JP2690956B2

JP2690956B2 - 生体由来のタンパク質

Info

Publication number: JP2690956B2
Application number: JP63205690A
Authority: JP
Inventors: 喬村松; 寿子村松; 浩井上; 昭粟屋; 英雄福井; ▲吉▼秀橋本
Original assignee: 三井東圧化学株式会社; 三井製薬工業株式会社; 喬村松
Priority date: 1987-08-22
Filing date: 1988-08-20
Publication date: 1997-12-17
Anticipated expiration: 2012-12-17
Also published as: WO1989001947A1; JPH03173899A; DE3885735T2; DE3885735D1; EP0331743B1; EP0331743A4; EP0331743A1

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］本発明は、脳・神経系の細胞増殖、分化あるいは他の
臓器・組織の成長・発育等に必須であり、その促進ない
し調節に重要な役割を果たし、脳・神経系の異常に基く
疾患、各臓器・組織の成長・発育の不全あるいは異常増
殖および癌等の治療剤および予防剤、あるいはこれらの
診断用剤などへ適用し得るマウス胎児脳等より単離され
た分子量約68,000、等電点5.4〜5.6であるタンパク質
（以後GP68タンパク質と略称する）に関する。

また、本発明は該GP68タンパク質の分離精製方法、該
GP68タンパク質に対するポリクローナル抗体およびモノ
クローナル抗体、該モノクローナル抗体生産能を有する
ハイブリドーマならびにこれら抗体の製造方法に関す
る。

更に、該GP68タンパク質またはこれら抗体を含有する
癌診断用剤として有用な組成物に関する。

［従来の技術］脳・神経系の組織・細胞中に存在するタンパク質等に
関する研究は、他の臓器や器官に存在するタンパク質等
の研究に比して遅れているものの、近年多くの知見が集
積されつつある。

例えば、脳・神経系の組織・細胞中に存在するタンパ
ク質等として、チューブリン、微小管結合タンパク質
（microtubule-associated proteins,MAPs）、ニューロ
フィラメントトリプレット、グリア繊維酸性タンパク質
（glial fibrillary acidic protein,GFAタンパク質）
［日本生化学会編、続生化学実験講座６、細胞骨格の構
造と機能、上、第１章、第２章および、下、第９章参
照］などが知られている。

脳・神経系の細胞中に含まれる各種物質、特に脳・神
経系の細胞の分化において機能するタンパク質などの検
索と、その機能の分析は、例えば各種脳・神経系疾患の
新しい治療薬および予防薬、あるいはそれらの診断方法
の開発に有用なタンパク質等を見い出す上で、極めて有
効な手段である。

それ故、脳・神経系の細胞中に含まれる各種物質の検
索およびその機能の分析に対する要請が高まっている。

このような観点から種々の検討がなされているなか
で、脳・神経系の細胞由来のタンパク質として、マウス
胎児脳に時期特異的に出現するタンパク質の存在が本発
明者らによって既に明らかにされている［特開昭60-100
597号公報、Noguchi,S.,et al;J.Biochem.,96,881（198
4）］。

また、ヒト脳・神経系腫瘍細胞に特異的に出現するタ
ンパク質の存在が特開昭61-233623号公報に本発明者ら
によって開示されている。

一方、マウス、ラットの脳・神経系細胞腫などに検出
されるが、正常マウス脳および正常ラット脳には検出さ
れないか、もしくはわずかしか検出されないタンパク質
の存在が本発明者らによって開示されている［特開昭61
-275221号公報、およびNoguchi,S.,et al;Cell Structu
re and Function,12,127（1987）］。

［発明が解決しようとする課題］本発明者らは、上述のように脳・神経系の組織・細胞
に含まれるタンパク質の重要性に鑑み種々のタンパク質
等の物質の検索を行なってきたが、その過程で、マウス
胚（胎児）の脳に存在するタンパク質のなかで、最もそ
の存在比率が高く、脳・神経系の異常に基く疾患、各臓
器・組織の成長・発育の不全あるいは異常増殖および癌
等の治療剤、予防剤などへの適用が大いに期待される二
次元電気泳動法で分子量約68,000を示し、等電点が5.4
〜5.6であるタンパク質（GP68タンパク質）に着目し
た。

ところが、該GP68タンパク質の存在量は極めて微量で
あり、また従来の方法では夾雑する各種タンパク質の混
入が避けられない場合が多く、高い精製度で量的に十分
なGP68タンパク質を得ることが必要となっていた。

そこで、本発明者らは、より効率良いGP68タンパク質
の分離精製方法について鋭意検討した結果、レクチンを
担体に結合したアフィニティークロマトグラフィーを行
なう工程をGP68タンパク質の単離精製工程に新たに導入
することにより、夾雑タンパク質の混入を効果的に排除
し、より純度の高い形で、十分な量のGP68タンパク質を
効率良く単離精製できることを見い出した。更に、この
新たな知見に基いた精製方法によって十分な量のGP68タ
ンパク質が得られるようになり、その結果GP68タンパク
質に対する抗体の生産に成功し、またそれを用いた確実
なGP68タンパク質の分離精製方法を確立するに至り、本
発明を完成した。

本発明の目的は、GP68タンパク質の性質および機能を
分析し、その医薬、動物薬、あるいは診断薬としての有
用性を明確とするのに必要な技術である、量的に十分な
より精製度の高いGP68タンパク質を分離精製できる方法
を提供することにある。

本発明の他の目的は、例えば、脳・神経系の疾患のみ
ならず各臓器・組織の成長・発育の不全あるいは異常増
殖および癌等を有する患者のマーカーとしてのGP68タン
パク質を、該タンパク質に対するポリクローナル抗体あ
るいはモノクローナル抗体で検出する各種免疫測定法の
開発に必要な技術、およびこれら抗体自身ならびにその
製造方法、あるいは該抗体を含有する癌診断用組成物を
提供することにある。

［課題を解決するための手段］本発明のGP68タンパク質の第１の分離精製方法は、GP
68タンパク質の単離段階に、レクチンを親和試薬として
担体に結合（固定化）して用いたアフィニティークロマ
トグラフィーによる工程が導入されていることに特徴を
有する。

すなわち、GP68タンパク質および例えば種々の夾雑タ
ンパク質を含む混合物を、レクチンを担持（固定化）し
た担体に接触させて該担体にGP68タンパク質を吸着さ
せ、更に該担体からGP68タンパク質を選択的に単離す
る。

この工程に用いることのできる担体としては、例えば
アガロース、アクリルアミドゲル、各種トヨパール（東
洋曹達工業社製）、セルロースなどを挙げることができ
る。

また、担体に固定化させるレクチンとしては、ヒマ凝
集素（Ricinus Communis Agglutinin、以下RCAと略記す
る）、小麦胚アグルチニン（Wheat Germ Agglutinin,WG
A）、コンカナバリンＡなどを用いることができるが、
これらの中では、RCAが特に好適である。

レクチンを担体に担持（固定化）させる方法として
は、用いる担体およびレクチンの種類に応じて常法に従
って行なえば良い。

これらを用いてのアフィニティークロマトグラフィー
は、レクチンを担持した担体を適当な大きさ及び形状の
カラムに通して利用するカラム法や、レクチンを担持し
た担体と処理すべき溶液あるいは溶出用溶液とを一度に
混合して処理するバッチ方式を用いた方法など所望に応
じて適宜選択した方法によって実施すれば良い。

このようなレクチンを用いたアフィニティークロマト
グラフィーにより、マウス胎児脳などの各種組織・細胞
の抽出液のみならず、各種精製段階で得られるGP68タン
パク質を含む溶液を処理して、GP68タンパク質を分離精
製することが可能である。

マウス組織・細胞からGP68タンパク質を分離する場合
には、例えば、２％トリトン（Triton）Ｘ−100（ロー
ムアンドハース社製）、0.005％フェニルメチル
スルフォニルフルオライド（PMSF）、0.15M食塩を含む1
0mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.5）中にマウス組織・細胞
をホモジナイズして所定時間の抽出操作を行ない、得ら
れた粗抽出液から遠心分離（例えば、40,000rpm）で得
られる上清液を用いることができる。

なお、この時用いるマウス組織・細胞としては、受精
から生後１週間までの、例えば、受精後11日目胚〜19日
目胚の胎児や、生後１週間のマウスの脳、神経組織、胃
腸管、平滑筋組織、肝臓、心臓、腎臓、肺、脾臓等の各
臓器などを挙げることができるが、高濃度での抽出分離
を行いたい場合には胎児脳あるいは生後１週間位までの
マウス脳を用いるのが便利である。

レクチンを担持する担体に吸着させたGP68タンパク質
は、溶出用の溶液としてGP68タンパク質を選択的に溶出
できる組成の溶液を選択して用いることにより、GP68タ
ンパク質を溶出させて、これと他のタンパク質とを分離
することができる。

この溶出用の溶液は、レクチンおよび担体の種類など
に応じて適宜選択すれば良いが、例えば、0.01M〜0.2M
のラクトース溶液、Ｎ−アセチルグルコサミン溶液、α
−メチルマンノシド溶液、シアル酸溶液などを利用する
ことができる。

溶出画分中でのGP68タンパク質の確認は、その分子量
および等電点の測定などによって行なうことができる。

本発明のGP68タンパク質は、後述の実施例１に記載の
２次元電気泳動での測定で約68,000（68,000±2,000）
の分子量を有し、その等電点が5.4〜5.6である。

以上のような操作によって分画したGP68タンパク質を
含む画分を、更に例えばゲルロ過法などの必要に応じた
その他の各種精製方法に用いられてる各種工程で処理し
て、より高純度のGP68タンパク質を効率良く得ることが
可能である。

このゲル過法には、通常のタンパク質精製技術で用い
られている方法が適用できる。

このようにして得られた純度の高いGP68タンパク質は、
後述の実施例１に示されるアミノ酸組成及び糖組成を有
し、そのアミノ末端部分のオリゴペプチドのアミノ酸配
列は、マウスのα−フェトプロテインのアミノ末端のア
ミノ酸配列［Michael B.Gorin et al.,J.Biol.Chem.,25
6,1954（1981）］とほぼ同一であった。また、糖の含有
率は12.7重量％であった。

該GP68タンパク質は、脳・神経系はじめ各臓器の成長
・発育の不全を予防あるいは治療するための医薬として
有用な医薬組成物の有効成分として有用である。

次に、上記GP68タンパク質を用いて動物を免疫し、該
GP68タンパク質に対する抗体を調製することができる。

すなわち、GP68タンパク質を例えばラット、ウサギ、
ヤギ、ウマ、ウシなどの動物に免疫し、得られた抗血清
中にGP68タンパク質に対するポリクローナル抗体を得る
ことができる。

この免疫処理には、通常の方法が利用でき、例えば各
種動物の背中、足蹠、腹腔内、血管内などに適当なアジ
ュバントとともにGP68タンパク質を接種する。免疫後、
７〜200日経過した動物から抗血清を採取して目的とす
るポリクローナル抗体を得ることができる。

なお、初回免疫後、適当な間隔をおいて追加免疫して
抗体価を高めることができる。

一方、上記のようにして免疫した動物や、Balb/cなど
のようなマウスの脾細胞と骨髄腫細胞（ミエローマ細
胞）株との融合によって、GP68タンパク質に対するモノ
クローナル抗体生産能を有するハイブリドーマを作製す
ることができる。

この融合に用いるミエローマ細胞株としては、マウス
NS−１株、X 63-Ag8株、MPC-11株、SP−2/0株などのマ
ウス系のミエローマ細胞株やラット210.RCY.Ag1.2.3な
どを挙げることができる。

また、GP68タンパク質で免疫した動物としては、初回
免疫後10〜80日経過したものが好適である。

更に、融合は公知の方法で行なえば良く、得られたハ
イブリドーマは、例えば５〜20％の牛胎児血清とHATを
含むRPMI培養液（日水製薬社製、Code 05911）、続いて
HTを含むRPMI培養液、最終的にRPMI培養液などの細胞培
養用培地て培養して、培地中に所望とするGP68タンパク
質に対するモノクローナル抗体を分泌、備蓄させて該モ
ノクローナル抗体を生産することができる。

あるいは、該ハイブリドーマをヌードラット、または
免疫抑制されたラットの腹腔内に移植してその腹水癌化
を誘発し、該腹水中に該モノクローナル抗体を生産、備
蓄させる方法によって該モノクローナル抗体を生産する
ことができる。

こうして得られたポリクローナル抗体およびモノクロ
ーナル抗体は、先の述べたように、各種免疫測定法によ
って脳・神経系の疾患のみならず各臓器・組織の成長・
発育の不全あるいは異常増殖および癌等を有する患者の
疾患マーカーとしてのGP68タンパク質を検出する際の試
薬の成分として、またこれらの抗体を含む治療剤および
予防剤の開発に有用である。一例として、GP68タンパク
質に対するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗
体を用いて各種癌患者の癌組織を蛍光抗体法により染色
してみると、癌組織のみにおいて特異的に本発明のこれ
ら抗体によって組織・細胞が染色されることが明らかと
なり、癌の診断薬として抗GP68タンパク質抗体が有用で
あることが明かとされた。

また、GP68タンパク質に対する抗GP68タンパク質ポリ
クローナルウサギ（ラット）抗血清及び抗マウスα−フ
ェトプロテインポリクローナルウサギ抗血清とのオクタ
ルロニー（Ouchterlony）法によるゲル内沈降反応を行
なったところ、両抗血清はGP68タンパク質に対して同様
の沈降反応を示し、マウスGP68タンパク質とマウスα−
フェトプロテインとはここでもかなり近似したタンパク
質であることが解った。

他方、同時に行なったオクタルロニー法によるゲル内
沈降反応で、GP68タンパク質に対するウサギ抗血清とは
異なり、ヒト胎盤α−フェトプロテインに対するウサギ
抗血清（ヘキスト社製）はGP68タンパク質と沈降反応を
示さなかった。これに対応する事実として、ヒト癌患者
組織抗原をベクタステインABC法あるいは蛍光抗体法に
より染色してみると、両血清の反応性には明瞭な差異が
あることが示された（表1A及び表1B）。そして、抗GP68
タンパク質抗血清は、抗ヒトα−フェトプロテイン抗血
清よりもスペクトラムが広く、かつ強度が高いことが明
らかとなった。

また、こうして得た抗体を用いて作製したアフィニテ
ィークロマト担体を用いて本発明における第２のアフィ
ニティークロマトグラフィーを行なうことにより、GP68
タンパク質の分離精製を行なうことができる。

その際用いる担体としては、アガロース、セファデッ
クス類、BrCN活性化セファロース4Bのようなセファロー
ス類、Afigel 10（Bio-Rad社製）、各種トヨパールなど
を利用することができ、担体への結合方法は、適当な緩
衝液などに抗体を溶解し、４℃で数時間から一昼夜担体
とまぜあわせて行なえば良い。

このGP68タンパク質に対する抗体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーを行なう場合、吸着したGP68タ
ンパク質を溶出させる溶液としては、酸性緩衝液、アル
カリ性緩衝液あるいは高濃度の塩を含む中性緩衝液など
が利用できる。

本発明のGP68タンパク質または抗GP68タンパク質抗体
を有効成分とする医薬組成物は、必要に応じた各種添加
剤と混合することによって調製することができる。該添
加剤としては、例えばアルブミン、ゼラチン、デキスト
ラン、Tween 80などのポリソルベート系等の非イオン界
面活性剤、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、脂肪酸ア
ルコールエステル、ポリグリコールエーテル、リン酸緩
衝生理食塩水、各種アミノ酸、デキストロース、マンニ
トール、グルコース、キシリトール、乳糖、ショ糖、ガ
ラクトース、フラクトース、マルトース、サッカロー
ス、ソルビトールなどの糖類等を挙げることができ、こ
れらの１種または２以上を組み合せて用いることができ
る。

本発明のGP68タンパク質を適用し得る医薬組成物は、
たとえば錠剤、カプセル剤、散剤、顆粒、トローチ、カ
シエー、エリキシル、乳濁液、溶液、シロップ、懸濁
液、エアロゾル、軟膏、無菌注射器、成型パップ、テー
プ、軟質及び硬質ゼラチンカプセル、坐薬及び無菌包装
粉末などの形態として利用できる。

更に、本発明のGP68タンパク質を適用し得る医薬用組
成物は、製薬的に許容される担体等の添加剤として、上
記の例示物の他に、充填剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、
崩壊剤、乳濁および懸濁剤、保存剤、希釈剤、甘味剤あ
るいは芳香剤等として作用する各種物質を含有し得る。

これらの添加剤の例としては、とうもろこし澱粉、結
晶セルロース、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アル
ジネート、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリ
ビニルピロリドン、トラガカントゴム、ゼラチン、シロ
ップ、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロー
ス、メチルヒドロキシ安息香酸エステル、プロピルヒド
ロキシ安息香酸エステル、タルク、ステアリン酸マグネ
シウム、不活性なポリマー類、水及び鉱油等が挙げられ
る。

なお、本発明のGP68タンパク質を適用し得る医薬用組
成物は、投薬の後の活性成分の放出速度が所望に応じて
制御されるように処方しても良い。

本発明のGP68たんぱく質を適用し得る医薬用組成物を
経口投与する場合には、例えばGP68タンパク質または抗
GP68タンパク質抗体は、上記担体等と混合され、錠剤、
カプセル剤などの形とすることができる。

静脈内点滴もしくは注射、あるいは筋肉内注射等の非
経口投与の場合、例えばGP68タンパク質または抗GP68タ
ンパク質抗体の有効量を、ブドウ糖水溶液、等張食塩
水、無菌水あるいは類似の液体に溶解し、バイアルまた
はアンプルに密封することができる。

なお、バイアルまたはアンプル剤とした場合には、そ
の安定性を向上させるために、GP68タンパク質または抗
GP68タンパク質抗体の凍結乾燥品をバイアルやアンプル
内で調製しても良い。

本発明のGP68タンパク質を適用し得る医薬用組成物中で
のGP68タンパク質または抗GP68タンパク質抗体の含有量
は、必要に応じて適宜選択すれば良いが、例えば単位投
薬量形状あたり、0.1μｇ〜50mg程度とすることができ
る。

［実施例］以下、実施例、実験例をもって本発明を更に詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 100個のICRマウス胎児脳（受精後13日胚脳）を、100m
lの２％トリトンＸ−100、0.005％PMSF、0.15M食塩を含
む10mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.6）中でホモジェナイ
ズして、４℃、30分の抽出を行ない、得られた粗抽出液
を120,000×ｇ、１時間の条件の高速遠心にかけた後、
更に得られた上清液を以下のようにして調製したRCAア
ガロースアフィニティークロマトグラフィーカラム
（4ml）に通した後、上記緩衝液40mlでこのカラムを洗
浄した。

カラムへの充填； RCAアガロース（EY Laboratories社製）の4mlを円筒
状カラムに充填し、これを１％トリトンＸ−100、0.005
％ PMSFを含む10mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.5）で処理
し平衡化した。

次に該カラムに１％トリトンＸ−100、0.005％PMSFを
含む10mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.5）に更に0.1Mラク
トースを加えた20mlの溶液を通し、溶出液を得た。

この溶出液の一部を充分透析して精製タンパク質溶液
を得た後、これを凍結乾燥してタンパク質標品を得た。

なお、タンパク質標品の収量は、100個のマウス胚の
脳あたり2.0mgタンパク質であった。

また、タンパク質量は、ローリー（Lowry）法によ
り、牛血清アルブミン（シグマ社製）を標準として求め
た。なお、以下の各種操作でのタンパク質量の測定も同
様の方法により行なった。

一方、これとは別に、先の溶出液の残りにエタノール
を最終濃度が80〜90％となるように加えてエタノール沈
殿タンパク質を得て、これをタンパク質標品とした。

得られたタンパク質標品の一部を以下の条件の二次元
電気泳動にかけて、その分子量および等電点を測定した
ところ、この標品から分子量約68,000、等電点5.4〜5.6
のタンパク質のみが検出された。

なお、分子量測定での対照のタンパク質としては、い
ずれもシグマ社製のチログリブリン（分子量330,00
0）、ラクトフェリン（分子量88,000）、ウシ血清アル
ブミン（分子量67,000）、卵白アルブミン（分子量43,0
00）、アルドラーゼ（分子量34,000）を使用した。

二次元電気泳動の条件；ａ）一次元目泳動用媒体として、尿素2.76g、30％アクリルアミド
0.67ml、10％ NP-40の1ml、アンホライン（pH3.5-10）
の0.25ml、10％過硫酸アンモニア10μｌ、５％テトラメ
チルエチレンジアミン［tetramethylethylenediamine
（TEMED）、半井化学社製］0.14ml、水0.91mlの組成の
ものを使用し、サンプルをこの一次元ゲルにかけ、陽極
液として10mM H₃PO₄、陰極液として20mM NaOHをそれぞ
れ用い、400Vで13時間、次で800Vで１時間電気泳動を行
なった。

ｂ）二次元目一次元泳動後、ゲルをソジウムドデシルサルフェート
（SDS）試料緩衝液［10％グリセリン、５％ β−メル
カプトエタノール、23％SDS、62.5mMトリス・塩酸緩衝
液（pH6.8）］と平衡化し、7.5％のアクリルアミドスラ
ブゲル（25mMトリス、192mMグリシン、0.1％SDS）にか
け、120Vで４時間の二次元目の泳動を行なった。

泳動後、0.05％クマシブルー、10％メチルアルコー
ル、10％酢酸で１時間ゲルを染色した後、更に10％メチ
ルアルコール、10％酢酸で処理し、得られた各スポット
を測定した。

次に、先に得たGP68タンパク質の凍結乾燥標品（1mg
タンパク質）における糖含有率を、バアティら（Bhatti
et al）の方法に従って、メタノリシス反応を行なった
後にガス液体クロマトグラフィーにより求めた。

一方、該凍結乾燥標品中のシアル酸の含有率を、0.05
M H₂SO₄を用いた80℃、30分の加水分解反応を行なった
後に、Ｎ−acetylneuraminic acidを標準として用いたT
hiobarbituric acid反応により求めた。

更に、該GP68タンパク質の凍結乾燥標品（タンパク質
量としてそれぞれ1mgあるいは98μｇ）を4M HClでの100
℃、４時間の処理あるいは6M HClでの105℃、24時間の
処理によって加水分解し、得られた加水分解物中のヘキ
ソサアミンあるいはアミノ酸を、日立アミノ酸分析器83
5型により分析した。

以上の分析操作の結果を以下に示す。

糖組成（モル比）；ガラクトース１マンノース 1.42 フルクトース 0.32 グルコース 0.07 グルコサミン 1.06 ガラクトサミン 0.10 シアル酸 0.18 アミノ酸組成（モル比）；アスパラギン酸 43.2 スレオニン 26.1 セリン 35.8 グルタミン酸 58.4 グリシン 30.2 アラニン 30.6 システイン 6.9 バリン 23.3 メチオニン 5.2 イソロイシン 9.5 ロイシン 48.4 チロシン 8.6 フェニルアラニン 17.4 リジン 26.3 アンモニア 90.1 ヒスチジン 10.6 アルギニン 18.2 プロリン 26.5 更に、上記GP68タンパク質の凍結乾燥標品（105μ
ｇ）を25μｌの水に溶解させ、その17μｌ（71.4μｇ）
をペプチドシークエンサー（Applied Science社Model 4
77A）に適用して、そのアミノ末端のアミノ酸配列を分
析したところ、以下の結果が得られた。

GP68タンパク質のアミノ末端のアミノ酸配列； Leu-His-Glu-Asn-Glu-Phe-Gly-Ile-Ala-Ser-Thr-Leu-As
p-Ser−Ｘ−Gln−Ｙ−Lys-Thr-Glu-Lys−（Ｘ、Ｙは未
確定）なお、参考のためにマウスα−フェットプロテインの
アミノ末端のアミノ酸配列［Michael B.Gorin et al.,
J.Biol.Chem.,256,1954〜（1981）］は以下のとおりで
ある。

マウスα−フェトプロテインのアミノ末端のアミノ酸
配列； Leu-His-Glu-Asn-Glu-Phe-Gly-Ile-Ala-Ser-Thr-Leu-As
p-Ser-Ser-Gln−Cys-Val-Thr-Glu-Lys− 更に、GP68タンパク質（上記凍結乾燥標品）に対する
抗マウスGP68タンパク質ポリクローナルウサギ抗血清
（実施例２で調製）及び抗マウスα−フェトプロテイン
ポリクローナルウサギ抗血清（ヘキスト社製）のオクタ
ルロニー（Ouchterlony）法によるゲル内沈降反応を行
なったところ、両抗血清はGP68タンパク質に対して同様
の沈降反応を示した。

実施例２実施例１で得たGP68タンパク質の凍結乾燥標品とエタ
ノール沈殿標品の1:1での混合物100μｇを、２週間おき
にフロイントの完全アジュバント（半井化学社製）とと
もに計４回ウサギ（ニュージーランドホワイト種）の足
蹠に接種してこれを免疫した。

最終免疫後10日目に全採血し、血清を調製した。得ら
れた血清は、BSAを結合したAfigel 10（Bio Rad Labora
tories社製）カラムに通し、流出液を更に、1mg/ml濃度
のGP68タンパク質を含む重炭酸ナトリウム緩衝液（pH8.
0）と接触させたAfigel 10を充填したカラムに通し、抗
体を吸着させた。次に、3Mのチオシアン酸カリウム溶液
で吸着抗体を溶出させ、流出液を集めた。この操作を必
要な回数繰り返し抗体溶液を備蓄した。

この抗体を含む流出液を充分透析し、20μg/mlのタン
パク質濃度とし、イムノブロッティング法により分析し
たところ、GP68タンパク質に対するポリクローナル抗体
が含まれていることが確認された。

実施例３実施例１で得たGP68タンパク質の凍結乾燥標品とエタ
ノール沈殿標品の1:1での混合物500μｇを、２週間おき
にフロイントの完全アジュバントとともに計４回ヤギの
各所皮内、皮下に投与して、これを免疫し、経時的に採
血した。

十分抗体価が上った５箇月後に全採血した。得られた
血清を実施例２と同様にカラム処理して、GP68タンパク
質に対するポリクローナル抗体を集積し、その一部を分
析したところ、GP68タンパク質に対する特異的抗体であ
ることが確認された。

実施例４免疫する動物としてウマを用いる以外は実施例３と同
様にしてポリクローナル抗体を集積した。

実施例５免疫する動物としてウマを用いる以外は実施例３と同
様にしてポリクローナル抗体を集積した。

実施例６実施例１で得たGP68タンパク質の凍結乾燥標品とエタ
ノール沈殿標品の1:1での混合物を以下に示す量で、２
週間間隔でウイスターラット（５〜６週令）に投与し、
これを免疫した。

１回目（皮下） 50μｇ２回目（皮下） 50μｇ３回目（腹腔内） 100μｇ４回目（腹腔内） 100μｇ最終免疫から３日目の脾細胞１×10⁸個と、ミエロー
マ細胞としてのマウスNS−１細胞株の２×10⁷個とをポ
リエチレングリコール400の存在下でKoehlerらの方法に
従って融合させた。

ポリエチレングリコールを除き、得られたハイブリド
ーマを200mlのHAT培地（HAT及び10％fetal calf serum
（FCS）を含むRPMI 1640 medium）に浮遊させ、これを9
6ウエルプレート（Falcon社製）に各ウエル当りの細胞
数が１×10⁵個となるように移した。

次に37℃で１週間〜10日培養を続けた。

培養10日目より３日ごとに各ウエル培養上清の半分を
用いて（その分新しい培養液を加えて培養を続ける）、
ベクタスティンABC法（Vectastain ABC method、アビジ
ン−ビオチン化ワサビペルオキシダーゼコンプレックス
法、フナコシ社販売）によるELISA（enzyme linked imm
uno sorbent assey）を行ない、陽性クローンを含むウ
エルを検索し、更に陽性のものを含むウエルから限界希
釈法によるクローニングを行なって所望とするクローン
を得た。

なお、ELISA法に用いたアッセイプレート2095（Falco
n社製）には、常法に従い実施例１で得たエタノール沈
殿GP68タンパク質を溶解したリン酸緩衝生理食塩水（以
下PBS）と１〜数時間接触させることによって、各ウエ
ルにGP68タンパク質を100ng吸着させて使用した。

以下の操作で、計８個の陽性クローンが得られた。

これらのクローンのうちの２種（EBR 3、EBR 7）をそ
れぞれ個々に用いて以下のようにしてEBR 3−１モノク
ローナル抗体、EBR 7−１モノクローナル抗体を得た。

なお、これらクローンEBR 3及びEBR 7は、昭和63年
（1988年）８月18日付けで、通商産業省工業技術院微生
物工業技術研究所（日本国茨城県つくば市東１丁目１番
３号、郵便番号305）にブタペスト条約に基いて寄託さ
れた。

これらクローンの原寄託日は、昭和63年（1988年）８
月18日であり、クローンEBR 3の受託番号はFERM BP-200
2、クローンEBR 7の受託番号はFERM BP-2003である。

実施例７実施例６で得たハイブリドーマ（クローンEBR 3、EBR
7）を用いたGP68タンパク質に対するモノクローナル抗
体の生産を実施した。

まず、クローンEBR 3、EBR 7を別々にRPMI1640培地
で、10cmシャーレ中で培養した。

得られた２種の培養上清から50％硫安で沈殿した沈殿
物を１〜2mlのPBSに溶解し、３日間PBSで透析した。次
いで、透析処理後の溶液をセファデックスＧ−250カラ
ムに通し、精製EBR3−１モノクローナル抗体および精製
EBR 7−１モノクローナル抗体を得た。

更に、プリスタン処理［2,6,10,14−テトラメチルペ
ンタデカン0.5ml/匹を腹腔内に投与し、１〜２週飼育す
る］した８週令ヌードラットに実施例６で得られたクロ
ーンEBR 3、EBR 7を個々に１×10⁷／匹となるように腹
腔内に投与した。10〜21日目に腹水のたまったラットか
ら腹水（50ml/匹）を採取し、これから遠心分離により
固形分を除去した。

得られた上清を50％硫安塩析、40％硫安塩析し、更に
PBS（pH7.2）で３日間透析した。

得られた粗精製モノクローナル抗体は、セファデック
スＧ−200カラムにかけて、PBSで溶出させ、精製モノク
ローナル抗体（EBR 3−２モノクローナル抗体およびEBR
7−２モノクローナル抗体）をそれぞれ個々に含む２種
の溶液を回収した。

実施例８ハイブリドーマの形成に、ウイスターラットの代りに
Balb/cマウスを用いる以外は、実施例６及び実施例７と
同様の操作を繰り返して、精製モノクローナル抗体（EB
R 3−３モノクローナル抗体およびEBR 7−３モノクロー
ナル抗体）を得ることができた。

実施例９常法に従って、Afigel 10と実施例２で得られたポリ
クローナル抗体の緩衝液溶液とを４℃で１昼夜接触させ
る方法を用いて、ポリクローナル抗体を固定化したカラ
ムを作製した。

このカラムで、実施例１で得たマウス胎児脳抽出液を
処理したところ、GP68タンパク質を効率良く単離、精製
することができた。

実施例10 実施例７で得た精製モノクローナル抗体（EBR 3−１
モノクローナル抗体およびEBR 7−１モノクローナル抗
体）をそれぞれ用いる以外は実施例９と同様にしてマウ
ス胎児脳抽出液を処理したところ、GP68タンパク質を効
率良く単離、精製することができた。

参考例１実施例１で得た精製タンパク質溶液（RCAアガロース
カラムからの溶出液を透析処理して得たもの）を、１バ
イアル中GP68タンパク質の100μｇが含まれるように充
填し、凍結乾燥させた後、これにTween 80を0.001〜0.1
％となるように加えた生理食塩水溶液1.0mlを加えて栓
をして、GP68タンパク質を有する医薬組成物を得た参考例２ Tween 80の代りに、アルブミンを0.001〜10％となるよ
うに加えた生理食塩水溶液を用いる以外は参考例１と同
様にしてGP68タンパク質を有する医薬組成物を得た。

参考例３ Tween 80の代りに、マンニトールを0.01〜５％となるよ
うに加えた生理食塩水溶液を用いる以外は参考例１と同
様にしてGP68タンパク質を有する医薬組成物を得た。

参考例４ Tween 80の代りに、グルコースを0.01〜５％となるよう
に加えた生理食塩水溶液を用いる以外は参考例１と同様
にしてGP68タンパク質を有する医薬組成物を得た。

参考例５〜８１バイアル中GP68タンパク質の量を1mgとなるように
凍結乾燥を行なう以外は、参考例１〜４と同様にしてGP
68タンパク質を有する医薬組成物をそれぞれ得た。

参考例９実施例７で得た２種の精製モノクローナル抗体を含む
溶液をそれぞれ個々に用い、１バイアル中抗GP68タンパ
ク質モノクローナル抗体の100μｇが含まれるように充
填し、凍結乾燥させた後、これにTween 80を0.001〜0.1
％となるように加えた生理食塩水溶液1.0mlを加えて栓
をして、抗GP68タンパク質モノクローナル抗体を有する
医薬組成物を得た。

参考例10 Tween 80の代りに、アルブミンを0.001〜10％となるよ
うに加えた生理食塩水溶液を用いる以外は参考例９と同
様にして抗GP68タンパク質モノクローナル抗体を有する
医薬組成物を得た。

参考例11 Tween 80の代りに、マンニトールを0.01〜５％となるよ
うに加えた生理食塩水溶液を用いる以外は参考例９と同
様にして抗GP68タンパク質モノクローナル抗体を有する
医薬組成物を得た。

参考例12 Tween 80の代りに、グルコースを0.01〜５％となるよう
に加えた生理食塩水溶液を用いる以外は参考例９と同様
にして抗GP68タンパク質モノクローナル抗体を有する医
薬組成物を得た。

実験例１実施例２で得たポリクローナル抗体を用いたマウス胚
および生後１〜30日のマウスの各臓器のトリトンＸ−10
0により抽出物のウエスタンブロット法による分析を以
下のようにして実施した。

まず、マウス（13日胚）およびマウスの各臓器（脳、
神経節、心臓、肺、肝臓、胃腸管、脾臓等）を用い以下
のようにして処理し抽出物を得た。

試料を２％トリトンＸ−100、50μg/mlのPMSFを含む
0.01 Mトリス・塩酸緩衝液中でホモジェナイズし、氷上
で30分間抽出を行なった。得られた抽出液を40,000rp
m、一時間の遠心分離処理し、得られた上清液をエタノ
ール沈殿処理した。ここで得られた沈殿に含まれるタン
パク質量をローリー法により定量しておいた。

次に、レムリ（Laemmli）の方法（Nature,227,680〜6
85,1970］に従って、SDS可溶化溶液［9.5M尿素２％NP-4
0（半井社製）、２％アンホライン（ファルマシア社
製）、５％メルカプトエタノール、0.25％SDS］に沈殿
物が4mg/ml（最終濃度）となるように溶解し、これをSD
S−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ゲル濃度10％、1
0〜15μl/レーン、すなわち40〜60μｇタンパク質／レ
ーン）にかけた。

泳動が終了した後、トウビンらの方法［Towbin et a
l,Proc.Nat.Acad.Sci.,76,4350〜4354,1979］に従っ
て、上記の分画された各タンパク質の位置を保ちなが
ら、これらをニトロセルーロース膜（Schleicher＆Schu
ell社製またはBio-Rad社製）にブロッティングした（１
アンペアで２時間）。

ブロッティング終了後、ニトロセルーロース膜を３％
ウシ血清アルブミン（BSA）を含むPBSと室温で１時間接
触させた。

その後、ニトロセルーロース膜を１％トリトンＸ−10
0を含むPBSで洗浄後、これを実施例２で得た抗GP68タン
パク質に対する抗体（100〜500倍に希釈したラットある
いはウサギ血清）で２〜３時間室温で処理した。

更に、１％トリトンＸ−100を含むPBSでの１時間の洗
浄を数回行なった後、HRP（horse radish peroxidase、
Cappel社製）結合抗ラットIgGあるいは抗ウサギIgGマウ
スIgG抗体（100倍希釈）を含む溶液で１時間処理した。

次に、１％トリトンＸ−100を含むPBSでの１時間の洗
浄を５〜６回行なった後、0.05％の４−chloro−１−na
phtolの40mMトリス・塩酸溶液（pH7.6）で膜を処理し、
灰褐色に染色されたバンドの出現を目視で観察した。

その結果マウス胚の各組織の抽出物では、どの抽出物
からも染色されたスポットが検出された。

例えば、13、15及び17日胚の頭部、腹部及び尾部の抽
出物のいずれにおいても染色されたスポットが検出され
た。

一方、生後１〜７日のマウスの各組織・細胞からの抽
出物においても染色されたスポットが検出された。

例えば、誕生直後のマウスの頭部、腹部及び尾部の抽
出物のいずれにおいても染色されたスポットが検出さ
れ、更に生後７日目のマウスの脳、肝臓、腎臓、肺、心
臓、皮膚、脾臓、筋肉からの抽出物のいずれにおいても
染色されたスポットが検出された。このうち、肝臓、心
臓の染色の程度は強く、脳はびまん性の弱い染色を示し
た。

これに対して、生後１週間を越えたマウスの各組織・
細胞からの抽出物では染色されたスポットは全く検出さ
れなかった。

例えば、生後14日、21日のマウスの脳、肝臓、腎臓、
肺、心臓、皮膚、脾臓、筋肉からの抽出物、及びマウス
成体の脳、肝臓、腎臓、肺、心臓、皮膚、脾臓、筋肉、
子宮、脊髄からの抽出物のいずれにおいても染色された
スポットは検出されなかった。

従って、GP68タンパク質は、増殖あるいは分化の極め
て盛んな胎児および生後間もない時期に特異的に出現す
る生物活性を有するタンパク質であると考えられる。

実験例２マウス15日胚をドライアイスアセトン中で急冷して、
クリオスタットで切片を切り出し、これらに実施例７で
得たEBR 3−１モノクローナル抗体およびEBR 7−１モノ
クローナル抗体を含む溶液のそれぞれの10倍希釈液を個
々に加え、更にこれらにHRP結合抗ラットIgGマウスIgG
抗体を１〜２週間反応させ、洗浄後染色する臓器を光学
顕微鏡で観察した。また、実施例６に示したABCを用い
て更に観察した。

その結果、EBR 3−１モノクローナル抗体では神経お
よび平滑筋が染り、またEBR 7−１モノクローナル抗体
では脳、神経節、肝臓が染ったことが観察された。

実験例３経日的にマウス胚の脳細胞を取り出し、組織培養を行
なった。これに実施例７で得られたEBR 3−１モノクロ
ーナル抗体およびEBR 7−１モノクローナル抗体を加
え、脳細胞の活動を観察した。

実験例４実施例２で得た抗マウスGP68タンパク質ウサギ抗血清
及び抗ヒトα−フェトプロテインウサギ抗血清をそれぞ
れ用いて、ABC法により各種癌患者の癌組織の染色を行
なった。

得られた結果を表1A及び表1Bに示す。なお、評価結果
における、「−」は染色せず、「＋−」は弱いかつびま
ん性の染色、「＋」は中程度の染色、「＋＋」は顕著だ
が「＋＋＋」よりは弱い染色、「＋＋＋」は顕著な染色
を示す。

一方、同様に行なったマウス線維芽細胞、健常人の各
細胞、及び癌患者の癌組織以外の正常組織細胞では何ら
染色されず、抗マウスGP68タンパク質ウサギ抗血清は、
癌組織抗原特異的に反応する抗体を有することが示され
た。

また表1Aおよび表1Bに示されるように、抗GP68タンパ
ク質ウサギ抗血清は、抗ヒトα−フェトプロテインウサ
ギ抗血清が染色しない癌患者組織を染色し、かつ染色強
度も後者に比べて、弱いものはなく、同等かそれ以上の
強度を示すことが歴然であり、癌診断薬の成分として有
用性の高いものであることがわかった。

［発明の効果］本発明により、脳・神経系の発生分化の過程で時期特
異的に消長し、その発生分化の過程で、重要な役割を果
す可能性のあるGP68タンパク質が単離された状態で提供
された。

また、本発明の精製分離方法により十分な量の純度の
高いGP68タンパク質を得ることが可能となった。

更に、本発明のGP68タンパク質に対する抗体を用いる
ことにより、該抗体を用いた各種研究の促進が容易とな
る。

本発明のGP68タンパク質は、受精から生後１週間まで
の特定な時期にしか存在せず、成体においてはその生産
が欠失していることから、該タンパク質を成体に投与し
て新たな機能の発現が期待できる。

また、本発明のGP68タンパク質は成体各器官、組織、
細胞、膜の発育促進、遺伝的、器質的な各臓器・組織の
成長・発育の不全の解消・回復、脳・神経系の再生・修
復などの効果が期待できる。

本発明によりGP68タンパク質に対するポリクローナル
抗体およびモノクローナル抗体が得られたことによっ
て、GP68タンパク質をコードするｍ−PNAおよびｃ−DNA
の調製が容易となり、遺伝子組み換え技術を用いた例え
ば大腸菌、枯草菌、酵母、各種動物細胞を宿主としたGP
68タンパク質の生産への道がひらかれた。

GP68タンパク質あるいはそれの活性中心ペプチドおよ
びそれらに特異的な抗体は、各種脳・神経系疾患の治療
剤、予防剤、また各種成長・発育促進剤、各種成長不全
治療剤あるいは異常増殖、腫瘍、癌などの医薬、動物
薬、または脳・神経系疾患、各臓器・組織の成長・発育
不全あるいは異常増殖および癌などの疾患のマーカー、
更には診断薬としての有用性が期待される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/53 9282−4Ｂ 15/00 Ｃ //(Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者村松寿子鹿児島県鹿児島市桜ヶ丘３丁目26番地９号 (72)発明者井上浩鹿児島県鹿児島市日之出町22―22 (72)発明者粟屋昭神奈川県横浜市戸塚区矢部町1541番地 (72)発明者福井英雄千葉県茂原市東部台３丁目９番９号 (72)発明者橋本 ▲吉▼秀千葉県茂原市東郷2141番地

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】受精から生後１週間までの生体に特異的に
見い出され、以下の特性：分子量約68,000 等電点 5.4〜5.6 糖組成（モル比）ガラクトース１マンノース 1.42 フルクトース 0.32 グルコース 0.07 グルコサミン 1.06 ガラクトサミン 0.10 シアル酸 0.18 アミノ酸組成（モル比）アスパラギン酸 43.2 スレオニン 26.1 セリン 35.8 グルタミン酸 58.4 グリシン 30.2 アラニン 30.6 システイン 6.9 バリン 23.3 メチオニン 5.2 イソロイシン 9.5 ロイシン 48.4 チロシン 8.6 フェニルアラニン 17.4 リジン 26.3 アンモニア 90.1 ヒスチジン 10.6 アルギニン 18.2 プロリン 26.5 アミノ末端のアミノ酸配列 Leu-His-Glu-Asn-Glu-Phe-Gly-Ile-Ala-Ser-Thr-Leu-As
p-Ser−Ｘ−Gln−Ｙ−Lys-Thr-Glu-Lys- （Ｘ及びＹは未確定）を有することを特徴とするタンパク質。
【請求項２】前記生体がマウスである請求項１記載のタ
ンパク質。
【請求項３】受精から生後１週間までのマウス組織ある
いは細胞の抽出液から、レクチンを親和試薬として用い
たアフィニティークロマトグラフィーにより単離された
ものである請求項１記載のタンパク質。
【請求項４】受精から生後１週間までの生体の組織ある
いは細胞の抽出液をレクチンを担持した担体と接触させ
る過程と、該担体に吸着した成分から請求項１記載のタ
ンパク質を選択的に溶出し単離する過程とを含むことを
特徴とする請求項１記載のタンパク質の製造方法。
【請求項５】前記抽出液が、受精から生後１週間までの
マウス組織または細胞の抽出液である請求項４記載の製
造方法。
【請求項６】請求項１記載のタンパク質を動物に免疫す
る過程を経て得られることを特徴とする該タンパク質に
対するポリクローナル抗体。
【請求項７】前記タンパク質がマウスから得られたもの
である請求項６記載のポリクローナル抗体。
【請求項８】請求項１記載のタンパク質で免疫した動物
の脾細胞と骨髄腫細胞株との融合により得られ、該タン
パク質に特異的であるモノクローナル抗体生産能を有す
ることを特徴とするハイブリドーマ。
【請求項９】前記タンパク質がマウスから得られたもの
である請求項８記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】請求項１記載のタンパク質に特異的であ
ることを特徴とするモノクローナル抗体。
【請求項１１】請求項１記載のタンパク質で免疫した動
物の脾細胞と骨髄腫細胞株との融合により得られたハイ
ブリドーマにより生産されたものである請求項10記載の
モノクローナル抗体。
【請求項１２】前記タンパク質がマウスから得られたも
のである請求項11記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】請求項１記載のタンパク質で免疫した動
物の脾細胞と骨髄腫細胞株とを融合させることによりハ
イブリドーマを得る過程（Ａ）と、得られたハイブリド
ーマから前記タンパク質に対するモノクローナル抗体の
生産能を有するハイブリドーマを選択し、該選択された
ハイブリドーマに前記モノクローナル抗体を生産させる
過程（Ｂ）とを有することを特徴とする請求項１記載の
タンパク質に対するモノクローナル抗体の製造方法。
【請求項１４】前記過程（Ｂ）が、前記モノクローナル
抗体生産能を有するハイブリドーマを組織培養液中で培
養し、該培養液内に前記モノクローナル抗体を生産、備
蓄させる過程からなり、その後、該培養液から前記モノ
クローナル抗体を分離する請求項13記載の製造方法。
【請求項１５】前記過程（Ｂ）が、前記モノクローナル
抗体生産能を有するハイブリドーマを、ヌードラットま
たは免疫制御されたラットの腹腔内に移植してその腹水
癌化を誘発し、該腹水中に該モノクローナル抗体を生
産、備蓄させる過程からなり、その後、該腹水から前記
モノクローナル抗体を分離する請求項13記載の製造方
法。
【請求項１６】前記タンパク質がマウスから得られたも
のである請求項13〜15のいずれかに記載の製造方法。
【請求項１７】請求項１記載のタンパク質に対する抗体
を担持した担体に、請求項１記載のタンパク質を含む混
合物を接触させる過程と、該担体に吸着した成分から該
タンパク質を選択的に溶出し、単離する過程とを含むこ
とを特徴とするタンパク質の分離方法。
【請求項１８】前記抗体が請求項６記載のポリクローナ
ル抗体である請求項17に記載の分離方法。
【請求項１９】前記抗体が請求項10記載のモノクローナ
ル抗体である請求項17に記載の分離方法。
【請求項２０】請求項６記載の抗体を含有することを特
徴とする癌診断用組成物。
【請求項２１】請求項10記載の抗体を含有することを特
徴とする癌診断用組成物。