TW434257B - Proteins from mammalian liver and their use in oncology - Google Patents
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Description
4342 5 7 Λ7 B7 經濟部中央標準局貝工消资合作社印製 五、 發明説明 (1 L ) 本 發 明 係 m 於 得 自 動 物 組 織 > 特 別 得 自 哺 乳 動 物 肝 臟 之 蛋 白 質 及 其 用 於 腫 瘤 方 面 之 用 途 0 V0 92/10197 揭 示 ,ί, 哺 乳 動 物 器 官 特 別 山 羊 肝 臟 之 萃 取 物 其 由 至 少 二 種 不 同 的 蛋 白 質 組 成 並 Μ 不 尋 常 的 藥 理 及 免 疫 學 性 質 為 特 徵 0 該 案 未 報 m 個 別 m (a 質 成 分 之 真 JE 角 色 及 序 列 〇 可 使 用 5¾ 過 氛 酸 由 大 鼠 IT- 臟 及 哿 臓 萃 取 出 23 -ΟΛ -» 元 蛋 白 質 揭 示 於 Eu Γ , J * b i 0 C he m + 272 ,665 ,1 99 3 ( >對應之 CDNA 序 列 寄 存 於 EHBL 買 料 庫 寄 存 編 號 為 X70825 〇 此 種 蛋 白 質 據 報 導 可 與 高 活 動 力 群 (mm6)蛋白質共同萃 \ 取 出 此 暗 示 其 .在 蛋 白 質 的 摺 上 扮 演 某 種 色 因 此 被 認 為 屬 於 所 諝 的 tt C ha p e Γ 0 n S rl 或C ha P e Γ 0 n i ns 的 組 別 中 之 一 員 〇 W0 93/18146 揭示- -種可與C ha P e Γ 0 n s 複 合 並 具 有 分 子 量 59kd 之 由 兔 肝 臟 萃 取 的 蛋 白 質 及 90kd 之 熱 νβί 蛋 白 質 〇 W0 92/ 1 0 1 9 7所擷示之由萃取物純化得到之新頭甭曲質琨 在 被 發 現 具 有 序 列 識 別 編 號 1之部分胺基酸序列。 該 蛋 白 質 由 於 具 有 下 列 性 質 故 可 用 於 腫 瘤 力 面 便 用 該 m 1¾ 質 免 疫 之 動 物 之 血 清 對 人 類 腫 痛 細 胞 培 養 物 顯 示 細 胞 毒 性 ; — 該 蛋 白 質 在 患 有 鼠 結 腸 線 癌 (C2t5)之 B a 1 b/ C小鼠體內及 在 患 有 胸 腔 內 吉 田 腹 水 癌 之 大 鼠 體 内 1 於 0 . 0 1 5 m g / k g 上 劑 最 下 具 有 明 顯 抗 臆 瘤 活 性 » — 當 投 予 動 物 體 (包含人體) 時 可 提 高 可 辨 認 人 類 腰 瘤 细 胞 木吆张玟戍過爪t内㈣家標苹(CMS )八4』兄格(} 43425 ·τ Λ7 Β7 經濟部t央標準局員工消资合作社印製 五、 發明説明(2) 1 1 之 抗 體 0 1 1 I 該 等 性 質 可 說 明 臨 床 試 驗 中 將 W0 9 2 / 1 0 9 7萃取物投予患 1 \ 有 肺 Λ 乳 房 Μ 结 腸 及 ST- 臟 m 度 癌症 之病人時所觀察到 請 先 1 i U] | 之 活 性 〇 讀 背 1¾ | 本 發 明 之 蛋 白 質 與 Eu r , J • B i 0 C hem. 2 7 2 , 6 6 5 , 1 9 9 3 所揋 之 1 Ϊ t 1 I 示 的 由 大 鼠 肝 臟 萃 取 到 的 蛋 白 質 具 髙度 同源性。 市 項 存 填 % 1 與 序 列 識 別 編 號 1具_高度而源性之蛋白質也出現於不同 裝 1 種钟物听)&特別是牛及 禺 肝 臟 〇 本 發 明亦 關於此等類似序列 本 η > 不 過 得 白 大 鼠 肝 臟 之 已 知 序 列 除 外。 ί 1 因 此 發 現 __» 類 新 穎 蛋 白 質 此 種 先前 未'知類別之成員其 \ 1 1 徽為在.哺乳勒物稲屜間具有高度 保留 性及1¾源性及分子 1 訂 \ 量 於約]0 K D a至約1 4 K D a 之 m 圃 0 1 1 Γ 高 度 同 源 J —* 詞 表 示 胺 基 酸 序 列之 同源性約8 0 S!或更 1 1 高 較佳90¾或更高 ·> ί 1 本 發 明 又 係 關 於 j·»*- 月U 述 得 商 哺 乳 動 物肝 臟之可使用過氮酸 , 線 萃 取 的 蛋 白 質 用 於 臞 m 方 面 作為治療及/或診斷工具之 I 用 途 〇 ί i 因 此 本 發 明 提 供 一 種含有序列識別編號1之部份胺基酸 1 1 序 列 之 蛋 白 質 或 與 胺 基 酸 序 列 識 別 編號 1具有至少80¾同源 1 1 性 較佳至少9 0 %同源性之蛋甶質之睇槩組成物。 1 1 本 發 明 之 m 藥 組 成 物 將 藉 腸 外 途 徑, 較佳經皮或肌肉投 I I 藥 典 型 地 每 窜 位 劑 最 總 計 含 有 〇. 1至5 0 m g蛋白質。賴習 1 I t 知 13 法 鈍 化 之 蛋 白 質 活 性 成 分 可 於 適常 無毒性載劑上凍乾 1 i 1 並 分 配 於 小 瓶 或 瓶 内 〇 1 i 木紙張尺度通用个内阀家標卒(CN’S ) A4ML格(2丨〇κ^7公及) 434257 Λ7 B7 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 五、 發明説明(3 1 適 當 溶 劑 包 含 無 菌 水 或 鹽 水 溶 液 〇 1 | 根 據 本 發 明 之 又 一 具 ; 體 例 > 例 如 藉 蛋 a 質 合 成 法 生 產 I 1 的 本 發 明 之 蛋 白 質 或 斷 Μ 可 用 於 生 產 多' 株 或 單 株 抗 咖 體 0 請 先 閱 讀 背 1 i | 特 別 令 人 感 m 趣 之 抗 體 可 辨 認 腫 m 抗 原 因 此 可 用 於 診 晰 1 f i 而 、 治 療 或 研 究 〇 其 中 兩 種 抗 體以寄存編號9 .3 0 8 0 6 1 0 3及 之 注 J 意 l I 93080 6 1 0 4於1 9 9 3年1月 27曰 寄 存 於 歐 洲 動 物 培 兹 赛 收 集 所 ψ 1 [ i (EGACC)(英 國 m 里 斯 堡 波 頓 唐 ) 本 裝 此 等 抗 體 用 於 數 種 人 類 癌 症 之 生 檢 樣 品 之 免 疫 细 胞 化 學 I 、* 1 i 試 驗 kk 供 辨 認 此 等 癌 症 0 1 i 本 發 明 之 蛋 白 質 當 投 人 患 有 腫 痫 病 人 時、 除 \ 具 優 異 效 果 如 1 抑 制 或 退 行 m 瘤 之 塊 減 少 疼 痛 及 改 善 _·_ 般 、感 覺 外 可 講 1 訂 生 «Lt 對 培 養 的 腫 痫 細 胞 具 有 明 顯 細 胞 毒 性 的 抗 體 0 未 除 去 補 ! 1 體 串 聯 之 全 血 清 乃 發 揮 细 朐 毒 性 效 果 所 必 需 〇 1 1 [ 本 發 明 蛋 白 質 當 用 於 治 療 用 途 或 作 為 疫 苗 Μ 誘 生 對 抗 惡 1. 性 轉 變 之 免 疫 力 時 可 藉 皮 下 > 肌 肉 或 靜 脈 途 徑 以 0 . 1至 30mg/曰/病人之 劑 量 投 藥 〇 反 覆 治 療 甚 至 段 長 期 間 直 | 到 誘 生 出 的 抗 aatf 體 濃 度 達 到 合 宜 的 湄 度 為 止 0 i I 誘 生 出 的 抗 體 濃 度 例 如 可 使 用 免 疫 m 素 技 術 藉 習 知 1 1 方 法 测 定 〇 欲 達 到 此 目 的 本 發 明 提 m 含 有 經 適 當 標 記 製 1 1 劑 之 診 斷 套 (牛 組 例 如 本 發 明 蛋 白 質 或 其 斷 片 作 為 抗 原 9 1 1 m 擇 性 固 定 於 適 當 撐 體 上 抗 I ε 抗 m 及 適 當 製 劑 例 如 可 1 I 利 用 比 色 反 應 檢 測 抗 原 一 抗 體 複 合 體 〇 1 1 | 本 發 明 之 蛋 白 質 較 佳 連 同 適 當 載 m 作 為 _ 助 劑 投 m 〇 適 1 i 當 補 助 劑 可 選 例 如 無 毒 蛋 甶 m 較 佳 例 如 液 體 m 白 質 9 1 1 木紙ίΑ尺度適川中阀阄家桴爭(CNS ) AVt格(210X297公处) 43425 7 A7 B7 手19日修正>補充 經濟部令央標準局員Η消費合作社印製 五、發明説明-(4 ) 例如來自該種免疫原性蛋白質萃取之同種動物之蛋白質。 本發明之蛋白質之製法係將使用過氛酸及陳後使用高張 鹽水溶液(例如KC1 3M)進行鈍化’如後文實例所詳细說明 者。 得自山羊肝臟之蛋白質於H-端封阻,因此使用CNBr割裂 後決定部份序列,獲得分子量(藉MALDI-T OF方法測定)分 別為10263及4063D之主要斷片,而割裂前之分子量為 ~ 14.290埴爾頓,此乃與SDS PAGE電泳測定值符合一致。 下列實例進一步擧例說明本發明。 簧例1 如W0 92/1019 7製備之山羊肝臟萃取物(後文稱為UK101) *於Amicon PM10膜上濃縮及随後對NaH2P04/MazHPO*, 0.01M,pH6.5渎析。產物於媛衝液平衡的TSK DEAE 5PW藉 HPLC純化;收集起始媛衝液,吸附於樹脂上之蛋白質與1M HaCl溶離。於起始媛衝液内溶離出之峰於TSKSW 3000柱藉 Η P L C纯化。 藉層析獲得兩個主峰:第一峰拋棄因為含有糖原;第二 峰之低分子最蛋白質特別豐富,随後於Protein-Pac HIC Phenyl 5 PW柱上藉FPLC纯化。 於疏水交換柱之純化係於下列條件下進行:首先用含 1M(HH4)zS〇4之起始媛衝液Tris HCL 20 mM pH7進行溶離 ,接著進行線性梯度溶雜,最後使用不含硫酸銨之Tris-HCL 20 mM溶離。拋棄起始媛衝疲而收集硫酸銨冥耳濃度 為0.6至0.8M之梯度溶離區並對水滲析。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 修王頁 ί請先閲讀背面之注項再填寫本頁)
43 42 5 7 A7 B7 8& 3· 修正 年κ 3 .補充 五、發明説明-(5 ) 獲得之樣品(在下文中被稱為UK114)於SDS-PAGE顯示約 14K<ia之蛋白質帶*純度約90¾。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例2 兔疫畑胞化學實驗中,使用從被山羊肝臟萃取物(W0 9 2/10197)免疫之兔子中取得的多株抗體,其中該山羊肝 臟萃取物被混於含Freund完全輔助劑之PBS中,然後經由 皮下注射每週投藥歷兩涸月而使兔子免疫。 ' 單株抗體係於每週予Balb/c小鼠皮下注射100w s含不完 全Freund的輔助劑之UK101後一個月而得到。骨髓瘤细胞 Μ從被ϋΚΙΟΙ免疫之動物體得到之淋巴细胞藉習知方法融 合。所得之兩種融合瘤Μ寄存編號9 308 0610 3與930 80 6104 於1993年7月27日寄存於歐洲動物细胞培養收集所(ECACC) (英國薩里斯堡♦波頓•唐)。 該融合瘤分離出的抗體被用於辨認本發明之蛋白質。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 簞株及多株抗體於免疫细胞化學試驗對30種由不同器官 如乳房、肺臓、膀胱、胃、結腸一直腸、子宫、軟組继、 攝護腺。分離出的惡性腫瘤樣品生檢细胞進行檢定分析。 組绷固定於10¾經緩衝的福馬林及於石獵之製劑*利用 Mistostain套件組 SP Zymed Lab. Inc染色。 切片與抗體(0.5« s/inl之Ig含UBSA/PBS)於培養隔 夜。洗滌後切片與抗兔豬生物素化Is共同培育60分鐘,然 後與過氧化鏈絲菌抗生物素一生物素附合體之1 : 100稀釋 液一起再培育60分鐘。過氣化麻迪接作用係使用3,3-二胺 基聯苯肢/過氧化氫反應檢测。唯有於胞質內對抗體顯示 -S-镄正莨 本紙乐尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X297公釐) 434257 |_—----―'| 434257 |_—----―'| A7 B7 補充 五、發明説明1 6) 特異性反應元組继考處為陽性反應。對正常組織之免疫反 應性被認為係陰性,略陽性,陽性(+ + )及高度陽性( + + + ) 。结果報告於下表。於大部份惡性腫瘤可K測得與抗山羊 、小牛及馬肝臟萃取物之不同多株抗體具有免疫细胞化學 反應性(其在抗馬肝臟萃取物抗體之場合為82.7¾,在小牛 肝臟萃取物之場合為10030。融合瘤編號930806103分泌的 單株抗體在93.7¾被檢定之腫瘤中顯示陽性結果。 i 表 惡性腫瘤之免疫细胞反應性 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
Anti UK101 位置 山羊 小牛 馬 Mad η 乳房 4/0 1/0 1/0 930806103 1/0 Μ 4/3 3/0 3/0 3/0 结腸/直腸 7/0 5/0 5/0 5/0 肺臟 1/1 n . a . η · a . 1/0 膀胱 2/0 1/0 1/0 1/0 攝護 腺 3/0 1/0 1/0 1/1 子宮 1/0 1/0 1/0 1/0 蹵上 腺 1/0 1/0 1/0 1/0 NO S 2/1 1/0 0/1 1/0 總計 25/5 14/0 13/1 15/1 序列清單 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) •9-修正英 43425 7 Λ7 R7 五、發明説明(τ ) (1) 一般訊息: (i )申請人:
(Λ )姓 名:7」Ιϊ T E S T S (Β)街 名:Galleriadel Corso 2 (C) 城市名 (E)國名:ΙΤΛΙΥ (F )郵遞區號:2 0 1 2 2 (ii )發明名稱:得自哺乳動物臓之蛋S質及其在腫瘤 學方面之用途。 (m )序列數目:1 ' 、 (iv )電腦可謓格式: ~
(Λ )媒體類型:軟性磁碟 (Β )電. 腦:I Β Μ P C相容 (C )作業系統:P C C0S/HSD0S (D) 軟 體:Patertln Releaxe ίί 1 - 0 , Version tl 1.25 (EPO) 經濟部t央樣準局另工消t合作社印製 (2 )序列識別編號1之資料: (i )序列特徴: (Λ )長度:5 3胺基酸 (B )類型:胺旌酸 (D)形態:擷形 (ii )分子類型:蛋白質 , (v )斷片類型.:N-端 10 (請tw請背而之i.i意事項r}·填朽本K) 本紙張尺度適川十阀國家標準(CNS > Λ4叫」ft ( 公尨) 43 42 5 7 Λ7 . B7五、發明説明(8 )(vi )原始來源:.(A)有機體:Capra hircu_s (F )組織類型:;奸臓 (X ί )序列說明:序列識別編號1 : 經濟部中央標準局負工消费合作社印製 3 5 y--' GIL.
-1 ο Θ Λ 3 L
e1 rj 5 G
A
e · · b TL p a · p 1 o s A2A e, Γ ο .—_ p 1 *—^
15a G 2 V ρ ο s 5
A (諳先叫讀背而之注意事項洱壤朽本頁) 木紙iR尺度琦用十阔同孓標苹(C‘NS ) M/兄格(2!0X:^7公鋒)
Claims (1)
- 4342S7 9ft 1 %條正 六申—請專90. 1. 12修正本 1. 一種可由哺乳動物肝臟但非由大鼠肝臟萃取之蛋白質*其分子量約爲14 Ma,具有序列如 Met Asp Pro Ala Ser Gly Gin Leu Val Pro Gly Gly Val Val5 10 Ala20ASPIle Glncysl ey a LyGlAl a a u AlAlLe45 u a u GlAl30Le GIUbLysval Le he As e,h L T ela Π A u^ GlLy40。 y 1Ua Gl25vaAl eraler π V s η n e ASASph ThrThrl50 A. 2.如申請專利範圍第1項之蛋白質,可由山竿肝臟萃取 得。3 . —種用於治療腫瘤的醫藥組成物,含有如申請専利範 圍笫1項之蛋白質作爲主要成份,並與適當載劑混合°4.如申請專利範圍第1項之蛋白質,其係用於膣瘤之診 斷或抗腫瘤治療。 (諳先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝! —訂-----l!_fA 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐) 43425 7 A7 B7 手19日修正>補充 經濟部令央標準局員Η消費合作社印製 五、發明説明-(4 ) 例如來自該種免疫原性蛋白質萃取之同種動物之蛋白質。 本發明之蛋白質之製法係將使用過氛酸及陳後使用高張 鹽水溶液(例如KC1 3M)進行鈍化’如後文實例所詳细說明 者。 得自山羊肝臟之蛋白質於H-端封阻,因此使用CNBr割裂 後決定部份序列,獲得分子量(藉MALDI-T OF方法測定)分 別為10263及4063D之主要斷片,而割裂前之分子量為 ~ 14.290埴爾頓,此乃與SDS PAGE電泳測定值符合一致。 下列實例進一步擧例說明本發明。 簧例1 如W0 92/1019 7製備之山羊肝臟萃取物(後文稱為UK101) *於Amicon PM10膜上濃縮及随後對NaH2P04/MazHPO*, 0.01M,pH6.5渎析。產物於媛衝液平衡的TSK DEAE 5PW藉 HPLC純化;收集起始媛衝液,吸附於樹脂上之蛋白質與1M HaCl溶離。於起始媛衝液内溶離出之峰於TSKSW 3000柱藉 Η P L C纯化。 藉層析獲得兩個主峰:第一峰拋棄因為含有糖原;第二 峰之低分子最蛋白質特別豐富,随後於Protein-Pac HIC Phenyl 5 PW柱上藉FPLC纯化。 於疏水交換柱之純化係於下列條件下進行:首先用含 1M(HH4)zS〇4之起始媛衝液Tris HCL 20 mM pH7進行溶離 ,接著進行線性梯度溶雜,最後使用不含硫酸銨之Tris-HCL 20 mM溶離。拋棄起始媛衝疲而收集硫酸銨冥耳濃度 為0.6至0.8M之梯度溶離區並對水滲析。 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 修王頁 ί請先閲讀背面之注項再填寫本頁)43 42 5 7 A7 B7 8& 3· 修正 年κ 3 .補充 五、發明説明-(5 ) 獲得之樣品(在下文中被稱為UK114)於SDS-PAGE顯示約 14K<ia之蛋白質帶*純度約90¾。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 實例2 兔疫畑胞化學實驗中,使用從被山羊肝臟萃取物(W0 9 2/10197)免疫之兔子中取得的多株抗體,其中該山羊肝 臟萃取物被混於含Freund完全輔助劑之PBS中,然後經由 皮下注射每週投藥歷兩涸月而使兔子免疫。 ' 單株抗體係於每週予Balb/c小鼠皮下注射100w s含不完 全Freund的輔助劑之UK101後一個月而得到。骨髓瘤细胞 Μ從被ϋΚΙΟΙ免疫之動物體得到之淋巴细胞藉習知方法融 合。所得之兩種融合瘤Μ寄存編號9 308 0610 3與930 80 6104 於1993年7月27日寄存於歐洲動物细胞培養收集所(ECACC) (英國薩里斯堡♦波頓•唐)。 該融合瘤分離出的抗體被用於辨認本發明之蛋白質。 經濟部中央標準局負工消費合作社印製 簞株及多株抗體於免疫细胞化學試驗對30種由不同器官 如乳房、肺臓、膀胱、胃、結腸一直腸、子宫、軟組继、 攝護腺。分離出的惡性腫瘤樣品生檢细胞進行檢定分析。 組绷固定於10¾經緩衝的福馬林及於石獵之製劑*利用 Mistostain套件組 SP Zymed Lab. Inc染色。 切片與抗體(0.5« s/inl之Ig含UBSA/PBS)於培養隔 夜。洗滌後切片與抗兔豬生物素化Is共同培育60分鐘,然 後與過氧化鏈絲菌抗生物素一生物素附合體之1 : 100稀釋 液一起再培育60分鐘。過氣化麻迪接作用係使用3,3-二胺 基聯苯肢/過氧化氫反應檢测。唯有於胞質內對抗體顯示 -S-镄正莨 本紙乐尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X297公釐) 434257 |_—----―'| 434257 |_—----―'| A7 B7 補充 五、發明説明1 6) 特異性反應元組继考處為陽性反應。對正常組織之免疫反 應性被認為係陰性,略陽性,陽性(+ + )及高度陽性( + + + ) 。结果報告於下表。於大部份惡性腫瘤可K測得與抗山羊 、小牛及馬肝臟萃取物之不同多株抗體具有免疫细胞化學 反應性(其在抗馬肝臟萃取物抗體之場合為82.7¾,在小牛 肝臟萃取物之場合為10030。融合瘤編號930806103分泌的 單株抗體在93.7¾被檢定之腫瘤中顯示陽性結果。 i 表 惡性腫瘤之免疫细胞反應性 (請先聞讀背面之注意事項再填寫本頁) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 Anti UK101 位置 山羊 小牛 馬 Mad η 乳房 4/0 1/0 1/0 930806103 1/0 Μ 4/3 3/0 3/0 3/0 结腸/直腸 7/0 5/0 5/0 5/0 肺臟 1/1 n . a . η · a . 1/0 膀胱 2/0 1/0 1/0 1/0 攝護 腺 3/0 1/0 1/0 1/1 子宮 1/0 1/0 1/0 1/0 蹵上 腺 1/0 1/0 1/0 1/0 NO S 2/1 1/0 0/1 1/0 總計 25/5 14/0 13/1 15/1 序列清單 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) •9-修正英 4342S7 9ft 1 %條正 六申—請專90. 1. 12修正本 1. 一種可由哺乳動物肝臟但非由大鼠肝臟萃取之蛋白質*其分子量約爲14 Ma,具有序列如 Met Asp Pro Ala Ser Gly Gin Leu Val Pro Gly Gly Val Val5 10 Ala20ASPIle Glncysl ey a LyGlAl a a u AlAlLe45 u a u GlAl30Le GIUbLysval Le he As e,h L T ela Π A u^ GlLy40。 y 1Ua Gl25vaAl eraler π V s η n e ASASph ThrThrl50 A. 2.如申請專利範圍第1項之蛋白質,可由山竿肝臟萃取 得。3 . —種用於治療腫瘤的醫藥組成物,含有如申請専利範 圍笫1項之蛋白質作爲主要成份,並與適當載劑混合°4.如申請專利範圍第1項之蛋白質,其係用於膣瘤之診 斷或抗腫瘤治療。 (諳先閲讀背面之注意事項再填窝本頁) 裝! —訂-----l!_fA 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS)A4規格(210 X 297公釐)
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