KR100425627B1 - 포유동물의간으로부터추출된단백질및종양치료와관련한그이용방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 포유동물의 간, 특히 염소의 간을 과염소산으로 처리하여 추출될 수 있는 단백질과 이 단백질을 종양학에 이용하는 방법에 관한 것이다.
Description
WO 92/10197호는 포유동물의 기관, 특히 적어도 3종류의 다른 단백질로 구성되어 있고 특이적인 약학적 성질과 면역학적 성질을 가지고 있는 것을 특징으로 하는 염소의 간 추출물에 대해 기술하고 있다. 그러나 개별적인 단백질 성분의 실질적인 역할이나 씨퀀스에 대해서는 어떠한 사항도 기재된 바 없다.
5%의 과염소산을 이용하여 랫트의 간과 신장으로부터 추출된 23KDa의 이합체성 단백질이 보고된 바 있다 (Eur. J. Biochem. 272, 665, 1993). 이에 대응하는 cDNA 씨퀀스는 EMBL 데이터뱅크에 기탁번호 X70825로 기탁되어 있다.
고이동성 그룹(High-Mobility Group:HMG)과 함께 추출되는 것으로 보고된 바 있는 상기 단백질은 단백질의 폴딩(folding)과정에서 중요한 역할을 하는 것으로서 소위 샤페론(chaperon) 또는 샤페로닌류(chaperonin)를 이루는 하나의 구성원인 것으로 여겨질 수 있다고 제안된 바 있다.
WO 93/18146호에는 토끼의 간으로부터 추출된 것으로서 분자량이 59Kd이며샤페론과 복합체를 형성할 수 있는 단백질과 90Kd의 열충격 단백질(heat shock protein)에 대해 기재되어 있다.
WO 92/10197호에 개시된 추출물로부터 정제된 새로운 단백질은 이제 Id. No. 1으로 기재된 부분적인 아미노산 씨퀀스를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다.
상기 단백질은 다음과 같은 특성면에서 종양학(oncology)에서 유용하다.:
- 상기 단백질로 면역처리된 동물의 혈청은 인간의 종양세포배양물에 대해 세포독성을 나타낸다.
- 결장부분에 선암종(c26)을 가지고 있는 Balb/c 마우스와 흉막내 요시다 복수종양(intrapleuric Yoshida ascitic tumor)을 가지고 있는 랫트에게 상기 단백질을 0.015㎍/kg 투여하면 현저한 항종양활성이 나타난다.
- 사람을 포함하여 동물에게 상기 단백질을 투여하면, 사람의 암세포를 인식할 수 있는 항체가 증가된다
상기와 같은 특성들은 폐, 흉부, 위장, 결장 및 간 부위에 진행성 암을 앓고 있는 환자에게 WO 92/10197호에 개시된 추출물을 투여함으로써 실시된 임상실험에서 관찰된 활성이다.
본 발명은 동물의 조직, 특히 포유동물의 간으로부터 추출된 단백질 및 종양학 분야에서 이것을 이용하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 단백질은 상기 유럽 생화학회지 (Eur. J. Biochem. 272, 665, 1993)에 기재되어 있는 랫트의 간으로부터 추출된 단백질과 매우 유사하다.
씨퀀스 Id. No. 1과 유사성이 매우 큰 단백질은 또한 여러 동물의 간, 특히 소와 말의 간에서도 발견되어 왔다. 본 발명은 또한 랫트의 간에서 알려져 있는 씨퀀스를 제외하고 상기 유사한 씨퀀스에 관한 것이기도 하다.
그리하여 새로운 단백질 군이 발견되었다: 이렇게 아직 공지되어있지 않은 군의 구성요소들은 포유동물과의 사이에 고도의 보존성과 유사성을 가지며, 분자량이 약 10KDa 내지 14KDa 범위인 것을 특징으로 한다.
"고도의 유사성"이란 용어는 아미노산 씨퀀스면에서 약 80% 또는 그 이상, 바람직하기로는 90% 또는 그 이상의 유사도를 의미한다.
본 발명은 또한 포유동물의 간으로부터 과염소산에 의해 추출될 수 있는 전술한 단백질을 치료 및/또는 진단용으로서 종양학분야에 이용하는 방법에 관한 것이기도 한다.
그러므로, 본 발명은 부분적인 아미노산 씨퀀스 No. 1을 가지고 있는 단백질 또는 씨퀀스 Id. No. 1과 80%의 유사도, 바람직하기로는 적어도 90%의 유사도를 가지고 있는 단백질을 포함하고 있는 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 약학적 조성물은 비경구경로, 바람직하기로는 피하주사, 근육주사를 통해 투여되며, 일반적으로 단위 투여당 0.1 내지 50mg의 총단백질을 포함한다. 통상의 방법에 의해 정제되는 단백질 활성 성분은 적절한 비독성 캐리어와 함께 동결건조된 다음 바이알 또는 병에 분배된다.
적절한 용매로는 멸균수 또는 생리식염수가 있다.
본 발명의 바람직한 구체적 실시예에 따르면, 예를 들어 화학적 합성방법에 의해 제조되는 본 발명의 단백질 또는 그 절편들은 폴리클로날 또는 모노클로날 항체를 제조하는데 이용될 수 있다. 특히 관심을 끄는 항체는 종양성 항원을 인식하며, 따라서 진단, 치료 또는 연구목적으로 유용한 것이다. 상기와 같은 항체 중에 2종류가 유럽동물세포배양기탁기관 (European Collection of Animal Cell Cultures(EGACC), 영국 샐리스버리 포톤 다운)에 1993년 7월 27일자로 기탁번호 930806103과 930806104로 각각 기탁되었다.
이들 항체들은 이들의 인식이 가능한 사람의 암의 여러 가지 생검시료에 대한 면역세포화학테스트에 이용되었다.
본 발명의 단백질은 암환자에게 투여될 때, 종양덩어리의 성장 억제 또는 퇴화, 고통의 감소 및 체감(cenesthesis)의 개선과 같은 바람직한 효과외에도 배양된 종양세포에 대해 현저한 세포독성을 나타내는 항체를 증가시킨다. 이러한 세포독성 효과가 나타나기 위해서는 일련의 보체(complement)를 가지고 있는 완전한 혈청이 필요하다.
치료목적 또는 종양성 전이에 대한 면역성을 유도하기 위한 백신으로서 이용되는 경우에는, 본 발명의 단백질이 0.1 내지 30mg/day/환자의 투여랑으로 피하주사, 근육주사 또는 정맥주사를 통해 투여될 수 있다. 치료는 증가된 항체의 농도가 적절한 수준에 도달할 때까지 오랜기간이 걸릴지라도 반복될 것이다.
증가된 항체의 농도는 예를 들어 면역효소법과 같은 통상의 방법에 의해 결정될 수 있다. 이를 위해, 본 발명은 적절하게 레이블링된 시약, 예를 들어 항원으로서, 경우에 따라 적절한 지지체에 고정화되어 있는 본 발명의 단백질 또는 그 절편, 항-Ig 항체 및 칼라화반응과 같은 방법에 의해 항원-항체 콤플렉스를 검출할 수 있는 적절한 시약을 포함하는 진단용 킷트를 제공한다.
바람직하기로는, 본 발명의 단백질은 면역보강제(adjuvant)로 작용하는 적절한 캐리어와 함께 투여될 수 있다. 적절한 면역보강제는 예를 들어 비독성 단백질, 바람직하기로는 이종발생성 단백질(xenogenic protein)로부터 선택될 수 있는데, 그 예로는 면역단백질을 추출하는데 이용된 종과 동일한 종으로부터 추출된 단백질을 들 수 있다.
본 발명의 단백질은 개체의 기관을 추출함으로써 얻어진 원추출액을 과염소산으로 처리하고 이어서 고장성(hypertonic) 생리식염수 용액 (예: 3M KCl 용액)으로 처리한 다음 투석을 하고 HPLC, 소수성 교환크로마토그래피(FPLC)를 이용하여 정제함으로써 제조되는데, 이하 상세한 사항에 대해서는 실시예에서 설명하기로 한다.
염소의 간으로부터 얻어진 단백질은 N-말단이 봉쇄(blocking)되어 있어서, CNBr로 처리하여 분자량(MALDI-TOF 방법으로 측정)이 각각 10263D와 4063D인 두 개의 주 절편으로 분리한 후 부분적으로 씨퀀싱하였는데, 분리 전의 분자량은 SDS-PAGE 전기영동법에 의해 측정된 값으로서 14290달톤 이었다.
하기 실시예들은 본 발명을 보다 상세히 설명해주고 있다.
실시예 1
WO 92/10197호에 기재되어 있는 방법에 따라 제조된 염소의 간 추출물 (이하, "UK 101"이라 칭함)을 아미콘 (Amicon) PM 10 멤브레인을 이용하여 농축하고이어서 NaH2PO4/Na2HPO4(0.01M, pH 6.5)를 이용하여 투석을 실시한다. 이렇게 하여 얻은 생성물을 상기 완충용액으로 평형화된 TSK DEAE 5 PW 칼럼을 이용한 HPLC법으로 정제한다; 출발 완충용액을 모으고 수지에 흡착된 단백질을 1M NaCl로 용출시킨다.
이러한 크로마토그래피에 의해 2개의 주 피크가 얻어진다: 제1 피크는 주로 글리코겐으로 구성되어 있으므로 폐기한다; 제2 피크는 저분자량 단백질이 풍부한데 프로테인-팩 HIC 페닐 (Protein-Pac HIC Phenyl) 5 PW 칼럼을 이용하여 FPLC법에 의해 정제한다.
이러한 소수성 교환칼럼을 이용한 정제는 다음과 같은 조건하에서 실시된다: 출발 완충용액으로서 황산암모늄((NH4)2SO4) 1M을 함유하는 트리스 HCl (20mM, pH 7)로 먼저 용출시킨 다음 황산암모늄을 함유하지 않은 트리스-HCl (20mM)로 마무리되도록 선형 구배형 (linear gradient)으로 용출시킨다. 출발 완충용액을 폐기하고 황산암모늄의 몰농도가 0.6 내지 0.8M인 범위의 농도구배에서 용출된 부분을 모아서 물을 이용하여 투석한다.
SDS-PAGE 시험에서 약 14KDa의 단백질 밴드를 약 90%의 순도로 나타내는, 이하 UK 114로 지칭될 시료가 얻어진다.
실시예 2
면역세포화학적 테스트를 실시하는데 있어서, 프로인트의 완전 보조액(Freund's complete adjuvant)을 함유하는 인산완충용액(PBS)에 염소의 간추출물(WO 92/10197)을 혼합하여 2개월간 매주 피하주사방식으로 투여함으로써 면역처리된 토끼에게서 생성된 폴리클로날 항체를 이용하였다.
프로인트의 불완전 보조액과 함께 UK 101 100㎍을 Balb/c 마우스에게 매주 피하주사한지 1개월 후 Balb/c 마우스로부터 모노클로날 항체를 얻었다. UK 101에 대해 면역된 동물로부터 얻은 림프구의 골수종세포와 통상의 방법으로 융합시켰다. 이렇게 하여 얻은 하이브리도마 중 2가지를 1993년 7월 27일자로 ECACC에 기탁번호 930806103과 930806104로 기탁하였다.
상기 하이브리도마에 의해 분비되는 항체는 본 발명의 단백질을 인식한다.
흉부, 폐, 방광, 위장, 결장-직장, 자궁, 연조직, 전립선과 같은 여러 가지 기관으로부터 분리된 악성 종양의 생검시료 30개에 대한 면역세포화학적 시험법을 통해 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 분석하였다. 상기 조직을 10% 포르말린 완충용액으로 고정하고 파라핀 처리한 다음 미스토스테인 킷트 (Mistostain Kit SP, Zymed Lab. Inc.)를 이용하여 염색하였다.
항체(1% BSA/PBS에 용해된 Ig 0.5㎍/ml)와 함께 상기 부분들을 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척 후, 슬라이드를 비오틴으로 레이블링된 돼지의 항-토끼 Ig와 함께 60분 동안 배양한 다음 과산화된 스트렙타비딘-비오틴 콤플렉스의 1:100 희석액과 함께 추가로 60분 동안 배양하였다. 과산화효소와의 결합은 3,3-디아미노벤지딘/H2O2반응에 의해 검출하였다. 항체에 대해 특이적 반응을 보이는 조직만이 양성인 것으로 나타났다. 면역반응은 정상 조직에 대해 음성, 약양성,양성(++) 및 강양성(+++)으로서 표시하였다. 그 결과를 하기 표에 나타내었다. 여러 가지 다른 형태의 폴리클로날 항체인 항-염소, 소 및 말의 간 추출물에 대한 면역세포화학반응성이 대부분의 악성종양에서 검출가능하다 (말의 간 추출물에 대한 항체의 경우에는 82.7%, 소의 간 추출물에 대한 항체의 경우에는 100%). 하이브리도마 No. 930806103에 의해 분비된 모노클로날 항체는 분석된 종양 93.7%에 대해 양성 결과를 보여주었다.
씨퀀스 리스팅
(1) 일반 정보
(i) 출원인:
(A) 명칭: 제테시스
(B) 가로명: 갈레리아 델 코르소 2
(C) 도시명: 밀란
(E) 국가명: 이탈리아
(F) 우편번호: 20122
(ii) 발명의 명칭: 포유동물의 간으로부터 추출된 단백질 및 종양치료와 관련한 그 이용방법
(iii) 씨퀀스의 수: 1
(iv) 컴퓨터 독출형태
(A) 매체 유형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환형
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, Version #1.25 (EPO)
(2) 씨퀀스 ID No. 1에 대한 정보:
(i) 씨퀀스 특성:
(A) 길이: 53개의 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(D) 형태: 직선형
(ii) 분자 유형: 단백질
(v) 절편 유형: N-말단
(vi) 근원:
(A) 개체: 카프라 히르쿠스 (Capra hircus)
(F) 조직 유형: 간
(xi) 씨퀀스 서술: SEQ ID NO. 1.
Claims (7)
- 염소, 말 도는 소의 간으로부터 추출가능한 단백질로서, 씨퀀스 Id No. 1의 아미노산 씨퀀스를 가진 단백질.
- 제1항에 있어서, 염소의 간으로부터 추출가능한 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제1항에 있어서, 분자량이 10 내지 14Kda 범위인 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제3항에 있어서, 분자량이 14Kda인 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제1항에 있어서, ECACC에 기탁번호 930806103과 930806104로 기탁되어 있는 하이브리도마로부터 분비되는 항체에 의해 인식되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 제1항에 있어서, 종양 진단 및 종양 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 단백질.
- 활성 성분으로서 제1항의 단백질을 약학적으로 허용가능한 캐리어와 함께 포함하고, 종양 진단 및 종양 치료에 이용되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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