JPH06504039A - ヒトの治療に有用なポリペプチド性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ヒトの治療に有用なポリペプチド性物質本発明は、動物組織、特にヤギまたはヒ ツジ組織の抽出によって得られる物質であって、治療および診断に有用な物質に 関する。

さらに詳しくは、本発明は、ガン学的治療（または少な（とも腫瘍性疾患の補助 的治療）ならびに免疫組織学的および免疫血清学的な診断に応用する場合にそれ らの物質を有用にする驚くべき生物学的特性を有する物質に関する。

合成、半合成、発酵または抽出に由来する「外来性」抗腫傷薬に関する進行中の 研究に加えて、直接的細胞毒作用により、または免疫系の液性もしくは細胞性成 分との複雑な相互作用によって腫瘍細胞の生育を阻害し得る、身体内に自然に生 じる生理学的化合物の研究に基づ（新しいアプローチが、近年より一層注目され てきている。

この傾向の中で、例えば、インターフェロン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インタ ーロイキンのようなサイトカインおよびリンフ才力イン、異なる種類の細胞毒性 物質とモノクローナル抗体とのコンジュゲートから得られるイムノトキシン等に 、顕著な研究努力が払われている。

外因性組織から抽出され得る化合物の探索に対しては、今日まで余り注意が払わ れなかった。ヒツジおよびヒツジ胚の抽出により得られるＡＦ２と呼ばれる因子 は、１９４０年以来研究されてきたが、しかし明らかに、さらに研究を続ける価 値のある実用的な結果は得られていない（Ｓｃｈｗｅｉｚ−Ｒｕｎｄｓｃｈ−Ｍ ｅｄ、　Ｐｒａｘ、　１９９０娼（１６）：４９８−５０２　）。

腫瘍に罹患した患者の血清中の、異常な免疫学的特性を有する物質の存在（Ｂｉ ｏｍｅｄ、円］ａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、　１９８７．４１．２−５　）に関する 本発明者の従来の研究から出発して、現在では、動物組織、特にヤギおよびヒツ ジの組織からポリペプチド性の物質を抽出することができ、そわらの物質が下記 の驚くべき特性を有することが見出されたニ ー　それらは、ヒト腫瘍抗原を認識し得る抗体の生成を誘発し得る。

−それらは、異なる種類の悪性腫瘍に罹患したヒトに投与した場合に、腫瘍性疼 痛を軽減または阻止することができ、さらに細胞溶解の作用を誘発し、腫瘍の生 育を阻害または減速させることができる。

［ポリペプチド性物質」という用語の意味は、本開示中で用いる場合、タンパク 質、糖タンパク質、ムコタンパク質等のようなあらゆる種類のポリペプチド化合 物を包含するよう意図されるべきである。

本発明の物質は、好ましくは酸性条件下で、動物組織、特にヤギおよびヒツジの 組織のホモジネートを抽出して得られる。ヤギの器官を用いるのが特に好ましい ；予備試験では、他の動物種、例えばサメの使用も除外されていない。

肝臓および腸の抽出試験では、これらの器官における上記の特徴を有する物質の 存在が確認された；したがって、それらの分布は偏在性であり、１つの器官また は器官群に限定されないと考えられる。実際的理由から、ここではこれ以降ヤギ 肝臓に関して具体的に言及する。ヤギ肝臓は他の器官より取扱いが便利であり、 より容易に入手できる。

本発明の物質の抽出は、以下の工程を含む：ａ）通常の技法による組織および器 官のホモジナイザーシジン；ｂ）１０℃より低い温度での強無機酸による、ある いは等価の抽出法（界面活性剤、尿素等）によるホモジネートの処理；Ｃ）遠心 分離および水に対する透析； ｄ）高張液での処理、遠心分離または膜濾過、および水に対する、次いで生理食 塩緩衝液（ＰＢＳ）に対する透析；ｅ）約１　ｍｇ／ｍｌまでのタンパク質濃度 への、カットオフ１０．０ＯＯＤの膜上での限外濾過； ｆ）場合により、さらにゲルクロマトグラフィーによる精製。

工程ｂ）においては、約４℃の温度の２Ｎ　過塩素酸を用いるのが好ましい。

工程ｄ）では、３Ｍ　ＫＣＩ溶液を用いるのが好ましく、処理は４℃で約２４時 間実施する。透析、濾過または遠心分離操作は、通常の方法により実施する。

得られた物質は、本発明に従って直接用い得る。

それを、適宜に通常の方法で処理して、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃ ｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　Ｈａｎｄｂｏｏｋ、　Ｍａｃｋ　Ｐｕｂ、 　Ｇｏ、、　Ｎ、Ｙ、、　ＵＳＡに開示されているような好適な医薬組成物の形 態で患者または動物に投与するために、無菌的及び非発熱性にする。

上記の組成物の例としては、使用前に無菌生理食塩水、水性または油性無菌溶媒 中の溶液または懸濁液に溶解される凍結乾燥活性成分のバイアル、およびインビ ボ投与に好適な同様の組成物が含まれる。

後記で要約する予備臨床試験により、本発明の物質は、広範囲の用量で、例えば ０．１〜ｌｏＯｍｇ／日で、連日または異なる間隔（例えば週１回、月１回また はそれより長い間隔）で投与し得ると考λらねる。特に、ヤギ肝臓から抽出した 物質（以後ＬＧＥと呼ぶ）を用いて、腫瘍性病変に罹患した患者において驚くべ き且つ非常に迅速な結果を得るには、１〜３Ｂの量の乾燥物質（１〜３ｍｌ溶液 ）の１回投与で十分であり得るということが注目された。

約３０日後の２回目の投与は、時折有利な効果を生じ得る。しかしながら、進行 中の試験が、病理学および患者の状態により決定した薬量学および治療スケジュ ールの変更をめる可能性があるということは除外できない。

以下の実施例で本発明をさらに説明する。

泗 雄ヤギ肝臓１００ｇをブレードホモジナイザー中でホモジナイズし、ホモジネー トを蒸留水に再懸濁して、最終容量を４００ｍ１とした。

２Ｎ　ｔ（ＣＩ０４４００ｍｌを、４℃で約２０分で上記の懸濁液中に滴下し、 さらに３０分攪拌し、た、、１０．０００ｇで２０分遠心分離後、沈殿物を捨て 、上清を水道水に対して、次いで蒸留水に対して透析した。

１雪折後、３Ｍ溶液が得られるまで粉末ＫＣＩを得られた液体に添加し、この混 合物を４℃で２４時間攪拌した。１００，０００ｇで１時間遠心分離後、上清を 蒸留水およびリン酸緩衝液（ＰＢＳ）に対して透析した。

得られた溶液（８００ｍｌ）は、Ｌｏｗｒｙ法によれば２００　ｕｇ／ｍｌの平 均タンパク質濃度を有していた。

この溶液を限外濾過により１　ｍｇ／ｍｌの濃度まで濃縮し、ＬＧＥと命名して 、後記で要約する臨床試験に直接用いたが、そこでは常に略語Ｌ　Ｇ　Ｅとして 引用している。

この物質をＰＡＧＥ　４／３０で検定すると、４つの主要バンドがはっきり見え た（図１）：橿準のパラメーターから得られた検量曲線から、４つの主要バンド の分子量を算出した：第−パンド；　＝　約５０，０００ｄ 第二バンド：　＝　約２０，０ＯＯｄ 第三バンド二　二　約１４，８００ｄ 第四バンド：　＝　約１２，０ＯＯｄ ＬＧＥ抽出に続く精製工程として、以下の方法に従ってイオン交換クロマトグラ フィーを用いた。ＬＧＥ約２０ｍ１を、リン酸緩衝液（Ｎａ、ＨＰＯ，−ＮａＨ ｉ　ＰＯ４０，ＯＩＭ、ｐＨ６，５）に対して透析した。透析後、試料を０．４ ５μｍフィルターを通して濾過し、次いで、同一の透析緩衝液で平衡化したＴＳ Ｋ　ＤＥＡＥＳＰＷ７．５Ｘ７．５ｍｍカラム上で、３０ｍ１／時間の流量で交 換した。

カラム溶離を同一の流量および緩衝液で１００分間続けた。

ｐＨ６，５のリン酸緩衝液の線形勾配を、初期モル濃度０．０ＩＭから始めて最 終モル濃度０．１Ｍまでとしたが、この勾配は持続時間１００分であり、操作流 量は３０ｍ１／時間に維持した。

溶離物から０．５ｍ１分画を収集し、種々のピークに対応する異なる帯域をプー ルした。

クロマトグラム（図２）から導かれるように、種々のタンパク質分画が得られた 。これらをＰＡＧＥ　ＰＡＡ４／３０で別々に検定してその成分を評価した。Ａ 帯と定義された出発緩衝液、およびＢ帯と定義された最高タンパク質濃度を有す る勾配分画は、低分子タンパク質が主としてＡ帯に存在し、一方５０，０００ダ ルトンの分子量を有するタンパク質はＢ帯により高い濃度で存在したため、より 興味深いと前もって考えられた。

その２つの試料、すなわちＡ帯およびＢ帯を、次に１１２５で樟識しく図３およ び４）、ＲＩＡに用いた。実際に有用な量でＡ帯およびＢ帯を別々に投与する臨 床実験に利用できるようにするためには、より大量のＬ　Ｇ　Ｅの精製を要した 。

ＤＥＡＥ　ＳＰＷカラムと同一条件下で平衡化および溶離するゾーン大量調製用 ゲルＤ　Ｅ　Ａ　Ｅ　−５ｅｐｈａｄｅｘカラムを、ＦＰＬＣに用いた。

ＬＧＥ　８００ｍｇをこのカラムで精製し、Ａ帯４２ｍｇおよびＢ帯１５ｍｇを 得た。

次いで、Ｌ　Ｇ　Ｅハツチ２／９０の一部を、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔ ｅｍ社のＡｑｕａｐｏｒｅ　Ｂｕｔｙｌ　（３０Ｘ　４　、６ｍｍ　７　Ｕ）に より逆相で、溶離剤として水、および０．０５％ＴＦＡを含有するアセトニトリ ルを２５〜５５％アセトニトリルの線形勾配で用いて１５分間で分析した。２２ Ｏｎｏｎで記録したクロマトグラムを図５に示す。ＤＥＡＥ−５ｅｐｈａｃｅｌ ｌから得られるＡ帯およびＢ帯試料の一部を、粗製ＬＧＥに関して報告されたも のと同一条件下で、逆相でクロマトグラフィーに付した（図６および図７）。

粗製ＬＧＥのクロマトグラム並びにＡ帯およびＢ帯のクロマトグラムを調べると 、原生成物中に見出されるより有意のタンパク質成分は、濃度は異なっていても 、Ａ帯およびＢ帯から得られた２つの試料で同一であることが観察された。

！亙虚 ＰＡＧＥプレートＬＫ８３．５−９．５を、使用説明書に従って用いた。

非分画ＬＧＥは、ｐＨ８，３に１本のかすかなバンドを、ｐＨ６，７〜７に１本 の顕著なバンドを、そしてｐＨ６〜４．５の間に同種抗原の典型的様相を有する 数本の密なバンドを示した。

ＬＧＥのＡ帯は、ｐＨ８，２に１本の顕著なバンドを、ｐＨ６，７に１本の顕著 なバンドを、そして酸帯域に、ｐｏｓ、ｓ、５および４．９に３本の特定のバン ドのい（らかの広まりを伴ういくつかのバンドを示した。

ＬＧＥのＢ帯は、同種抗原の典型的様相を有する顕著な強度の帯の染色をｐＨ＜ ６の酸帯域に示した。

白・、　′・および　・阜　１白・± 遠心分離工程前に得られた溶液から５ｍｌの用量（乾燥抽出物１ｍｇに相当する ）を調製し、フロイント完全アジュバントで乳化させた。ウサギ２羽を１５日毎 に１用量で免疫した。

元の２羽のウサギのうち、１羽は最初の免疫後に死亡した。二羽目の動物から血 清のアリコート（ＲＦ４と呼ぶ）を採取し、これを次に生化学的、免疫化学的、 放射線免疫学的および免疫細胞化学的試験に用いた。ＲＦ４抗体を、Ｉ−Ｇ　Ｈ に対するウェスタンプロット法を用いて調べた。抗原をＰＡＧＥ　ＳＤＳ　ＰＡ Ａ　４／３０プレート（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけ、続いてニトロセルロース にトランスブロリティックした。この最後のものを、次にＲＦ４血清と一緒にイ ンキュベートし、抗ウサギペルオキシダーゼ（ＰＩＥＲＣＥ）で反応を明らかに した。図８に示すように、この抗体は分子量約５０．０ＯＯｄのタンパク質を認 識した。

第二訂のウサギを、上記のようにＬＧＥで免疫した［５ｍ１（乾燥抽出物５ｍｇ に相当）、フロイント完全アジュバント２．５ｍｌで！Ｌ化させたもの］。

これらのウサギは、抗ＬＧＥＩ、２．３．４．５．６．７．８．９．１０．１１ ．１２．１３．１４と呼ばれる１４種類の抗血清を産生した。これらをＲＦ４と 同じ方法で試験した。

°＋化学的方法（特にウェスタンプロット法）から得られたデータは、こ第１ら の抗血清が、ＲＦ４抗血清とは異なって、ＬＧＥの全てのタンパク質成分を認識 したことを示唆する（図９）。

さらに、モノクローナル抗体の産生のために、１０週齢のｆｌＢＡＩ、Ｂ　／　 ｃマウスを免疫した。具体的には、抗原１００Ｉｌｌ＋フロインドアジユバント １００μｍの皮下投与により、２匹のマウスをＬ　Ｇ　Ｅ　（１ｍｇ／ｍｌ）で 免疫し、２匹をＤＥＡＥ　５ＰＷからの１．−　Ｇ　Ｅ　Ａ帯（ｌ　ｍｇ／ｍｌ ）で免疫した。

免疫計画を以下に示すニ 一次投与：Ａｇ　１００ｕｌ＋フロイント完全アジユバント１００μｍ。

二次投与：Ａｇ　１００１１１　＋フロイント完全アジュバント１００ｕｌ。

一次投与の７日後。

三次投与：二次と同様。

二次投与の７日後。

四次投与：三次と同様。

三次投与の７日後。

免疫終了時に各マウスから血液のアリコートを採取し、得られた血清をＬ　Ｇ　 Ｅに対する結合試験（図１０）、および免疫細胞化学的試験に付した。

得られた結果に基づいて、モノクローナル抗体を得るためにＬＧＥ　Ａ帯で免疫 したマウスｎ、２を屠殺することにした。

Ｍｉｌｓｔｅｉｎに従って実施した融合により、２５０個のクローンが得られた 。

一次スクリーニングは、多数のクローンがＬ　Ｇ　Ｅ低分子成分に発現されてい る決定基に向けられ、一方、より少数のクローンが５０．０００のタンパク質を 認識することを示した。クローン拡張後に実施した二次スクリーニングは、全て のクローンに関して陰性結果を示し、したがって別の免疫マウスからの牌臓を融 合することにした。この融合から、４００クローン（１００％）が得られた。

最初の試験では、約１０日後に６４クローンがＬＧＥに関して陽性であることが 立証された。

続いて、これら６４クローンの上清を、Ｌ、ＧＥ、ＬＧＥ　Ａ帯およびＬＧＥＢ 帯に関して試験した。スクリーニングは、４つのクローンが３抗原との強い結合 を示し、ＬＧＥ　Ａ帯に関してより明らかであることを示した。これら４つのク ローンをクローニングし、次いで３つの抗原に関して同様に再試験した。平行し て、これらのクローンをウェスタンプロットによってもＬＧＥに関して試験した 。

これら２つの試験の結果から、我々は９クローンの腹水を拡張し、産生させるこ とにした。得られた腹水を、ＬＧＥ、ＬＧＥ　Ａ帯およびＬＧＥ　Ｂ帯に対する 結合試験で滴定した。腹水は全て、この３つの抗原との良好な程度の結合を示し 、ＬＧＥ　Ａ帯に対してはいくらか広がりを示した。

これに対して、ウェスタンプロット試験は、１つのモノクローナル抗体だけが５ ０．０ＯＯｄバンドと結合でき、一方、その他のものは全て５０，０ＯＯｄをわ ずかに超える分子量を有するバンドを認識することを示した。結合試験と相違し て、これらのモノクローナル抗体は、どれも低分子成分とのいかなる結合も示さ なかった。

腫瘍移ｔｔｉ（ＨＴ２９と名付けられたヒト結腸線ガン細胞株）を施された「ヌ ード」マウスを用いた試験を実施した。

培地０．５ｍｌ中の１．０，０００，０００個の細胞を各動物に接種した。接種 の１７日後に、イムノグロブリン分画を単離するために、予めイオン交換により 精製し、次いで１２ｓｉで放射能標識したＲＦ４抗血清で動物を処理した。各動 物には、０．５　ｍＬ　ＰＢＳ＋１％ＢＳＡ中の１０，０００．ＯＯＯｃｐｍを 腹腔内接種した。

２４．４８および７２時間後に動物を層殺し、剖検して、抗体局在指数を算出し た。

ＬＧＥ免疫ウサギの血清による抗原認識能力を、ヒト組織に関して調べた。

ＡＢＣイムノペルオキシダーゼおよびイムノガラクトシダーゼ法によりヒト組織 切片で、並びにＲＩＡによりヒト組織抽出物で抗血清を調べた。

胃、大腸、乳房、肺、前立腺および卵巣のガン、並びにＨＴ２９細ｌ１２！（腸 ガンからの）の腫瘍外植片（ヌードマウスで得られた）、乳ガン　ＭＣＦ７およ びＧＴＬ１６細胞の、ホルマリン固定−パラフィン包埋切片を用いた。対照のた めに、異なるヒト正常組織を用いた。

得られた結果から、以下のことが立証された：ａ）褐色に染色されたウサギ抗Ｌ ＧＥ血清は、胃ガン、大腸ガンおよび乳ガン並びにＨＴ２９細胞、ＧＴＬ１６細 胞の場合、腫瘍細胞の表在性および細胞質性抗ｌ１９ｉＩｌｌＩ造を、種々の程 度の力価および特異性をもって認識した。

ｂ）免疫細胞化学的試験においてウサギ抗ＬＧＥ血清とヒト正常肝細胞との間に 反応は起きず、免疫細胞化学的試験およびＲＩＡにおいてＣＥＡと反応しなかっ た。

Ｃ）試験した腫瘍は全て陽性ではなかった。

ＬＧＥ、　”’Ｉ　ＬＧＥ、ウサギ抗ＬＧＥおよびウサギ１２５工抗ＬＧＥ系を 、インビボで、ヌードマウスおよびＨＴ２９細胞を異種移植したヌードマウスに おいて試験した。

得られた結果を以下に示す・ １）両群において、　”Ｊ　ＬＧＥはインビボで非常に迅速な代謝回転を示し、 た：皮丁注射の２４〜４８時間後に放射能は全て泌尿系に局在した。

２）ＬＧＥおよび抗Ｌ　Ｇ　Ｅイムノグロブリンは、いくつかの場合に腫瘍の顕 著な充血が観察された場合でも、ヌードマウスの腫瘍の苦しみの軽減を誘発しな かった。

３）　１２’Ｉ一種識抗１−　Ｇ　Ｅイムノグロブリンは、ＨＴ　２９細胞を異 種移植されたヌードマウスへの注射の３〜５日後に、腫瘍性塊中に有意のＬ　Ｇ 　Ｅ局在を示した。上記の結果は、免疫細胞化学的データをインビボで再現した 。

抽出物（ＬＧＥ）および抗ＬＧＥ血清を、以下に関してインビトロで試験した・ １）ヒト腫瘍性胸膜滲出液の一次培養。

２）腫瘍性細口包株：ヒト（ＨＭＦ７株およびＨＴ２９株）およびラット（Ｒ３ ２３０ＡＣ）。

、４）好塩基球脱顆粒試験。

結果を以下に示す・ １＞ＬＧＥおよび抗ＬＧＥ血清は、腫瘍性細胞に対して直接の毒性作用を何ら示 さなかった。

２）ＬＧＥおよび抗ＬＧＥ血清は、標的細胞に対してＴＮＦ　（腫瘍壊死因子） 活性をインビトロで何ら示さなかった。

３）おそらくリンパ球および／またはマクロファージに媒介される細胞毒活性は 、腫瘍性滲出液の一次培養における乳ガン細胞に関して立証された。

４）標的細胞としてに５６２およびＨＬ６０を用いた場合、ＬＧＥはヒトリンパ 球に対して強力なＬＡＫ　（リンフ才力イン活性化キラー細胞）誘発因子として 作用した。

この結果は、ＩＬ２応答と比較して変動し得た。事実、異なるドナーからのリン パ球は、ＬＧＥで処理した場合、異なる細胞毒性作用を示した。

これに対して、ＬＧＥおよびＩＬ−２共用は、この活性を大いに増大した（＋２ ７．２％）。

ＣＴＬＬ細胞（ＩＬ−２感受性）を用いて実施した実験は、ＬＧＥとＩＬ−２と の間のいかなる種類の類似性も排除した。

ＬＧＥと、いかなるＢＲＭ（生物学的応答調節剤）、特に２群のものとの間での 比較は、実施し得なかった。実際、ＬＧＥは、腫瘍細胞に対してインビトロで、 「ヌードコマウスモデルにおける腫瘍細胞に対してインビボで、不活性であった 。転移性ヒト胸膜滲出液に関してＬＧＥを用いて得られたインビボ応答は、免疫 媒介細胞の存在が必要であることを示した。

他方、高酸性培地中のＬＧＥの抽出は、ＢＲＭやインターフェロンとのいかなる 類似性も排除した。

５）ＬＧＥは、ＰＢＬの増殖を「インビトロ」で阻害した。これはリンパ球に及 ぼす直接阻害作用に関連づけられ得るか、あるいは異なる阻害因子の誘導により 媒介される可能性がある。阻害作用は、用量および時間依存性であるように見え た。

■−５ＧＥを好塩基球／顆粒球験で検定した。この試験は、免疫記憶を獲得した 好塩基球および／または結合抗体に対する特異的抗原を認識するために用いた。

試験は、３０％を超える値について陽性であると考えられる。肺ガン患者の血液 試料に関して、ＬＧＥは、有意の用量依存性好塩基球脱顆粒（〉８０％）を非常 に低濃度（１＋１ｇ〜０．　１　＋１ｇ／ｍｌ）で生じた。さらに５症例に関し て実施した試験は、新形成を患う患者の５０％がこの試験に陽性であることを示 した。脱顆粒は、非洗浄（すなわち、循環抗体および抗原の存在下で、好塩基球 と結合する因子を伴わないだけ）で実施した対！］ｑおよびカルシウムなしの試 料に関しては起きなかった（表１）。

好塩基球の脱顆粒は、健常ドナーの血液を用いた場合は認められなかった。

表１ 誕 全血 好塩基球／顆粒球　（％）　脱顆粒化Ｂ（好塩基球） の％ 対照　２５　６０５０　０．４１ １００　ｕｇ／ｍ１　２１　６０００　０．３５　１５１０　μｇ／ｍ１　２８ 　６９００　０．４　２１　＋１ｇ／ｍ１　３４　７８３０　０．４３　００、 Ｉ　Ｉｔｇ／ｍｌ　２５　７５００　０．３４　１５１００　ｕｇ／ｍｌ　Ｃａ ”なし　３１　８３００　０．３７　７（次ページへつづく） （前ページからのつづき） 、先、争血ｌ夜 好塩基球／顆粒球　（％）　脱顆粒化Ｂ（好塩基球） の％ 対照　４６　８５５０　０．５４ １００　μｇ／ｍ１　２１　１００００　０．２１　６１１０　μｇ／ｍ１　１ ２　１００００　０．１２　７８１　ＬＬｇ／ｍｌ　９　１００００　０．０９ 　８３０、Ｉ　ＬＬｇ／ｍ１．　２５　１１０００　０．２２　５９１００　ｇ ｇ／＋＋＋ｌ　ＣＢ”なし　４３　６３００　０．６９　０１０　ｕｇ／ｍｌ　 Ｃａ”なし　４４　６５００　０．６７　０１　μｇ／ｍｌ　Ｃａ”なし　４３ 　６３００　０．６９　０毒物学 動物における急性および慢性毒性を、マウスおよびウサギで試験した。

急性毒性に関しては、マウスおよびウサギに、７　、　１　ｍｇ／ｋｇ用量と等 価のＬＧＥ溶液を、毎日（１０日間）皮下注射した。

慢性毒性試験は、毎週１．２ｍｇ／ｋｇの用量で６か月間、ウサギで進行中であ る。

毒性作用も検出可能な変化も、何ら立証できなかった。

１２５Ｉ欅識ＬＧＥを用いた予備試験は、尿を通じた２　４／４８時間内の完全 クリアランスを立証した。

動物に種々の濃度でＬＧＥを注射することによって、何らの毒性作用も検出でき なかった。致死用量は測定できなかった。

ｌ困試■ 第一段階 末期慰者２９名を、特別に、患者の同意を得て治療した。患者は全員、複数の抗 ガン療法（手術、放射線療法、化学療法）を以前に受けたことがあり、並びに抗 炎症薬（ＦＡＮＳおよびステロイド）およびオピオイドまたは他の主な鎮痛薬の コースといった補助的療？去？麦であった。

はとんどの患者が悪液質で、ずっと前昏睡状態であり、平均余命が〈７日であっ た。

それにもかかわらず、７０％の患者で陽性の応答が観察され、そのＲも一般的な 効果は、疼痛の消失および患者の主観的幸福感の誘発であった；患者の４８％に 関して余命の顕著な増大（〉２か月）が観察され、疼痛は再発しなかった。

２か月を超えて生存した１４名の患者の５名において、腫瘍性塊の縮小が観察さ れた（表２）。

表２ 第一段階 ＬＧＥ皮下注射（１，５ｍｇ）に対する応答転移および症例数　陽性３０日間　 陽性１５５回目　陰性胃腸　８　３（３７，５％）　ｌ　（１２，５％）　３（ ３７，５％）肺ガン　６　４（６６，６％ｌ　１　（１６，６％）　１（１６， ６％）７Ｌガン　４　２＋５０％）　０２５％）　Ｉ（２５％）膵ｑ蔵ガン　４ 　０２５％）　２（５０％）　１（２５％）、２尿− 宇殖器ガン　３　３（１００％）− 巾腫　２　１　（５０％）　１＋５０％）種々のガン　２　１（５０％ｌ　ｌ　 （５０％）計　２９１４°（４８，２％）　６＋２０．６％＋　９（３１，４％ ）＊　５例において腫瘍性塊の消失（臨床−計器的に立証）第一群の患者におい ては、治療は非常に好ましい亜活性作用を発揮したが、病理的および臨床的状態 が異なるためにそれ以上の分析は実施できず、したがって患者は計器的または実 験室評価を受けなかった。

さらに、ＬＧＥ治療は、毎日〜週１回投与（０、０２５ｍｇ／ｋｇ）の範囲にわ たった。この経験においては、過敏症反応は現れなかった。

この研究の最初の部分から、以下の観察が得られた：１）ＬＧＥは、反復して毎 日投与後も、ヒトにおいて毒性を示さなかった。

２）異なるバッチが同一の臨床効果を誘発した。

３）ＬＧＥは、より良い体感、食欲および腸機能の改善と共に強度の疼痛軽減を 誘発した。

臨床医の意見では、それは非常に重篤な患者に解明されていない「多幸感」を誘 発した。

第二段階 この期間中、新しい末期ガン患者１４１名を治療した。しかし、ＬＧＥの無害性 についての保証および観察された肯定的作用を実証する必要性に基づいて、臨床 医の姿勢は異なった。しかしながら、他のいかなる治療もうまく行かなかった末 期患者にだけは、単に清秋を考虜して、依然として薬剤を投与した。

はとんど全ての患者が、ＬＧＥ　１．５ｍｇ（約０　、０２５　ｍｇ／ｋｇ）の １回の皮下注射を受けた。いくつかの場合には（最後の３か月に）、１か月後に ２回目の用量を投与した。

下記の図では、患者をｒＮＪおよび日月と定義された２群に分けた。

ｒＪ患者の集まりには１０８症例を示した。

ｒ　Ｕ　Ｊ実験は、３３名の患者に実施した。患者の余命が全員非常に短いため に、応答者の定義は、主観的および客観的な一般的状態、すなオ）も反応状況だ けに基づいた。

ｌ工及ユＬ ４か月後、Ｌ　Ｇ　Ｅ治療を受けた末期ガン患者３３名は全員生存し２、そのう ちｌ１名はまだ評価可能でないと考えられたが、残り２２名のうち１３名は応答 者であった（１か月未溝の期間では３名）。

残り１０名の応答者のうち（〉３０日）、５名は余命６か月で依然として生存し ５ていた。

瞳瘍塊の縮小（〉２５％）および／または消失が、この群では５名のうちの２名 で示された。非応答Ｍ９名は全員死亡し、た。

ｒ　ＬＩ　Ｊ肝の患者において、対照試験は、Ｌ　Ｇ　Ｅ投与とは異なる時期に ２１名の患者で実施した。

１３名の患者においては、他のいかなるリンパ球集団の増加も伴わずに、顆粒球 の増加が統計的に有意であった。

表３ 第二段階−ｒＵＪ群 臨床状態　症例数　生存　死亡　塊の退行または消失 （〉２５％） 非応答者　９−９ 応答者３０日日月１０５５２ 応答者３０日日月３−３ 評価中　１１　１１　− 計　３３　１６　１７　２ これらのデータの評価時には、これらは高度に免疫抑制された末期ガン患者であ ったということを思い起こす必要があり、したがって、ＬＧＥにより誘発された 血液化学的変化は、過去に実施された免疫抑制療法（化学療法、放射線療法等） により不明瞭となったり変えられたりした可能性がある。

ｒＮ　（４−５−６） 末期ガン患者１０８名を治療した。全ての抗腫瘍特異的療法（化学、放射線、ホ ルモン療法）は、それらが有効でないことが立証されたため、これらの患者全員 に対して一時中止された。患者は疼痛療法だけを受けており、それはしばしばオ ピオイドおよびＦＡＮＳであったが、これらはこの試験の開始時に中断された。

患者は全員、１用量のＬＧＥ　（１，５ｍｇ）皮下１回投与を受けた。いくつか の場合には、初回投与の３０日後にこの用量を繰り返した。

治療を受けた１０８名のうち、８２名の患者だけを評価した（表・４）６、その うち、Ｌ　Ｇ　Ｅ治療の５日後に、２７名（３２，９％）が−１１応答者で、５ ２名（６３４％）が応答者であった。

非応答者１１名（１：３．４％）および応答者３７名（４５１％）は、Ｌ　ＧＥ 　１回注射から最初の３０日以内は生存した（表４）。

表４ 第二段階　−ｒＮＪ群 転移　症例数　評　価　５日月　３０日日月３０日日月−塊症例数 胃腸ガン　２７　１７　７−　１−　１　４９＋　５＋　５＋ １市ガン　２２　１７　５−　２−　０　４１０＋　７＋　５＋ 孔ガン　２０　＋６　４−　２−　１−　４喉頭ガン　３　２　２−　１−　０ 　０甲状腺ガン　６　４　２−　１−　０　１２＋　１＋　０ 柔組織肉ｌＩ＠　４　３　２−　１−　０　１１＋　１＋　１＋ １　ｎ１＠　１４　１３　２−　１　１−　６計　１０８　８２　２７−　１１ 　４−　２４５２÷　３７４　３０＋ −非応答者である患者 ＋ＬＬ、答者である患者 一塊　縮小（〉２５％）または消失 最初の１か月後およびその後の４か月には、非応答者４名（４，８％）および応 答者３０名（３６５％）が生存した。ｌか１を越えて生存した３０名の応答者患 者のうち、２４名（８０％）においても、腫瘍性塊の縮小（〉２５％）または消 失が認められた（図１１および表５）。

表５ 第二段階　−「Ｎ１群 ＬＧＥ療法　−応答者と腫瘍性塊との関係転移　症例数　非応答者　応答者（〉 １か月）　−塊０胃腸ガン　１７　１　５　４ 肺ガン　１７　０　５　４ 乳ガン　１６　１　８　４ 喉頭ガン　２　０　０　。

甲状腺ガン　４　０１　１ 柔組織肉腫　３　０１　１ 骨肉腫　１３　１　７　６ 計　８２　４　３０　２４ これらの患者においては、患者を応答者と定義するために、ｒｌｌ！１１性疼痛 」の症状を、採点したその地金ての症状とは別に試験した。

表６は、患者８２名に関するこの試験の結果を示すが、これは以前の観察を確証 するものであった：症例の顕著なパーセンテージ、オなオっち３７／８２　（４ ５，１％）において、最も重要なオピオイドおよび最新の疼痛療法がＬ２ばしば 効かない疼痛が、１２／２４時間１ヲ、内に消失し、どの場合にも常に第−日月 のうちであった。

他のより少数の患者の群（２４／８２）では、腫瘍性疼痛の消失は、常に完全で はあったが、しかし７それはより遅く　（３０日以内）に消失ｌ−だ。

表６ 第二段階　−ｒＮ」群 ＬＧＥ療法　−腫瘍性疼痛の消失 転移　評価症例数　５日月まで　３０日目止で胃腸ガン　１７９６ １市ガン　１７　９　５ 乳ガン　１６９２ 泌尿生殖器　１０５３ ガン 喉頭ガン　２　０　０ 甲状腺ガン　４　２　１ 柔組織肉腫　３　１　１ 骨肉腫　１３２６ 第三段階 上記と同一の判定基準に従って患者を調節したが、治療の解剖−病理学的評価を 導入した。ＬＧＥの１回注射を受けた異なるガンを轡う患者６名に、４〜５１日 の間隔をあけた後に腫瘍塊の切除のための手術を施した。

６名の患者からの計８つの検体を調べた。

２つの検体組織（両方とも大腸ガン患者からの）は、治療前に採取した。

同じ患者からの、並びに胃ガン（２例）、肛門道のガンおよび膵臓ガンに罹患し た他の４名の患者からの組織を、Ｌ　Ｇ　Ｅ治療後（注射は、４〜５１日前に行 なった）に検査した。

組織をパラフィンに包埋し、組織学的に検査した。さらに、リンパ球（共通白血 球抗原　ＣＬＡ）、ＰＡＮ　Ｐ　マ　−　カ　−（Ｌ２６　モノクローナル）、 ＰＡＮＴマーカー（ＵＣＨＬＩモノクローナル）に対するモノクローナル抗体を 用いて免疫染色を実施した。

結果は以下のことを示す： ＬＧＥ治療前に得られた腫瘍性組織は、中程度の炎症性浸潤のみを示した。

同じ患者をＬＧＥで治療した。

ＬＧＥ冶療治療５日後に調べた組織は、広範な壊死領域および顆粒球の顕著な浸 潤を示した。

同一の結果が、ＬＧＥ冶療治療１日後の異なる患者から得られた。

全症例において、ＬＧＥ治療後の検査の時間によらず、好酸性顆粒球による顆粒 球浸潤が非常に明らかであった。異なる種類のリンパ球を染色すると、主にＢ型 リンパ球であるＣＬＡ陽性細胞の存在が示されたが、一方、ＵＣＨＬＩ細胞（Ｔ リンパ球）はまれであった。

顆粒球および好酸球の存在と結びつけられるこの少数のＴリンパ球は、治療時の 患者の血液化学的値（顆粒球はＬＧＥ投与後第１日目日月加する）や、ＰＢＬ増 殖の阻害が観察されたＬ　Ｇ　Ｅ存在下でのＰ　Ｂ　Ｌ、培養からの結果および 好塩基球脱顆粒試験の結果と比較すると、非常に興味深いと思われた。

駄困口粘遣 ３つの卒中心的試験で得られた結果は、全く均一であった。

時間、手順および医師の修養に差異があったが、観察の１か周接の応答者の量は 、それぞれ４８８２％、４５．４％および４５．１％であった。

〈７日の群を含めた全ての観察期間後の総体的応答は、それぞれ６８９％、５９ ％および６３４％であった。

総応答者の４６％（観察期間１か月）および６３．４％の総体的応答率（図１２ ）が得られた。ｒＮＪ群では（表４および５）、１か月を越えて生存した応答者 の８０％が腫瘍性塊の縮小（〉２５％）または消失を示したことは興味深い。

同一観察期間においては、非応答者の４．８％だけが生存した。

非常にまれで且つ驚くべき観察は、オピオイドに応答しない被験者においても腫 瘍性疼痛が劇的に（表７）消失したことであった。

この効果は腫瘍塊の縮小前に始まり、客観的効果が認められない愚者にも存在す る。

表７ ＬＧＥ療法＝１回皮下注射（１，５ｍｇ）患者１３４名の臨床結果 塊の縮小または消失 応答者　８５３０日：１２ 〉３０日：５４　３１ 非応答者　４９ この臨床的観察は、さらに深く研究するに値する。

第三番目の試験の結果は、ＬＧＥの１回用量の投与後の腫瘍性組織における集中 的な顆粒球増加症および血管周囲の壊死を示し、組織病理学的見地から、腫瘍特 異的な機序によりヒトの腫瘍性細胞の溶解を誘発し、宿主の免疫原性パターンを 誘発することにおける本物質の活性を確認するものである。

’ＦｉＱ−ＪＱεＡ ＰＡＡ　４／３０で（７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ３：ＬＧＥロット１ ４：ＬＧＥロットｌ／Ｂ −＋’＋ｒ平 −ｐ１ｒ平、−０１Ｘ −１１（平１−０１　’ 、４１ｒ平　ｔ−０１× ＳＴ　１１２３４　Ｓ　６　７　８　Ｓ）　２４　ｍ　ＬにＥクロット１９１ ＳＴ２雪低分子 ＰＡＡ８／１　Ｂ上でのＳＤＳ　ＰＡＧＥ］＝　ＡＨｃｏｎ　Ａ−３ｅｐｈａｒ ｏｓｅ　非結合２＝　Ａ帯ｃｏｎ　Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　結合３＝ロット４ ／９１ 補正書の写しく翻訳文）提出書（特許法第１８４条の８）平成５年６月ｌＯ日

Claims (13)

【特許請求の範囲】
1. １．動物組織ホモジネートから抽出することによって得られるポリペプチド性物 質であって、種々の動物種に投与した場合に、ヒト腫瘍性細胞に存在する抗原を インビボまたはインビトロで認識可能な抗体の生成を誘発し得る；且つ、種々の 悪性腫瘍に罹患したヒトに投与した場合に、疼痛を軽減または阻止し、細胞溶解 の作用を誘発し、腫瘍の成長を阻止または減速し得る物質。
2. ２．動物組織ホモジネートからＨＣ１Ｏ４および３Ｍ　ＫＣｌを用いて抽出する ことによって得られるポリペプチド性物質であって、以下の特性を有する物質： −　分子量が１０，０００〜５０，０００ダルトンの範囲（ポリアクリルアミド ゲル電気泳動による）である；−　それらは、異なる動物種に投与した場合に、 ヒト腫瘍性細胞に存在する抗原をインビボまたはインビトロで認識し得る抗体の 生成を誘発し得る； −　それらは、異なる種類の悪性腫瘍に罹患したヒトに投与した場合に、疼痛を 軽減または阻止し、細胞溶解の作用を誘発し、腫瘍の成長を阻止または減速し得 る。
3. ３．ヤギまたはヒツジの組織から得られる請求項１または２記載の物質。
4. ４．ヤギ、ヒツジまたは雄ヒツジ組織から得られる請求項３記載の物質。
5. ５．サメ組織から得られる請求項１または２記載の物質。
6. ６．肝臓または腸から得られる請求項１〜５のいずれか１項に記載の物質。
7. ７．ヤギ肝臓から得られる請求項１〜２記載の物質。
8. ８．ヤギ肝臓または腸から得られる請求項１または２記載のポリペプチド性物質 であって、ポリアクリルアミドゲル上で約５０，０００、２０，０００、１４， ８００および１２，０００ダルトンの電気泳動バンドを有する物質。
9. ９．請求項１〜７記載の物質の製造方法であって、以下の：ａ）従来の技法によ る組織または器官のホモジナイゼーション； ｂ）１０℃より低い温度での強無機酸によるホモジネートの処理、または等価の 抽出手順； ｃ）遠心分離および水に対する透析； ｄ）高張液での処理、遠心分離または膜濾過、および水に対する、続いて生理食 塩緩衝液に対する透析；ｅ）約１ｍｇ／ｍｌまでのタンパク質濃度への、カット オフ１０，０００の膜上での限外濾過； ｆ）場合により、さらにゲルクロマトグラフィーによる精製；を含む方法。
10. １０．請求項１〜８記載のポリペプチド性物質から成る、またはそれを活性成分 として含有する医薬組成物。
11. １１．抗腫瘍療法および（腫瘍病理関連疼痛の）制御に有用な薬剤としての請求 項１〜８記載の物質の用途。
12. １２．インビボ治療および診断に用いるための、およびインビトロ診断（ＲＩＡ 、ＥＩＡ、免疫細胞化学）に用いるための、腫瘍性細胞に存在する抗原に対する モノクローナルまたはポリクローナル抗体の製造のための請求項１〜８記載の物 質の用途。
13. １３．免疫調節物質および／またはアジュバントとの好適なコンジュゲートにし て、健康な集団に能動免疫を産生（予防接種）させる請求項１〜８記載の物質の 用途。