назначении экстрактов, приведенных в WO 92/10197, пациентам, пораженным развившимся раком легкого, молочной железы, желудка, толстой кишки и печени.
Белки по настоящему изобретению в значительной степени гомологичны белкам, экстрагированным из печени крыс и приведенным в Eur. J. Biochem. 272, 665, 1993.
Белки, обладающие высокой степенью гомологии с последовательностью с номером идентификации N 1, были также обнаружены в печени различных видов животных, в частности, в печени быка и лошади. Изобретение относится также к указанным гомологичным последовательностям, за исключением известной последовательности из печени крысы.
Таким образом, обнаружено новое семейство белков: члены этого ранее неизвестного семейства отличаются высокой степенью консервативности и гомологии у разных видов млекопитающих, а их молекулярный вес составляет приблизительно от 10 килодальнон до приблизительно 14 килодальтон.
Термин "высокая степень гомологии" означает, что гомология аминокислотных последовательностей составляет около 80% или более, преимущественно 90% или более.
Изобретение далее относится к использованию указанных ранее белков, способных экстрагироваться из печени млекопитающих с помощью хлорной кислоты, в онкологии в качестве терапевтического и/или диагностического средства.
Таким образом, в изобретении заявляются фармацевтические композиции, содержащие белок, имеющий неполную последовательность аминокислотных остатков, соответствующую последовательности с номером идентификации N 1, или белки, которые, по крайней мере, на 80%, предпочтительно на 90%, гомологичны последовательности с номером идентификации N 1.
Фармацевтические композиции по настоящему изобретению назначают парентерально, преимущественно подкожно или внутримышечно, и обычно содержат от 0,1 до 50 мг общего белка в одной единичной дозе. Активную составную часть белка, очищенного обычными способами, можно лиофилизовать в подходящем нетоксичном носителе и поместить в пузырьки или склянки.
Подходящие растворители включают воду и солевые физиологические растворы.
В соответствии с еще одним вариантом осуществления настоящего изобретения, белки по настоящему изобретению или их фрагменты, синтезированные, например, химическим путем, могут использоваться для получения поликлональных или моноклональных антител. Особенно интересные антитела распознают антигены опухоли, а поэтому полезны для диагностических, терапевтических и исследовательских целей. Два из указанных антител были депонированы 27 июля 1993 г. в Европейской коллекции культур клеток животных (ECACC), Porton Down, Salisbury, UK и получили при регистрации номера 930806103 и 930806104.
Указанные антитела используются при проведении иммунологических испытаний нескольких полученных биопсией образцов рака человека и позволяют провести их распознавание.
Белки по настоящему изобретению при назначении пациентам, пораженным вызываемыми опухолями заболеваниями, помимо благотворного воздействия, такого как подавление или регрессия опухолевой массы, уменьшение боли и улучшение общего состояния, приводят к индуцированию антител, обладающих цитотоксическим воздействием на культуры клеток опухоли. Для указанного цитотоксического воздействия необходима цельная сыворотка, не освобожденная от комплементного каскада.
При использовании в терапевтических целях или в качестве вакцины для иммунизации против неопластической трансформации белки по настоящему изобретению могут назначаться подкожно, внутримышечно или внутривенно с дозами в интервале от 0,1 до 30 мг в день на одного пациента. Лечение можно проводить в течение длительного периода времени до тех пор, пока концентрация индуцированных антител не достигнет обычного уровня.
Концентрацию индуцированных антител можно определить обычными способами, применяя, например, иммуноферментные методы. С этой целью в изобретении заявляются диагностические наборы, включающие реагенты, имеющие соответствующие метки, в частности, в качестве антигена белок по настоящему изобретению или его фрагменты, необязательно иммобилизованные на подходящем носителе, антииммуноглобулиновые антитела и соответствующие реагенты, способные обнаружить, например, с помощью колориметрической реакции, комплекс антиген-антитело.
Белки по настоящему изобретению можно назначать вместе с подходящими носителями, играющими роль вспомогательных средств. Подходящие вспомогательные средства можно выбрать, например, из нетоксичных белков, преимущественно ксеногенных белков, в частности, белков тех же видов животных, у которых проводили экстракцию иммуногенного белка.
Белки по настоящему изобретению получают, подвергая сырой экстракт, полученный путем экстракции органов хлорной кислотой, а затем гипертоническими физиологическими растворами (например, 3 M раствором хлорида калия) с последующим диализом, очистке с помощью методов жидкостной хроматографии высокого разрешения и гидрофобной обменной хроматографии (жидкостной экспресс-хроматографии белков), как это далее описывается в примерах.
Белок, выделенный из печени козы, блокируют по N-концу и частично определяют последовательность его аминокислотных остатков после расщепления с помощью CNBr, получая два основных фрагмента с молекулярным весом (определяют по методу MALDI-TOF), соответственно, 10263 и 4063 дальтон, в то время как молекулярный вес до расщепления составляет 14290 дальтон, что согласуется с величиной, полученной электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия.
Изобретение поясняется следующими примерами.
Пример 1
Экстракт из печени козы, полученный как указано в WO 92/10197, и который далее обозначают как UK 101, концентрируют на мембране Amicon PM 10 и затем подвергают диализу по отношению к 0,01 М раствору NaH2PO4/Na2HPO4 с pH 6,5. Полученный продукт очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на колонке TSK DEAE 5 PW, уравновешенной указанным буферным раствором; исходный буфер отбирают, а белок, абсорбированный на смоле, элюируют 1 М раствором хлорида натрия. Пик, элюирующийся в исходном буфере, далее очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на колонке TSK SW 3000.
Экстракт из печени козы, полученный как указано в WO 92/10197, и который далее обозначают как UK 101, концентрируют на мембране Amicon PM 10 и затем подвергают диализу по отношению к 0,01 М раствору NaH2PO4/Na2HPO4 с pH 6,5. Полученный продукт очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на колонке TSK DEAE 5 PW, уравновешенной указанным буферным раствором; исходный буфер отбирают, а белок, абсорбированный на смоле, элюируют 1 М раствором хлорида натрия. Пик, элюирующийся в исходном буфере, далее очищают методом жидкостной хроматографии высокого разрешения на колонке TSK SW 3000.
После проведения указанных хроматографических очисток получают два основных пика: первый отбрасывают, поскольку он в основном состоит из гликогена; второй, наиболее обогащенный белками с низким молекулярным весом, затем очищают методом жидкостной экспресс-хроматографии белков на колонке Protein-Рас HIC Phenyl 5 PW.
Очистку на указанной колонке гидрофобной обменной хроматографии проводят в следующих условиях: вначале элюируют исходный буфер, 20 мМ Tris HCl с pH 7, содержащий 1 М раствор сульфата аммония, а затем проводят элюирование в линейном градиенте, заканчивая 20 мМ раствором Tris-HCl без сульфата аммония. Исходный буфер отбрасывают, а зону, элюирующуюся в градиенте молярности сульфата аммония от 0,6 до 0,8 М, собирают и подвергают диализу по отношению к воде.
Получают образец, который далее обозначают как UK 114, показывающий белковую полосу размером около 14 килодальтон при проведении электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и степень чистоты около 90%.
Пример 2
При проведении иммуноцитохимических испытаний используют поликлональные антитела, индуцированные у кроликов, которым еженедельно в течение двух месяцев подкожно вводят вакцину экстракта из печени козла (WO 92/10197) в виде забуференного фосфатом солевого раствора, содержащего полный адъювант Фрейнда.
При проведении иммуноцитохимических испытаний используют поликлональные антитела, индуцированные у кроликов, которым еженедельно в течение двух месяцев подкожно вводят вакцину экстракта из печени козла (WO 92/10197) в виде забуференного фосфатом солевого раствора, содержащего полный адъювант Фрейнда.
Моноклональные антитела получают от мышей Balb/c через месяц после еженедельных подкожных инъекций по 100 мкг UK 101 в неполном адъюванте Фрейнда. Слияние с миеломными клетками лейкоцитов, выделенных у животных, вакцинированных против UK 101, проводят обычными способами. Две, из полученных гибридом, депонируют 27 июля 1993 г. в Европейской коллекции культур клеток животных (ЕСАСС), Porton Down, Salisbury, UK и при регистрации присваивают им номера 930806103 и 930806104.
Антитела, секретируемые указанной гибридомой, распознают по настоящему изобретению.
Моно- и поликлональные антитела исследуют с помощью иммуноцитохимических тестов, которые проводят на 30 полученных методом биопсии образцах злокачественных опухолей, выделенных из различных органов, таких как молочная железа, легкое, мочевой пузырь, желудок, толстая кишка/прямая кишка, матка, мягкие ткани, предстательная железа. Ткани фиксируют в 10%-ном забуференном растворе формалина и препараты в парафине окрашивают, используя набор Mistostatin Kit SP, выпускаемый компанией "Zymed Lab. Inc.".
Срезы выдерживают при температуре 4oC в инкубаторе вместе с антителами (0,5 мкг/л иммуноглобулина в забуференном фосфатом солевом растворе, содержащем 1% бычьего сывороточного альбумина) в течение ночи. После промывки срезы в течение 60 минут выдерживают в инкубаторе вместе с антикроличьим свиным биотинилированным иммуноглобулином, а затем еще 60 минут с разбавленным 1: 100 пероксидированным комплексом стрептавидин-биотин. Связывание пероксидазы определяют с помощью реакции 3,3-диаминобензидин/перекись водорода. Положительными считаются ткани, показывающие специфическую реакцию против антител в цитоплазме. Иммунную активность для нормальных тканей оценивают как отрицательную, слегка положительную, положительную (++) и сильно положительную (+++). Результаты приведены в таблице. Иммуноцитохимическая активность с различными поликлональными антителами против экстрактов из печени козы, теленка и лошади обнаруживается в большинстве злокачественных опухолей (82,7% для антител против экстракта из печени лошади и 100% против экстракта из печени теленка). Моноклональное антитело, секретируемое гибридомой с номером 930806103, дает положительные результаты для 93,7% исследованных опухолей.
Claims (4)
1. Белки, имеющие молекулярный вес приблизительно от 10 до приблизительно 14 кДа и частичную аминокислотную последовательность Последовательности с номером идентификации 1 или последовательностей, которые, по крайней мере, на 80% гомологичны указанной Последовательности с номером идентификации 1, экстрагируемые из козьей печени хлорной кислотой, а затем гипертоническими солевыми растворами с последующим диализом и очисткой методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и гидрофобной обменной хроматографией.
2. Белки по п.1, по крайней мере, на 90% гомологичны указанной Последовательности с номером идентификации 1.
3. Белки по п.1, проявляющие противоопухолевую активность для использования в противораковой терапии.
4. Фармацевтическая композиция, обладающая противоопухолевой активностью для парентерального использования, отличающаяся тем, что содержит в качестве активного начала белки по п.1 в смеси с подходящим носителем.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
ITMI941469A IT1270618B (it) | 1994-07-14 | 1994-07-14 | Proteine ad attivita' antitumorale |
ITMI94A001469 | 1994-07-14 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU97101876A RU97101876A (ru) | 1999-03-10 |
RU2163243C2 true RU2163243C2 (ru) | 2001-02-20 |
Family
ID=11369276
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU97101876/04A RU2163243C2 (ru) | 1994-07-14 | 1995-07-12 | Белки из печени козы, обладающие противоопухолевой активностью, фармацевтическая композиция |
Country Status (20)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5792744A (ru) |
EP (1) | EP0770093A1 (ru) |
JP (1) | JPH10502814A (ru) |
KR (1) | KR100425627B1 (ru) |
CN (1) | CN1146576C (ru) |
AU (1) | AU702294B2 (ru) |
BR (1) | BR9508382A (ru) |
CA (1) | CA2194861A1 (ru) |
CZ (1) | CZ289380B6 (ru) |
FI (1) | FI970097A (ru) |
HU (1) | HU218285B (ru) |
IL (1) | IL114561A (ru) |
IT (1) | IT1270618B (ru) |
MX (1) | MX9602557A (ru) |
NO (1) | NO970114L (ru) |
RU (1) | RU2163243C2 (ru) |
TR (1) | TR199500854A2 (ru) |
TW (1) | TW434257B (ru) |
WO (1) | WO1996002567A1 (ru) |
ZA (1) | ZA955837B (ru) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1276707B1 (it) * | 1995-06-13 | 1997-11-03 | Zetesis Spa | Composizioni farmaceutiche ad attivita' analgesica |
IT1282608B1 (it) * | 1996-02-13 | 1998-03-31 | Zetesis Spa | Sequenza oligonocleotidica da fegato di capra |
IT1284524B1 (it) * | 1996-09-13 | 1998-05-21 | Zetesis Spa | Uso di proteine come agenti anti-retrovirali |
KR20000036207A (ko) | 1996-09-18 | 2000-06-26 | 스피니엘로 살바토르 | 자가면역 질환 치료제로서의 단백질의 용도 |
IT1290828B1 (it) * | 1997-03-25 | 1998-12-11 | Zetesis Spa | Uso di proteine estraibili da organi animali per la preparazione di medicamenti per il trattamento di condizioni patologiche |
IT1298442B1 (it) * | 1998-02-24 | 2000-01-10 | Zetesis Spa | Composizioni orali a basso dosaggio di proteine citotossiche |
US20010014471A1 (en) * | 1999-04-15 | 2001-08-16 | Vytautas Naktinis | Recombinant protein and its use in therapy and diagnostics |
AU7700900A (en) * | 1999-09-03 | 2001-04-10 | Vigen Laboratories, Inc. | Enriched fraction from a porcine liver extract for treating human diseases |
ITMI20010762A1 (it) * | 2001-04-10 | 2002-10-10 | Zetesis Spa | Uso della proteina uk114 o di suoi frammenti per il trattamento e la prevenzione dello shock endotossico |
ITMI20022307A1 (it) * | 2002-10-30 | 2004-04-30 | Zetesis Spa | Associazioni anti-tumorali comprendenti proteine e chemioterapici. |
CN104610762A (zh) * | 2015-01-16 | 2015-05-13 | 青岛新诺科铸造材料科技有限公司 | 一种填充型精密铸造低温调制蜡及其制备方法 |
IT201600127428A1 (it) * | 2016-12-16 | 2018-06-16 | Cusani Alberto Bartorelli | Nuova proteina ricombinante uk 114 in forma stabile polimerica per uso nella terapia, nella diagnostica e nella prevenzione di neoplasie maligne |
IT201900022203A1 (it) | 2019-11-26 | 2021-05-26 | Cusani Alberto Bartorelli | Proteine uk 114 da salmone per uso nella terapia, nella diagnostica e nella prevenzione di neoplasie maligne |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IT1244879B (it) * | 1990-12-11 | 1994-09-12 | Alberto Bartorelli | Estratti da tessuti animali, utili in terapia e in diagnostica. |
-
1994
- 1994-07-14 IT ITMI941469A patent/IT1270618B/it active IP Right Grant
-
1995
- 1995-07-12 CA CA002194861A patent/CA2194861A1/en not_active Abandoned
- 1995-07-12 EP EP95943524A patent/EP0770093A1/en not_active Ceased
- 1995-07-12 RU RU97101876/04A patent/RU2163243C2/ru not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 HU HU9700057A patent/HU218285B/hu not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 US US08/765,957 patent/US5792744A/en not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-12 MX MX9602557A patent/MX9602557A/es not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 IL IL11456195A patent/IL114561A/xx not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 AU AU30779/95A patent/AU702294B2/en not_active Ceased
- 1995-07-12 CZ CZ199769A patent/CZ289380B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 WO PCT/EP1995/002723 patent/WO1996002567A1/en not_active Application Discontinuation
- 1995-07-12 JP JP8504683A patent/JPH10502814A/ja not_active Ceased
- 1995-07-12 CN CNB951941186A patent/CN1146576C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1995-07-12 BR BR9508382A patent/BR9508382A/pt not_active IP Right Cessation
- 1995-07-12 KR KR1019970700272A patent/KR100425627B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-07-13 ZA ZA955837A patent/ZA955837B/xx unknown
- 1995-07-14 TR TR95/00854A patent/TR199500854A2/xx unknown
- 1995-07-17 TW TW084107362A patent/TW434257B/zh not_active IP Right Cessation
-
1997
- 1997-01-10 NO NO970114A patent/NO970114L/no not_active Application Discontinuation
- 1997-01-10 FI FI970097A patent/FI970097A/fi not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
Eur.J.Biochem. (1993), 212(3), 665-673. * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HU9700057D0 (en) | 1997-02-28 |
NO970114L (no) | 1997-03-05 |
AU702294B2 (en) | 1999-02-18 |
CZ6997A3 (en) | 1997-08-13 |
IL114561A0 (en) | 1995-11-27 |
ITMI941469A1 (it) | 1996-01-14 |
IT1270618B (it) | 1997-05-07 |
CN1152924A (zh) | 1997-06-25 |
CN1146576C (zh) | 2004-04-21 |
US5792744A (en) | 1998-08-11 |
FI970097A0 (fi) | 1997-01-10 |
HU218285B (en) | 2000-07-28 |
EP0770093A1 (en) | 1997-05-02 |
FI970097A (fi) | 1997-03-06 |
JPH10502814A (ja) | 1998-03-17 |
WO1996002567A1 (en) | 1996-02-01 |
TW434257B (en) | 2001-05-16 |
NO970114D0 (no) | 1997-01-10 |
AU3077995A (en) | 1996-02-16 |
ZA955837B (en) | 1996-02-21 |
TR199500854A2 (tr) | 1996-06-21 |
CZ289380B6 (cs) | 2002-01-16 |
MX9602557A (es) | 1997-05-31 |
KR100425627B1 (ko) | 2004-06-18 |
HUT76328A (en) | 1997-08-28 |
CA2194861A1 (en) | 1996-02-01 |
ITMI941469A0 (it) | 1994-07-14 |
IL114561A (en) | 2000-11-21 |
BR9508382A (pt) | 1997-12-23 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Kuhajda et al. | Expression of haptoglobin-related protein and its potential role as a tumor antigen. | |
RU2163243C2 (ru) | Белки из печени козы, обладающие противоопухолевой активностью, фармацевтическая композиция | |
JP3502125B2 (ja) | 形質転換細胞の抽出および培養ならびにそれらに対する抗体の製造 | |
US5866690A (en) | Detection of malignant tumor cells | |
US4486538A (en) | Detection of malignant tumor cells | |
IBRAHIM et al. | Reproductive tract secretions and bull spermatozoa contain different clusterin isoforms that cluster cells and inhibit complement‐induced cytolysis | |
US5824640A (en) | Substances of polypeptide nature useful in human therapy | |
Takacs et al. | Activated macrophages and antibodies against the plant lectin, GSI-B4, recognize the same tumor-associated structure (TAS). | |
Reuter et al. | Molecular relationships between U snRNP proteins as investigated by rabbit antisera and peptide mapping | |
Ross et al. | Monoclonal antibodies as applied to tumor-associated antigens: the CO 17-1A antigen | |
WO1981001849A1 (en) | Purified human prostate antigen | |
WO1988004779A1 (en) | Method of treatment of mammals using antibodies to early pregnancy factor (epf) | |
Nakamura et al. | Oligomeric IgA: the major component of the in vitro primary response of mouse spleen fragments | |
US5003048A (en) | Method for the purification of lymphokine LK 2 | |
JPH076982B2 (ja) | 抗 体 | |
JPH05506241A (ja) | 35kd腫瘍関連タンパク質抗原および免疫複合体 | |
JP2690956B2 (ja) | 生体由来のタンパク質 | |
CA2222551A1 (en) | Tumor associated epitopes | |
JPWO2003099869A1 (ja) | 8−ニトログアニンを認識する抗体 | |
Larose | The Fate of Soluble Protein Antigens | |
WO2001064869A2 (en) | Tumor-related antigen | |
JPH0759589A (ja) | モノクローナル抗体、その製造法および用途 | |
JP2004041084A (ja) | ヘリコバクター・ピロリ菌に対するワクチン用ペプチド、それをコードする遺伝子、その遺伝子が導入された形質転換体、及びそれらの利用方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20050713 |