KR100196028B1

KR100196028B1 - 사람의 치료에 유용한 폴리펩티드성 물질

Info

Publication number: KR100196028B1
Application number: KR1019930701728A
Authority: KR
Inventors: 알베르토 바르토렐리.; 안젤라 투리아노
Original assignee: 스피니엘로 살바토르; 제테시스 에스.피.아.
Priority date: 1990-12-11
Filing date: 1991-12-09
Publication date: 1999-06-15
Also published as: RU2113224C1; AU661287B2; CA2098113A1; ES2073277T3; DK0574394T3; WO1992010197A1; JP3213942B2; EP0574394B1; NO932101D0; JPH06504039A; CA2098113C; DE69110060D1; EP0574394A1; AU9035791A; NO932101L; NO308396B1; IT9022341A1; IT1244879B; DE69110060T2; HU217615B

Abstract

여러 가지 동물종에 투여되었을 때 사람의 종양세포에 존재하는 항원을 생체내 또는 시험관내에서 인식할 수 있는 항체의 형성을 유도할 수 있고; 다른 종류의 악성 종양 환자에 투여되었을 때 통증을 감소시키거나 저해하고, 세포용해의 효과를 유도하고, 종양 성장을 저해하거나 감속시킬 수 있는, 동물조직 균질화물로부터 추출에 의하여 얻을 수 있는 폴리펩티드성 물질.

Description

사람의 치료에 유용한 폴리펩티드성 물질

본 발명은 동물 조직의 추출에 의하여 얻을 수 있는 물질에 관한 것으로서, 상세하게는 염소 또는 양의 조직으로부터 얻은 치료 및 진단에 유용한 물질에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 종양 치료(또는 적어도 종양 질환 치료의 보조) 및 면역조직학적 및 면역혈청학적 종류의 진단적 적용에 유용하게 만드는 놀라운 생물학적 특성을 갖는 물질에 관한 것이다.

합성, 반합성, 발효 또는 추출에 유래하는 외원성(exogenous)항종양제를 위하여 진행되는 연구외에도 직접적인 세포독 효과에 의하거나 또는 면역 시스템 중 액체 또는 세포 성분과의 복합적 상호 작용에 의하여 종양 세포의 성장을 저해할 수 있는, 신체 내에 자연적으로 존재하는 생리적 화합물의 연구에 기초하는 새로운 접근에 더욱 주의가 기울여지고 있다.

이러한 경향에서, 예를 들어 인터페론, 종양 괴사 인자(TNF), 시토카인(cytokines) 및 인터류킨(interleukins)과 같은 림포카인(lympokines), 다른 종류의 세포독성 물질과 모노클로날 항체와의 결합으로부터 유래된 면역독소(immunotoxin)에 현저한 연구적 노력이 기울여지고 있다.

현재까지 외원성 조직으로부터 추출될 수 있는 화합물을 위한 조사는 거의 주목되지 않았다. AF2라고 불리우는 양 및 어린 양의 배(embryos)의 추출에 의하여 얻을 수 있는 인자는 1940년 이래로 열구되어 왔으나, 더 이상 조사할 가치있는 응용적 결과가 없었다 (schweiz-Rundsch-Med. Prax. 1990 79(16): 498-502).

종양 환자의 혈청 내에서 비정상적인 면역특성을 갖는 물질의 존재에 대한 발명자의 이전 연구 (Biomed. Pharmacother. 1987. 41, 2-5)로부터 출발하여, 폴리펩티드성 물질이 동물, 특히 염소 및 양의 조직으로부터 추출될 수 있음이 현재 발견되었는데, 이 물질은 다음의 놀라운 특성을 갖는다.;

-이들은 사람 종양 항원을 인식할 수 있는 항체의 형성을 유도할 수 있다;

-이들은 다른 종류의 악성 종양에 걸린 사람에 투여하였을 때, 종양성 통증을 감소 또는 저지할 수 있으며 세포 용해 효과를 유도하거나 종양의 성장을 저지 또는 감속시킬 수 있다.

본 개시에 사용된 바와 같은 폴리펩티드성 물질이라는 용어의 의미는 단백질, 당단백질, 뮤코단백질 및 이와 유사한 어떠한 종류의 펄리펩티드 화합물이라도 포함하도록 의도될 수 있다.

본 발명의 물질은 동물, 특히 염소 및 양의 조직의 균질화물을, 특히 산 조건 중에서 추출하는 것에 의하여 얻어질 수 있다. 염소 기관의 사용이 특히 바람직한데; 예비적 시험은 예를 들어 상어와 같은 다른 종의 사용을 배제하지 않는다.

간 및 장관의 추출 시험은 이들 기관 내에서 상기 보고된 특성을 갖는 물질의 존재를 확인해 주었는데; 따라서, 이들의 분포가 특이적이고 하나의 기관 또는 기관 그룹에만 제한되지 않는다는 것을 예상할 수 있다. 실무적인 이유로, 이하에서는 특히 염소의 간을 참고하였는데, 이것은 다른 기관에 비하여 다루기 편리하고 보다 쉽게 구할 수 있다.

본 발명의 물질의 추출은 다음의 단계를 포함한다; a) 통상적인 기술을 가지고 조직 및 기관의 균질화; b) 균질화물을 10℃ 보다 낮은 온조에서 강한 무기산, 또는 이와 균등한 추출 방법 (계면활성제, 요소 등)으로 처리; c) 원심분리 및 물에 대하여 투석; d) 고장액으로 처리, 원심분리 또는 멤브레인 여과 및 물과 이어서 염 완충액 (PBS)에 대하여 투석; e) 10,000 D 차단의 멤브레인 상에서 단백질 약 1mg/ml의 농도까지 한외여과; f) 겔-크로마토그래피에 의한 선택적 정제.

단계 b)에 있어서는 약 4℃의 온도에서 2N 과염소산이 바람직하게 사용된다.

단계 d)에 있어서는 3M KCl 용액이 바람직하게 사용되고 처리는 4℃에서 약 24시간 동안 수행된다. 투석, 여과 또는 원심분리 조작은 통상적인 방법에 따라 수행된다.

얻어진 물질은 본 발명에 따라 직접 사용될 수 있다.

그러므로, 상기 물질은 레밍톤 약제학 핸드북 (Remington's Pharmaceutical Sciences Handbook, Mack Pub, Co.,N.Y., USA)에 개시된 것과 같은 적절한 약제학적 조성물의 형태로 환자 또는 동물에 투여하기 위하여 통상적인 방법으로 처리하여 멸균 및 발열성 물질을 제거할 수 있다.

상기 조성물의 예는 사용전에 멸균 생리 식염수에 용해될 수 있는 동결 건조 활성 성문의 바이알, 물 또는 유성 멸균 용매중의 용액 또는 현탁액, 및 생체내 투여하기에 적절한 유사한 조성물을 포함한다.

이하에서 요약되는 전 임상 시험은, 본 발명의 물질이 광범위한 용량, 예를 들어 연속적인 날 또는 다른 간격 (예를 들어 1주일에 1회, 1달 또는 그보다 더 긴 기간에 1회)으로 0.1 내지 100 mg/일로 투여될 수 있음을 예측하게 만들었다. 특히, 염소 간으로부터 추출된 물질 (이하 LGE로서 지칭)을 사용한 건조 물질 1-3mg 양 (용액 1-3ml)의 1회 투여는 종양 병태 환자에 있어서 놀랍고도 매우 신속한 결과를 얻기에 충분하다는 것이 주목되었다.

약 30일 후의 두 번째 투여는 때때로 유리한 효과를 낳을 수도 있다. 그러나, 진행되는 시험은 결정된 약용량 및 치료계획에 있어서 병태 및 환자의 증상에 따라 변화를 요할 수도 있다는 것을 배제할 수는 없다.

다음의 실시예는 본 발명을 더욱 예시한다.

수컷 염소의 간 100g을 블레이드 균질화기(blade homogenizer) 내에서 균질화시키고, 균질화물을 증류수에 재현탁하여 최종 용적을 400 ml로 하였다.

2N HCLO₄400 ml를 4℃에서 약 20분 이내에 상기 현탁액에 적가하고 30분 더 교반하였다. 10,000g에서 20분 동안 원심분리한 다음, 침전물을 버리고 상징액은 수돗물과 이어서 증류수에 대하여 투석하였다.

투석 후, 3몰 용액을 얻을 때까지 분말 KCl을 얻어진 액체에 가하고 혼합물을 4℃에서 24시간 동안 교반하였다.100,000g에서 1시간 동안 원심분리 후, 상징액을 증류수와 인산 완충액(PBS)에 대하여 투석하였다.

얻어진 용액 (800ml)는 로우리(Lowry) 법에 따라 200㎍/ml 의 평균 단백질 농도를 갖는다.

용액은 한외여과에 의하여 1mg/ml의 농도 까지 농축되어, LGE로 호칭되며 임상 테스트에 직접 사용되는데, 이하에서는 약자 LGE로 약칭된다.

이 생성물은 PAGE 4/30에서 분석되었는데 4개의 주요 밴드가 명백하다(제1도); 표준 인자로부터 얻은 캘리브레이션 커브로부터, 4개의 주요 밴드의 분자량이 계산되었다.

1^st밴드 ;= 약 50,000d

2^nd밴드 ;= 약 20,000d

3^rd밴드 ;= 약 14,800d

4^th밴드 ;= 약 12,000d

LGE 추출에 이어지는 정제 단계로서, 다음의 방법에 따라 이온-교환 크로마토그래피가 사용되었다. LGE 약 20 ml를 인산 완충액 (Na₂HPO₄-NaH₂PO₄0.01M, pH 6.5)에 대하여 투석하였다. 투석 후 0.45㎛ 필터를 통하여 샘플을 여과한 다음, 동일한 투석 완충액으로 30ml/시간의 유속에서 평형상태에 있는 TSK DEAE SPW 7.5×75mm 칼럼 상에서 변화시켰다.

칼럼 용출은 동일한 유속가 완충액으로 100분 동안 계속되었다.

pH 6.5에서의 인산 완충액의 선형 구배는 0.01 M의 초기 물농도로부터 출발하여 0.1M의 최종 물농도까지 갔으며, 상기 구배는 100분의 유지시간을 가지며 작동 유속은 30ml/시간으로 유지되었다.

용출로부터 0.5ml 분율을 수집하고 여러 가지 피이크에 대응하는 다른 영역을 모았다.

이것이 크로마토그램(제2도)으로부터 유래될 수 있는 것과 같이, 여러 가지 단백질 분율이 얻어져서 PAGE PAA4/30 내에서 단일 분석되어 그 성분이 평가된다. 영역A로서 정의되는 출발 완충액과 영역B로서 정의되는 최고 단백질 농도를 갖는 구배 분율은 이전에는 보다 흥미있는 것으로 여겨졌는데, 저분자량 단백질은 영역A에 가장 많이 존재하는 반면 50,000달톤의 분자량을 갖는 단백질은 영역B에서 보다 고농도로 존재하기 때문이다.

이들 두 샘플, 영역 A와 B는 계속해서 I¹²⁵로 표지되고 (제3 및 4도) RIA에서 사용되었다. 실질적으로 유용한 양으로 임상 실험에서 이용 가능하게 만들기 위하여, 분리 투여되는 영역 A 및 B는 보다 많은 양의 LGE의 정제를 필요로 하였다.

DEAE SPW 칼럼과 동일한 조건 하에서 평형화되고 용출되는 영역 준비 겔 DEAE-세파덱스 칼럼이 FPLC에서 사용되었다.

LGE 800mg 이 이 칼럼으로 정제되고 영역 A 42mg과 영역 B 15mg이 얻어졌다.

이어서 LGE 배치 2/90분율을 어플라이드 바이오시스템(Applide Biosystem)의 아쿠아포어 부틸(Aquapore Butyl)(30x4.6mm 7U)을 가지고, 15분에 25 내지 55%의 아세토니트릴 선형구배로 되는 물 및 0.05% TFA를 함유하는 아세토니트릴을 용출액으로 사용하여, 역상으로 분석하였다. 220mm에서 기록된 크로마토그램을 제5도에 나타낸다. DEAE 세파셀(Sephacell)로부터 유래된 영역 A 및 영역 B 샘플의 분율을 조 LGE에서 보고된 동일한 조건 하에서 역상으로 크로마토그래피하였다(제6 및 제7도).

조 LGE의 크로마토그램 및 영역 A 와 B의 크로마토그램을 검사하면서, 조 생성물에서 발견되는 것보다 중요한 단백질은 비록 농도를 다르다 하더라도 영역 A와 B로부터 유래되는 두 샘플에서 동일하다는 것을 관찰할 수 있었다.

[등전점]

PAGE 플레이트 LKB 3.5-9.5는 공급자의 지시에 따라 사용하였다.

분율화되지 않은 LGE는 pH 8.3에서 하나의 약한 밴드, pH 6.7-7에서 하나의 현저한 밴드 및 pH 6과 4.5 사이에서 여러개의 밀집된 밴드를 형성하여 동종항원의 전형적인 양상을 보여주었다.

LGE 영역 A는 pH 8.2에서 하나의 현저한 밴드, pH 6.7에서 하나의 현저한 밴드 및 pH 5.6; 5 및 4.9에서 어떤 빈도의 3개의 특수한 밴드를 갖는 산성 영역에서의 몇가지 밴드를 형성한다.

LGE 영역 B는 동종항원의 전형적인 양상을 가지고 pH 6의 산성 영역에서 현저한 강도의 영역 염색을 보여준다.

[생화학적, 면역화학적 및 방사선면역학적 결과]

5ml의 용량(건조 추출물 1mg에 대응)을 농축 단계 전에 얻은 용액으로부터 제조하고 사균을 가한 프로인트 보조액(Freund's complet adjuvant)과 함께 유화하였다. 토끼 2마리를 매 15일 마다 용량으로 면역시켰다.

원래의 토끼 중에서 한 마리를 첫번째 면역 이후에 잃었다. 두번째 동물로부터 하나의 혈청 분획(RF4)을 얻은 다음 생화학적, 면역화학적, 방사선면역학적 및 면역세포화학적 연구에 사용하였다. RF4 항체를 LGE에 대하여 웨스턴 블롯 방법(Western Bolt method)으로 시험하였다. 항원을 PAGE SDS PAA 4/30 플레이트(Pharmacia)에 받고 이어서 니트로셀룰로스로 블롯이동시켰다. 다음에 이것을 RF4 혈청과 함께 배양하고 반응을 항래빗 퍼옥시다제(PIERCE)로 나타내었다. 제8도에 나타낸 바와 같이, 항체는 분자량 약 50,000d의 단백질을 인식한다.

두번째 그룹의 코끼를 상기에 기술한 바와 같이(5ml, 건조 추출물 5mg에 대응, 사균을 가한 프로인트 보조액 2.5ml)LGE로 면역시켰다.

이들 토끼는 RF4와 동일한 방법으로 시험된 14개의 항혈청 항-LGE 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14를 얻었다.

생화학적 방법(특히 웨스턴 블롯 방법)으로부터 얻은 데이타는 이들 항혈청이 RF4 항혈청과는 달리 LGE의 모든 단백질 성분을 인식한다는 것을 암시한다(제9도).

또한, 10주된 암컷 BALB/c 마우스를 모노클론 항체의 생산을 위하여 면역시켰다. 특히, 항원 100μl+프로인트 보조액 100μl의 피하투여에 의하여, 두 마리의 마우스를 LGE(1mg/ml)로 면역시키고 두 마리는 DEAE 5PW(mg/ml)로부터의 LGE영역 A로 면역시켰다.

면역화 계획은 하기와 같다;

1^et투여:Ag 100μl+사균을 가한 프로인트 보조액 100μl.

2^nd투여:Ag 100μl+사균을 가한 프로인트 보조액 100μl.

1^et투여 7일 후.

3^rd투여; 2^nd와 동일.

2^nd투여 7일 후.

4^th투여; 3^rd와 동일.

3^rd투여 7일 후.

면역화 말기에 각 마우스로부터 혈액의 분획을 취하고 얻어진 혈청을 LGE에 대하여 결합 테스트(제10도) 및 면역세포화학적 테스트를 하였다.

얻어진 결과에 기초하여, 모노클론 항체를 얻기 위하여 LGE 영역 A로 면역시킨 2번 마우스를 치사시킬 것을 결정하였다.

밀스테인(Milstein)에 따라 수행된 융합으로 250클론을 얻었다.

첫번째 스크리닝은 많은 클론이 LGE 저분자량 성분 상에 표현된 결정인자로 향하고, 반면에 50,000d 단백질을 인식하는 클론은 수가 적다는 것을 보여주었다. 두뻔재 스크리닝은, 클론 팽창 후에 수행되었는데, 모든 클론에 대하여 음성의 결과를 낳았으며, 따라서 다른 면역화된 마우스로부터 비장을 융합하기로 결정하였다. 융합으로 400클론(100%)을 얻었다. 첫번째 테스트에서는 약 10일 후에 64 클론이 LGE에 양성인 것으로 입증되었다.

이들 64클론의 상측액을 이어서 LGE, LGE 영역 A 및 LGE 영역 B에 대하여 시험하였다. 이 스크리닝은 4클론이 LGE 영역 A에 대해서 보다도 명백하게 3항원에 대하여 강하게 결합한다는 것을 보여주었다. 이들 4클론을 클로닝한 다음 3항원에 대하여 동일한 방법으로 재시험하였다. 병행하여, 웨스턴 블롯으로 LGE에 대하여 클론을 시험하였다.

이들 두가지 시험으로부터 얻은 결과는 9클론의 복수종을 확장하고 생산한다는 것을 가르쳐 주었다. 얻어진 복수종을 LGE, LGE 영역 A 및 LGE 영역 B에 대한 결합 시험으로 측정하였다. 모든 복수종은 3개의 항원에 대하여 양호한 정도의 결합을 보여주었는데, LGE 영역 A에 대한 어떤 우세를 함께 보여주었다.

반대로, 웨스턴 블롯 테스트는 단지 하나의 모노클론 항체만이 50,000d밴드와 결합할 수 있고 반면에 다른 모든 것들은 50,000d를 약간 넘는 분자량을 갖는 밴드를 인식한다는 것을 보여주었다. 결합 시험의 변형에서는, 이들 모노클론 항체의 어느 것도 저분자량 성분과 어떠한 결합도 보여주지 않았다. 종양이식(사람 대장 선종양 셀라인 HT29)을 받은 누드 마우스의 연구가 수행되었다.

배지 0.5ml 중에 있는 10,000,000 세포를 각 동물에 접종하였다. 접종 17일 후, 면역글로불린 분율을 분리하기 위하여, 미리 이온교환으로 정제한 RF4 항혈청으로 동물을 처리하고 나서¹²⁵I로 방사선 표지하였다. 각 동물은 PBS+1% BSA 0.5ml 중 10,000,000cpm을 복강내에 받았다.

24, 48 및 72시간 후에 동물을 치사시키고 해부하여 항체 국소화 표지를 게산하였다.

LGE 면역화된 토끼의 혈청에 의한 항원 인식 능력을 사람 조직에 대하여 시험하였다.

ABC 이뮤노퍼옥시다제 및 이뮤노갈락토시다제 방법으로 사람조직 부분에 대하여, 그리고 사람 조직 추출물에 대하여 RIA를 가지고 항혈청을 시험하였다.

포르말린에 고정된-파라핀에 묻은 HT29 세포(장관 종양으로부터)의 흉선 체외 배양체(누드 마우스에서 얻은), 흉성 종양 MCF7 및 GTL16세포 뿐 아니라 위, 대장, 흉선, 폐, 전립선 및 난소의 절편을 사용하였다. 대조를 위하여 다른 사람의 정상 조직을 사용하였다.

얻어진 결과로부터, 다음을 입증할 수 있었다:

a) 토끼 항-LGE 혈청은 갈색으로 염색되고, 종양 세포내에서 표면적이고 세포질적인 항원 구조로 인식되며, 위, 대장 및 유방암 및 HT29, GTL16 세포의 경우에 있어서 다양한 정도의 측정 및 특이성을 갖는다.

b) 면역세포화학에서와 CEA와 함께 면역세포화학 및 RIA에서 토끼 항-LGE 혈청과 사람 정상 간세포 사이에서는 아무 반응도 일어나지 않았다.

c) 모든 시험된 종양에서는 어느것도 양성이 아니었다.

LGE,¹²⁵I LGE, 토끼 항=LGE 및 토끼¹²⁵I 항-LGE 시스템을 생체내, 누드 마우스 및 HT29 세포로 이종 조직이식된 누드 마우스에서 시험하였다.

얻어진 결과는 다음과 같다:

1) 양 그룹에서¹²⁵I LGE는 생체내에서 매우 신속한 교체를 보여주었다; 피하주사 24-48시간 후에 모든 방사능이 배뇨계에 국소화되었다.

2) 몇몇 경우에서 현저한 종양의 과혈증이 관찰되기는 하였으나, LGE 및 항-LGE 면역글로불린은 누드 마우스에서 종양 부하의 어떠한 감소도 유발하지 않았다.

3)¹²⁵I-표지된 항-LGE 면역글로불린은 HT29 세포로 이종 조직이식된 누드 마우스에 주사 3-5일후에 종양 질량에 있어서 유의적인 LGE 국소화를 보여주었다. 상기 결과는 생체내에서 면역세포화학적 데이타로 재생산되었다.

추출물(LGE) 및 항-LGE 혈청을 시험관 내에서 다음에 대하여 시험하였다:

1) 사람 종양의 흉막 삼출액의 첫번째 배양물.

2) 종양셀라인:사람(라인 HMF7 및 HT29) 및 래트(R3230Ac).

4) 호염구 탈과립화 시험.

결과는 다음과 같다:

1) LGE 및 항-LGE 혈청은 종양 세포에 대하여 어떠한 직접적인 독성도 보여주지 않았다.

2) LGE 및 항-LGE 혈청은 시험과 내에서 표적 세포에 대하여 어떠한 TNF(종양 괴사 인자) 활성도 보여주지 않았다.

3) 아마도 임파구 및/또는 대식세포에 의하여 중개되는 세포 독성 활성이, 종양 삼출의 첫번째 배양에서 흉선 종양 세포에 대하여 입증되었다.

4) K562 및 HL60이 표적 세포로 사용되었을 때, LGE는 사람 임파구에 대하여 강력한 LAK(림포카인-활성화 킬러 세포)유도체로서 작용한다.

이러한 결과는 IL2 반응과 비교하여 다양하다. LGE로 처리하였을 때 사실상 다른 공여자로부터의 임파구는 다른 세포 독성 작용을 보여준다.

반대로, LGE 및 IL-2는 함께 이러한 활성이 크게 증가한다.(+27.2%).

CTLL 세포(IL-2 반응성)와 함께 시행한 실험은 LGE와 IL-2 사이에서 어떠한 형태의 유사성도 배제하였다.

LGE와 어떠한 BRM(생물학적 반응 변형제), 특히 그룹 2의 사이에서는 아무 비교도 행해지지 않았다. 사실 LGE는 시험과 내에서는 종양 세포에 대하여, 생체내에서는 누드 마우스 모델내의 종양 세포에 대하여 비활성이다. 전이성 사람 흉막 삼출물에 대하여 LGE와 함께 얻어진 생체내 반응은 면역 중개 세포의 존재가 필요하다는 것을 지적하였다.

반면에, 높은 산도의 매체 중에서 LGE의 추출은 BRM 및 인터페론과의 어떠한 유사성도 배제하였다.

5) LGE는 시험관 내에서 PBL의 증식을 저해하였다. 이것은 임파구에 대한 직접적인 저해 작용과 관려되거나, 또는 다른 저해 인자의 유도를 통하여 중개될 수도 있다. 저해 작용은 용량과 시간에 의존하는 것으로 보인다.

LGE는 호염구 탈과립화 시험으로 분석되었다. 이 시험은 호염구 및/또는 면역 기억을 얻은 부착된 항체에 대하여 특정한 항원을 인식하기 위하여 사용된다. 이 시험은 30% 이상의 값에 대하여 양성인 것으로 여겨진다. 폐 종양 환자의 혈액 샘플에 있어서, LGE는 매우 낮은 농도(1μg-0.1μg/ml)로 생산되는데, 유의적 용량은 호염구 탈과립화에 의존한다(80%). 5 경우에 대하여 더욱 수행된 시험은 종양 환자의 50%가 이 시험에 양성이었다는 것을 보여주었다. 세척하지 않고(즉, 호염구에 부착된 인자 뿐 아니라 순환하는 항체 및 항원의 존재 중에서) 그리고 칼슘 샘플이 없이 수행된 대조군에 대해서는 어떠한 탈과립화도 일어나지 않았다(표 1). 호염구의 탈과립화는 건강한 공여자의 혈액을 사용하면 존재하지 않았다.

[독물학]

동물에 있어서 급성 및 만성 독성을 마우스와 토끼에서 시험하였다.

급성 독성을 위하여, 마우스와 토낀느 7.1mg/kg 용량과 동등한 LGE 용액을 매일(10일 동안)피하 주사하였다.

만성 독성 시험은 토끼에서 1주일에 1.2mg/kg의 용량을 6개월 동안 시행하였다.

어떠한 독성 작용도 검출가능한 변화도 확증될 수 없었다.

I 표지된 LGE로 수행된 예비 연구는 24/48시간 내에 뇨를 통한 완전한 클리어런스를 나타내었다.

동물에게 다양한 농도로 LGE를 주사하는 것에 의해서는 어떠한 독성 작용도 검출할 수 없었다. 치사량은 결정할 수 없었다.

[임상시험]

[제1상]

29인의 말기 환자를 특수한 요법으로 환자의 동의를 얻어 처치하였다. 이들 모두는 이전에, 항염제(FANS 및 스테로이드) 및 아편 또는 다른 주요 진통제 경로와 같은 후기의 보조 치료 뿐 아니라 복합 항암 치료(수술, 방사선요법, 화학요법)를 받았다.

대부분의 환자는 카테터를 부착하고 평균 수명이 7일인 전혼수 상태에 있었다.

그럼에도 불구하고, 환자의 70%에서 양성 반응이 관찰 되었으며, 가장 일반적인 효과는 통증의 소실과 주관적인 행복감의 유도였으며; 48%의 환자에서는 현저한 수명 연장(2개월)이 관찰되었으며 어떠한 통증도 재발되지 않았다.

종양괴의 감고슨 2개월 보다 오래 생존하였던 5 내지 14인의 환자에서 관찰되었다(표 2).

첫번째 그룹의 환자에 있어서, 투여는 매우 양호한 준활성적 효과를 나타내었지만, 병리적 임상적 상태의 다양성 때문에 더 이상의 분석이 행해질 수 없었고, 따라서 환자는 기기적 또는 실험실적 평가를 받지 못하였다.

게다가 LGE 투여는 매일 투여에서부터 주간 투여(0.025mg/kg)까지의 범위에 있었다. 이러한 실험에서 어떠한 아나필락시스 반응도 나타나지 않았다.

이러한 첫번째 조사로부터, 다음을 관찰할 수 있었다:

1) LGE는 사람에 있어서 반복적인 매일 투여후에도 어떠한 독성도 보여주지 않았다.

2) 다른 배치도 동일한 임상적 효과를 유도하였다.

3) LGE는 보다 양호한 신체감각, 식욕 및 장기능의 개선과 함게 강력한 통증 감소를 유도하였다.

임상가의 의견으로서, 이것은 매우 심한 환자에게서 설명할 수 없는 다행감(euphoria)을 유도하였다.

[제2상]

이 시기 동안 141명의 새로운 말기 암환자가 치료받았다. 그러나 임상가의 태도는 LGE의 무해성에 관한 확신과 관찰된 양성적 효과를 증명할 필요에 있어서는 다른 바탕에 있었다. 그러나 이 약물은 아직도 어떠한 다른 투여도 실패한 말기 환자에게만 단지 특수한 요법으로서 투여되고 있다.

거의 모든 환자가 단 1회의 1.5mg LGE(약 0.025mg/kg) 피하주사를 받았다. 몇몇 경우에 있어서는(마지막 3개월간) 1개월 후 두번째 용량을 투여하였다.

다음의 도면에 있어서, 환자는 N 및 U로 정의된 2 그룹으로 분리되었다.

N 환자 그룹은 108 증상을 나타내었다.

U 실험은 33 환자에 대하여 수행되었다. 환자들이 모두 예상 수명이 매우 낮기 때문에, 반응의 정의는 단지 주관적 및 객곽적 일반 증상, 즉 행동 상태에 근거하였다.

[U그룹(표 3)]

4개월후 LGE 치료를 받은 33인의 말기 ca 환자들은 모두 생존하였고, 이들중 11인은 아직 평가할 만하다고 생각되지 않았으며 나머지 22인의 환자중 13인은 반응자였다(3인은 1개월보다 짧은 기간).

나머지 10인의 반응자(30일) 중 5인은 6개월의 예상수명을 가지고 아직 생존하였다.

종양괴의 감소(25%) 및/또는 소실은 이 그룹에서 5에서 2인의 환자에게 나타났다. 9인의 비-반응자는 모두 사망하였다.

그룹 U의 환자에 있어서 대조군은 LGE 투여와 다른 시기에 21 환자에 대하여 수행되었다.

13 환자에 있어서 과립구 증가는 다른 임파구수의 증가 없이 통계적으로 유의성이 있었다.

이들 데이타의 평가에 있어서는 이들이 말기 ca 환자로, 매우 면역기능이 저하되어 있으며, 따라서 LGE에 의하여 유도되는 혈액 화학적 조정이 숨겨지거나 앞서 수행된 면역억제치료(화학적, 방사선치료 등)에 의하여 변형되었을 수도 있다는 것을 상기하는 것이 필요하다.

[N 그룹(표 4-5-6)]

108인 말기 ca 환자가 치료받았다. 모든 항종양적 특수요법(화학적, 방사선, 호르몬용법)이 무효한 것으로 입증되었기 때문에 이들 환자 모두에 있어서 중단되었다. 환자들은 단지 통증요법, 종종 아편 및 FANS 만을 받았으며, 이것은 이 시험 개시로 중단되었다.

모든 환자는 단일 용량의 LGE(1.5mg)를 1회 피하투여 받았다. 몇몇 경우에 있어서는 첫번 투여 30일 후 이 용량을 재투여 하였다.

투여받은 108인 중 단지 82 환자만이 평가되었고(표 4), 이들중에서 LGE 투여 5일 후 27인(32.9%)이 비반응자이고 52인(63.4%)이 반응자였다.

11인의 비반응자(13.4%)와 37인(45.1%)의 반응 환자는 1회의 LGE 주사로 첫번 30일 동안 생존하였다(표 4).

첫번째달 이후와 다음의 4달 이내에, 4인(4.8%)의 비반응자 및 30인의 반응자(36.5%)가 생존하였다. 1달 이상 생존한 30인의 반응환자중 24인(80%)에 있어서, 종양괴의 감소(25%) 또는 소실이 나타났다(제11도 및 표 5).

이들 환자에 있어서, 종양성 통증의 증상은 환자를 반응자로서 정의하기 위하여 모든 다른 계산된 증상과 독립적으로 연구되었다.

표 6은 이전의 관찰을 확인하는 82인의 환자에 대한 이 연구의 결과를 보여준다; 37/82(45.1%)의 현저한 환자 비율에서, 종종 가장 강력한 아편 및 최근의 통증 요법에도 저항성인 통증이 12/24시간 이내에 그리고 어느 경우에나 첫째날 이내에 소실되었다.

보다 작은 다른 환자 그룹(24/82)에 있어서, 종양성 통증의 소실은 비록 후에(30일 이내) 소실되었지만 항상 완전하였다.

[제3상]

환자들은 상기에서 열거한 것과 동일한 기준에 따라 조절되었지만, 치료의 해부-병리학적 평가가 도입되었다. 다른 암에 걸리고 LGE의 1회 주사를 맞은 6인의 환자가 4 내지 51일 범위의 간격이 지난 후 종양괴의 절제를 위하여 수술을 받았다.

6인의 환자로부터 총 8개의 표본을 검사하였다.

2개 표본 조직(둘 다 대장암에 걸린 환자로부터 얻은)을 치료 전에 얻었다.

위암(2인), 항문관 종양 및 췌장암에 걸린 다른 4인의 환자 뿐 아니라 동일한 환자로부터, LGE 투여(4 내지 51일 전부터 주사)후 조직을 검사하였다.

조직을 파라핀에 묻고 조직학적으로 검사하였다. 게다가, 임파구(통상적인 백혈구 항원 CLA), PAN P 표지 (L26 모노클로날), PNA T 표지(UCHL1 모노클로날)에 대하여 모노클로날 항체로 면역염색이 수행되었다.

결과는 다음을 지적한다:

LGE 치료 전에 얻은 종양 조직은 단지 완화한 염증성 침윤만을 보여주었다.

동일한 환자를 LGE로 치료하였다.

LGE 치료 15일 후 검사한 조직은 광범위한 괴상영역 및 현저한 과립구 침윤을 보여주었다.

LGE 치료 51일 후 다른 환자의 조직으로부터 동일한 결과를 얻었다.

모든 경우에 LGE 투여 후 검사 시기와 독립적으로, 호산성 과립구의 과립구 침윤은 매우 분명하였다. 주로 B형 임파구인 다른 형태의 임파구 염색은 CLA 양성 세포의 존재를 보여준 반면, UCHL1 세포(T 임파구)는 드물었다.

이렇게 과립구 및 호산구의 존재와 결합하는 T 임파구가 적은 것은, 요법중인 환자의 혈액화학적 값(LGE 투여후 첫날 동안 과립구가 증가한다)과 비교할 때, 그리고 PBL 증식의 저해가 관찰되는 LGE의 존재중 PBL 배양으로부터의 결과 및 호염구 탈과립 시험의 결과와 비교할 때 매우 흥미있는 것으로 보인다.

[임상적 결론]

3가지 다중심성 시험에서 얻어진 결과는 매우 균일하였다.

관찰 1개월 후 반응자의 양은 비록 시간, 과정 및 의사의 방법에 차이가 있었지만, 각각 48.2%, 45.4% 및 45.1%였다.

매 관찰 시기후 총 반응은 7일 그룹을 포함하여 각각 68.9%, 59% 및 63.4%였다.

46%(관찰시기 1개월)의 전체 반응율(제12도) 및 63.4%의 총 반응자를 얻었다. N 그룹(제4 및 5도)에 있어서 1개월 이상 생존한 반응자의 80%는 종양괴의 감소(25%) 또는 소실을 보인 점은 흥미롭다.

동일한 관찰 시기에 있어서 비반응자의 단지 4.8%만이 생존하였다.

매우 드물고 놀라운 관찰은 아편에 대하여 반응하지 않았던 환자에 있어서 종양 통증이 극적으로 (표 7)소실된 것이다.

이 효과는 종양괴의 감소 전에 시작되었으며 아무 객관적인 효과도 보이지 않았던 환자에게서도 존재하였다.

이러한 임상적 관찰은 보다 깊이 있게 연구할 가치가 있다.

제3상의 결과는 1회 용량의 LGE 투여후 강력한 과립구 증다증 및 종양 조직에 있어서 관주위 괴사를 보여주고, 조직병리학적 관점으로는 사람에 있어서 종양 특이적 기전을 갖는 종양 세포의 용해를 유도하고 숙주에 있어서 면역원성 패턴을 유도하는데 있어서 물질 활성을 확인해 준다.

Claims

염소, 양 및 상어로 이루어진 군으로부터 선택된 동물의 조직 균질화물로부터 HCIO₄와 3M KCl로 추출하는 것에 의하여 얻을 수 있으며, 다음의 특성을 갖는 폴리펩티드성 물질: -(폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 측정된) 분자량이 1,000 내지 ; 50,000 달톤 범위이며, 폴리아크릴아미드 겔상에서의 전기영동 밴드가 약 50,000, 20, 000, 14,800 및 12,000 달톤에 해당되며; -다른 동물중에 투여되었을 때 사람의 종양세포에 존재하는 항원을 생체내 또는 시험관내에서 인식할 수 있는 항체의 형성을 유도할 수 있고; -다른 종류의 악성 종양 환자에 투여되었을 때 통증을 감소시키거나 저해하고, 세포용해의 효과를 유도하고, 종양성장을 저해하거나 감소시킬 수 있음.
제1항에 있어서, 상기 동물의 조직이 간 또는 장관인 것을 특징으로 하는 물질.
제1항에 있어서, 상기 동물의 조직이 염소의 간인 것을 특징으로 하는 물질.
제1항 내지 제6항 중 어느 한항의 폴리펩티드성 물질을 활성성분으로서 포함하는 항종양 효과를 지닌 약제학적 조성물.
제1항에 있어서, 종양세포에 존재하는 항원에 대한 모노-또는 폴리-클로날 항체의 제조, 생체내 치료 및 진단 및 시험관내 진단에 이용되는 것을 특징으로 하는 폴리펩티드성 물질.
제4항에 있어서, 건강한 집단내에서 능동면역 (예방접종)이 이루어지도록 하기 위해 면역조절물질 및/또는 부형제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.