EA012162B1 - Способ рефолдинга рекомбинантных антител - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение в общем относится к способам повышения продуцирования или выхода предпочтительных (пространственных) форм IgG-белков. Конкретнее, изобретение относится к взаимодействию препаратов таких рекомбинантных IgG-белков со связующим окислительно-восстановительным реагентом и необязательно хаотропным агентом.

Description

Изобретение относится к способам повышения выделения активных рекомбинантных белков. Кроме того, в изобретении используется обработка хаотропными агентами (такими, например, как денатурирующие реагенты, такие как додецилсульфат натрия, гуанидингидрохлорид или мочевина) для дополнительного процессинга белков. Способы получения соответствующим образом подвергшегося рефолдингу белка объединяют с преимущественными способами ЖХ для выделения белка, как подробно описано ниже. Данные комбинированные способы рефолдинга и очистки белка согласно изобретению являются особенно преимущественными, когда рекомбинантный белок предназначен для применения в условиях ίη νίνο в качестве лекарственного или биологического препарата.

Использование ЖХ методов позволит специалистам в данной области определить такие конкретные условия рефолдинга, которые обеспечивают желаемую конформацию белка для любого данного рекомбинантного белка. Также можно использовать другие методы очистки и выделения.

Желаемая конформация рекомбинантного белка может иметь или может не иметь различное расположение дисульфидных связей, хотя предпочтительно конформация содержит нативные дисульфидные связи.

Было установлено, что способы, описанные здесь, представляют мягкий и эффективный способ усовершенствования процесса получения рекомбинантных 1дС-антител или их фрагментов, которые могут принимать множественные конформации. В одном аспекте способы согласно изобретению можно использовать на препаратах рекомбинантных 1дС-антител или их фрагментов, где препарат [дС-антитела или его фрагмента представляет гетерогенную смесь, которая содержит стабильную и нестабильную конформации [дС-антитела или его фрагмента. Термины «стабильная» и «нестабильная» применяются в качестве условных терминов. Например, стабильная конформация будет иметь более высокую температуру плавления (Т_пл.) по сравнению с нестабильной конформацией при определении в одном и том же растворе. Конформация является стабильной по сравнению с другой конформацией, когда различие в значениях Тпл. составляет по меньшей мере примерно 2°С, более предпочтительно примерно 4°С, еще более предпочтительно примерно 7°С, еще более предпочтительно примерно 10°С, даже еще более предпочтительно примерно 15°С, еще более предпочтительно примерно 20°С, еще более предпочтительно примерно 25°С и наиболее предпочтительно примерно 30°С при определении в одном и том же растворе.

Таким образом, в одном аспекте изобретение предусматривает взаимодействие препарата рекомбинантного белка, который получен из гетерогенной смеси по меньшей мере двух конфигурационных изомеров рекомбинантного белка, со связующим окислительно-восстановительным реагентом в течение времени, достаточного для повышения относительного содержания желаемого конфигурационного изомера, и определение относительного содержания желаемого конфигурационного изомера в смеси. В другом аспекте изобретение предусматривает взаимодействие препарата рекомбинантного белка, продуцированного клетками млекопитающих, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН в пределах примерно от 7 до примерно 11, и выделение фракции препарата рекомбинантного белка с желаемой конформацией. Некоторые рекомбинантные белки представляют собой гликозилированные рекомбинантные белки, например, такие как продуцированные эукариотическими клетками. В некоторых аспектах способы согласно изобретению применяются для уменьшения конформационной гетерогенности, которая индуцируется разрывом дисульфидных связей. В более конкретных аспектах данная конформационная гетерогенность имеется в антителах и конкретнее в 1дС1-, 1дС2-, 1дС3- или 1дС4антителах. Следует отметить, что термин «конфигурация» используется здесь взаимозаменяемо с термином «конформация» и предназначен для обозначения белка, который имеет иную вторичную, третичную или четвертичную структуру по сравнению с другим белком с той же первичной структурой (с той же аминокислотной последовательностью). При использовании редокс-реагентов одних или в сочетании с дополнительным процессингом при использовании хаотропных агентов, таких как гуанидингидрохлорид, возможно получить более гомогенный и более терапевтически активный белок [дС по сравнению с образом того же белка, продуцированного таким же образом, но в присутствии редокс-реагентов и/или хаотропных агентов.

Как правило, способы согласно изобретению являются пригодными для усовершенствования способов получения рекомбинантных молекул или белков 1дС (т.е. 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4). Рекомбинантные молекулы или рекомбинантные белки представляют собой белки, полученные генноинженерным способом. Термин «генно-инженерный» относится к любому способу рекомбинантной ДНК или РНК, используемому для создания клетки-хозяина, которая экспрессирует ген на высоких уровнях, низких уровнях и/или мутантную форму гена. Иными словами, клетку трансфектируют, трансформирут или трансдуцируют рекомбинантной полинуклестидной молекулой и тем самым изменяют таким образом, чтобы индуцировать в клетке изменение экспрессии желаемого белка. Способы и векторы для получения рекомбинантных клеток и/или клеточных линий для экспрессии представляющего интерес белка

- 16 012162 являются хорошо известными специалистам в данной области; например. различные методы приведены в Сштсп! Ρτοΐο^Η ίη Μο^π1αΓ Βίο1ο§γ. Аи8иЬс1 с! а1.. сбз. (\УПсу & δοηβ. №\\·-Υογ1<. 1988 и периодически обновляемые издания) и δηπΛίΌοΙί с! а1.. Μο1^π1αΓ Ο1οηίη§: А ^аЬο^а!ο^у Магша1 (Сб1б 8ргшд ^аЬο^а!ο^у Рге§8. 1989). Методы генной инженерии включают. но не ограничиваются этим. экспрессирующие векторы. целенаправленную гомологичную рекомбинацию и активацию генов (см.. например. патент США № 5272071. С11аррс1) и трансактивацию генно-инженерными факторами транскрипции (см.. например. 8сда1 с! а1.. 1999. Рюс. №!1. Асаб. 8с1. И8А 96 (6): 2758-63).

В способах лечения заболевания. нарушения или состояния. в дополнении к профилактическим способам или способу профилактики таких заболеваний. нарушений или состояний. «эффективное количество» рекомбинантного полипептида представляет количество полипептида. которое будет обеспечивать желаемое биологическое или физиологическое действие. известное в данной области. Конкретно по отношению к способам лечения. а также способам ослабления симптома. связанного с заболеванием. нарушением или состоянием. «эффективное количество» используется как синоним выражения «терапевтически эффективное количество». В таких способах «субъект. нуждающийся» представляет любое животное. например. человека. у которого имеется симптом или риск развития. или поставлен диагноз заболевания. нарушения или состояния.

Изобретение находит особое применение в усовершенствовании продукции любых рекомбинантных белков. которые продуцируются клетками млекопитающих. и для которых требуется соответствующий рефолдинг. В некоторых вариантах осуществления изобретение. в частности. относится к усовершенствованной продукции и рефолдингу 146В7. молекулы 1дС1 против 1Ь-15. Гетерогенность таких белков за счет присутствия остатка непарного цистеина в положении 104 (Суз104) уменьшается в результате применения редокс-реагентов. описанных здесь. Данные положительные результаты можно оценить при определении такой гетерогенности с использованием методов ЖХ и ЖХ/МС. известных специалистам в данной области. В частности. белки. которые секретируются грибковыми клеточными системами (например. дрожжами. нитчатыми грибами) и клеточными системами млекопитающих. будут подвергаться гликозилированию. Предпочтительно белки секретируются продуцирующими их клетками млекопитающих. адаптированными для роста в клеточной культуре. Примерами таких клеток. обычно используемых в промышленности. являются клетки СНО. УЕКО. ΒΗΚ. НсЬа. СУ1 (включая Οοδ). МОСК. 293. 3Т3. миеломные клеточные линии (особенно мышиные). РС12 и \У138. Особенно предпочтительными клетками-хозяевами являются клетки яичника китайского хомяка (СНО). которые широко применяют для получения нескольких сложных рекомбинантных белков. например. цитокинов. факторов свертывания крови и антител (Вгазс1 с! а1.. 1996. Β1οο6 88: 2004-2012; ΚаиГтаη с! а1.. 1988. I. Βίο1. СЬет. 263: 63526362; МсКипюп с! а1.. 1991. I. Μο1. Εη6οαίηο1.. 6: 231-239; \\οο6 с! а1.. 1990. I. ^тигок. 145: 3011-3016). Мутантная клеточная линия с недостатком дигидрофолатредуктазы (ΌΗΡΚ) (Иг1аиЬ с! а1.. 1980. Ртос. №!1. Асаб. 8с1. И8А 77: 4216-4220). ΌΧΒ11 и Ό6-44 являются клеточными линиями-хозяевами СНО выбора. поскольку эффективная селектируемая по ΌΗΡΚ и амплифицируемая экспрессирующая ген система обеспечивает высокий уровень экспрессии рекомбинантного белка в данных клетках (ΚаиГтаη К.1. с! а1.. 1990. Мс111. Εηζутο1. 185: 527-566). Кроме того. с данными клетками легко манипулировать в виде прикрепляющейся к субстрату и суспензионной культур. и они проявляют относительно хорошую генетическую стабильность. Клетки СНО и рекомбинантные белки. экспрессированные в них. были хорошо охарактеризованы и разрешены для применения в производстве лекарственных препаратов официальными органами.

Было установлено. что изобретение представляет собой мягкий и эффективный способ усовершенствования способа продукции молекул рекомбинантного 1дС (например. 1дС1. 1дС2. 1дС3 или 1дС4). которые могут принимать множественные конформации и/или содержат более чем один домен. «Домен» представляет собой смежную область полипептидной цепи. которая принимает особую третичную структуру и/или обладает особой активностью. которая может быть локализована в данной области полипептидной цепи. Например. один домен белка может обладать аффинностью связывания для одного лиганда. и один домен белка может обладать аффинностью связывания для другого лиганда. В отношении термостабильности. домен можно отнести к кооперативной. развернутой единице белка. Такие белки. которые содержат более чем один домен. можно найти в природе в виде одного белка или полученного генно-инженерным путем в виде гибридного белка. Кроме того. домены полипептида могут иметь субдомены.

Композиции и способы согласно изобретению также являются пригодными для получения других типов рекомбинантных 1дС-белков. включая молекулы иммуноглобулинов или их фрагменты. и химерные антитела (например. антитела. содержащие человеческую константную область. соединенную с мышиной антигенсвязывающей областью) или их фрагменты. Известны многочисленные методы. с помощью которых можно манипулировать с ДНК. кодирующими молекулы иммуноглобулинов. с получением ДНК. способных кодировать рекомбинантные белки. такие как одноцепочечные антитела. антитела с повышенной аффинностью или другие полипептиды на основе антител (см.. например. Ьаглск с! а1.. 1989. Βίο1^1ιηο1οβ\' 7: 934-938; Кс^сйтаηη с! а1.. 1988. №!игс 332: 323-327; Κο^ήδ с! а1.. 1987. №1Ц1гс 328: 731-734; Ус^су^ с! а1.. 1988. 8с1спсс 239: 1534-1536; С1аибЬагу с! а1.. 1989. №и.1гс 339: 394-397). Также

- 17 012162 в изобретении можно использовать препараты полностью человеческих антител (таких как полученные с использованием трансгенных животных и необязательно дополнительно модифицированные в условиях ίη νίίτο). а также гуманизированных антител. Термин «гуманизированное антитело» также включает одноцепочечные антитела. См.. например. СаЬШу с( а1.. патент США № 4816567; СаЬШу с( а1.. Европейский патент № 0125023В1; Вокк е( а1.. патент США № 4816397; Вокк е( а1.. Европейский патент № 0120694В1; ЫеиЬегдег М. 8. е( а1.. \¥О 86/01533; ЫеиЬегдег М. 8. е( а1.. Европейский патент № 0194276В1; \Ут1ег. патент США № 5225539; \Ут1ег. Европейский патент № 0239400В1; Онееп е( а1.. Европейский патент № 0451216В1; Раб1ап Е. А. е( а1.. ЕР 0519596А1. Способ согласно изобретению также можно использовать при получении конъюгатов. содержащих антитело и цитотоксическое или люминесцентное вещество. Такие вещества включают производные маитанзина (такие как ΌΜ1); энтеротоксины (такие как стафилококковый энтеротоксин); изотопы йода (такие как йод-125); изотопы технеция (такие как Тс-99т); флуорохромы на основе цианина (такие как Су5.5.18) и инактивирующие рибосомы белки (такие как буганин. гелонин или сапорин-86).

С использованием способов согласно изобретению можно также получить препараты различных гибридных белков. Примеры таких гибридных белков включают белки. экспрессированные в виде гибридных белков с участком молекулы рекомбинантного 1дС (т.е. 1дС1. 1дС2. 1дС3 или 1дС4). белки. экспрессированные в виде гибридных белков с «застежкой-молнией». и новые полифункциональные белки. такие как гибридные белки цитокина и фактора роста (например. СМ-С8Е и Ш-3. МСЕ и Ш-3). В \УО 93/08207 и \УО 96/40918 описано получение различных растворимых олигомерных форм молекулы. относящейся к ί.Ό40Ε включающих соответственно иммуноглобулиновый гибридный белок и гибридный белок с «застежкой-молнией»; способы. описанные здесь. применимы для других белков. Любую из вышеуказанных молекул можно экспрессировать в виде гибридного белка. включая. но не ограничиваясь внеклеточным доменом молекулы клеточного рецептора. ферментом. гормоном. цитокином. участком молекулы иммуноглобулина. «застежкой-молнией»-доменом и эпитопом.

Получение рекомбинантного белка предпочтительно проводить при использовании редоксреагентов. описанных здесь. в среде культуры клеток. Рекомбинантные белки продуцируются клетками в культуре и затем их выделяют. Препарат рекомбинантного белка может представлять собой супернатант культуры клеток. клеточный экстракт. но предпочтительно он является частично очищенной фракцией указанного. Под выражением «частично очищенная» понимается. что проводили некоторую методику или методики фракционирования. но присутствуют еще полипептидные молекулы (по меньшей мере 10%) иные чем желаемый белок или белок с желаемой конформацией. Одно из преимуществ способов согласно изобретению заключается в том. что препарат рекомбинантного белка может иметь очень высокую концентрацию. Некоторые значения концентраций находятся в пределах от 0.1 до 20 мг/мл. более предпочтительно от 0.5 до 15 мг/мл и еще более предпочтительно от 1 до 10 мг/мл.

Препарат рекомбинантного белка первоначально можно получить при культивировании рекомбинантных клеток-хозяев в условиях культивирования. подходящих для экспрессии полипептида. в присутствии редокс-реагентов. описанных здесь.

Полипептид также можно экспрессировать в виде продукта трансгенных животных. например. в виде компонента молока трансгенных коров. коз. свиней или овец. для которых характерно. что соматические или половые клетки содержат нуклеотидную последовательность. кодирующую полипептид. Затем полученный экспрессированный полипептид можно выделить или частично выделить из такой культуры или компонента (например. из культуральной среды или клеточных экстрактов. или жидкости организма) с использованием известных методов. Несмотря на то. что можно использовать фракционирование. включающее. но не ограничивающееся одной или более стадиями фильтрования. центрифугирования. осаждения. разделения фаз. аффинную очистку. гель-фильтрацию. ионообменную хроматографию. хроматографию гидрофобного взаимодействия (Н1С; с использованием смол. таких как фениловый эфир. бутиловый эфир или пропиловый эфир). ВЭЖХ и сочетания вышеуказанного. в преимущественных способах согласно изобретению можно применять фракционирование и очистку высокомолекулярных терапевтических белков ЖХ. как описано в заявке на патент США № 60/548302. Όί11οη е( а1.. поданной 27 февраля 2004. и заявке № 60/538982. Вопбагепко е( а1.. поданной 23 января 2004 (каждая из которых включена здесь в полном объеме для сведения).

Также способы ЖХ и ЖХ/МС. описанные здесь ниже. можно объединить со способами очистки. например. такими как очистка полипептида с использованием колонки для аффинной хроматографии. содержащей агенты. которые будут связываться с полипептидом; с одной или более стадиями очистки на колонках с аффинными смолами. такими как А-агароза. гепарин-1оуореаг1® или 3СА сефароза Цибахром синий; с одной или более стадиями. включающими элюирование; и/или иммуноаффинную хроматографию. Полипептид может экспрессироваться в форме. которая облегчает очистку. Например. он может экспрессироваться в виде гибридного полипептида. такого как связывающийся с мальтозой полипептид (МВР). глутатион-8-трансфераза (С8Т) или тиоредоксин (ТЕХ). Имеются промышленно доступные наборы для экспрессии и очистки таких гибридных полипептидов производства соответственно Ыете Епд1апб ВюЬаЬ (Веνе^1у. Макк). Рйаттас1а (Ркса1а\\'ау. Ν.Υ.) и 1пУНгодеп. Полипептид может быть мечен эпитопом и затем подвергнут очистке с использованием специфического антитела против такого эпито- 18 012162 па. Один такой эпитоп (ЕЬЛС®) является промышленно доступным производства Койак (Ыете Науеп, Сопп.). Также возможно использовать колонку для аффинной хроматографии, содержащую полипептидсвязывающий полипептид, такой как моноклональное антитело к рекомбинантному белку, для аффинной очистки экспрессированных полипептидов. Другими типами стадий аффинной очистки может быть колонка протеин А- или протеин С-колонка, где аффинные реагенты связываются с белками, которые включают в себя Тс-домены. Полипептиды можно элюировать с колонки для аффинной хроматографии с использованием обычных методов, например, буфера для элюирования с высокой концентрацией соли и затем диализовать в буфер с низкой концентрацией соли для применения, или изменением рН или других компонентов в зависимости от используемого аффинного матрикса или можно удалить в конкурентных условиях с использованием нативных субстратов для аффинной группы. В одном варианте осуществления изобретения препарат рекомбинантного белка можно частично очистить на протеин А-колонке для аффинной хроматографии.

Некоторые или все вышеописанные стадии очистки, в различных комбинациях, можно также использовать для получения соответствующего препарата рекомбинантного 1дС (т.е. 1дС1, 1дС2, 1дС3 или 1дС4) для применения в способах согласно изобретению и/или дополнительно очистить такой рекомбинантный полипептид после взаимодействия препарата рекомбинантного белка со связующим окислительно-восстановительным реагентом.

Полипептид, в основном не содержащий другие полипептиды млекопитающих, определяется как «очищенный полипептид». Специфические ЖХ методы, которые можно объединить со способами на основе применения редокс-реагентов, описанными здесь, подробно представлены в заявке на патент США №: 60/548302, Όίΐΐοη е! а1., поданной 27 февраля 2004, и 60/538982, Вопйагепко е! а1., поданной 23 января 2004 (каждая из которых включена здесь в полном объеме для сведения).

Полипептид также можно получить известным обычным химическим синтезом. Специалистам в данной области известны методы конструирования полипептидов синтетическим путем. Полученные синтетически полипептидные последовательности можно гликозилировать в условиях ш νίΙΐΌ.

Желаемая степень чистоты зависит от предполагаемого использования полипептида. Желательна относительно высокая степень чистоты, когда полипептид предназначен, например, для введения в условиях ш у1уо. В таком случае полипептиды очищают таким образом, чтобы отсутствовали полосы полипептидов, соответствующие другим полипептидам, детектируемые при анализе электрофорезом в 8Э8полиакриламидном геле (8П8-РЛСЕ). Очевидно, специалистам в данной области понятно, что можно обнаружить много полос, соответствующих полипептиду, при 8Э8-РЛСЕ за счет различий в гликозилировании, различий в посттрансляционном процессинге и пр. Наиболее предпочтительно, когда полипептид согласно изобретению очищают до значительной гомогенности по данным анализа 808-РЛСЕ, когда обнаруживают одну полосу полипептида. Полосу полипептида можно визуализировать при окрашивании серебром, окрашивании кумасси синим и/или (если полипептид включает радиоизотопную метку) авторадиографией.

Под термином «взаимодействие» понимается действие или воздействие в растворе. Белок или полипептид можно подвергнуть взаимодействию с редокс-реагентами, также связанными с твердой подложкой (например, колонкой для аффинной хроматографии или хроматографическим матриксом). Предпочтительно раствор забуферен. Для получения максимального выхода белка с желаемой конформацией рН раствора выбирают таким образом, чтобы обеспечить стабильность белка и оптимизировать для обмена дисульфидов. В практике изобретения является предпочтительным, чтобы значение рН раствора не было сильно кислым. Так, пределы рН должны быть выше рН 5, предпочтительно примерно от рН 6 до примерно рН 11, более предпочтительно примерно от рН 7 до примерно рН 10 и еще более предпочтительно от рН 7,6 до примерно рН 9,6. В одном не ограничивающем варианте осуществления изобретения было установлено, что оптимальное значение рН составляет примерно 8,6. Однако оптимальное значение рН для конкретного варианта осуществления изобретения может легко определить экспериментально специалист в данной области.

Связующий окислительно-восстановительный реагент является источником восстановителей. Некоторые восстановители представляют собой свободные тиолы. Предпочтительно связующий окислительно-восстановительный реагент состоит из соединения из группы, включающей восстановленный и окисленный глутатион, дитиотреитол (ΌΤΤ), 2-меркаптоэтанол, дитионитробензоат, цистеин и цистин/цистамин. Для простоты применения и экономии можно использовать восстановленный глутатион и/или восстановленный цистеин. Необходимо отметить, что при нейтральном значении рН цистеин образует дисульфиды с образованием цистина. Скорость такой реакции окисления возрастает в присутствии кислорода, который часто находится в растворах, включая растворы с редокс-реагентами, используемые для рефолдинга. Практически раствор с нейтральным рН, который первоначально содержит только цистеин (восстановитель), быстро образует цистин (окислитель). Следовательно, в раствор можно ввести реагент редокс-сопряжения при добавлении только цистеина.

Редокс-реагент можно внести в ферментационную среду, на которой культивируют клетки, продуцирующие рекомбинантный белок. В дополнительных вариантах осуществления реагенты можно также добавить к подвижной фазе при ЖХ во время проведения стадии очистки ЖХ для выделения рекомби

- 19 012162 нантного белка. В некоторых вариантах осуществления белок иммобилизуют на стационарной фазе на колонке для ЖХ и редокс-реагент и хаотроп являются частью подвижной фазы. В конкретных вариантах осуществления необработанное ЦС-антитело может элюировать в виде гетерогенной смеси, что идентифицируется по числу пиков. Применение связующего окислительно-восстановительного реагента и/или хаотропного агента приводит к образованию более простого и более однородного характера пиков. Предусматривается, что данный более однородный интересующий пик можно выделить в виде более гомогенного препарата 1дС.

Связующий окислительно-восстановительный реагент находится в концентрации, достаточной для повышения относительного содержания желаемой конформации. Оптимальная абсолютная концентрация и соотношение связующего окислительно-восстановительного реагента зависят от общей концентрации 1дС и в некоторых обстоятельствах от конкретного подкласса 1дС. Когда он применяется для получения молекул 1дС1, то также это будет зависеть от количества и доступности непарных цистеинов в белке.

Как правило, концентрация свободных тиолов связующего окислительно-восстановительного реагента может составлять примерно от 0,05 мМ до примерно 50 мМ, более предпочтительно примерно от 0,1 мМ до примерно 25 мМ и еще более предпочтительно примерно от 0,2 мМ до примерно 20 мМ.

Кроме того, связующий окислительно-восстановительный реагент может содержать окисленные тиолы в примерно более высокой, равной или более низкой концентрации по сравнению с восстановленным тиолом. Например, связующий окислительно-восстановительный реагент может представлять комбинацию восстановленного глутатиона и окисленного глутатиона. Было установлено, что могут одинаково хорошо функционировать соотношения восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону в пределах примерно от 1:1 до примерно 100:1 (восстановленные тиолы:окисленные тиолы). Альтернативно в другом варианте осуществления связующий окислительно-восстановительный реагент может представлять собой цистеин или комбинацию цистеина и цистина/цистамина. Таким образом, когда окисленные тиолы включены в исходный связующий окислительно-восстановительный реагент, то соотношение восстановленных тиолов к окисленным тиолам может в некоторых вариантах осуществления равняться примерно от 1:10 до примерно 1000:1, более предпочтительно примерно от 1:1 до примерно 500:1, еще более предпочтительно примерно от 5:1 до примерно 100:1, даже еще более предпочтительно составлять примерно 10:1.

Взаимодействие препарата рекомбинантного белка со связующим окислительно-восстановительным реагентом проводят в течение времени, достаточном для повышения относительного количества желаемой конформации. Желательно любое относительное увеличение пропорции, включая, например, чтобы 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 и даже 80% белка с нежелательной конформацией превращалось в белок с желаемой конформацией. Типичные выходы, которые можно достичь со способами согласно изобретению, находятся в пределах примерно от 40 до 80%. Взаимодействие можно проводить при добавлении редокс-реагента в ферментационную среду, в которой продуцируется белок. Альтернативно взаимодействие имеет место во время частичного выделения белка из клеточной культуры, в которой продуцируется белок. В еще одних вариантах осуществления взаимодействие проводят после элюирования белка с колонки для ВЭЖХ, но до проведения любого дополнительного процессинга. Важно, что взаимодействие можно осуществлять на любой стадии во время получения, очистки, хранения или формуляции антитела.

Также можно проводить взаимодействие с 1дС-антителами, присоединенными к стационарной фазе хроматографических колонок, в то время как редокс-реагенты и хаотропные агенты являются частью подвижной фазы. В данном случае взаимодействие можно проводить в виде части метода очистки хроматографией. Примеры показательных хроматографических методов с рефолдингом могут включать гель-хроматографию (8ЕС); обмен растворителя во время обратимой адсорбции на протеин А-колонке; хроматографию гидрофобного взаимодействия (Н1С); аффинную хроматографию с иммобилизованным металлом (1МАС); обращенно-фазовую хроматографию (КРС); применение иммобилизованного катализатора для укладки, такого как СгоЕ1, СгоЕ8 или других белков со свойствами способствовать укладке. Рефолдинг на колонке является привлекательным, поскольку его легко автоматизировать с использованием промышленно доступных препаративных хроматографических систем. Недавно был сделан обзор по рефолдингу рекомбинантных белков на колонке (Ь1 е! а1., 2004).

Если стадию взаимодействия проводят с частично или высоко очищенным препаратом рекомбинантного белка, то стадию взаимодействия можно проводить в течение короткого периода времени примерно от 1 ч до примерно 4 ч, и более длительного - в течение примерно от 6 ч до примерно 4 суток. Было установлено, что хорошо функционирует стадия взаимодействия продолжительностью примерно от 4 ч до примерно 16 ч или примерно 18 ч. Также стадия взаимодействия может иметь место во время проведения другой стадии, такой как очистка на твердой фазе, или во время фильтрования или любой другой стадии при очистке.

Способы согласно изобретению можно проводить в широком пределе значений температуры. Например, способы согласно изобретению с успехом проводили при температуре в пределах примерно от 4 до примерно 37°С, однако, наилучшие результаты получали при более низких значениях температуры.

- 20 012162

Типичная температура для взаимодействия частично или полностью очищенного препарата рекомбинантного белка равняется примерно от 4 до примерно 25°С (комнатной температуры), но также ее можно проводить при более низких значениях температуры и более высоких значениях температуры.

Кроме того, предусматривается, что способ можно проводить при высоком давлении. Ранее было установлено, что высокое гидростатическое давление (1000-2000 бар), в сочетании с низкими, не приводящими к денатурации концентрациями гуанидингидрохлорида, т.е. ниже 1 М, использовали для дезагрегации (солюбилизации) и рефолдинга нескольких денатурированных белков, продуцированных Е. сой, в виде включений, в состав которых входил человеческий гормон роста и лизоцим, и Ь-лактамаза (δΐ. бо1т е! а1., Ргос. №11. Асаб. δα. И8А, 96: 13029-13033 (1999)). В-лактамаза подвергалась рефолдингу с высоким выходом активного белка даже без добавления СбтНС1. В другом опыте (8ееГе1б1 е! а1., Рго1ет δα., 13: 2639-2650 (2004)) выход рефолдинга продуцированного клетками млекопитающих белка бикунина, полученного при модулированном высоким давлением рефолдингом при 2000 бар, составлял 70% по данным ОФ-ВЭЖХ, что было существенно выше по сравнению со значением 55% (по данным ОФВЭЖХ), полученным традиционным «разведением-рефолдингом» под действием гуанидингидрохлорида. Данные факты указывают, что высокое гидростатическое давление способствует разрыву меж- и внутримолекулярных связей, приводя к развертыванию и дезагрегации белка. Воздействие высокого давления на белок аналогично воздействию на белок хаотропных агентов. Таким образом, предусматривается, что в способах согласно изобретению вместо применения хаотропных агентов используется высокое давление для развертывания белка. Конечно, в некоторых случаях можно использовать сочетание высокого давления и хаотропных агентов.

Препарат рекомбинантного белка можно подвергнуть взаимодействию со связующим окислительно-восстановительным реагентом в различных соответствующих объемах. Например, способы согласно изобретению можно успешно проводить в масштабах аналитической лаборатории (1-50 мл), препаративных масштабах (50 мл - 10 л) и промышленных масштабах (10 л и более). Таким образом, способы согласно изобретению можно воспроизводимо проводить в небольших и больших объемах.

В некоторых вариантах осуществления белки, продуцированные с использованием среды, содержащей редокс-реагенты, дополнительно подвергаются процессингу на отдельной стадии процессинга, на которой применяются хаотропные денатурирующие агенты, например, такие как додецилсульфат натрия (δΌδ), мочевина или гуанидингидрохлорид (СиНС1). Для ощутимого развертывания требуются значительные количества хаотропных агентов. В некоторых вариантах осуществления на стадии процессинга используется от 0,1 М до 2 М хаотропа, который воспроизводит эффект, равноценный применению от 0,1 М до 2 М гуанидингидрохлорида. В конкретном варианте осуществления окислительный рефолдинг достигается в присутствии примерно 1,0 М гуанидингидрохлорида или количества другого хаотропного агента, который обеспечивает такой же или аналогичный рефолдинг, что и 1 М гуанидингидрохлорида. В некоторых вариантах осуществления в способах используется от 1,5 М до 0,5 М хаотропа.

Используемое количество хаотропного агента зависит от структурной стабильности белка в присутствии указанного хаотропа. Необходимо иметь достаточное количество присутствующего хаотропа для нарушения локальной третичной структуры и/или четвертичной структуры взаимодействий домена белка, но меньшее чем требуется для полного развертывания вторичной структуры молекулы и/или отдельных доменов. Для определения точки, на которой белок начнет развертываться под действием равновесной денатурации, практикующий специалист в данной области должен оттитровать хаотроп в растворе, содержащем белок, и следить за структурой таким методом, как круговой дихроизм или флуоресценция (фиг. 36).

Имеются другие параметры, которые можно использовать для развертывания или незначительного нарушения структуры белка, которые можно использовать вместо хаотропа. Температура и давление представляют собой два основных параметра, которые применялись ранее для изменения структуры белка и которые можно использовать вместо хаотропного агента при взаимодействии с редокс-реагентом. Заявители предусматривают, что специалистам в данной области можно использовать любой параметр, который, как было показано, приводит к денатурации или нарушению структуры белка вместо хаотропного агента.

Обмен дисульфидов можно погасить любым методом, известным специалистам в данной области. Например, связующий окислительно-восстановительный реагент можно удалить или уменьшить его концентрацию на стадии очистки и/или можно инактивировать его химическим путем, например, при подкислении раствора. Как правило, когда реакцию гасят подкислением, то рН раствора, содержащего связующий окислительно-восстановительный реагент, следует довести до значения ниже рН 7. В некоторых вариантах осуществления рН следует довести до рН 6. Как правило, значения рН снижается в пределах примерно от рН 2 до примерно рН 6.

Определение конформации белка и относительные соотношения конформационных форм белка в смеси можно провести с использованием любого из разнообразных аналитических или количественных методов. Если имеется различие в активности между конформационными формами белка, то определение относительного содержания конформации в смеси можно осуществить с помощью теста определения активности (например, связывания с лигандом, ферментативной активности, биологической актив

- 21 012162 ности и т. д.). Также можно использовать биологическую активность белка. Альтернативно можно применить тесты связывания, в которых активность выражена в виде единиц активности/мг белка.

Если две конформационные формы разделяются во время проведения методов разделения, таких как хроматография, электрофорез, фильтрование и другая методика очистки, то тогда относительное количество конформационной формы в смеси можно определить с использованием таких методов очистки. Например, по меньшей мере две различные конформационные формы рекомбинантного 1дС можно разделить хроматографией гидрофобного взаимодействия. Кроме того, поскольку круговой дихроизм в дальнем УФ-свете использовали для установления вторичной структуры белков (Регсхе1 е1 а1., 1991, Рго1еш Епдгд. 4: 669-679), то с помощью такого метода можно определить присутствие альтернативных конформации белка. Еще одним методом, используемым для определения конформации, является флуоресцентная спектроскопия, которую можно применять для установления некоторых дополнительных различий в третичной структуре за счет флуоресцирующих свойств триптофана и тирозина. Другими методиками, которые можно использовать для определения различий в конформации и, следовательно, относительного содержания конформационной формы, являются гель-хроматография для определения состояния агрегации, дифференциальная сканирующая калориметрия для определения перехода точки плавления (Т_пл.) и энтальпии, и развертывания под действием хаотропа. В некоторых вариантах осуществления, подробно описанных ниже, в изобретении применяется детектирование ЖХ/МС для определения гетерогенности белка.

Под термином «выделение» понимается физическое отделение по меньшей мере одного компонента в смеси от других компонентов в смеси. Выделение компонентов или конкретных конформационных форм белка можно достичь при использовании любого способа очистки, который приводит к разделению таких компонентов. Следовательно, можно осуществить много стадий хроматографии в дополнении к ОФ-ВЭЖХ, описанных ниже, включая, но не ограничиваясь этим, Н1С, хроматографию на гидроксиапатите, ионообменную хроматографию, аффинную хроматографию и катионообменную хроматографию. Другими методами очистки являются фильтрование (например, тангенциальное проточное фильтрование), электрофоретические методы (например, электрофорез, электроэлюция, изоэлектрическое фокусирование) к фазовое разделение (например, фазовое разделение на ПЭГ-декстране), и это только некоторые. Кроме того, фракцию препарата рекомбинантного белка, которая содержит белок в нежелаемой конформации, можно вновь обработать способами согласно изобретению для дополнительной оптимизации выхода белка с желаемой конформацией.

Также изобретение необязательно включает дополнительную формуляцию белков. Под термином «формуляция» понимается, что для белков можно поменять буфер, стерилизовать, упаковать в объемных композициях и/или упаковать для конечного потребителя. Для целей изобретения термин «стерильная объемная форма» означает, что композиция не имеет или в основном не имеет загрязнения микроорганизмами (до той степени, которая допустима для продукта питания и/или лекарственного препарата), и она определяется составом и концентрацией. Термин «стерильная разовая лекарственная форма» означает форму, подходящую для продажи и/или введения или потребления пациентом. Такие композиции могут включать эффективное количество белка в комбинации с другими компонентами, такими как физиологически приемлемый разбавитель, носитель и/или наполнитель. Термин «фармацевтически приемлемый» означает нетоксичное вещество, которое не оказывает отрицательного влияния на биологическую активность активного ингредиента(ов). Композиции, подходящие для введения, включают водные и неводные стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиокислители, буферы, бактериостатики и растворенные вещества, которые способствуют обеспечению изотонических свойств раствора с кровью реципиента; и водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие вещества или загустители. Кроме того, стерильные объемные формы и стерильные разовые лекарственные формы могут содержать небольшую концентрацию (примерно от 1 мкМ до примерно 10 мкМ) связующего окислительно-восстановительного реагента (например, глутатиона, цистеина и т. д.). Полипептиды можно формулировать согласно известным методам, используемым для получения фармацевтически пригодных композиций. Их можно объединить в смеси в виде одного активного вещества или с другими известными активными веществами, подходящими для данного показания, с фармацевтически приемлемыми разбавителями (например, физиологическим раствором, Трис-НС1 буфером, ацетатом и забуференными фосфатом растворами), консервантами (например, тимеразолом, бензиловым спиртом, парабенами), эмульгаторами, солюбилизаторами, адъювантами и носителями. Подходящие лекарственные формы для фармацевтических композиций включают в себя описанные в Кеттд1оп'§ РЕагтасеийса1 8с1епсе§, 16'¹' ей. , 1980, Маск РиЬИкЫпд Сотрапу, ЕаЧоп, РА. Кроме того, такие композиции можно приготовить в виде комплексов с полиэтиленгликолем (ПЭГом), ионами металлов и/или включить в полимерные соединения, такие как полиуксусная кислота, полигликолевая кислота, гидрогели, декстран и т.д., или включить в липосомы, микроэмульсии, мицеллы, униламеллярные и мультиламеллярные везикулы, «тени» эритроцитов и сферобласты. Подходящие липиды для липосомальной композиции включают, без ограничения, моноглицериды, диглицериды, сульфатиды, лизолецитин, фосфолипиды, сапонин, желчные кислоты и пр. Специалисты в данной области могут осуществить приготовление таких липосомальных композиций, как раскрыто, например, в патенте США № 4235871; патенте

- 22 012162

США № 4501728; патенте США № 4837028; и патенте США № 4 7 37323. Такие композиции будут оказывать влияние на физическое состояние, растворимость, стабильность, скорость высвобождения в условиях ίη νίνο и клиренс в условиях ίη νίνο, и таким образом их выбирают согласно предполагаемому применению, так, что характеристики носителя будут зависеть от выбранного пути введения. Формы для замедленного высвобождения включают, но не ограничиваются этим, полипептиды, которые инкапсулируют в биосовместимый полимер с медленным растворением (такой как микрочастицы из альгината, описанные в патенте США № 6036978), в смеси с полимером (включая наносимые местно гидрогели) или включают в биосовместимый полупроницаемый имплантат.

Способы согласно изобретению являются пригодными для анализа рекомбинантных белков 1§С (например, 1дС1, 1дС2, 1дС3 и 1дС4) и, в частности, пригодными для анализа таких высокомолекулярных белков. Также способы подходят для анализа мономеров белков с большой молекулярной массой и белковых гетеромультимеров, например, антител. Предусматривается, что данные белки будут включать пострансляционные модификации, такие как присоединение олигосахаридных групп и пр. В конкретных вариантах осуществления способы согласно изобретению применяют для анализа антител и доменов антител. В одном примере способы используют для анализа белков с молекулярной массой выше 90 кДа, включая интактные антитела, любой третичной структуры белков с молекулярной массой выше 90 кДа. Очевидно, понятно, что молекулярную массу рассчитывают на основе аминокислотной последовательности и включают известные пострансляционные модификации белка, например, модификацию углеводами. Способы применимы для характеристики олигосахаридной композиции, расщепления, образования димера или мультимера и окисления белков, структурных вариантов с различными дисульфидными структурами и/или специфических аминокислот в белке.

В некоторых вариантах осуществления способы согласно изобретению применяют для анализа антител и фрагментов антител. Образец, предназначенный для анализа, может включать иктактное антитело, содержащее Ес-домен и два ЕаЬ-домена. Альтернативно способы согласно изобретению используют для анализа структуры участка антитела, например, такого как Ес-домен и один или оба ЕаЬ-домена. В частности, предусматривается, что способы согласно изобретению являются пригодными для анализа продуктов частичного расщепления интактного антитела. Такое расщепление можно осуществить до проведения разделения ОФ-ВЭЖХ. Типичный протеолиз проводят с использованием фермента, например, такого как папаин, 1ус-С протеаза или пепсин, с воспроизведением расщепления антитела в шарнирной области. Альтернативно при расщеплении можно использовать восстановитель для восстановления дисульфидных связей, которые связывают две цепи антитела. Такое восстановление можно провести, например, с использованием дитиотреитола, меркаптоэтанола, трибутилфосфина и три(2-карбоксиэтил) фосфина гидрохлорида. Обзор аналитических и препаративных способов, используемых при получении антител и их фрагментов, представлен 1о51с апй Ыт: Мс11юЙ5 £ог Рипйсайоп о£ ЛпйЬокеу Еоой Тсс11по1од. Вю1ес11по1од. 39 (3): 215-226 (2001).

В примерных вариантах осуществления ограниченный протеолиз проводят с использованием эндопротеиназы Ьу8-С в течение от 10 до 60 мин при рН в пределах 7,0-8,0. Расщепление проводят без денатурации при 37°С с молярным соотношением фермент:белок, равным 1:150. Это приводит к образованию нескольких крупных фрагментов антитела без чрезмерного нарушения структуры белка. Затем продукты ограниченного протеолиза подвергают ОФ-ВЭЖХ/МС, описанным здесь. При использовании ограниченного протеолиза образуются Ес- и ЕаЬ-фрагменты в шарнирной области 1дС. Данные способы позволяют детектировать увеличение массы фрагментов на +16 Да за счет окисления остатка метионина и детектировать повышение +2 Да за счет неполного образования дисульфидных связей.

Способы согласно изобретению можно использовать для анализа нативных белков, гибридных белков, гуманизированных антител, химерных антител, человеческих антител, одноцепочечных антител и пр. В одном примере способы также можно использовать для анализа любого антитела или его фрагмента с такой небольшой молекулярной массой, как 40, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85 кДа или выше. В некоторых вариантах осуществления антитело, нанесенное на колонку для ОФ-ВЭЖХ, представляет собой интактную ЕаЬ-область. В других вариантах осуществления антитело, подвергающееся анализу, представляет собой (ЕаЬ)₂-область, полученную расщеплением Ес-области антитела. Аналогично способы согласно изобретению также можно использовать для анализа Ес-области антитела, полученного в результате такого расщепления. В конкретных вариантах осуществления анализируемое антитело содержит интактную Ес-область и только одну интактную ЕаЬ-область. Кроме того, способы согласно изобретению можно использовать для анализа белка, содержащего Ес-область антитела и соединенные с ним дополнительные пептиды, или белок, содержащий ЕаЬ-область антитела с соединенными с ним дополнительными пептидами.

Способы согласно изобретению можно использовать для анализа рекомбинантных антител. Рекомбинантные антитела могут содержать Ес-домен или могут не содержать Ес-домен. В частности, мультивалентные антитела можно анализировать при использовании настоящего изобретения. В том смысле, в котором он здесь используется, термин «мультивалентные антитела» представляет собой рекомбинантные антителоподобные молекулы, которые содержат связывающие домены для более чем одного эпитопа. Например, такие белки, производные антител, включают молекулы, в которых ЕаЬ-цепь антитела

- 23 012162 гибридизована со связывающими доменами (например, битела ЕаЬ-ксЕу или тритела). Данные молекулы представляют собой пригодные промежуточные рекомбинантные биспецифические антитела, не содержащие Ес-область. Получение антител с отсутствием Ес-домена является преимущественным, поскольку наличие такого домена в связанной с антителом терапевтической молекуле приводит к повышению зремени нахождения молекулы в сыворотке крови посредством ее защиты от метаболизма в печени, и также она может связываться с другими клетками при взаимодействии с Ес-рецептором, тем самым, приводя к развитию токсических побочных эффектов за счет системного «запуска» иммунных эффекторных клеток. Таким образом, в некоторых терапевтических молекулах, представляющих антитела, отсутствует Есдомен. Специалистам в данной области знакомы способы конструирования таких молекул на основе антител. Например, рекомбинантные антитела можно получить из комбинации «строительных» блоков для антител (таких как Ес, (ЕаЬ')2, ЕаЬ, ксЕу, дитело) с мотивом гетеродимеризации для эффективного создания мультиспецифических антител.

Способы согласно изобретению являются особенно пригодными при определении целостности антитела и, в частности, терапевтического антитела. Антитело отделяют и анализируют с использованием методов ОФ-ВЭЖХ/МС, описанных здесь, для определения присутствия продуктов деградации антитела. Способы, описанные здесь, позволяют специалистам в данной области оценить наличие димеров, продуктов расщепления антитела, продуктов дезамидирования, наличие окисления или образования Νконцевой пироглутаминовой кислоты или беспорядочного взаимодействия дисульфидных связей в антителе. Все эти характеристики являются показателями деградации, которая имеет место в антителе, и снижают структурную целостность антитела.

Способы, описанные здесь ниже в примерах, показывают улучшенное хроматографическое разделение и точное определение молекулярной массы фармацевтических антител и продуктов их деградации. В способе применяется масс-спектрометр высокого разрешения с высокой точностью, способный определять различие в массе между двумя вариантами антитела, которые различаются только на один аминокислотный остаток (например, глицин 57 Да) или на одну группу сахара (например, галактоза 162 Да). Разрешение спектрофотометра по массе должно составлять по меньшей мере 3000 для обычного 1дСантитела с молекулярной массой 150 кДа. Разрешение по массе рассчитывается следующим образом: Разрешение = ΜΜ/ΔΜΜ = 150 кДа/57 кДа « 3000.

В некоторых вариантах осуществления способы согласно изобретению могут детектировать изменение массы антитела или белка более чем 100 кДа до и после окисления, т.е. различие в массе, составляющее 16 Да. Это обеспечивает разрешение по массе 10000 для обычного антитела. Способы согласно изобретению дополнительно иллюстрируются в примерах ниже.

Примеры

Последующие примеры включены для демонстрации некоторых вариантов осуществления. Специалисты в данной области, очевидно, понимают, что описанные в примерах методы, представляют методы, разработанные заявителями для хорошего функционирования в практике изобретения, и таким образом, их можно рассматривать в качестве предпочтительных способов его практики. Однако специалисты в данной области в свете настоящего изобретения, очевидно, понимают, что можно внести много изменений в конкретные варианты осуществления, которые раскрыты, и при этом получить такой же или аналогичный результат, не отступая от сущности и объема изобретения.

В предварительной заявке на патент США № 60/621295 (включена здесь для сведения) приводится раскрытие рефолдинга молекулы 1дС2 в присутствии окислителя-восстановителя и необязательно хаотропных агентов. Биологическая активность такого подвергшегося рефолдингу 1дС2 была в шесть раз выше по сравнению с подвергшимся рефолдингу 1дС2 без хаотропного агента и в три-четыре раза выше по сравнению с обычным контрольным 1дС2-антителом, которое было приготовлено без применения редокс-реагентов для воспроизведения рефолдинга белка. Согласно вышепредставленной заявке при использовании 1дС2 после рефолдинга будет возможно доставить более высокую эффективную дозу 1дС2 при меньшем количестве белка. Такое снижение общего количества белка, необходимого для получения биологически эффективной ответной реакции, будет преимущественным, поскольку снижение количества такого белка, которое необходимо ввести животному, будет приводить к меньшему развитию побочной реакции при введении, например, внутривенной или подкожной инъекцией.

Последующие примеры обеспечивают примерные варианты осуществления для достижения преимущественного рефолдинга молекул рекомбинантного 1дС.

Пример 1. Обсуждение рефолдинга белков.

Рефолдинг белков, продуцированных Е. сой. В недавнем обзоре Кийо1рй и коллег (Ыйе с1 а1., 1998; Кийо1рй аий Ыйе, 1996) были представлены преимущества рефолдинга белков, продуцированных Е. сой. Авторы подчеркивали, что укладка белков представляет собой один из наиболее сложных механизмов в процессе продукции белков и «и для каждого белка должны быть оптимизированы конкретные условия в отношении состава буфера, концентрации белка, температуры и так далее». Неправильное образование дисульфидных связей являются одной из проблем. Это означает «усилить корректировку неправильного образования дисульфидных связей в периплазме Е. Сой, означает привести к сверхэкспрессии эндогенного периплазматического белка ЭьЬС, который представляет собой дисульфидизомеразу. Другой путь

- 24 012162 заключается в культивировании в присутствии тиоловых реагентов, что приводит к перегруппировке неправильных дисульфидных связей, что как было показано приводит к повышению выхода нативных белков, содержащих множественные дисульфидные связи (С1оск8ЙиЬсг с! а1., УсгЬс^сгсшщ бег аикЬсШс Ье1 бсг кскгсйоп νοη йкиШШсгЬгисЫсп рго!сшсп [патент № 0510658 В1], 1992; ХУипбсгКсН с! а1., I. Вю1. Сйст., 268: 24547-24550, 1993). Цитировано несколько других патентов, касающихся рефолдинга белков (ЬШс с! а1., Сигг. Орт. Вю!ссй., 9: 497-501, 1998). Также было показано, что пропоследовательность облегчает укладку нескольких белков, включая человеческий фактор роста нервов (Ва!!спЬо11 с! а1., Еиг. I. Вюйст., 268: 3296-3303, 2001) из телец включения ЕксйспсЫа со11.

Промежуточные продукты укладки мышиных моноклональных 1§С-антител

Исследовали пути укладки мышиного антитела, относящегося к подклассу к/1дС1 (ЬШс с! а1., I. Мо1. Вю1., 248: 190-201, 1995Ь), включая укладку домена, ассоциацию посредством образования дисульфидных связей и пролил цис/транс-изомеризацию. В исследовании было установлено, что при ренатурации ЕаЬ укладка после ассоциации Ей и легкой цепи определяется пролилизомеризацией. Определяли по меньшей мере четыре промежуточных продукта укладки на стадии укладки легкой цепи и конфигурацию, по меньшей мере, пролил-пептидной связи. Остаток Рго 159 во Εά-фрагменте может быть ответственным за наблюдаемую медленную укладку, и может быть необходима четвертичная, но не третичная структура для облегчения изомеризации (ЬШс с! а1., I. Мо1. Вю1., 248: 190-201, 1995Ь). Для того же ЕаЬфрагмента антитела было установлено, что взаимодействия домен-домен являются лимитирующей скорость укладки стадией, таким образом приводя к накоплению промежуточных продуктов укладки на поздней стадии укладки (ЬШс с! а1., Рто!сш 8ск, 4: 917-924, 1995а). Ранее ЬШс с! а1. (ЬШс с! а1., Рто!сш 8ск, 2: 1490-1496, 1993) показали, что несколько пролилизомераз (РР1) ускоряли процесс рефолдинга ЕаЬ-фрагмента антитела и повышали выход правильно уложенных молекул в условиях ш νίΙΐΌ. Они функционировали в качестве катализаторов укладки белков, ускоряя ограниченную во времени изомеризацию пептидной связи Хаа-Рго (ЬШс с! а1., Рто!сш 8с1., 2: 1490-1496, 1993).

Альтернативная укладка мышиных моноклональных 1§С-антител

Была описана альтернативная укладка, которая отличается от нативных состояний, для моноклональных ЦС-антител с интактными дисульфидными связями (Висйпсг с! а1., ВюсйстЦ!гу, 30: 6922-6929, 1991; \Ус1Г1с с! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1431: 120-131, 1999). Согласно сообщениям, это конформационное состояние образуется при инкубации нативной или подвергшейся денатурации молекуле 1дС при кислых значениях рН (<3). Данное А-состояние характеризуется высокой степенью вторичной структуры, повышенной гидрофобностью, повышенной стабильностью к развертыванию под действием денатурирующих реагентов и нагревания и наличием третичной структуры (Висйпсг с! а1., Вюсйсшщ!гу, 30: 6922-6929, 1991). Было установлено (Висйпсг с! а1., I. Вю1. Сйст., 318: 829-836, 2002), что восстановленный ЕаЬ-фрагмент мышиного моноклонального антитела и его восстановленная легкая цепь образовывали специфическую, стабильную, но не нативную структуру при низком значении рН. Интересно, что явная стабильность альтернативной укладки восстановленной легкой цепи выше по сравнению с окисленной легкой цепью, на основании чего можно предположить, что дисульфидные связи внутри домена, которые являются решающими для обеспечения стабильности нативного состояния, приводят к дестабилизации альтернативной укладки (Висйпсг с! а1., I. Вю1. Сйст., 318: 829-836, 2002). Было установлено, что взаимодействия легкой и тяжелой цепей, стабилизированные внутрицепочечными дисульфидными связями в ЕаЬ-фрагменте, являются важными для образования альтернативной укладки (ЬШс с! а1., ЕЕВ8 Ьс!!., 362: 43-46, 1995). ^с1Г1с с! а1. установили, что снижение рН до 3,4-2,0 вызывало конформационные изменения и образование новой структуры, и на основании чего можно предположить, что десорбцию с колонок для аффинной хроматографии следует проводить при значении рН 3,5 или выше (^Ус1Пс с! а1., ВюсЫт. Вюрйук. Ас!а, 1431: 120-131, 1999).

Рефолдинг уложенных иммуноглобулиновых белков с использованием СийНС1 и Ь-аргинина

Обсуждалось влияние добавок, таких как СиНС1, глутатион, Ь-аргинин, на рефолдинг уложенных иммуноглобулиновых белков (ИтсЫи с! а1., I. Вю1. Сйст., 278: 8979-8987, 2003). Спонтанная укладка в присутствии 1 М СийНС1 приводила к образованию структуры, в которой достигалось правильное образование дисульфидных связей; однако, внесение Ь-аргинина приводило к образованию частично уложенного промежуточного продукта без дисульфидных связей (ИтсЫи с! а1., I. Вю1. Сйст., 278: 89798987, 2003).

Пример 2. Установление структурной гетерогенности человеческих моноклональных 1дС2-антител.

В нескольких работах опубликованы спектры рентгеновской кристаллографии человеческих 1дС1антител (8арЫтс с! а1., 8с1спсс, 293: 1155-1159, 2001; 8арЫтс с! а1., I. Мо1. Вю1., 319: 9-18, 2002). Например, 8арЫтс с! а1. (2001) представили спектр рентгеновской кристаллографии человеческого 1дС1 -Ь- 12антитела. Однако к настоящему времени отсутствуют данные по рентгеновской кристаллографии 1дС2антитела. В настоящем изобретении показано, что человеческие 1дС2-антитела обладают структурной гетерогенностью, и такая гетерогенность может быть причиной затруднений для получения данных по рентгеновской кристаллографии для ЦС2.

Данные обращенно-фазовой (ОФ) ВЭЖХ и катионообменной (СЕХ) ВЭЖХ показывали, что для всех исследованных 1дС2-антител характерно наличие многих пиков на ОФ- и СЕХ-хроматограммах, в

- 25 012162 то время как 1дС1-антитела выходят одним пиком. На фиг. 1 представлены ОФ-хроматограммы рекомбинантных человеческих антител с одинаковыми СОЯ в виде молекул 1дС1 и ХдС2. Аминокислотные последовательности имели 95% гомологию для данных двух молекул, но ОФ-хроматограммы различались и содержали много пиков для 1дС2 и один пик для 1дС1. На СЕХ-хроматограммах виден одинаковый характер пиков по сравнению с ОФ-хроматограммами (фиг. 2). После того, как собранные СЕХфракции повторно наносили на ОФ-колонку, то они элюировались вместе с ОФ-пиками целого образца 1дС2 (фиг. 2).

Использовали масс-спектрометр с высокой разрешающей способностью М1стота88/Аа1ег8 Ц-ТОЕ для получения масс-спектров пиков, разделенных ОФ-ВЭЖХ. На фиг. 3 представлены ОФхроматограммы 1дС2-антитела при детектировании по поглощению в УФ-свете и общему ионному току на масс-спектрометре. Из данных фигуры следует, что пик 1 давал более слабый ток по сравнению с другими пиками. Данные фиг. 3 показывают, что ионы 1дС2, элюирующие в виде пика 1, содержат максимальное число 53 протонов на поверхности иона, придавая иону 53 положительный заряд. Молекулярные ионы 1дС2 пика 1 имели примерно на 6 протонов меньше по сравнению с другими молекулами 1дС2, элюирущими в виде пиков 2, 3 и 4, что указывает на то, что пик 1 содержит молекулы 1дС2, которые уложены более компактно по сравнению с другими элюирущими молекулами данного образца. Меньший заряд на поверхности ионов пика 1 также дает меньший сигнал Т1С (фиг. 3А). С другой стороны, развернутые масс-спектры с использованием электрораспылительной ионизации показывают, что все изоформы 1дС2, разделенные ОФ-ВЭЖХ, имели одинаковые значения молекулярной массы (ММ) в пределах точности определения массы ±2 Да. Данный факт устраняет возможность большей части сообщений о структурных модификациях 1дС2-антител. После восстановления и алкилирования ОФ-хроматография 1дС1- и 1дС2-антител дает узкие пики для легкой и тяжелой цепей без наличия гетерогенности. Тот факт, что восстановление устраняет гетерогенность, указывает, что она связана с наличием дисульфидных связей.

Подклассы 1дС1- и 1дС2-антител различаются по структуре шарнирной области, которая включает две дисульфидные связи между цепями в 1дС1 и четыре в 1дС2 (фиг. 4 и 43). На основании результатов вышепредставленных опытов можно высказать обоснованное предположение, что множественные изоформы 1дС2 состоят из молекул с различным расположением дисульфидных связей в шарнирной области.

При анализе представленных выше результатов заявители пришли к выводу о том, что молекулы 1дС2 имеют несколько структурных вариантов, которые различаются по дисульфидным связям в шарнирной области. На фиг. 4, взятой из КиЬу, Сйар1ет 4 11гапипод1оЬи11П8: §1гис1иге апб Еипсйоп, 2002, представлены все четыре подкласса 1дС-антител в их обычной конфигурации. В действительности в результате исследований, проведенных Аа1Ьет§е и §сйиигтап (Аа1Ьет§е е! а1., 1ттипо1оду, 105: 9-19, 2002), было установлено, что в предпочтительной конфигурации 1дС4 СН1-области взаимодействуют с СН2доменами данного антитела (фиг. 5). На фиг. 4 показано, что структуры 1дС4 очень схожи, включая четыре дисульфидных связи в шарнирной области. Имеются различия в аминокислотной последовательности шарнирной области, так что в результате не предполагается, что конфигурации 1дС2 и 1дС4 являются одинаковыми, но могут иметь аналогии и, возможно, укладываются, как 1дС4-антитело на фиг. 5.

В другом исследовании, проведенном РЫШрк е! а1. (РЫШрк е! а1., Мо1. 1ттип., 31: 1201-1210, 1994) с использованием электронной микроскопии и анализа осаждения, было получено распределение форм 1дС2 по сравнению с другими тремя подклассами антител. Авторы данного исследования наблюдали «распределение комплексов, которые существенно отличались от других подклассов. Наблюдали наличие циклических димеров, некоторого количества линейных димеров и большого количества мономеров. Эти факты интерпретировали в отношении энергетического барьера для смыкания кольца в результате ориентации ЕаЬ-плеч в 1дС2, что, возможно, приводит к образованию линейных димеров в виде преобладающего комплекса, обнаруженного при аналитическом ультрацентрифугировании». Данные по осаждению (фиг. 6) показывают наличие частично разделенных многих пиков, дополнительно указывая на то, что молекулы 1дС2 в структурном отношении являются гетерогенными (РЫШрк е! а1., Мо1. 1ташап., 31: 1201-1210, 1994). В другой работе Сгедогу е! а1. (Сгедогу е! а1., Мо1. 1ттип., 24: 821-829, 1987) описано применение осаждения и анализа рассеивания рентгеновских лучей с небольшим углом подклассов 1дС. Согласно данным авторов «предполагается, что 1дС1 имеет длину шарнирного участка 0-15 А и некопланарные ЕаЬ-плечи; 1дС2 эффективно стабилизируется уложенными назад ЕаЬ-плечами». На основании двух цитированных выше работ (Сгедогу е! а1., Мо1. 1ттип., 24: 821-829, 1987: РЫШрв е! а1., Мо1. 1ттип., 31: 1201-1210, 1994) можно предположить, что 1дС2 может иметь несколько конформационных состояний, включая конфигурацию с уложенными назад ЕаЬ-плечами. На фиг. 7 приведено несколько структур 1дС2-антитела, предложенных авторами настоящей работы. Также на фиг. 7 представлена единственная опубликованная структура 1дС1-антитела, полученная на основе данных рентгеновской кристаллографии.

Пример 3. Рефолдинг 1дС2-антител в присутствии редокс-реагентов приводит к снижению структурной гетерогенности 1дС2 и повышает его активность.

Результаты исследований, описанных выше, привели к возникновению идеи о рефолдинге 1дС2

- 26 012162 антитела для проверки его активности. Рефолдинг проводили при инкубации антитела в буфере, содержащем смесь цистеин/цистин, при рН 8, 4°С в течение 72 ч.

Предпочтительной редокс-сопряженной системой, используемой здесь, является смесь цистеин/цистин в качестве связующих окислительно-восстановительных реагентов. Исходное вещество представляло собой очищенный препарат ЦСЗ-антитела. Буферами были 0,1 М цитрат или 0,2 Трис при рН 8,5. Концентрация белка ΙβΟ2 в реакционной смеси варьировала в пределах от 0,5 мг/мл до 10 мг/мл. В предпочтительных примерах концентрация составляла от 2,5 мг/мл до 3 мг/мл.

Применяли редокс-сопряжающую систему Ь-цистеина (в концентрации от 0 до 50 мМ) и способ оценивали в присутствии или отсутствии равных количеств Ь-цистеина и в присутствии или отсутствии 1 мМ ЭДТА. Температура при инкубации равнялась 4°С, 15°С и 22°С в течение 6, 18 и 48 ч. Обработанные препараты рекомбинантного белка охарактеризовывали ОФ-ВЭЖХ, как описано в примерах выше, и в описании к фиг. 1-15 у ИШоп е1 а1., предварительная заявка на патент США 60/621295 и РСТ/И805/001840.

Было установлено, что рефолдинг быстро происходит, когда редокс-система содержит примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистеина и примерно от 0,1 мМ до примерно 10 мМ цистина. Смесь цистеин/цистин может находиться, но это не требуется, в соотношении концентраций 1:1.

Кроме того, протокол включал 0,9 М СпйНС1 в буфере для незначительного развертывания (релаксации) структуры во время рефолдинга/окисления. На фиг. 8 приведены результаты двух опытов по рефолдингу. Результаты указывают, что два подвергшихся рефолдингу образца Iд^2-антитела имеют гомогенную структуру и элюируют вместе в виде пиков 1 и 3 на ОФ-хроматограммах элюирования.

Еще одной редокс-сопряжающей системой, которую можно использовать, является таковая, в которой восстановленный глутатион и окисленный глутатин (СЗН/СЗЗС в соотношении 10:1) вносят в различных концентрациях от 0,1 до 5 мМ СЗН. Можно оценить влияние рН и температуры при инкубации в присутствии данного реагента редокс-сопряжения. Значение рН может находиться в пределах от 5 до 9. Температура при инкубации может составлять 4, 22 или 31°С. В других вариантах осуществления варьировала температура, при которой ΙβΟ2 инкубировали в редокс-сопряжающей системе СЗН/СЗЗС. Рефолдинг был более эффективным при 4°С по сравнению с комнатной температурой (фиг. 52).

Биологическая активность подвергшегося рефолдингу ΙβΟ2 в присутствии 0,89 М гуанидингидрохлорида была в шесть раз выше по сравнению с подвергшимся рефолдингу ΙβΟ2 без гуанидингидрохлорида и в три-четыре раза выше по сравнению с контрольным; ЦСЗ-антителом, которое получали без использования редокс-реагентов в целях воспроизведения рефолдинга белка (фиг. 47).

Способы рефолдинга можно осуществлять с г и кг продуцированного клетками СНО контрольного ΙβΟ2 с существенным повышением концентрации активной формы ΙβΟ2 на г вещества и снижением концентраций белка в растворе композиции. Таким образом, процессинг белка гуанидингидрохлоридом дополнительно будет повышать выход биологически активного белка. Результаты ОФ-ВЭЖХ/МС, описанные здесь, показывают, что все ЦСЗ-антитела содержат множественные формы и их можно модифицировать по предложенному способу рефолдинга.

С использованием подвергшегося рефолдингу ΙβΟ2 будет возможным вводить более высокую эффективную дозу ΙβΟ2 при меньшем количестве белка. Такое снижение общего количества белка, которое необходимо для воспроизведения биологически эффективной ответной реакции, будет преимущественным, поскольку уменьшение количества такого белка, которое необходимо ввести животному, вероятно, будет в меньшей степени приводить к развитию побочной реакции при введении, например, внутривенной или подкожной инъекцией. Способы согласно изобретению преимущественно позволят получать гомогенные препараты Ι§02, которые во многих случаях представляют преимущественный тип фармацевтических средств на основе антител по сравнению с Ι§01, поскольку имеется больший риск, связанный с высокой комплемент-связывающей активностью ΙβΟ1 по сравнению с Ι§02.

Несмотря на то, что в примерных протоколах с использованием редокс-реагентов, описанных выше, обработке подвергается очищенный препарат продуцированного рекомбинантным путем Ι§02, предусматривается, что ΙβΟ2 может быть получен в присутствии такой редокс-сопряжающей системы, где реагенты добавляют в среду клеточных культур, в которой продуцируется белок. Альтернативно редоксреагенты можно вносить после очистки белка. Кроме того, несмотря на то, что примеры, приведенные здесь, относятся к исследованию гетерогенности Ι§02, предусматривается, что способы можно легко адаптировать и использовать для любого рекомбинантного белка, который подвергается посттрансляционному рефолдингу и проявляет гетерогенность за счет присутствия дисульфидных связей, доступных для восстановления. Способы, описанные здесь, могут быть особенно пригодными для получения других Ι§0, например, таких как ΙβΟ3- и Iд^4-антитела, которые могут проявлять гетерогенность.

Пример 4. Дополнительные исследования по получению и характеристике конформационных изоформ человеческих моноклональных

Человеческие терапевтические белки, продуцированные клетками микроорганизмов, часто бывают неправильно уложены и накапливаются в виде нерастворимых телец включения. Белок затем требуется подвергнуть рефолдингу с использованием хаотропных агентов в условиях восстановления/окисления для получения биологической активности. До недавнего времени полагали, что продукция человеческих

- 27 012162 терапевтических белков клетками млекопитающих обеспечивает получение продукта, имеющего правильную укладку и посттрансляционные модификации. В настоящем примере установлено четыре структурных варианта 1дС2-антитела против 1Ь-1В и несколько других 1дС2-антител. Данные вновь охарактеризованные структурные варианты являются уникальными для подкласса 1дС2 (для рекомбинантных и нативных 1дС2), которые не встречаются для 1дС1 и 1дС4. На основе этих фактов можно предположить, что подкласс 1дС2 человеческих иммуноглобулинов можно дополнительно подразделить на подклассы с учетом представлений о конформационных вариантах.

Материалы и методы

Последующие материалы и методы являются примерными методами, использованными в настоящем примере. В других примерах использовали аналогичные такие методы, как конкретно указано в этих примерах. Очевидно, понятно, что данные примерные методы можно легко модифицировать для применения при анализе других 1дС в контексте настоящего изобретения.

1дС2-антитела против 1Ь-1В и другие человеческие моноклональные 1дС-антитела, использованные в данном опыте, экспрессировали рекомбинантным путем и очищали с использованием стандартной методики получения. 1дС2-каппа из человеческих миеломных клеток из плазмы получали от 81дта, #15404.

Проведение рефолдинга:

в другом конкретном примере способа рефолдинга, использованного в настоящем изобретении, человеческое моноклональное 1дС2-антитело против 1Ь-1В инкубировали в концентрации 3 мг/мл или 10 мг/мл в двух буферах 1) 200 мМ Трис буфер при рН 8,0 (нативный рефолдинг); 2) 200 мМ Трис буфер при рН 8,0 с 0,9 М СиНС1 (рефолдинг под действием СиНС1). Комбинацию цистеин:цистин добавляли в молярном соотношении соответственно 6 мМ : 1 мМ (3 мг/мл) и 10 мМ :1 мМ (10 мг/мл). Точную концентрацию цистина не определяли ввиду слабой растворимости цистина, однако, цистин обеспечивался по массе в соотношении, указанном выше. Образцы выдерживали при 2-8°С в течение 48 ч. Другие испытанные условия рефолдинга включали применение аргинина и мочевины в качестве хаотропного агента, другие соотношения цистеин:цистин и применение цистамина вместо цистина, пределы концентраций СиНС1 0-2 М и многие значения температуры во время проведения редокс-процесса.

Анализ интактного антитела катионообменной хроматографией:

белки наносили на слабую катионообменную колонку Оюпех \УС.'Х10 в условиях функционирования со скоростью потока 0,80 мл/мин и 25°С. Использовали градиентное элюирование при повышении концентрации растворителя В и соответственно снижении растворителя в подвижной фазе. Растворитель А представлял 20 мМ ацетата натрия при рН 5,0, растворитель В включал 20 мМ ацетата натрия, 0,5 М №101 при рН 5,0.

Анализ интактного антитела и фрагментов антитела обращенно-фазовой ЖХ/МС:

белки наносили на колонку С8 ΖοΛηχ 3008В, работающую при 75°С. В оптимизированном методе использовали подвижную фазу, состоящую из смеси изопропилового спирта и ацетонитрила с 0,1% ТФУ. Система для капиллярной ВЭЖХ ЛД1еп1 1100 была соединена с масс-спектрометром \Уа1ег5 0То(Мюто, снабженном источником электрораспылительной ионизации (Ε8Ι). Масс-спектрометр Ε8Ι-ΟТОЕ был установлен в режиме положительных ионов с капиллярным напряжением, равным 3400 V, напряжением на воронке для образца 70-100 V, пределах т/ζ 1000-5000 и разрешении массы 5000. Прибор был настроен и откалиброван с использованием множественно заряженных ионов бычьего трипсиногена, 23981,0, 8Дта Т1143. Развертку Е81-масс-спектров проводили с использованием алгоритма МахЕпИ программного обеспечения МаккЬупх производства \Уа1ег5.

Ограниченный протеолиз с использованием пепсина:

расщепление человеческого 1дС2 проводили методом, аналогичным описанному (Титпет апб Вепшсй, 1968, Вюсйет. I., ν.107, 171-178), но при более низком значении рН и в течение более короткого периода времени. 1дС2-антитело против 1Ь-1В и несколько других 1дС2-антител подвергали ограниченному протеолизу с использованием пепсина в течение 1 ч при рН 2,5 в 100 мМ аммонийно-ацетатном буфере, рН 2,5 при комнатной температуре с одним добавлением пепсина. Расщепление проводили без денатурации при соотношении фермента к белку (мас./мас.), равном 1:50.

Восстановление, окисление и расщепление трипсином:

восстановление и алкилирование проводили с использованием 1дС в денатурирующих условиях с получением свободной тяжелой и легкой цепей для проведения дальнейшей аналитической характеристики. Антитело разводили до концентрации 2 мг/мл 7,5 М гуанидингидрохлоридом (МаШпсктоб(, #7716), 0,1 М Трис-НС1 (Е1ика), 1 мМ этилендиаминтетрауксусной кислотой (ЭДТА, 81дта #6281-92-6), рН 7,5 до объема 0,5 мл. Вносили 5 мкл 0,5 М маточного раствора дитиотреитола (ОТТ, производства 81дта Ό5545) с получением концентрации 5 мМ ОТТ и реакционную смесь помещали при 37°С на 30 мин. Затем раствор белка охлаждали до комнатной температуры и добавляли 13 мкл 0,5 М маточного раствора йодацетата (1АМ, 81дта #11149) для получения концентрации 1АМ, равной 13 мМ. Алкилирование проводили при комнатной температуре в течение 40 мин в темноте. 0,5 мл от объема восстановленного и алкилированного вещества заменяли на 1 мл 10 мМ раствора ацетата натрия (ТГ ВАКЕР, РйбНркЬитд, N1, # 9526-03) рН 5,0 до конечной концентрации 1 мг/мл белка. Обмен буфера проводили с использованием колонки для гель-фильтрования НАР-5, упакованной 8ерйабех С-26 (Рйагтас1а Вю(есй).

- 28 012162

Расщепление трипсином градации для секвенирования проводили с использованием восстановленного и алкилированного ΙβΟ из предыдущего раздела. Лиофилизованный трипсин (\Уог11ипдЮп #3744) суспендировали в воде до конечной концентрации 0,50 мг/мл. Восстанавливающий буфер заменяли на буфер для расщепления, включающий 0,1 М Трис, 1 М мочевины, 20 мМ гидроксиламина (81дта #Н9876), рН 7,5. 1 М мочевины и 20 мМ гидроксиламина добавляли соответственно для повышения растворимости легкой и тяжелой цепей и для защиты белка от карбамилирования (Сойсп. 1968, Апп. Ве\зе\у Вюе11ст..у.37. рр.695-726). Расщепление трипсином проводили в течение ночи (15 ч) при 37°С с использованием соотношения фермент:белок, равного 1:50. Расщепление гасили добавлением небольшого количества 20% муравьиной кислоты до конечной концентрации муравьиной кислоты 0,2%. Перевар помещали в автосамплер при 4°С для анализа ОФ-ЖХ/МС или замораживали для последующего анализа. Меньшие количества антитела восстанавливали, алкилировали и расщепляли с использованием аналогичного метода в меньших объемах с теми же молярными соотношениями компонентов.

ВЭЖХ подвергшихся расщеплению трипсином пептидов:

подвергшиеся расщеплению трипсином пептиды разделяли обращенно-фазовой ВЭЖХ на хроматографе для ВЭЖХ АдПеп! 1100, снабженном УФ-детектором, автосамплером, микропроточной ячейкой и колонкой с контролируемой температурой. Для разделения пептидов использовали колонку Ро1ап8 Εί^Γ, 250x2 мм, с размером частиц 3 мкм, С18 смола с размером пор 300 А (Уапап, Тоггапсе, СА, И8А). Растворителями были: А=0,1% трифторуксусной кислоты в воде и В=90:9,015:0,085 АС№вода:ТФУ. Методику проводили следующим образом. Подвергшиеся обработке трипсином пептиды вводили в колонку для ОФ-ВЭЖХ, которую затем уравновешивали 100% А. В течение 205 мин шел линейный градиент 050% В. Колонку элюировали со скоростью подвижной фазы 200 мкл/мин и температуру поддерживали при 50°С. В целом на колонку было нанесено 20 мкг общего перевара белка для анализа массспектрометрией. Элюат с колонки анализировали с использованием УФ-детектора и затем направляли на ионозахватывающий масс-спектрометр.

Ионозахватывающая масс-спектрометрия:

использовали ионозахватывающий масс-спектрометр ТПегто Иптдап ЬСЦ ΩΕίΑ в комбинации с системой для ВЭЖХ для идентификации продуктов расщепления. Массы пептидов и их фрагментов получали с использованием метода «тройной игры», включающего полный скан, затем зум-скан и МС/МС. Использовали стандартный осевой источник электрораспылительной ионизации в виде поверхности раздела атмосфера-вакуум. Аппарат настраивали с использованием дважды заряженных ионов синтетического пептида (т/ζ 842). Для идентификации пептидов использовали алгоритм программного обеспечения Тегто Иптдап Вю\Уог1<5 3.1 и программное обеспечение Ма§8 Апа^ег.

Тест связывания:

покрытые биотином флуоресцентные микросферы (шарики Веаб1у!е (ир§1а!е Вю!есЬпо1оду 1пс.)) покрывали гибридным белком авидин-1Ь-1В. Шарики промывали для удаления несвязанного белка и аликвотные порции вносили в 96-луночный планшет с дном-фильтром (М1Шроге Согр.). Затем к микросферам добавляли оттитрованные количества тестируемых антител (в разведении от 1 нМ до 61 фкМ). Связывание антител с захваченным микросферами гибридным белком авидин-1Ь-1В детектировали с использованием козьего античеловеческого, конъюгированного с рФикоэритрином (ЕаЬ')2 (8ои111егп Вю1ес11по1оду). Реакции связывания анализировали с использованием прибора Ьиттех 100 (Ьиттех Согр.). Количество антитела, связавшегося со связанным с микросферами белком, было пропорционально среднему значению интенсивности флуоресценции (ΜΕΙ) по данным прибора. Кривые связывания и соответствующие значения ЕС50 (концентрация антитела, генерирующая половинный от максимального ответ) рассчитывали с помощью программного обеспечения ΡΒΙ8Μ™.

Биологическая активность (тест на хондроцитах):

готовили серийные разведения ЦСЗ-антитела против ГЬ-1В, рефолдинг 1-формы 1 и рефолдинг 2формы 3 в пределах от 40 нМ до 0,0256 пкМ средой для теста. 50 мкл разведенных тестируемых антител вносили в лунки 96-луночного планшета с высеянными человеческими хондроцитами при титре 10000 клеток/лунку в объеме 100 мкл. Конечная концентрация антител составляла от 10 нМ до 0,0064 пкМ. После 30 мин инкубации вносили 50 мкл рекомбинантного человеческого ГЬ-1В до конечной концентрации 10 пкМ. После инкубации в течение ночи определяли активность антител с использованием ΕΕΙ8Λ с Ш-6 и ΜΜΡ-13. Инкубирование продукции Ш-6 и ММР-13 рассчитывали в виде процента от максимальной активности ΙΕ-1-бета. Строили кривые зависимости ингибирования ответа для каждого тестируемого антитела и определяли соответствующие значения Ιί.\₀ (концентрацию антитела, которая приводит к уменьшению сигнала на 50%) с использованием программного обеспечения СгарП Раб ΡΒI8ΜАа.

Биологическая активность (антителоопосредованный лизис):

для теста антителоопосредованного лизиса клеток антитело добавляли к цельной крови (1 мг/мл), инкубировали в течение 48 ч (37°С, 5% СО₂), проводили клеточный сортинг с возбуждением флуоресценции (ЕАС8) (метка Т/В-клеток и лизис эритроцитов) и затем анализировали. Истощение В/Т-клеток определяли проточной цитометрией.

- 29 012162

Результаты

Результаты катионообменной (СЕХ) и обращенно-фазовой (ОФ) хроматографии 1дС2-антитела против 1Ь-1К. указывали на наличие структурной гетерогенности 1дС2 (фиг. 1 и 2 А), хотя структура антитела оценивалась двумя методиками в очень разных условиях.

Антитело находилось в нативном конформационном состоянии (характеризующемся противоположными по направлению бета-складками) в подвижной фазе при СЕХ, которая по своему составу близка к физиологическим условиям по значению рН, температуре и концентрации соли. С другой стороны, антитело находилось в расплавленном глобулярном состоянии (ΒιιοΙιικγ е! а1., 1991, Β^οскет^8ί^у, ν.30, рр.6922-6929; Р!1!§уп е! а1., 1990, ΕΕΒ8 Ье!!., ν.262, рр.20-24; Ки\уарта. 1989, Рго!ет§, ν.6, рр.87-103), когда элюировалось с обращенно-фазовой колонки с высоким процентом изопропанола в 0,1% водном растворе ТФУ (рН 2) при 75°С. Данные кругового дихроизма в дальнем УФ-свете указывают, что бетаскладки нативного глобулина превращались в спиральные и произвольно закрученные расплавленные структуры в данных условиях ОФ-хроматографии. На основании того факта, что нативная и расплавленная структуры, элюированные с СЕХ- и ОФ-колонок, имеют одинаковые хроматограммы, можно предположить, что конформационные изоформы имеют различные ковалентные структуры, которые сохраняют различие в нативном и расплавленном состоянии. Для исследования корреляции пиков, разделенных при использовании двух различных методов, собирали четыре фракции, полученные при СЕХ, и наносили на ОФ-колонку (фракции при СЕХ 1, 2, 3 и 4). Повторное введение СЕХ-фракций 1, 2, 3 и 4 привело к совместному элюированию пиков 1, 2, 3 и 4 при ОФ-ВЭЖХ, указывая, что имеется корреляция между относительным количеством и порядком элюирования пиков (фиг. 2В). В результате данного опыта также было получено дополнительное доказательство того, что ОФ-хроматография сама по себе не является источником расщепления пиков, а в большей степени представляет иной пригодный аналитический инструмент для детектирования ковалентных вариантов.

Человеческое моноклональное 1дС2-антитело против 1Ь-1К. клонировали и экспрессировали в виде 1дС1. Подтип 1дС1 имеет более чем 96% гомологию последовательности с 1дС2. Анализировали СЕХ и ОФ-ВЭЖХ человеческое 1дС1-шАЬ против [И-1К с использованием аналогичных методов, как описано ранее. Анализ 1дС1 с помощью СЕХ и ОФ-ВЭЖХ давал хроматограммы, на которых имелся один гомогенный пик. 1дС1-антитело элюирует примерно в то же время, что и форма 3 (при ОФ-ВЭЖХ пик 3) 1дС2-антитела (фиг. 1).

С использованием ΕδΙ-ортогонального-ТОЕ масс-спектрометра, описанного в экспериментальном разделе, соединенного с системой ОФ-ВЭЖХ, было установлено, что четыре изоформы 1дС2 имеют одинаковые значения молекулярной массы в пределах ошибки определения на приборе, равной ±2 Да (фиг. 45). Это элиминировало различия гликозилирования, варианты лизина и другие химические модификации, характерные для деградации, связанные со значительным изменением массы как причины гетерогенности. Несмотря на то, что развернутые Ε8Ι масс-спектры изоформ показали одинаковые значения молекулярной массы, изоформы несли различное количество положительных зарядов (протонов) на их поверхности. Проводили ОФ-хроматографию интактного антитела при детектировании в УФ-свете при 215 нм и определение общего ионного тока (Т1С) (фиг. 3А). Также получали Ε8Ι масс-спектры, содержащие множественные заряженные ионы интактных антител, для четырех разделенных изоформ. Эти данные показывали, что элюирующие позднее формы несли большее количество положительных зарядов (фиг. 3В). Это обстоятельство указывает на то, что данные варианты обладают большей площадью поверхности и, возможно, лучшей доступностью остатков основных аминокислот для протонов (С1ю\\'йкиггу апй Скак, 1991, Апа1. Скет., ν.63, рр.1660-1664; ИоЬо апй КаНакком, 2001, Апа1. Скет., ν.73, рр.4763-4773; Еепп, 1993, I. Ат. 8ос. Ма§8 8рес1гот. , ν.4, рр. 524-535). Когда данные формы элюировали с ОФ-колонки, то форма 3 имела большую площадь поверхности с большим числом зарядов, в то время как форма 1 имела меньшую площадь поверхности и более «уложенную» структуру. Тот факт, что форма 3 имела большее число зарядов по сравнению с формой 1, также был подтвержден в опытах, которые показывали, что форма 3 также обеспечивает более высокий общий ионный ток (Т1С), но меньшее поглощение в УФ-свете по сравнению с формой 1. Это означает, что форма 3 несет большее количество зарядов по сравнению с формой 1. Увеличение концентрации растворителя В во время получения пика при элюировании пика составляет менее 0,5%. Следовательно, изменение органического растворителя для электрораспыления является незначительным и не должно привести к сдвигу пиков т/ζ. Проводили контрольный опыт с использованием (структурно гомогенного) 1дС1-антитела для получения дополнительных доказательств того, что различие в заряде не индуцировано минорным изменением процента органического растворителя в элюирующей подвижной системе.

После восстановления и алкилирования гетерогенность исчезла и на ОФ-хроматограммах 1дС2антитела с восстановленными дисульфидными связями имел место только один узкий пик легкой цепи и один узкий пик тяжелой цепи (фиг. 46). Данные факты вновь указывают на то, что открытые варианты 1дС2-антитела имеют различную связь через дисульфиды или открытые дисульфидные связи. Открытый дисульфид представлял возможность, поскольку одна открытая дисульфидная связь будет увеличивать массу на 2 Да, что находится в пределах ошибки определения массы для интактного антитела с молекулярной массой 150 кДа. Структурные варианты, возникающие за счет дисульфидных связей, имеют другие ковалентные структуры, которые можно разделить как при СЕХ в нативных условиях, так и при ОФ

- 30 012162 хроматографии в денатурирующих условиях.

Сравнивали обращенно-фазовые хроматограммы нескольких 1дС2-и 1дС1-антител, использованных в данном исследовании. Несмотря на то, что 1дС1-антитела элюировались в виде одного пика, все 1дС2антитела, включая миеломные 1дС2-антитела из человеческой плазмы и сыворотки крови, разделялись на множественные варианты в тех же хроматографических условиях (фиг. 44). На основании этого результата можно предположить, что гетерогенность представляет собой признак для целого подкласса 1дС2 молекул гамма-иммуноглобулинов, включая молекулы 1дС2 из человеческой сыворотки.

В тяжелых цепях 1дС2 СН1-пептид РЬАРС8Я идентифицировали в виде части остатков 127-133 (ЕЙ), образующих связь между легкой и тяжелой цепями, и остаток С131 из данного пептида был соединен с легкой цепью. Аналогичный пептид РЬАР81318Ь занимает положение от остатка 127 до 133 (ЕЙ) в тяжелой цепи человеческого 1дС1.

Несмотря на то, что отсутствуют публикации по кристаллическим структурам 1дС2-антител, на основании тесной гомологии между первичными последовательностями 1дС1- и 1дС2-антител можно предположить, что положение 8131 в тяжелой цепи 1дС1 можно использовать для приближения к положению С131 тяжелой цепи 1дС2 по отношению к остаткам цистеина 214 легкой цепи и 226 и 229 (шарнирная область) тяжелой цепи. Во фрагменте кристаллической структуры человеческого 1дС1-антитела около шарнирной области, взятой из банка данных по белкам К.С8В под номером для доступа 1ΗΖΝ (8арЫге е! а1., 2002, 1. Μοί. ΒίοΙ., ν.319, рр.9-18), положение серина 8131 использовали в качестве примерной локализации цистеина С131 в человеческом ЦС2 (фиг. 49). Кристаллическая структура не показывает данные три остатка, ЬС С214, НС 8131, НС С226, которые находятся в тесной близости друг к другу (в пределах 6А). Данная близость может позволить им образовать несколько ковалентных структурных вариантов с различной структурой дисульфидных связей в шарнирной области.

Заявители получили обширные данные для того, чтобы показать, что можно повысить содержание различных структурных форм обработкой раствора 1дС2 редокс-реагентами (цистеин/цистин) в присутствии и отсутствии хаотропного агента (СиНС1). Рабочая гипотеза заключалась в том, что хаотропный агент в относительно небольшом количестве может несущественно нарушить структуру и расположение остатков цистеина в шарнирной области в пользу одной из форм. Для проверки данной гипотезы несколько аликвотных образцов 1дС2-антитела обрабатывали смесью цистеина и цистина согласно протоколу, описанному в экспериментальном разделе. Количество добавленного СиНС1 варьировало от 0 М до 1,4 М. Выход рефолдинга оценивали обращенно-фазовой хроматографией (фиг. 50), которая показывала, что форма 1 и форма 3 находятся в предпочтительном количестве в течение 48 ч. При сравнении обращенно-фазовых хроматограмм исходного (не обработанного) гуманизированного 1дС2-антигела, продуцированного клетками млекопитающих (СНО), антитела, подвергшегося рефолдингу без участия какоголибо количества СиНС1 и антитела после рефолдинга под действием 1,0 М СиНС1, было установлено, что формы 1 было больше при отсутствии СиНС1. Внесение хаотропного агента способствовало накоплению формы 3. Увеличение содержания формы 3 проходило быстрее в присутствии 1,0 М СиНС1. Аналогичные результаты получали с рефолдингом других 1дС2-антител. Также оценивали действие аргинина НС1 в качестве денатурирующего вещества и результаты представлены на фигуре (фиг. 51). Было установлено, что аргинин-НС1 является слабым хаотропным агентом по сравнению с СиНС1.

Несмотря на то, что результаты теста связывания и образования «мостиков» не показывали существенных различий между необработанными и подвергшимися рефолдингу веществами, данные биологических тестов указывали, что изоформы проявляли иную биологическую активность. Биологические тесты повторяли в течение нескольких суток с 1Ь-6 и ММР-13 с воспроизводимыми результатами (фиг. 47). Форма 3 в среднем была в 3,5 раза активнее по сравнению с необработанным контролем, в то время как форма 1 составляла только часть (0,7) от биологической активности необработанного вещества. Следовательно, форма 3 была в семь раз активнее формы 1. Согласно данным обращенно-фазовой хроматографии, несмотря на то, что рефолдинг без участия СиНС1 приводил к существенному увеличению содержания формы 1, в образце оставались небольшие количества формы 2 и 3.

Подвергшееся рефолдингу вещество также тестировали на различия в физических свойствах с использованием О8С. СО и флуоресценции. Наиболее существенное различие между формами было установлено с использованием И8С, когда форма 3 имела только одно значение Т_пл. при более высокой температуре по сравнению с контролем и формой 1.

Пример 4. Демонстрация того, что 1дС1, иммунореактивный на 1Ь-15, содержит остатки свободного цистеина в тяжелой цепи, которая частично цистеинилирована.

Целью данного примера была характеристика человеческого моноклонального 1дС1-антитела, которое является иммунореактивным к 1Ь-15, в частности, антитела 146В7. 1дС1-антитело 146В7 охарактеризовывали с использованием анализа обращенно-фазовой ЖХ/МС как в виде интактного антитела, так и после ограниченного протеолиза с участием Ьук-С-протеазы. Данный ЦС2 имеет остаток свободного цистеина в положении 104 (С104) СИК3-области тяжелой цепи. Идентифицировали несколько модификаций при наиболее примечательной, заключающейся в цистеинилировании ЕаЬ-фрагмента (+119 Да), возможно в положении С104. Примерно 60% ЕаЬ-фрагментов было цистеинилировано. Кроме того, наблюдали вариансу С-концевого лизина, вызванную расщеплением концевого остатка лизина. Данный

- 31 012162 тип вариансы является типичным для продуцированных гибридомами молекул [дС. Примерно 70% образца [дС1 не содержало лизин в каждой из тяжелых цепей, 20% имело лизин в одной из тяжелых цепей, и 10% включало лизин в обеих тяжелых цепях. Также отмечали значительное окисление (примерно 10%) в ЕаЬ-области, возможно, в одном из остатков метионина в СЭР-области. Не обнаруживали значительных количеств ковалентных димеров даже в образцах, подвергшихся стрессу. В остаток С104 с трудом вводилась метка 1АА, что указывает на то, что свободный цистеин 104 не был легко доступен.

Исследуемое [дССантит-ело имеет свободный цистеин в положении 104 СОР3-области тяжелой цепи. Данный свободный цистеин может быть источником ковалентной димеризации и приводить к проблемам со стабильностью во время формуляции или хранения. Целью настоящего примера было установление редокс-статуса и оценка доступности свободного цистеина для алкилирующего агента, такого как 1АА, идентификация возможных ковалентных димеров в образцах, подвергшихся тепловому стрессу, и характеристика известных посттрансляционных модификаций, таких как варианса лизина, варианса гликоформы (С0, С1, С2) и других возможных модификаций.

Анализ интактного 1цС1 обращенно-фазовой ЖХ-МС

ОФ-хроматограмма 1дС1, представленная на фиг. 9, аналогична таковой для других молекул 1дС1. Основной пик (ПИК 3) соответствует молекуле 1дС. Имеется расщепление пика в верхней части пика 3, которое можно отнести за счет гетерогенности, установленной в данном исследовании. Можно также наблюдать два других минорных пика (пики 1 и 2) на хроматограмме. При использовании точных определений массы авторы идентифицировали два эти пика, как соответствующие фрагменту легкой цепи, Е1-С93^94, и цистеинилированной форме легкой цепи. В других молекулах 1дС можно наблюдать небольшие количества свободной легкой цепи.

Свободная легкая цепь (пик 2 на фиг. 8), обнаруженная в 1дС2, находится в цистеинилированной форме. Цистеинилирование имеет место по свободному остатку С214 легкой цепи. Данный остаток участвует в образовании дисульфидной связи между легкой и тяжелой цепью. Следовательно, цистеинилирование С214 предупреждает ассоциацию легкой и тяжелой цепей. Однако в других молекулах также обнаруживали небольшие количества нецистеинилированной легкой цепи. Концентрации примесей в легкой цепи в данном образце антитела можно легко определить описанным методом ОФ-ЖХ/МС. Цистеинилирование обнаружено в физиологических белках, которые содержат свободный цистеин. В рекомбинантные антитела оно вводится во время стадии получения, возможно, в результате добавления цистеина, вместе с некоторыми другими аминокислотами для питания клеток СНО. Различная степень цистеинилирования в свободной легкой цепи в различных рекомбинантных антителах указывает, что некоторые параметры получения оказывают влияние на степень цистеинилирования. О данном наблюдении можно упомянуть для понимания роли цистеинилирования остатка С104 в тяжелой цепи 1дС1.

На фиг. 10 представлен развернутый масс-спектр основного пика. Как правило, в молекулах [дС1 наблюдают несколько галатозных вариантов (С0, С1 и С2), наличие которых вызвано потерей 1 или обоих остатков галактозы из биантенарного сахара. Данные варианты можно идентифицировать по характерному различию в массе, равному 162 Да, соответствующему молекулярной массе галактозы. Из фиг. 10 можно увидеть, что данную типичную хроматограмму не наблюдали для [дС1 в настоящем примере. Вместо этого, можно было обнаружить несколько пиков, которые различались на 140-150 Да. Эти данные указывают, что в [дС1 имеются другие причины гетерогенности и различие в массе, наблюдаемое в развернутом спектре, является суммарным эффектом данных дополнительных модификаций, имеющих место наряду с различными формами гликозилирования. Дополнительная гетерогенность может быть вызвана такими модификациями, как варианты лизина, цистеинилирование и окисление.

Анализ 1цС1 после ограниченного протеолиза с участием Ьух-С обращенно-фазовой ЖХ-МС

Для дополнительной характеристики образца проводили ограниченный протеолиз при участии Ьу§С-протеазы. При использовании в низких концентрациях Ьу§-С предпочтительно расщепляют [1д] по лизину тяжелой цепи (остаток 223) в шарнирной области молекул типа 1дС1 с образованием ЕаЬ- и Есфрагментов. Ограниченный протеолиз усиливает анализ ЖХ/МС выделением модификаций из различных областей и повышает разделение ввиду меньшего размера фрагментов по сравнению с интактным 1дС. Обращенно-фазовая хроматограмма обработанного Ьу§-С 1дС1 в данном примере приведена на фиг. 11. Для типичного образца 1дС1 наблюдают два основных пика, соответствующих ЕаЬ-и Ес-фрагментам. Однако в [дС1 в данном примере обнаруживали несколько пиков, которые относились к дополнительным модификациям, наблюдаемым для данного образца. Развернутые масс-спектры с электрораспылительной ионизацией (ΕδΙ) пиков 1, 2 и 3 приведены на фиг. 12. Массы данных пиков соответствуют Есфрагменту.

Различие по массе между молекулами Ес, элюирующими в виде хроматографических пиков 1, 2 и 3, составляет примерно 128 Да, что четко соответствует массе лизина (128,2 Да). Варианса лизина обычно характерна для с [дС, продуцированных линиями гибридомных клеток, и связана с активностью карбоксипептидазы В. Антитело 146В7 также продуцируется линиями гибридомных клеток, и следовательно, пики 1, 2 и 3 возникают за счет вариантов лизина. Из различия массы можно установить, что пик 1 имеет остатки лизина на С-конце обеих тяжелых цепей. Пик 2 имеет лизин только в одной тяжелой цепи, и пик 3 не содержит С-концевые лизины. Помимо вариансы лизина также имеют место пики, которые разли

- 32 012162 чаются на 162 Да. Данные пики соответствуют гетерогенности. связанной с сахаром. когда одна или более молекул галактозы в конце биантенарной группы сахара отсутствует. Подобная гетерогенность является очень типичной для Ес-фрагмента в обеих молекулах 1дС1 и 1дС2. Не наблюдали других атипичных модификаций сахара. таких как потеря биантенарной группы сахара.

Развернутые масс-спектры пиков 5 и 7 из фиг. 11 приведены на фиг. 13. Молекулярная масса. равная 47281 Да. для пика 7 соответствует теоретической молекулярной массе ЕаЬ (47282). Пик 5 имеет молекулярную массу 47401. которая примерно на 120 Да больше по сравнению с пиком 7. Различие в массе. составляющее 120 Да. соответствует дополнительному остатку цистеина. Сообщалось о цистеинилировании свободных цистеинов в физиологических белках. В данном примере 1дС1 имеет свободный цистеин в ί.ΌΕ3 тяжелой цепи. Данный свободный цистеин цистеинилирован. возможно. во время получения. Из данных по определению площади пиков следует. что более чем 60% молекулы находится в цистеинилированной форме. Пики 4 и 6 имеют различие в массе в +16 Да по сравнению с пиками 5 и 7 соответственно. Данное различие в массе соответствует окислению. наиболее вероятно. остатка метионина. Места окисления можно дополнительно идентифицировать с использованием пептидного картирования.

Опыты с мечением ΙΑΑ

Проводили введение метки 1АА для оценки доступности остатка С104 тяжелой цепи. Различия в обращенно-фазовых хроматограммах интактного или расщепленного Ьук-С до и после введения 1АА отсутствовали. Обращенно-фазовые хроматограммы 1дС1. меченого или немеченого. после ограниченного протеолиза Ьук-С приведены на фиг. 14.

Мечение 1АА должно привести к добавлению 58 Да. Заявители уже показали в более ранних исследованиях. что 60% 1дС1 цистеинилированно и только в оставшиеся 40% можно ввести метку. Развернутый масс-спектр пика 5 (который соответствует форме. имеющей свободный цистин) меченого и немеченого образца приведен на фиг. 15. Не наблюдали сдвига массы после мечения. что указывает на то. что свободный цистеин не доступен для введения метки.

Анализ подвергшегося тепловому стрессу 1дС1 ОФ-ЖХ/МС Подвергшиеся стрессу образцы 1дС1 инкубировали в буфере А58 в течение 1 месяца при 45°С. Свободный цистеин в остатке 104 может принимать участие в ковалентной димеризации посредством образования межмолекулярных дисульфидный связей. Такую димеризацию можно стимулировать индуцированным теплом стрессом. Подвергшиеся тепловому стрессу образцы анализировали на возможное образование ковалентных димеров. На фиг. 16 представлены обращенно-фазовые хроматограммы антитела 146В7 после стресса по сравнению с контролем. Фиг. 17 представляет схематичное изображение клиппинга в подвергшемся стрессу образце.

Пики 1 и 2 подвергшегося стрессу образца появляются за счет клипа легкой цепи Е1-С93/894 (10125 Да) и дегидратированного клипа легкой цепи на 10107 Да. Пик 3 содержит Ν-концевой фрагмент тяжелой цепи (Е1-С138/С139). В основном пике подвергшегося стрессу образца 1дС1-антитела 146В7 можно заметить незначительное размывание (пик 4). Пик 4 содержит «одноплечевое антитело» ЕаЬ-Ес (фиг. 17) и минорный клип тяжелой цепи (Е1-С221/О222). «Потерянное плечо» (ЕаЬ-фрагмент. фиг. 17) элюирует вместе с основным пиком (пиком 5). Е81 масс-спектр пика 5 показал наличие минорного количества клипа ЕаЬ с типичной ступенчатой последовательностью за счет множественных сайтов расщепления в шарнирной области (данные не представлены). Пик 6 на фиг. 16 включает ковалентный димер антитела. В результате очень слабой интенсивности сигнала заявителям не удалось получить хороший развернутый спектр. Однако по данным Е81 масс-спектра можно наблюдать небольшое количество димера в обоих подвергшемся стрессу и контрольном образцах. За счет неполного отделения и низкой интенсивности заявители не смогли провести абсолютное количественное определение. Димер находится в очень маленьком количестве. ниже 1%. и оно существенно не возрастает после теплового стресса. Клипы. установленные в образце 1дС1-антителе 146В7. приведены в табл. X. и на схеме клипов антитела на фиг. 17.

Обобщенные данные по клипам. обнаруженным в подвергшихся стрессу образцах

Таблица X

Пик	Цепь	Фрагмент	Масса (Да)
1	Легкая цепь	Е1-693/594	10125
2	Легкая цепь	Е1-693/594 (Дегидратированный)	10(07
3	Тяжелая цепь	Е1-6138/6139	15122
4	Тяжелая цепь - легкая цепь	ЕаЬ-Рс	101000
4	Тяжелая цепь	Е1-С221/Ц222	23960
5	2(Тяжелая иепь:Легкая цепь)	186	148016
5	Тяжелая цепь-легкая цепь	Е1-Ц222Ж223 (НС) + ЕС	47148
6		1§6-димер	296000

Гетерогенность. установленная в Ес- и ЕаЬ-фрагментах в данном 1дС1. является уникальной для данной молекулы. Для подтверждения того. что обнаруженная гетерогенность в данном 1дС1 не индуци- 33 012162 рована способом, проводили аналогичные исследования с другими молекулами 1дС1. На фиг. 18 приведены ОФ-хроматограммы четырех различных 1дС после ограниченного протеолиза. Ес-фрагменты имеют высокую гомологию среди 1дС и элюируют примерно на 14 мин. ЕаЬ-области содержат вариабельные области и элюируют в разное время. Из данных на фиг. 19 можно увидеть, что гетерогенность, обнаруженная в Тс- и ЕаЬ-области в 1дС1 в данном примере, является уникальной для этой молекулы. Также данные подтверждают, что модификации не являются характерными для молекулы и не индуцируются во время проведения аналитического метода.

При обобщении результатов данного примера было показано, что цистеинилирование остатка С104 представляет основное изменение в 1дС1 в данном примере. С104 находится в СОИ3-области и модификации данного остатка могут оказывать влияние на связывание лиганда. Степень цистеинилирования в С104 может варьировать в различных партиях. Значительные колебания от партии к партии для цистеинилирования легкой цепи наблюдали в отношении нескольких молекул 1дС в композиции. Способы, описанные здесь, представляют основу способов рефолдинга данных антител для устранения цистеинилирования свободных цистеинов. Такие способы приведут к снижению структурной гетерогенности и/или повышению биологической активности, и/или повышению стабильности и срока хранения. Это приведет к получению более однородного продукта. Необходимо особо проверять и контролировать влияние цистеинилирования на связывание антигена.

Пример 5. Редокс-рефолдинг 1дС1 СНО снижает гетерогенность, устраняет цистеинилирование и повышает опосредованную клетками биологическую активность, по данным обращенно-фазовой ЖХ/МС и других методов.

Как уже здесь обсуждалось, рекомбинантная продукция в прокариотических клетках эукариотических белков осложняется тем фактом, что во время такой рекомбинантной продукции белки часто неправильно укладываются и накапливаются в виде нерастворимых телец включения. Данные белки нуждаются в проведении рефолдинга в присутствии хаотропных агентов и восстанавливающих тиолов для восстановления полной биологической активности. До недавнего времени полагали, что эукариотические белки, продуцированные в эукариотических хозяевах (например, человеческие или гуманизированные антитела, полученные в клетках СНО), уложены равномерно и правильно. Как уже обсуждалось в примерах, представленных выше, некоторые 1дС2-антитела были подвергнуты рефолдингу для устранения структурной гетерогенности данных молекул, и такой рефолдинг привел к существенному повышению активности 1дС2. В данном примере дополнительно демонстрируется рефолдинг 1дС1-антитела. Данный 1дС1 содержит непарный цистеин в положении 104. Процесс рефолдинга прослеживали и подвергшиеся рефолдингу молекулы охарактеризовывали с использованием недавно разработанного метода обращенно-фазовой ЖХ/МС для интактных антител и их ЕаЬ- и Ес-фрагментов, полученных в результате ограниченного протеолиза под воздействием Ьук-С-протеазы.

В примере 4 представлена детальная характеристика 1дС1-антитела, которое прошло рефолдинг в настоящем примере. Для данного антитела было характерно то, что примерно 60% молекулы было модифицировано цистеинилированием. Определили с помощью ограниченного протеолиза, что модификация находится в ЕаЬ-области антитела. Также было показано, что имеется по меньшей мере две изоформы ЕаЬ, присутствующие в интактной молекуле. Полагали, что различия возникали за счет дополнительного цистеинилирования и/или неправильной укладки(ок), вызванных уникальным цистеином в положении 104 тяжелой цепи. Кроме того, при постановке тестов оценки биологической активности и связывания с использованием данного вещества были получены не характерные результаты. Заявители предположили, что цистеинилирование ЕаЬ может быть причиной появления не предполагаемых свойств. В настоящем примере приводятся дополнительные данные по характеристике в результате проведения опытов с использованием окислительного рефолдинга для дальнейшего выяснения данного эффекта и оценки того, насколько данный процессинг приведет к улучшению фармацевтических свойств 1дС1.

Рефолдинг

1дС1 инкубировали в концентрации 3 мг/мл в двух буферах 1) 200 мМ Трис-буфер при рН 8,0 (нативный рефолдинг); 2) 200 мМ Трис-буфер при рН 8,0 с 0,9 М СиНС1 (рефолдинг под действием СиНС1). Комбинацию цистеин:цистин вносили с примерным молярным соотношением, равным соответственно 6 мМ : 1 мМ. Образцы инкубировали при 2-8°С в течение 48 ч. Аликвотные пробы отбирали для анализа через 24 и 48 ч.

Анализ

До и после рефолдинга пробы анализировали следующими методами: 1) катионообменная (СЕХ) хроматография; 2) анализ интактной молекулы обращенно-фазовой ЖХ/МС; 3) ограниченный протеолиз с участием Ьук-С-протеазы с последующим анализом обращенно-фазовой ЖХ/МС образовавшихся ЕаЬи Ес-фрагментов; 4) пептидное картирование контрольного 1дС1-антитела 146В7 и подвергшегося рефолдингу вещества; 5) определение биологической активности; 6) гель-хроматография (8ЕС); 7) флуоресцентная спектроскопия и круговой дихроизм. Данные методы в основном уже были описаны выше и ниже приводятся конкретные параметры. СЕХ анализ интактных антител.

СЕХ анализ проводили с использованием буфера на основе фосфата натрия и хлорида натрия при рН 7,2.

- 34 012162

При проведении анализа интактных антител обращенно-фазовой ЖХ/МС образцы анализировали с использованием обращенно-фазовой колонки 2огЬах 3008В С8 1x50 мм, упакованной частицами размером 3 мкм и функционирующей при скорости потока 50 мл/мин и при 75°С. В оптимизированном способе использовали подвижную фазу, состоящую из смеси изопропиловый спирт-ацетонитрил. Система для капиллярной ВЭЖХ Ащ1сп1 1100 была соединена с масс-спектрометром Мкготакк 0-ТОЕ М1сго с источником электрораспылительной ионизации (Ε8Ι). Масс-спектрометр Ε8Ι-Ο-ΤΘΕ был установлен в режиме положительных ионов с капиллярным напряжением 3400 V, напряжением на воронке для образца 70-100 V, пределах т/ζ 1000-6000 и разрешении массы 5000. Прибор был настроен и откалиброван с использованием множественно заряженных ионов бычьего трипсиногена, ММ 23931,0, 8щта Τ1143. Развертку Ε8Ι масс-спектров проводили с использованием алгоритма МлхЕп!1 в программном обеспечении МаккЕ-уах.

Описанные выше условия также использовали для анализа ЕаЬ- и Ес-фрагментов ОФ ЖХ/МС.

1дС1 подвергали ограниченному протеолизу с использованием эндопротеиназы Ьук-С (Косйе, Са! # 1420429) в течение 30 мин при рН 7,5, 100 мМ Трис буфера при 37°С. Расщепление проводили без денатурации при соотношении фермента к белку (мас./мас.), равном 1:400. При использовании данных условий заявителям удалось получить ЕаЬ- и Ес-фрагменты без дополнительного клиппинга.

Пептидное картирование Ι§61 проводили с использованием С1и-С-протеазы до и после рефолдинга. Расщепление С1и-С-протеазой проводили в аммонийно-ацетатном буфере с рН 5 без восстановления и алкилирования. При рН 5 С1и-С-протеаза в основном расщепляет по С-концу каждой глутаминовой кислоты (Е). Анализ ЖХ/МС/МС осуществляли на хроматографе Ащ1сп1 НР 1100, соединенном с ионозахватывающим масс-спектрометром Тйегто Είηηφαη БСО, снабженным источником Ε8Ι.

Для определения биологической активности проводили опосредованные клетками тесты оценки биологической активности при мониторинге зависимости концентрации [дС1-ответной реакции при 200 и 50 пкг/мл ΙΠ-15 и при определении биологической эффективности.

Разделение с использованием гель-хроматографии проводили с контрольным Ι§Ο1, продуцированным СНО, подвергшимся рефолдингу под воздействием СиНС1 и гибридомным веществом. 10 мкг каждой из данных композиций наносили (в отдельных анализах) на колонку Рйеηοтеηеx Т8К Се1 кирег 8\У3000 (4,6 мм х 30 см, размер частиц 4 мкм). Буфер для анализа представлял собой 100 мМ Να фосфата, 150 мМ №С1, рН 6,9, и скорость потока равнялась 0,25 мл/мин.

Для проведения кругового дихроизма и флуоресцентной спектроскопии образцы контрольного Ι§Ο1, продуцированного СНО, подвергшегося рефолдингу под воздействием СиНС1 и гибридомного вещества разводили до конечной концентрации 0,5 мг/мл А58 буфером. СО спектры снимали при 25°С в пределах волн 250-200 нм на спектрофотометре для кругового дихроизма ΆνΙν модель 202-01 с использованием длины пути 0,2 см для всех проб. Спектры флуоресценции снимали при 25°С на спектрофлуориметре ΆVIV АТЕ105 при длине волны возбуждения 290 нм и длине волны эмиссии в пределах от 500 до 300 нм.

Проводили указанные выше методики и последующие результаты и данные представляют пример данных, полученных в этих опытах.

Катионообменная хроматография интактного 146В7, подвергшегося окислительному рефолдингу

На фиг. 19 представлена катионообменная хроматограмма контрольного Ι§Ο1, продуцированного СНО, и образца после рефолдинга под действием СиНС1. Хроматограммы указывают, что после рефолдинга пропадает элюирующийся вначале (кислый) пик.

Анализ обращенно-фазовой ЖХ/МС интактного Ι§Ο1 после окислительного рефолдинга представлен на хроматограмме на фиг. 20, которая показывает Ι§Ο1 СНО до и после окислительного рефолдинга. Для контрольных проб характерно два основных пика с небольшим плечом после пика. Образцы после рефолдинга в основном элюировали в виде одного пика, как представлено на фиг. 20, который имел небольшое плечо после пика, как в контроле. Образцы Ι§Ο1 СНО после рефолдинга с и без участия СиНС1 давали одинаковые ОФ-хроматограммы. На основании аналогии хроматограмм можно предположить, что при наличии 0 М или 0,9 М СиНС1 подвергшиеся рефолдингу образцы имели одинаковую структуру, и скорость рефолдинга была примерно одинаковой. Точное определение массы молекул, элюированных в виде пика 1 на ОФ-хроматограмме на 10,0-10,5 мин, показывало, что молекулы данных антител имели значения ММ примерно на 240 Да выше по сравнению с рассчитанной молекулярной массой Ι§Ο2, представленной в предварительной заявке на патент США 60/621295 (см. также фиг. 21). В этом и ниже описанном анализе было установлено, что данная прибавка массы возникает за счет цистеинилирования двух непарных остатков цистеина. Пик 2, элюирующий между 11 и 13 мин, перекрывался с молекулами антител с двойным, одинарным цистеинилированием и без цистеинилирования.

На фиг. 22 представлен развернутый масс-спектр, полученный с использованием электрораспылительной ионизации (Ε8Ι) контрольного Ι§Ο1 СНО (А), после рефолдинга под действием СиНС1 (В) и нативного рефолдинга (С). После рефолдинга значения ММ образцов были одинаковыми и равными рассчитанному значению ММ в пределах разрешения масс-спектрометра 0-ТОЕ, составляющего ±3 Да (поправка А +14-Да была введена при использовании дополнительной внешней калибровки. Данная поправ

- 35 012162 ка доводила определенные значения ММ для подвергшихся рефолдингу образцов, представленных на фиг. 22В, С (147743 Да) до 147757 Да, которая находится в пределах ошибки ±3 Да рассчитанного значения ММ, равного 147759 Да. Анти-1Ь-1К-антитело использовали в качестве внешнего стандарта для калибровки). Ε8Ι масс-спектры показывают несколько пиков, разделенных остатками галактозы (162 Да), которые являются концевыми остатками двух групп сахара, присоединенных к Ес-фрагменту антитела. Пики, отмеченные на фиг. 22, как 00-00, 00-01, 01-01, 02-01 и 02-02, соответствуют гликозилированной структуре в целом с 0, 1, 2, 3 и 4 остатками галактозы на молекулу антитела. На фиг. 23 показана структура 1д01, включающего гликаны (02-02). Различное количество остатков галактозы представляет обычный источник гетерогенности среди антител и его легко определить на масс-спектрометре 0-ТОЕ. На фиг. 22А представлен Ε8Ι масс-спектр целого контрольного 1д01 СНО, элюированного на 10-13 мин. На масс-спектре на фиг. 22А показано несколько дополнительных групп с более высокими значениями молекулярной массы, элюирующих совместно с вариантами по галактозе. Идентификация молекул с более высокой ММ была затруднена при использовании интактных молекул антитела.

Для дополнительной характеристики образца проводили ограниченный протеолиз с Ьу§-Спротеазой. Ьу§-С при использовании в низких концентрациях предпочтительно расщепляет по лизину тяжелой цепи в шарнирной области подкласса 1д01 с образованием ЕаЬ- и Ес-фрагментов. 1д01-антитело расщепляется Ьу§-С с получением одного Ес-фрагмента, ММ_{рассчитанная} = 53483 Да, и двух ЕаЬфрагментов, ММ_{рассчитанная} = 47282 Да каждый (фиг. 24). Ограниченный протеолиз усиливал анализ ЖХ/МС выделением модификаций из различных областей и повышал разрешение ввиду меньшего размера фрагментов по сравнению с интактным 1д0. Обращенно-фазовая хроматограмма обработанного Ьу§-С 1д01 представлена на фиг. 24. Для типичного образца 1д01 наблюдали два пика, соответствующих ЕаЬ- и Ес-фрагментам. Однако имело место два пика ЕаЬ в контрольном образце 1д01, которые относились к дополнительным модификациям в данном образце. ЕаЬ-фрагмент в образце после рефолдинга в основном выходил одним пиком, который соответствовал плечу после пика, характерному для обычного контроля. На фиг. 25 представлен развернутый Ε8Ι масс-спектр ЕаЬ-фрагмента 1д01 до и после рефолдинга. Определенная масса ЕаЬ-фрагментов образцов после рефолдинга хорошо согласуется с рассчитанной массой и с массой пика 1 для ЕаЬ контрольного 1д01 (фиг. 25). Пик 1, соответствующий ЕаЬ контрольного образца, имел значение ММ на 118 Да выше по сравнению с рассчитанным значением, что свидетельствует о цистеинилировании ЕаЬ-фрагмента.

Сообщалось о цистеинилировании белков со свободными цистеинами в крови и также оно наблюдалось в минорных примесях легких целей, детектируемых в моноклональных 1д0. В рекомбинантных антителах цистеинилирование вводят во время стадии получения, возможно, в результате добавления цистеина вместе с другими аминокислотами для питания клеток СНО. Для двух ЕаЬ-фрагментов, элюирующих в виде пика 1 и пика 2 на фиг. 24, характерно хорошее хроматографическое разделение, которое вызвано наличием более значительных структурных различий, чем просто цистеинилирование. Например, цистеинилированные и нецистеинилированные примеси легкой цепи элюируют вместе на ОФхроматограммах. Существенное различие во времени элюирования ЕаЬ-фрагментов было другого порядка, на основании чего можно предположить, что может иметь место беспорядочное взаимодействие дисульфидов.

На фиг. 26 представлены результаты 01и-С невосстановительного пептидного картрирования контрольного 1д01 (обычного) и после нативного рефолдинга. Несмотря на то, что две пептидные карты являются практически одинаковыми, имеются различия в значении интенсивностей по меньшей мере для трех пептидов, отмеченных красными стрелками на фиг. 25. В настоящее время можно провести дополнительную идентификацию и распределение дисульфидов.

В табл. Υ приведены результаты клеточных тестов оценки биологической активности при мониторинге зависимости концентрация 1д01-ответная реакция с 200 пкг/мл и 50 пкг/мл 1Ь-5. В табл. Ζ представлены результаты определения биологической эффективности. Данные обоих тестов свидетельствуют, что опосредованная клетками биологическая активность повышается в два раза после рефолдинга при проведении нативного рефолдинга или рефолдинга под воздействием 0иНС1.

Результаты тестов оценки биологической активности контрольных антител 146В7, подвергшихся рефолдингу под действием 0иНС1 и нативному рефолдингу. Тест проводился №сЕо1а§ Υеаде^

Таблица Υ

Средние значения точек на кривой	200 пкг/мл 1Ь-15	50 пкг/мл И.-15
146В7-С1	15,73	1,544
Нативный рефолдинг	9,09	1,162
146В7-СиНС1	7,635	1,021
146В 7—фармацевтическое	22,438	2,488

- 36 012162

Результаты тестов оценки биологической активности контрольных антител 146В7, подвергшихся рефолдингу под действием СиНС1 и нативному рефолдингу

Таблица Ζ

146В7	Предполагаемая концентрация белка (мг/мл)	Концентрация биологически активных белков (мг/мл)	Относительная эффективность (п=3)
Средний (%)	СУ (%)
Контрольный тест	63,00	67,51	107	8
Продуцированный гибридомой	20,00	27,99	140	6
Продуцированный СНО, подвергшийся рефолдингу под действием СдпНС]	2,49	5,85	235	6
Продуцированный СНО, подвергшийся нативному рефолдингу	2,66	5,60	21]	4
Продуцированный СНО, контрольный в А55	5,47	6,41	П7	5

На фиг. 27 представлены БЕС хроматограммы контрольного 1д61, продуцированного СНО, после рефолдинга под действием СиНС1 и гибридомного вещества. Хроматограммы указывают на увеличение времени удерживания подвергшегося рефолдингу вещества, на основании чего можно предположить, что изменение в конформации по сравнению с контрольным и гибридомным белками. Также наблюдали снижение пика агрегата вещества после рефолдинга.

Результаты анализа СР и флуоресцентной спектроскопии приведены на фиг. 28. Блок А свидетельствует о том, что отсутствовало изменение во вторичной структуре 1дС1 после рефолдинга. Данные, представленные в блоке В, показывают увеличение интенсивности флуоресценции после рефолдинга по сравнению с контрольным СНО и гибридомным веществом. Это может быть результатом структурных изменений в микросреде(х) флуоресцирующих остатков триптофана после рефолдинга.

Интенсивность флуоресценции полученного из гибридомы белка выше по сравнению с контрольным СНО белком. Это может коррелировать с данными по более высокой биологической активности для гибридомного вещества по сравнению с обычным СНО белком. Продуцированный гибридомой белок хранили в РВБ при рН 7,4 перед разведением, значение рН является более действенным для реакций с обменом дисульфидов по сравнению с условиями хранения в Л58, использованными для контрольного СНО белка. Отсутствовало определяемое изменение в максимальной длине эмиссии между образцами, которое указывало бы на то, что полярность окружения триптофана остается той же.

Суммируя результаты представленных выше исследований, можно придти к выводу, что при получении данных исходили из того, что контрольный, продуцированный СНО 1дС1 является гетерогенным в структурном отношении и включает молекулы с цистеинилированным цистеином в ЕаЬ-фрагменте. Примерно 60% всех ЕаЬ-фрагментов были цистеинилированными. За счет большой разницы в характере элюирования цистеинилированных и нецистеинилированных ЕаЬ-фрагментов и присутствия уникального непарного цистеина в 1дС 1 -антителе против 1Б-15 заявители предположили, что цистеинилирование связано с нарушением дисульфидной связи. Контрольный 1дС1 подвергался рефолдингу с и без хаотропного агента (с 0,9 М СиНС1 и без СиНС1). Оба рефолдинга привели к появлению гомогенной нецистеинилированной молекулы 146В7 по данным точных определений массы на масс-спектрометре О-ТОЕ Через 24 ч большая часть контрольного 146В7 подверглась рефолдингу с превращением в гомогенные молекулы, элюирующие позднее. Через 48 ч рефолдинг был почти завершен. Проводили опосредованное клетками определение биологической активности и было установлено, что образцы после рефолдинга являются в два раза более активными по сравнению с контрольным продуцированным СНО 1дС1, который не прошел рефолдинг.

Результаты в данном примере показывают, что цистеинилированные молекулы элюируют раньше с ОФ-колонок, что было подтверждено масс-спектрометрией и элиминируют после рефолдинга. Метод ОФ ЖХ/МС, используемый в данном исследовании, был особенно эффективным вследствие очевидной связи между неправильной укладкой и цистеинилированием.

Представленные выше данные показывают, что подвергшиеся рефолдингу молекулы 1дС1 являются более гомогенными и более активными после рефолдинга. Сейчас можно провести дополнительную оптимизацию и характеристику на основе представленных исследований и методов.

Пример 6. Способы рефолдинга рекомбинантных антител, которые связываются с интерлейкином15.

В настоящем примере приводятся результаты сравнения различных партий антитела 146В7 с использованием ограниченного протеолиза с последующим анализом ОФ ЖХ/МС. В данном примере различные партии 146В7 сравнивали с уровнями цистеинилирования по С104 в тяжелой цепи с использова

- 37 012162 нием ограниченного протеолиза с последующим анализом ОФ ЖХ/МС. Также определяли уровень окисления. концентрацию сукцинимида и галактозы для различных партий. Идентифицировали с использованием пептидного картирования место цистеинилирования и окисления.

Уровень цистеинилирования. окисления. концентрация галактозы и сукцинимида варьировали в различных партиях. Имела место значительная вариабельность между продуцированным СНО и гибридомным веществом. Рефолдинг продуцированного СНО 146В7 приводит к отсутствию цистеинилирования. Рефолдинг не вызывал каких-либо других модификаций. и два вещества были сравнимыми при пептидном картировании. Для гибридомного антитела. СНО РО и подвергшегося рефолдингу СНО РО биологическая активность возрастала со снижением цистеинилирования.

Партия #	Гексоза I	% окисление	% Сукцинимид	% Цистеин (свободный)	Биологическая активность (Апа1. 5с1)
Гибридомный	1,1	13	13	54(46)	135
ΟΗΟΡϋ(Ι)	0,8	7	18	74(26)	105
СО РО( 1) после рефолдинга	0,9	7	15	0(100)	211
С1045	0,5	4	18	0(100)
СНО Рго5с1 (1)	1,3	4	И	74(26)	168
СНО Рго5с1(2)	1	6	11	50(50)	201

Независимо рассчитывали количество (в процентах) трех модификаций и не добавляли к 100% в приведенной выше таблице. Например. 13% цистеинилированных молекул. продуцированных гибридомой. также было окислено. в то же время 87% цистеинилированных молекул не было окислено.

Гексоза Ι представляет собой среднее значение концентрации молекул гексозы (галактозы) на молекулу 1дС. и идентификация цистеинилирования и рефолдинг 1дС1 описана выше в других примерах.

Данные из этих примеров согласуются с представленными в примерах 4 и 5. На фиг. 29 приведена другая ОФ-хроматограмма Ι§61. продуцированного гибридомой и СНО. после ограниченного протеолиза. Можно легко разделить и обсчитать количественно цистеинилированные и нецистеинилированные фрагменты. На фиг. 30 приведены ОФ-хроматограммы 1дС1 до и после рефолдинга. свидетельствующие об отсутствии РаЬ-Суз в подвергшемся рефолдингу препарате. При невосстановительном пептидном картировании 1дС1 после мечения свободных цистеинов с NΕΜ вещество. продуцированное СНО. до и после рефолдинга было сравнимым по данным пептидного картирования. Контрольный 1дС1 содержал большое количество триптического пептида С99-К122 с цистеинилированным С104. который элюировал на 117 мин. После рефолдинга количество цистеинилированного пептида уменьшилось и количество нецистеинилированного пептида возросло.

Нецистеинилированный пептид. меченный NΕΜ. для предупреждения от беспорядочного взаимодействия с другими остатками цистеина во время восстановления. алкилирования и расщепления. На фиг. 30 представлены результаты невосстановительного пептидного картирования 1дС1 с использованием трипсина после введения в свободные цистеины метки NΕΜ при рН 5. Была установлена локализация цистеинилирования в положении С104 тяжелой цепи. Также было идентифицировано окисление метионина 48 в СОК2-области тяжелой цепи (фиг. 32). Согласно данным невосстановительного пептидного картирования небольшой процент М48 в СОК2-области тяжелой цепи был окислен. Окисленный пептид элюировал на 98 мин. и не окисленный пептид элюировал на 110 мин. Как следует из фиг. 32. восстановленные ионные хроматограммы и масс-спектры фрагментов свидетельствовали о том. что 10% М48 окислено.

Пример 7. Рефолдинг рекомбинантных антител на протеин А-колонке для масштабного получения.

Данные. представленные в настоящей заявке. показывают. что в основном для очищенного 1дС2 характерно три пика при ОФ-ВЭЖХ. описанной здесь. Кроме того. три пика можно превратить в пик 1 или пик 3 при использовании окислительно-восстановительных реагентов с ΟιιΗΟ и без ΟιιΗΟ. Гетерогенность популяции антител возникает за счет беспорядочного взаимодействия дисульфидных связей. Данную проблему с гетерогенностью можно разрешить рефолдингом. как здесь описано. Из данных некоторых биологических тестов представляется. что популяция антител. элюирующая в виде пика 1 на хроматограмме. является более стабильной и та. которая элюирует в виде пика 3. является наиболее активной с относительной стабильностью после восстановления-окисления.

В настоящем примере получены данные. показывающие рефолдинг молекул ΙβΟ на колонке. Конкретнее. была получена протеин А-колонка для аффинной хроматографии для носителя восстановленияокисления или рефолдинга 1дС. Смолу колонки можно обработать 1-2 М ΟιιΗΟ. а также восстановителями. такими как смесь цистеин/цистин. Смолу используют при рН 7.2 или выше. т.е. значении рН хорошо подходящем для восстановления-окисления разделенных 1дО.

- 38 012162

1. Редокс или рефолдинг в растворе.

Номер анализа по порядку	1§62 (мг/мл)	Цистеин (мМ)	Цистин (мМ)	Температура (°С)	1М гуанидин	Время инкубации
1	3	0	0	Без редоксреагента	Без редоксреагента	48 часов
2	3	6	0,6	4	Да	48 часов
3	5	6	0,6	4	Да	48 часов
4	10	6	0.6	4	Да	48 часов
5	10	10	0,6	Комнатная температура	Да	48 часов
6	3	6	0,6 ί	Комнатная температура	Да	48 часов
7	3	6	0,6	4	Нет	48 часов
8	5	6	0,6	4	Нет	48 часов
9	10	6	0,6	4	Нет	48 часов
10	10	10	0,6	Комнатная температура	Нет	48 часов
11	3	6	0,6	Комнатная температура	Нет	48 часов

В представленной выше таблице приводятся примерные компоненты реакционной смеси для рефолдинга, которую можно использовать для рефолдинга ЦС в растворе. Для адаптации описанного выше способа процессинга для проведения на колонке в таблице приводятся параметры для редокспроцессинга 1дС2 на протеин А-колонке для аффинной хроматографии.

2. Редокс 1дС2 на протеин А-колонке для аффинной хроматографии.

Условия выполнения способа:

Параметр	Условия
Равновесие	3-5СУ-100 мМ 61аС1, 20 мМ Трис, рН 7,4 при 300 см/ч
Загрузка	Загрузка образца 10 или 20 мг/мл при 300 см/ч
Раствор для промывания 1	ЗСУ-200 мМ Трис рН 8,0 при 300 см/ч
Раствор для промывания 2 редокс	2,6 и 12 ч с или без 6иНС1 при 50 см/ч рН 8,0
Раствор для промывания 3	5СУ - 100 мМ ЯаС1, 20 мМ Трис, рН 7,4 при 300 см/ч
Элюирование	5СУ - 50 мМ ЦаАОс рН 3,4 при 200 см/ч

Номер анализа по порядку	1ёС2 (мг/мл)	Цистеин (мМ)	Цистин (мМ)	Температура (°С)	1,2М гуанидин	Время редокс обработки
1	20	20	0,6	4	Да	2 часа
2	20	20	0,6	4	Да	6 часов
3	20	20	0,6	4	Да	12 часов
4	10	10	0,6	4	Да	2 часа
5	10	10	0,6	4	Да	12 часов
6	20	20	0,6	4	Нет	2 часа
7	20	20	0,6	4	Нет	6 часов
8	20	Г 20	0,6	4	Нет	12 часов
9	10	10	0,6	4	Нет	2 часа
10	10	10	0,6	4	Нет	12 часов

Очищенные образцы ЦС1 обрабатывали редокс-парами в различных концентрациях и при значении рН, равном 7 и 8, и в течение различного периода времени. В некоторых примерных исследованиях обработка продолжалась в течение примерно 24 ч при температуре 2-8°С. Реакцию останавливали снижением рН образцов примерно до 5. Биологическую активность определяли в виде процента активности необработанного ЦС1 (см. таблицу ниже). Также редокс-обработку проводили в таких условиях, как комнатная температура, более короткая продолжительность (например, 3 ч) и было установлено, что они оказывают положительное влияние на биологическую активность 146В7.

- 39 012162

Результаты опосредованных клетками тестов определения биологической активности или эффективности после редокс-обработки

Таблица

а	рН	Цистеин (мМ)	Цистамин (мМ)	Цистин (мМ)	Соотношение	Эффективность
1	7	6	0,3		20	184
2	8	6	0.3		20	-
3	7	б	0,6		10	197
4	7	3	0,3		10	-
5	8	3	0,6		5	-
6	7	3	0,6		5	189
7	8	6	0,6		10	211
8	8	3	0,3		10	-
9(01:1)	8	6		0,6	10	208
10	8	1,5	0			212

Из данных фиг. 34 видно, что точка плавления ЦС1 возрастала после редокс-обработки по данным О8С, что указывает на более высокую термостабильность. Для получения этих данных ЦС1 обрабатывали 6 мМ цистеина, 0,6 мМ цистина, при рН 8 в течение ночи при температуре 2-8°С.

Также ЦС1 обрабатывали одним восстановителем без добавления окислителя, как показано в примере 10, в приведенной выше таблице. В этом примере очищенный ЦС1 инкубировали с 1,5 мМ цистеина в течение ночи при 2-8°С. Его активность возрастала примерно в 2 раза. С учетом этого предусматриваются не только некоторые варианты осуществления с применением как восстановителя, так и окислителя, но и предусматривается, что рефолдинг антитела можно проводить с использованием одного восстановителя.

Как обсуждалось в некоторых вариантах осуществления рефолдинга можно достичь добавлением реагента для рефолдинга в клеточную культуру, к одному антителу или даже разделением антитела с использованием колонки, которая содержит редокс-реагенты. В некоторых примерных вариантах осуществления ЦС1 подвергали рефолдингу в среде для культивирования клеток, в которой он продуцируется. Осветленную в среду для культивирования клеток обрабатывали редокс-парой (6 мМ цистеина, 0,6 мМ цистина, 2-8°С в течение ночи). Затем Ι§01 очищали на протеин А-колонке для аффинной хроматографии. В данном конкретном случае наблюдали рефолдинг со сдвигом времени удерживания при ЖСВЭЖХ (фиг. 35). Подвергшийся рефолдингу ΙβΟ2 постоянно показывал повышенное время удерживания при ЖС-ВЭЖХ, и поэтому ЖС-ВЭ’ЖХ можно использовать в качестве идентифицирующего рефолдинг метода анализа.

Во время масштабного получения ЦСВантитела в некоторых вариантах осуществления предусматривается, что стадию редокс-обработки можно легко ввести перед стадией катионообменной хроматографии для рефолдинга антител в целях элиминации цистеинилирования свободных цистеинов. Это дает популяцию антител, структурная гетерогенность которых уменьшается, и/или возрастает биологическая активность, и/или повышается стабильность и срок хранения.

Пример 8. Исследование стабильности ЦСВантитела против ГС-15 после рефолдинга.

Кривые денатурации можно использовать для установления конформационной стабильности белков, и они хорошо подходят для определения различий в стабильности между белками, различающихся по химической и конформационной структуре (Расе С.Ы. е1 а1., МеШойк ίη епгуто1о§у, 1986, уо1.131, 267280). В тех случаях, когда можно построить кривые равновесия для конкретного механизма развертывания, можно определить свободную энергию развертывания или насколько является более стабильной нативная конформация по сравнению с развернутым состоянием. Обычно создают условия для развертывания белка, затем дожидаются его уравновешивания при различных концентрация химического денатурирующего вещества, и для каждой концентрации денатурирующего вещества записывают спектроскопический сигнал.

Зная сигнал в уложенной области кривой (нативный контроль) и неуложенной области (неуложенный контроль) можно получить константу равновесия (и, таким образом, изменение свободной энергии) для каждой концентрации денатурирующего вещества в области перехода развертывания. Затем значения изменений свободной энергии можно экстраполировать обратно для отсутствия денатурирующего вещества с получением изменения свободной энергии раскручивания белка в воде.

С помощью различных спектроскопических методов можно регистрировать различные события развертывания, например, флуоресценцию используют для оценки развертывания третичной структуры и круговой дихроизм применяют для мониторинга развертывания вторичной структуры. Для более полного описания способа следует обратиться к тексту, приведенному выше.

- 40 012162

В целях сравнения 1дС1 против 1Ь-15 до и после редокс-обработки при концентрации 1 мг/мл белок уравновешивали в течение ночи с концентрациями гуанидингидрохлорида, представленными на графике. Затем образцы анализировали при длине волны возбуждения 295 нм и длине волны эмиссии 360 нм (см. фиг. 36). Также регистрировали СО данные при СО при 218 нм (данные не представлены). К сожалению, после нормализации данных ЕЬ и СО для развернутой фракции сигналы при двух спектроскопических определениях не перекрывались, на основании чего можно предположить о переходном состоянии развертывания, которое в это время трудно уловить с получением разницы свободной энергии, которая может быть сравнима между образцами, подвергшимися редокс-обработке и без редокс-обработки. Однако спектр флуоресценции показывал, что средние точки (Ст) данного перехода выше для редоксобработанных образцов по сравнению с контрольным, не редокс-обработанным веществом, на основании чего можно предположить, что стабильность редокс-обработанного [дС1-антитела 146В7 является более высокой по сравнению с контрольным, не редокс-обработанным образцом. Это может иметь место и подтверждается сдвигом значения Т_пл., установленным в опытах с денатурации тепловой обработкой, однако, без адекватного построения графика по данным с учетом явных различий в т-значении можно только говорить, что имеются явные различия между прошедшими и не прошедшими редокс-обработку белками 146В7 1дС1.

Проводили опыт с ускоренным определением стабильности при сравнении контрольного [дС1 без редокс-обработки и 1дС1-антитела 146В7, прошедшего редокс-обработку. Оба белка помещали в концентрации 100 мг/мл в буфер А5δ (10 мМ ацетата натрия, рН 5,5% сорбит) и хранили при следующих значениях температуры: -80, 4, 29, 37 и 45°С. В различные периоды времени отбирали образцы обоих белков и анализировали на деградацию. Используемыми методами были гель-хроматография (δΕί.') для мониторинга образования высокомолекулярных агрегатов и низкомолекулярных белковых клипов, электрофорез в δΌδ-полиакриламидном геле и определение количества частиц для оценки нерастворимых агрегатов. На каждую временную точку определяли концентрацию белка, а также рН. График на фиг. 37 представляет данные гель-хроматографии для образцов на период 3 месяца, показывающий, что не прошедший редокс-обработки образец имел способность к агрегации с большей скоростью по сравнению с редокс-обработанным 1дС1-антителом против 1ГО-15 при всех температурах жидкости. Реакции клиппинга оставались без изменений для каждой пробы (данные не представлены).

Пример 9. Получение обогащенной популяции интактного 1дС4.

Настоящий пример посвящен получению обогащенной популяции ковалентно связанных интактных моноклональных IдС4-аитител рефолдингом полумолекул 1дС4 в ковалентно связанные интактные молекулы [дС4. Рекомбинантное моноклональное [дС4-антитело получали в клетках млекопитающих, и оно представляло собой гетерогенную популяцию молекул [дС4, содержащую полумолекулы и ковалентно связанные интактные молекулы [дС4. Эту гетерогенную популяцию подвергали взаимодействию со связующими окислительно-восстановительными реагентами в присутствии денатурирующего реагента с получением интактных молекул [дС4. После проведения редокс-обработки антитело помещали в стабилизирующий буфер (низкое значение рН, жидкий или замороженный) для предупреждения дальнейшего образования полумолекул. Ковалентно связанные интактные моноклональные [дС4-антитела представляют собой антитела, которые обладают двумя тяжелыми цепями и двумя легкими цепями. Полумолекулы [дС4 имеют одну тяжелую цепь и одну легкую цепь. Полумолекулы образуются вместе с интактными молекулами во время получения в клетках млекопитающих и также в крови. Образование полумолекул является одним из основных препятствий на пути получения подкласса [дС4 в качестве промышленно доступных фармацевтических препаратов.

Человеческое 1дС4-антитело представляет собой уникальный подкласс гамма-иммуноглобулинов, поскольку оно обладает несколькими уникальными свойствами. Первое, заключается в том, что оно не способно осаждать очищенные антигены (Аа1Ьегае апб δс1ишπηаη. 1ттипо1оду 2002, 105, 9-19; δΟιιιιΐΓтап е! а1., 1ттипо1оду 1999, 97, 693-698). Эта неспособность является результатом неспособности 1дС4антител связывать два антигена и начинать образовывать комплексы. Человеческий сывороточный [дС4 называют моновалентным в функциональном отношении. Среди данных подклассов гаммаиммуноглобулинов [дС4 обладает только минимальной способностью (если она вообще имеется) к активации комплемента, как следует из данных табл. I, взятых из ЦеГГегЛ апб Ьипб, 1ттипо1. Ьей., 2002, 82, 57-65; Ни1ей апб НодаЛй, Абν. 1ттипо1. 1994, 57, 1-127). Данное уникальное свойство делает 1дС4 привлекательным антителом-кандидатом для терапевтических применений, для которых требуется только связывание лиганда, а не образование комплексов, которые могут привести к развитию нежелательного иммунного ответа.

- 41 012162

Специфичность узнавания человеческих 1дС-Ес для эффекторных лигандов

Таблица I

Изотип 1д6	1§С1	1§<32	1есз	1дО4
Экспрессия Ес-рецептора
ЕсуГП - моноциты, макрофаги,	+4+	-	4+44	-4
ЕсуКПа - моноциты, макрофаги, нейтрофилы, эозинофилы, тромбоциты	+		44	-
ГсуКПЬ - В-клетки, моноциты, макрофаги	++	9	++	+
ЕсуРЗПа - макрофаги, ЬСЬ, клетки-киллеры, γδ Т-клеткн	4	-	+	-
ЕсуКШЬ - нейтрофилы, эозинофилы	4	-	+	-
ЕсКп - множественные клеточные типы для катаболизма;	44	44	+?	++
плацентарные клетки для транспорта	+++	++	++	4+
Активация комплемента:
СЦ - классический путь	44+	-	++4	-
СЗ - альтернативный путь	-	-	-	-
МВБ - в зависимости от состояния гликозилирования	4+	4+	44	-4
Продукты микроорганизмов:
5рА - стафилококковый белок А	4+	44	-	-1—к
8рС - стрептококковый белок С	++	++	44	4+
ЕСуК - кодируемый вирусом герпеса	++	44	-	++

Взято из источника (4), ЬСЬ, крупные гранулоциты, клетки-киллеры, природные клетки-киллеры и ! в зависимости от аллотипа ЕсуКПа.

Кроме того, молекулы 1дС4 обладают следующим вторым уникальным свойством: молекулы 1дС4 претерпевают обмен полумолекул (НЬ) между молекулами 1дС4 (Аа1Ьег§е апб §сйиигтап, 1ттипо1оду 2002, 105, 9-19). Данный обмен возможен, поскольку молекулы 1дС4 образованы из двух нековалентно связанных полумолекул. В данных молекулах 1дС4 дисульфидные мостики между двумя тяжелыми цепями в шарнирной области смещены с образованием мостиков между цепями. Сообщалось, что 25-75% фракции молекул 1дС4 связано только нековалентными связями между тяжелыми цепями. Данные молекулы 1дС4 являются очень стабильными в обычных физиологических условиях ш \з!го в результате наличия сильных нековалентных связей между СН3-доменами и, возможно, СН1- и СН2-доменами. Аа1Ьегке и 8сйиштап (1ттипо1оду 2002, 105, 9-19) было высказано предположение, что обмен катализируется в условиях ш νί\Ό протеиндисульфидизомеразой (РЭ1) и/или ЕсЯп (Ес-рецептором, связанным с главным комплексом гистосовместимости (МНС)) во время транспорта 1дС4 на эндосомальном пути в эндотелиальных клетках. Также было высказано предположение, что дисульфидные связи между тяжелыми цепями 1дС4 находятся в равновесии с внутрицепочечными дисульфидными связями (8сйццгтап е! а1., Мо1. 1ттипо1., 2001, 38, 1-8).

Эта способность нековалентно связанных 1дС4-антител к обмену половинами является биологически важной в тех ситуациях, когда обнаружены сильные ответы на 1дС4 против двух несвязанных антигенов, которые находятся в организме одновременно и в одном месте (Аа1Ьег§е апб 8сйццгтап, 1ттипо1оду 2002, 105, 9-19). В таких обстоятельствах могут образоваться комплексы антитело-антиген, индуцирующие иммуногенный ответ. Это было подтверждено экспериментально 8сйиигтап е! а1. (1ттипо1оду 1999, 97, 693-698) в опытах, в которых было показано связывание 1дС4 с двумя различными антигенами в сыворотке крови от пациентов с 1дС4-антителами на антигены клещей домашней пыли и растительной пыльцы. Было установлено, что большая фракция молекул 1дС4 в плазме крови имеет два различных антигенсвязывающих сайта, что приводит к биспецифичности. Данный признак представляет потенциальный риск при введении молекул 1дС4 пациентам, страдающим аллергией, вызванной клещами домашней пыли, растительной пыльцой или укусами пчел, могут иметь поликлональный или вторичный моноклональный 1дС4. Заявители предположили на основе наблюдений авторов (Аа1Ьег§е апб 8сйиигтап, 1ттипо1оду 2002, 105, 9-19; 8сйиигтап е! а1., 1ттипо1оду 1999, 97, 693-698), что полумолекулы 1дС4 являются нежелательными молекулами для фармацевтических применений, поскольку они могут образовывать биспецифические антитела и имеют более короткий период полупаспада в крови (Апда1 е! а1., Мо1. 1ттипо1., 1993, 30, 105-108). Действительно при отборе потенциальных терапевтических препаратов для клинической разработки молекула 1дС4 не только не рассматривается, но и считает

- 42 012162 ся нежелательной из-за возможности биспецифичности, которая может возникнуть в результате обмена полумолекул специфического терапевтического 1дС4 с полумолекулами другого 1дС4, которые могут находиться в крови.

Апда1 и сотрудники подвергли мутации серин в шарнирном мотиве -СР8С- в пролин (который обнаружен в этом положении в 1дС1 и 1дС2) в химерной мышиной/человеческой тяжелой цепи 1дС4 (Апда1 е! а1., Мо1. 1ттипо1., 1993, 30, 105-108). Эта мутация одного остатка привела к получению гомогенного гомодимерного 1дС4-антитела. Одна точечная мутация приводит к существенному увеличению периода полураспада в сыворотке крови и улучшению распределения в тканях по сравнению с исходным химерным 1дС4.

С учетом представленных выше данных и наставлений согласно изобретению в отношении рефолдинга молекул 1дС1 и 1дС2, было предположено, что гетерогенная популяция молекул 1дС4, которая включает полумолекулы 1дС4, а также интактные молекулы 1дС4, можно обогатить ковалентно связанными интактными моноклональными 1дС4-антителами проведением рефолдинга полумолекул в ковалентно связанные интактные моноклональные 1дС4-антитела. Моноклональный 1дС4, продуцированный в клетках млекопитающих и содержащий полумолекулы и ковалентно связанные молекулы, будет взаимодействовать с окислительно-восстановительными реагентами в присутствии денатурирующих веществ с преимущественным образованием гомодимерных молекул 1дС4. После проведения редокс-обработки антитело будет способно формулироваться в стабилизирующем буфере (низкое значение рН, жидком или замороженном), который будет предупреждать дальнейшее образование полумеров. На фиг. 38 и фиг. 39 ниже детально приведены результаты анализа обращенно-фазовой ЖХ/МС 1дС4-антитела, которое использовали для разделения и идентификации полумолекул 1дС4 и интактных молекул 1дС4.

С учетом этих данных было высказано предположение, что представленные выше опыты по рефолдингу молекул 1дС1 и 1дС2 можно адаптировать для проведения рефолдинга молекул 1дС4 таким же образом, как для рефолдинга 1дС1 и 1дС2.

Пример 10. Рефолдинг антител для улучшения способности к кристаллизации.

Другой областью, для которой пригодны способы согласно изобретению, является область образования кристаллов антител. Разработки в области кристаллизации антител сдерживаются гетерогенностью данных крупных молекул в отношении конформации, дисульфидных связей, вариантов гликозирования и заряженных вариантов. Первоначально кристаллизация молекул 1дС в основном ограничивалась ЕаЬфрагментом, Ес-фрагментом, комплексами фрагментов с лигандом или Ес-рецептором, интактным 1дС1 и интактным мышиным 1дС2а (не интактный человеческий 1дС2). В предшествующих патентах по кристаллизации интактных антител описаны сферические нанокристаллические белковые частицы и кристаллические композиции (А1!и§ XVО 0272636(А2, А3) и XVО 0300014(А2)), которые были успешными только в ограниченных случаях терапевтического применения 1дС1-антител, а именно инфликсимаб (ремикад), ретуксимаб (ритуксан) и трастузумаб (герцептин).

В результате недавних аналитических усовершенствований в обращенно-фазовой ВЭЖХ высокомолекулярных белков была установлена дисульфидная гетерогенность 1дС2-антител (ИШоп е! а1., предварительная заявка на патент США 60/621295 и РСТ/И805/001840). Способы рефолдинга белков при добавлении окислительно-восстановительных реагентов (редокс-реагентов) приводят к облегчению образования подобных нативным дисульфидных связей, приводя к структурной гомогенности, активной форме молекулы с улучшенными фармацевтическими свойствами, описанными выше. В настоящем примере приводятся данные по применению подвергшихся рефолдингу антител для повышения способности к кристаллизации.

Как описано в РСТ/ϋδ 05/001840 и предварительной заявке на патент США 60/621295, один аспект изобретения включает введение или оптимизацию компонентов ферментационной среды, включая такие питательные вещества, как цистеин, цистин, цистамин, глутатион, медь и/или другие окислители и различные буферные композиции, так что в результате достигается соответствующий редокс-потенциал для рефолдинга продукта, секретированного в среду. Вторым аспектом является включение отдельной стадии процессинга для окислительного рефолдинга белка, отличающегося от обычного рефолдинга тельцами включения у микроорганизмов. Третий аспект изобретения представляет введение редоксреагентов непосредственно в растворы для кристаллизации, так что в результате неправильно уложенный белок может подвергнуться рефолдингу в растворе и прикрепиться к растущим кристаллам, приводя к повышенным выходам кристаллизации.

Данные, представленные в настоящем примере, свидетельствуют об успешной кристаллизации интактного 1дС2 после рефолдинга. Было показано, что рефолдинг 1дС1 с целью элиминации цистеинилирования приводит к повышенной активности и гомогенности (см. примеры выше), и в исследованиях по кристаллизации показано, что рефолдинг 1дС1 приводит к улучшенным кристаллизационным свойствам для иммуноглобулинов данного подкласса. При проведении рефолдинга во время ферментации, на отдельной стадии процессинга или в кристаллизационном растворе, возможно получить продукт с улучшенными фармацевтическими и кристаллизационными свойствами, включая повышенную гомогенность, активность/эффективность, стабильность, рост кристаллов и выход кристаллизации.

В первоначальных скрининговых исследованиях кристаллы получали в следующих условиях с ис

- 43 012162 пользованием подвергшегося рефолдингу 1дС2-антитела против 1Ь-1К в концентрации 50 мг/мл. 1дС2антитело против 1Ь-1К подвергали рефолдингу в присутствии денатурирующего реагента для повышения содержания формы 3, как описано выше.

1. 50 мМ хлорид калия, 20% ПЭГ 3350, рН 2,0.

2. 50 мМ хлорид калия, 24% ПЭГ 3350, рН 2,0.

3. 50 мМ МЕ8, 20% ПЭГ 3350, рН 6,0.

4. 50 мМ МЕ8, 20% ПЭГ 3350, рН 6,0.

5. 1,13 М Ыа-К фосфат, 0,1 М Ыа какодилат, рН 5,5, 0,69% МЕСА-7* (детергент на основе сахара производства Апа!гасе).

6. 2,12 М ацетат натрия, 0,65% МЕСА-7* (детергент на основе сахара производства Апа!гасе).

Данные, представленные на фиг. 41-43, показывают, что кристаллы 1дС2, образовавшиеся в условиях, описанных выше, представляют сферические кристаллы, указывая на то, что способы согласно изобретению обеспечивают получение гомогенного препарата 1дС, позволяющего получать однородные кристаллы интактных антител.

Все композиции и/или способы, раскрытые и заявленные здесь, можно провести и осуществить без излишнего экспериментирования в свете настоящего раскрытия. Несмотря на то, что композиции и способы согласно изобретению описаны в отношении некоторых вариантов осуществления, специалистам в данной области, очевидно, понятно, что к композициям и/или способам и стадиям или последовательности стадий способа, описанного здесь, можно применить вариации, не отступая от принципа, сущности и объема изобретения. Конкретнее, очевидно, понятно, что некоторые реагенты, которые близки в химическом и физиологическом отношении, можно использовать вместо реагентов, описанных здесь, с получением таких же или аналогичных результатов. Все такие аналогичные заменители и модификации, очевидные для специалистов в данной области, не отступают от сущности, объема и принципа изобретения, определенных прилагаемой формулой изобретения.

Источники, цитированные здесь, представленные в такой степени, чтобы они представляли примерный метод или другие прилагаемые подробности, все включены здесь для сведения.

Claims (92)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ получения препарата 1дС-антитела, включающий в себя взаимодействие очищенного препарата 1дС-антитела, которое продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительновосстановительным реагентом.
2. 2. Способ по п.1, где указанное 1дС-антитело выбрано из группы, состоящей из 1дС1-, 1дС2-, 1дС3и 1дС4-антитела или его фрагментов, которые проявляют наличие гетерогенности.
3. 3. Способ по п.1, где указанное 1дС-антитело представляет собой 1дС2-антитело, которое элюируется в виде нескольких отдельных форм при ОФ-ВЭЖХ, и указанный способ приводит к уменьшению количества форм, элюирующихся при ОФ-ВЭЖХ, или изменяет относительное распределение указанных нескольких отдельных форм при указанной ОФ-ВЭЖХ.
4. 4. Способ по п.3, где указанный способ предпочтительно способствует повышению по данным ОФВЭЖХ содержания по меньшей мере одной из указанных нескольких отдельных форм в указанном препарате.
5. 5. Способ по п.4, где указанная предпочтительно обогащенная форма обладает фармацевтически желаемым свойством по сравнению с препаратом, который не был подвергнут обработке указанным способом.
6. 6. Способ по п.1, где указанное 1дС-антитело представляет собой рекомбинантное 1дС1-антитело, содержащее по меньшей мере один свободный остаток цистеина, или фрагмент рекомбинантного 1дС1антитела, содержащий по меньшей мере один свободный остаток цистеина.
7. 7. Способ по п.6, где указанный способ не включает в себя взаимодействия указанного препарата с хаотропным агентом.
8. 8. Способ по п.1, где указанное 1дС-антитело представляет собой 1дС4-антитело и указанный способ способствует снижению образования полумолекул 1дС4.
9. 9. Способ по п.1, где рН указанного связующего окислительно-восстановительного реагента составляет примерно от 5 до примерно 10.
10. 10. Способ по п.1, где рН указанного связующего окислительно-восстановительного реагента составляет примерно от 7,6 до примерно 9,6.
11. 11. Способ по п.1, где рН указанного связующего окислительно-восстановительного реагента составляет примерно 8,6.
12. 12. Способ по п.1, где связующий окислительно-восстановительный реагент содержит восстанов

    - 44 012162 ленный глутатион и окисленный глутатион.
13. 13. Способ по п.12, где отношение восстановленного глутатиона к окисленному глутатиону составляет примерно от 1:1 до примерно 100:1.
14. 14. Способ по п.1, где связующий окислительно-восстановительный реагент содержит цистеин/цистин.
15. 15. Способ по п.14, где смесь цистеин/цистин содержит примерно от 0,1 до примерно 10 мМ цистеина.
16. 16. Способ по п.1, где связующий окислительно-восстановительный реагент содержит примерно от 0,1 до примерно 10 мМ цистина и экзогенный цистеин не добавляют.
17. 17. Способ по п.14, где смесь цистеин/цистин присутствует в соотношении цистеин/цистин в пределах примерно от 1:1 до примерно 10:1.
18. 18. Способ по п.14, где смесь цистеин/цистин содержит примерно 6 мМ цистеина и примерно 1 мМ цистина.
19. 19. Способ по п.14, где смесь цистеин/цистин содержит примерно 6 мМ цистеина и примерно 6 мМ цистамина.
20. 20. Способ по п.14, где стадию взаимодействия проводят по меньшей мере в течение 30 мин.
21. 21. Способ по п.20, где стадию взаимодействия проводят в течение примерно от 4 до примерно 48 ч.
22. 22. Способ по п.1, где указанное рекомбинантное ЦС-антитело очищают до указанного взаимодействия.
23. 23. Способ по п.1, где указанное рекомбинантное ЦС-антитело частично очищают перед указанным взаимодействием.
24. 24. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя взаимодействие подвергнутого взаимодействию рекомбинантного ЦС-антитела с дополнительной композицией, содержащей второй связующий окислительно-восстановительный реагент.
25. 25. Способ по п.1, где перед указанным способом указанное ЦС-антитело выделяют из культуральной среды клеток млекопитающего в способе, включающем в себя культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду ЦС-антитело или фрагмент ЦСантитела; добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, необязательно содержащего хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки.
26. 26. Способ по пп.1 и 25, где очистка включает в себя одну или более стадий хроматографии.
27. 27. Способ по п.1, где концентрация рекомбинантного ЦС-антитела составляет примерно от 1 до примерно 50 мг/мл.
28. 28. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование ^С-антитела, которое является более стабильным при хранении по сравнению с тем же самым ЦС-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.
29. 29. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование ^С-антитела, которое является более термостабильным по сравнению с тем же самым ^С-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.
30. 30. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование ^С-антитела, которое обладает повышенной способностью к кристаллизации по сравнению с тем же самым ^С-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.
31. 31. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование популяции ЦСантител, которая является более гомогенной по сравнению с тем же самым ^С-антителом, которое не подвергалось взаимодействию.
32. 32. Способ по п.1, где указанное взаимодействие обеспечивает продуцирование ЦС-антитела по меньшей мере с двукратно повышенной биологической активностью по сравнению с тем же самым ЦСантителом, которое не подвергалось взаимодействию.
33. 33. Способ по п.1, дополнительно включающий в себя взаимодействие указанного ЦС-антитела с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.
34. 34. Способ по п.33, где указанный хаотропный агент выбран из группы, состоящей из мочевины, аргинина, додецилсульфата натрия и гуанидингидрохлорида.
35. 35. Способ по п.34, где указанный хаотропный агент содержит гуанидингидрохлорид.
36. 36. Способ по п.35, где концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно от 0,1 М до примерно 1,5 М.
37. 37. Способ по п.35, где концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно от 0,1 М до примерно 1 М.
38. 38. Способ по п.35, где концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно 0,5 М.
39. 39. Способ по п.35, где концентрация гуанидингидрохлорида составляет примерно 0,9 М.
40. 40. Способ по п.33, где указанное взаимодействие с указанным связующим окислительновосстановительным реагентом и указанное дополнительное взаимодействие с указанным хаотропным агентом обеспечивает продуцирование ЦС-антитела по меньшей мере с трехкратно повышенной биоло

    - 45 012162 гической активностью по сравнению с тем же самым 1дС-антителом. которое не подвергалось взаимодействию.
41. 41. Способ по п.1 или 33. дополнительно включающий в себя помещение 1дС-антитела. полученного указанным способом. в стерильную объемную форму.
42. 42. Способ по п.1 или 33. дополнительно включающий в себя помещение 1дС-антитела. полученного указанным способом. в стерильную разовую лекарственную форму.
43. 43. Способ по п.1 или 33. дополнительно включающий в себя выделение фракции подвергшегося взаимодействию 1дС-антитела. обладающего желаемой конформацией после рефолдинга.
44. 44. Способ по п.43. где метод указанного выделения выбран из группы. состоящей из обращеннофазовой ВЭЖХ. эксклюзионной гель-хроматографии. ионообменной хроматографии. хроматографии гидрофобного взаимодействия. аффинной хроматографии и электрофореза.
45. 45. Способ по п.43. где методом указанного выделения является ионообменная хроматография.
46. 46. Препарат 1дС-антитела. полученного способом по п.1 или 33. где указанный препарат содержит гомогенную популяцию указанного 1дС-антитела.
47. 47. Препарат по п.46. дополнительно содержащий фармацевтически приемлемый носитель. наполнитель или разбавитель.
48. 48. Композиция. содержащая гомогенную популяцию рекомбинантного 1дС-антитела и фармацевтически приемлемый носитель. наполнитель или разбавитель.
49. 49. Композиция по п.48. где указанное рекомбинантное 1дС-антитело представляет собой 1дС 1 - антитело.
50. 50. Композиция по п.48.

    где указанное рекомбинантное 1дС-антитело представляет собой ЦС2антитело.
51. 51. Композиция по п.48.

    где указанное рекомбинантное 1дС-антитело представляет собой 1дС4антитело.
52. 52. Способ лечения субъекта. нуждающегося в 1дС. включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества гомогенной популяции 1дС по любому из пп.49-51.
53. 53. Способ по п.52. где указанное введение является подкожным или внутривенным введением.
54. 54. Способ детектирования или мониторинга качества рекомбинантного 1дС-антитела в процессе его производства. составления в композицию и/или хранения. включающий в себя:

    а) взаимодействие препарата указанного 1дС. который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего. со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до. после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окисли тельно-восстановительным реагентом;

    b) расщепление молекулы 1дС. которая была обработана на стадии а). на фрагменты и

    c) проведение хроматографического анализа интактного 1дС и/или его фрагментов со стадии Ь). тем самым детектирования или мониторинга качества указанной молекулы 1дС.
55. 55. Способ по п.54. где указанное 1дС-антитело представляет собой 1дС1-антитело. а указанный мониторинг качества включает в себя мониторинг статуса свободного или непарного цистеина в указанном 1дС1-антителе.
56. 56. Способ по п.54. где указанное 1дС-антитело представляет собой 1дС2-антитело. а указанный мониторинг качества включает в себя мониторинг числа форм указанного 1дС2 с целью определения гете рогенности препарата.
57. 57. Способ по п.54. где указанная молекула 1дС представляет собой молекулу 1дС4. а указанный мониторинг качества включает в себя мониторинг присутствия полумолекул 1дС4.
58. 58. Способ по п.54. где хроматография включает в себя анализ ЖХ/МС.
59. 59. Способ по п.54. где детектирование или мониторинг проводят во время стадии очистки молекулы 1дС. где указанная очистка включает в себя колоночную хроматографию.
60. 60. Способ получения рекомбинантного 1дС-антитела или фрагмента 1дС-антитела. включающий в себя взаимодействие 1дС-антитела или фрагмента 1дС-антитела. которое было продуцировано рекомби нантным путем клетками млекопитающего. со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительное взаимодействие указанного 1дС-антитела или фрагмента 1дС-антитела с хаотропным агентом до. после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окис лительно-восстановительным реагентом.
61. 61. Способ по п.60. где перед указанным способом указанное 1дС-антитело или фрагмент 1дСантитела выделяют из культуральной среды клеток млекопитающего в способе. включающем в себя культивирование клетки млекопитающего. которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду 1дС-антитело или фрагмент 1дС-антитела; добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11. необязательно содержащего хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки.

    - 46 012162
62. 62. Способ по п.60, где указанное рекомбинантное 1дС-антитело представляет собой 1дС1.
63. 63. Способ по п.60, где указанное рекомбинантное 1дС-антитело представляет собой 1дС2.
64. 64. Способ по п.60, где указанное рекомбинантное 1дС-антитело представляет собой 1дС4.
65. 65. Способ получения кристаллической формы интактного рекомбинантного 1дС-антитела, включающий в себя осуществление способа по п.1 или 60 и получение кристаллической формы указанного рекомбинантного 1дС-антитела.
66. 66. Способ по п.65, дополнительно включающий в себя выделение рекомбинантного 1дС-антитела, полученного по п.1 или 60, до кристаллизации указанного антитела.
67. 67. Способ по п.1, где указанное рекомбинантное 1дС-антитело присоединено к стационарной фазе хроматографической колонки и редокс-реагенты и хаотропные реагенты являются частью подвижной фазы.
68. 68. Способ по п.1, где указанный связующий окислительно-восстановительный реагент является ферментом.
69. 69. Способ по п.1, где указанный связующий окислительно-восстановительный реагент включает в себя ионы двухвалентного металла и кислород.
70. 70. Способ получения препарата 1дС-антитела, включающий в себя взаимодействие выделенного препарата 1дС-антитела, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительную денатурацию препарата под действием высокого давления до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительновосстановительным реагентом.
71. 71. Способ получения 1дС-антитела или его фрагмента, включающий в себя культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду 1дС-антитело или фрагмент 1дС-антитела;

    добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, необязательно содержащего хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки; и тем самым получения 1дС-антитела или его фрагмента, обладающих улучшенными фармацевтическими и кристаллизационными свойствами по сравнению с 1дС-антителом или его фрагментом, которые не подвергались воздействию указанного связующего окислительно-восстановительного реагента и необязательно хаотропного агента.
72. 72. Способ получения рекомбинантного 1дС-антитела или фрагмента рекомбинантного 1дСантитела на основе клеток млекопитающего, включающий усовершенствование, которое включает в себя добавление в культуральную среду, используемую для продуцирования указанного 1дС-антитела или указанного фрагмента 1дС-антитела, связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно хаотропного агента при секреции указанного 1дСантитела или указанного фрагмента 1дС-антитела в указанную среду.
73. 73. Композиция, содержащая гомогенную популяцию антитела и фармацевтически приемлемый носитель, наполнитель или разбавитель, где указанное антитело имеет аминокислотную последовательность, идентичную последовательности 146В7.
74. 74. Композиция по п.73, где по меньшей мере 90% указанного антитела имеет правильную пространственную упаковку (фолдинг) по данным ограниченного протеолиза при участии Ьук-С-протеазы.
75. 75. Композиция по п.74, где по меньшей мере 90% указанного антитела не цистеинилировано.
76. 76. Композиция по п.73, где указанное антитело представляет собой кристаллизованное антитело.
77. 77. Способ получения препарата 1дС1-антитела, включающий в себя взаимодействие очищенного препарата 1дС 1 -антитела, которое продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.
78. 78. Препарат 1дС1-антитела, полученный способом по п.1 или 33, где указанный препарат содержит гомогенную популяцию указанного 1дС1-антитела.
79. 79. Способ лечения субъекта, нуждающегося в 1дС1, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества гомогенной популяции 1дС1 по любому из пп.49-51.
80. 80. Способ детектирования или мониторинга качества рекомбинантного 1дС 1 -антитела в процессе его производства, составления в композицию и/или хранения, включающий в себя:

    a) взаимодействие препарата указанного 1дС1, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом;

    b) расщепление молекулы 1дС1, которая была обработана на стадии а), на фрагменты и

    - 47 012162

    с) проведение хроматографического анализа интактного 1д01 и/или его фрагментов со стадии Ь), тем самым детектирования или мониторинга статуса свободного или непарного цистеина указанного 1д01-антитела.
81. 81. Способ получения рекомбинантного 1д01-антитела или фрагмента 1д01-антитела, включающий в себя взаимодействие 1д01-антитела или фрагмента 1д01-антитела, которое было продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительное взаимодействие указанного 1д01-антитела или фрагмента 1д01-антитела с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.
82. 82. Способ получения кристаллизованной формы интактного рекомбинантного 1д01-антитела, включающий в себя осуществление способа по п.1 или 60 и получение кристаллизованной формы указанного рекомбинантного 1д01-антитела.
83. 83. Способ получения препарата 1д01-антитела, включающий в себя взаимодействие выделенного препарата 1д01-антитела, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительную денатурацию указанного препарата под действием высокого давления до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительновосстановительным реагентом.
84. 84. Способ получения 1д01-антитела или его фрагмента, включающий в себя культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду 1д01-антитело или фрагмент 1д01-антитела;

    добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, необязательно содержащего хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки; и, тем самым, получения 1д01-антитела или его фрагмента, обладающих улучшенными фармацевтическими и кристаллизационными свойствами по сравнению с 1д01-антителом или его фрагментом, которые не подвергались воздействию указанного связующего окислительно-восстановительного реагента и необязательно хаотропного агента.
85. 85. Способ получения препарата 1д02-антитела, включающий в себя взаимодействие очищенного препарата 1д02-антитела, которое было продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительновосстановительным реагентом.
86. 86. Препарат 1д02-антитела, полученный способом по п.1 или 33, где указанный препарат содержит гомогенную популяцию указанного 1д02-антитела.
87. 87. Способ лечения субъекта, нуждающегося в 1д02, включающий в себя введение указанному субъекту эффективного количества гомогенной популяции 1д02 по любому из пп.49-51.
88. 88. Способ детектирования или мониторинга качества рекомбинантного 1д02-антитела во время его производства, составления композиции и/или хранения, включающий в себя:

    a) взаимодействие препарата указанного 1д02, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительное взаимодействие указанного препарата с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом;

    b) расщепление молекулы 1д02, которая была обработана на стадии а), на фрагменты и

    c) проведение хроматографического анализа интактного 1д02 и/или его фрагментов со стадии Ь), тем самым детектирования или мониторинга числа форм указанного 1д02 в целях определения гетерогенности препарата.
89. 89. Способ получения рекомбинантного 1д02-антитела или фрагмента 1д02-антитела, включающий в себя взаимодействие 1д02-антитела или фрагмента 1д02-антитела, которое было продуцировано рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11; и необязательно дополнительное взаимодействие указанного 1д02-антитела или фрагмента 1д02-антитела с хаотропным агентом до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительно-восстановительным реагентом.
90. 90. Способ получения кристаллизованной формы интактного рекомбинантного 1д02-антитела, включающий в себя осуществление способа по п.1 или 60 и получение кристаллизованной формы ука

    - 48 012162 занного рекомбинантного 1дС2-антитела.
91. 91. Способ получения препарата 1дС2-антитела, включающий в себя взаимодействие выделенного препарата 1дС2-антитела, который продуцирован рекомбинантным путем клетками млекопитающего, со связующим окислительно-восстановительным реагентом при рН примерно от 5 до примерно 11 и необязательно дополнительную денатурацию препарата под действием высокого давления до, после или одновременно с указанным взаимодействием с указанным связующим окислительновосстановительным реагентом.
92. 92. Способ получения 1дС2-антитела или его фрагмента, включающий в себя культивирование клетки млекопитающего, которая экспрессирует и секретирует в культуральную среду 1дС2-антитело или фрагмент 1дС2-антитела;

    добавление связующего окислительно-восстановительного реагента при рН примерно от 5 до примерно 11, необязательно содержащего хаотропный агент при секреции антитела из указанной клетки; и, тем самым, получение 1дС2-антитела или его фрагмента, обладающих улучшенными фармацевтическими и кристаллизационными свойствами по сравнению с 1дС2-антителом или его фрагментом, которые не подвергались воздействию указанного связующего окислительно-восстановительного реагента и необязательно хаотропного агента.