JPH0794475B2 - 純粋なエリスロポエチンの製造法 - Google Patents
純粋なエリスロポエチンの製造法Info
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- JPH0794475B2 JPH0794475B2 JP58148779A JP14877983A JPH0794475B2 JP H0794475 B2 JPH0794475 B2 JP H0794475B2 JP 58148779 A JP58148779 A JP 58148779A JP 14877983 A JP14877983 A JP 14877983A JP H0794475 B2 JPH0794475 B2 JP H0794475B2
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、貧血患者の尿等の高純度に精製され、比活性
の高いエリスロポエチンを効率よく製造する方法に関す
る。
の高いエリスロポエチンを効率よく製造する方法に関す
る。
エリスロポエチン（EPO）は、赤血球生成促進因子とも
呼ばれ、骨髄に存在する赤血球系幹細胞に働いて、赤血
球系細胞への分化を促進させる一種のホルモンであり、
主として腎で生成されると考えられている。EPO生成を
調節するのは、酸素需要供給のバランスであり、酸素欠
乏状態に陥ると生成が亢進し、逆に酸素過剰状態になる
と生成が減少する。例えば、貧血患者では、EPO生成が
増加し、EPOが尿に排泄されるようになる。EPOは市販さ
れており、分子量３〜４万の酸性糖タンパク質である
が、化学構造は完全には、解明されていない。
呼ばれ、骨髄に存在する赤血球系幹細胞に働いて、赤血
球系細胞への分化を促進させる一種のホルモンであり、
主として腎で生成されると考えられている。EPO生成を
調節するのは、酸素需要供給のバランスであり、酸素欠
乏状態に陥ると生成が亢進し、逆に酸素過剰状態になる
と生成が減少する。例えば、貧血患者では、EPO生成が
増加し、EPOが尿に排泄されるようになる。EPOは市販さ
れており、分子量３〜４万の酸性糖タンパク質である
が、化学構造は完全には、解明されていない。
EPOは、貧血患者，手術後患者，腎摘出後の人工透析患
者に広く適用可能な医薬である。また、後述するよう
に、本発明により得られるEPOは高度に純粋であるので
標準試験として使用される。
者に広く適用可能な医薬である。また、後述するよう
に、本発明により得られるEPOは高度に純粋であるので
標準試験として使用される。
尿中にEPOが含まれていることは、前記のとおりである
が、その含量は極めて低く、全尿タンパク質中約0.01〜
0.02重量％程度とみられる。このため、尿からEPOを有
効に得ることは困難であり、通常のクロマト吸着法で
は、EPOを効率よく高純度で採取することはできない。
が、その含量は極めて低く、全尿タンパク質中約0.01〜
0.02重量％程度とみられる。このため、尿からEPOを有
効に得ることは困難であり、通常のクロマト吸着法で
は、EPOを効率よく高純度で採取することはできない。
本発明者らは、免疫抗体を結合させた吸着カラム（抗体
吸着カラム）を使用して、貧血患者の尿等から免疫特異
的にEPOを製造する方法について検討を行ってきた。カ
ラムに使用する抗体を得るべく、精製EPOで免疫したマ
ウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、
モノクローナル抗EPO抗体を産生するハイブリドーマ細
胞を得た。このハイブリドーマ細胞が産生した抗EPO抗
体を結合させて抗体吸着カラムを作成し、これに貧血患
者の尿タンパク質を通したところ、目的のEPOが特異的
に吸着され、収率よく高純度EPOが取得でき、そして、
かかるモノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞から安
定的に得られることを知見し、先に特許出願した（特願
昭58-26399号、特開昭59-155395号）。しかし、前述の
方法で得られたEPO標品は、わずかながら不純物質を含
有していた。そこで、一層純粋にEPOを取得すべく、さ
らに検討したところ、抗体吸着カラムによる処理の後
に、ゲル過による分子量分画操作を加えた結果、極め
て純粋にEPOを取得し得ることを知見し、本発明を完成
させた。
吸着カラム）を使用して、貧血患者の尿等から免疫特異
的にEPOを製造する方法について検討を行ってきた。カ
ラムに使用する抗体を得るべく、精製EPOで免疫したマ
ウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞とを融合させ、
モノクローナル抗EPO抗体を産生するハイブリドーマ細
胞を得た。このハイブリドーマ細胞が産生した抗EPO抗
体を結合させて抗体吸着カラムを作成し、これに貧血患
者の尿タンパク質を通したところ、目的のEPOが特異的
に吸着され、収率よく高純度EPOが取得でき、そして、
かかるモノクローナル抗体がハイブリドーマ細胞から安
定的に得られることを知見し、先に特許出願した（特願
昭58-26399号、特開昭59-155395号）。しかし、前述の
方法で得られたEPO標品は、わずかながら不純物質を含
有していた。そこで、一層純粋にEPOを取得すべく、さ
らに検討したところ、抗体吸着カラムによる処理の後
に、ゲル過による分子量分画操作を加えた結果、極め
て純粋にEPOを取得し得ることを知見し、本発明を完成
させた。
すなわち、本発明は、次の（ｉ）〜（ix）の工程よりな
る高純度に精製され、比活性の高いエロスロポエチンの
製造法に関する。
る高純度に精製され、比活性の高いエロスロポエチンの
製造法に関する。
（ｉ）貧血患者の尿を限外濾過にかけて濃縮してエリス
ロポエチン活性を有する粗タンパク質を得る工程、 （ii）このタンパク質を複数回クロマト処理して吸着と
溶出をくり返して順次エリスロポエチン比活性の高いタ
ンパク質画分を得る工程、 （iii）得られたタンパク質で動物を免疫し、この動物
の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハイ
ブリドーマ細胞を作製し、このハイブリドーマ細胞にエ
リスロポエチンに結合せずエリスロポエチン画分にソジ
ウムドデシルサルファート（以下、SDSという）電気泳
動において近接して低分子側に見出される免疫力の高い
主要タンパク質と結合するモノクローナル抗体を産生さ
せる工程、 （iv）このモノクローナル抗体を結合させたカラムクロ
マトに、工程（ii）で得られた粗精製エリスロポエチン
含有溶液を通過させ、エリスロポエチンに共存する免疫
力の強いタンパク質を除去する工程、 （ｖ）通過液をSDS電気泳動処理してエリスロポエチン
に相当するバンドからタンパク質を抽出し、これを抗原
として動物を免疫し、この動物の脾臓細胞とミエローマ
細胞とを細胞融合させて、ハイブリドーマ細胞を作製
し、このハイブリドーマ細胞からエリスロポエチンに結
合するモノクローナル抗体を産生させる工程、 （vi）このモノクローナル抗体を吸着剤に吸着させる工
程、 （vii）不純物を含むエリスロポエチン含有原料にあら
かじめSDSを加え加熱処理し、ついでSDSを除去する工
程、 （viii）工程（vii）の処理物を工程（vi）で得られた
モノクローナル抗体吸着体にかけ、吸着させ、ついでこ
れを溶出する工程、 （ix）得られた溶出液をゲル濾過処理する工程。
ロポエチン活性を有する粗タンパク質を得る工程、 （ii）このタンパク質を複数回クロマト処理して吸着と
溶出をくり返して順次エリスロポエチン比活性の高いタ
ンパク質画分を得る工程、 （iii）得られたタンパク質で動物を免疫し、この動物
の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハイ
ブリドーマ細胞を作製し、このハイブリドーマ細胞にエ
リスロポエチンに結合せずエリスロポエチン画分にソジ
ウムドデシルサルファート（以下、SDSという）電気泳
動において近接して低分子側に見出される免疫力の高い
主要タンパク質と結合するモノクローナル抗体を産生さ
せる工程、 （iv）このモノクローナル抗体を結合させたカラムクロ
マトに、工程（ii）で得られた粗精製エリスロポエチン
含有溶液を通過させ、エリスロポエチンに共存する免疫
力の強いタンパク質を除去する工程、 （ｖ）通過液をSDS電気泳動処理してエリスロポエチン
に相当するバンドからタンパク質を抽出し、これを抗原
として動物を免疫し、この動物の脾臓細胞とミエローマ
細胞とを細胞融合させて、ハイブリドーマ細胞を作製
し、このハイブリドーマ細胞からエリスロポエチンに結
合するモノクローナル抗体を産生させる工程、 （vi）このモノクローナル抗体を吸着剤に吸着させる工
程、 （vii）不純物を含むエリスロポエチン含有原料にあら
かじめSDSを加え加熱処理し、ついでSDSを除去する工
程、 （viii）工程（vii）の処理物を工程（vi）で得られた
モノクローナル抗体吸着体にかけ、吸着させ、ついでこ
れを溶出する工程、 （ix）得られた溶出液をゲル濾過処理する工程。
本発明における工程（ii）のクロマト処理は、DEAE−セ
ルロース、フェニルセルロース、ヒドロキシルアパタイ
ト、セファデックスを充填したカラムによる処理を順次
行なうことが好ましい。
ルロース、フェニルセルロース、ヒドロキシルアパタイ
ト、セファデックスを充填したカラムによる処理を順次
行なうことが好ましい。
本発明の方法は、EPOを特異的に吸着させ、これを吸着
画分として取得するアフィニティークロマト法の後に、
ゲル過による分子量分画法を組み合わせたものであ
り、この順序を逆にしてゲル過の後にアフィニティー
クロマト法を行っても、EPOを純粋に取得することはで
きない。本発明によれば、使用吸着支持体に結合させた
抗体がモノクローンマル抗体であるから、抗体に同一の
性質を持たせることができ、さらにEPOを免疫特異的に
吸着し、溶出するため、貧血患者尿等から高純度のEPO
を効率よく製造することができる。
画分として取得するアフィニティークロマト法の後に、
ゲル過による分子量分画法を組み合わせたものであ
り、この順序を逆にしてゲル過の後にアフィニティー
クロマト法を行っても、EPOを純粋に取得することはで
きない。本発明によれば、使用吸着支持体に結合させた
抗体がモノクローンマル抗体であるから、抗体に同一の
性質を持たせることができ、さらにEPOを免疫特異的に
吸着し、溶出するため、貧血患者尿等から高純度のEPO
を効率よく製造することができる。
本発明では、モノクローナル抗体の結合した吸着剤が使
用される。そして、このモノクローナル抗体は、ハイブ
リドーマ細胞より産生される。
用される。そして、このモノクローナル抗体は、ハイブ
リドーマ細胞より産生される。
モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、
SDS電気泳動による処理を行ったEPOで免疫した実験動物
の脾臓細胞とミエローマ（骨髄腫）細胞とを細胞融合し
て作られる。この場合の実験動物は、例えば、マウスや
ラット等であり、細胞融合は、同種の動物の細胞間で行
わせるのが好ましい。例えば、マウスの脾臓細胞とマウ
スのミエローマ細胞との間で細胞融合させる。ミエロー
マ細胞は、悪性腫瘍の一種であって増殖性に富む細胞で
ある。
SDS電気泳動による処理を行ったEPOで免疫した実験動物
の脾臓細胞とミエローマ（骨髄腫）細胞とを細胞融合し
て作られる。この場合の実験動物は、例えば、マウスや
ラット等であり、細胞融合は、同種の動物の細胞間で行
わせるのが好ましい。例えば、マウスの脾臓細胞とマウ
スのミエローマ細胞との間で細胞融合させる。ミエロー
マ細胞は、悪性腫瘍の一種であって増殖性に富む細胞で
ある。
マウスに対する免疫（抗原抗体反応）は、EPO、例えば
貧血患者の尿より精製したEPO標品を抗原として使用
し、これをマウスに投与して行う。ここで抗原として使
用されるEPO標品は次のようにして得られたものであっ
てもよい。すなわち、後記実施例で示すように、本発明
方法の前半部分に準じてハイブリドーマ細胞を作成し、
それから得られた抗体を結合してなる吸着カラムに貧血
患者尿を適して逆相クロマトに付し未吸着画分としてEP
Oを得る。
貧血患者の尿より精製したEPO標品を抗原として使用
し、これをマウスに投与して行う。ここで抗原として使
用されるEPO標品は次のようにして得られたものであっ
てもよい。すなわち、後記実施例で示すように、本発明
方法の前半部分に準じてハイブリドーマ細胞を作成し、
それから得られた抗体を結合してなる吸着カラムに貧血
患者尿を適して逆相クロマトに付し未吸着画分としてEP
Oを得る。
マウスへの抗原投与は、通常腹腔内注射するより行わ
れ、免疫を充分に進めるため、例えば２週間の間隔をあ
けて、数回注射をする。注射液は、前記の精製EPOタン
パク質を例えばPBSと呼ばれる燐酸塩緩衝食塩水に溶解
し、これにフロイントのアジュバンドを混合して、エマ
ルジョンを形成させて調製する。
れ、免疫を充分に進めるため、例えば２週間の間隔をあ
けて、数回注射をする。注射液は、前記の精製EPOタン
パク質を例えばPBSと呼ばれる燐酸塩緩衝食塩水に溶解
し、これにフロイントのアジュバンドを混合して、エマ
ルジョンを形成させて調製する。
このようにして免疫したマウスから、免疫処理終了後、
約３日後に、脾臓を摘出し、この脾臓細胞（主にＢ細
胞）と、別に調製したマウスのミエローマ細胞との間で
細胞融合を行わせる。マウスのミエローマ細胞として
は、P3-X63-Ag8，P3-NSI/1−Ag4−1,X63−Ag8 653など
を培養して増殖させたものを使用する。
約３日後に、脾臓を摘出し、この脾臓細胞（主にＢ細
胞）と、別に調製したマウスのミエローマ細胞との間で
細胞融合を行わせる。マウスのミエローマ細胞として
は、P3-X63-Ag8，P3-NSI/1−Ag4−1,X63−Ag8 653など
を培養して増殖させたものを使用する。
細胞融合は、公知の技法に従って行われる。通常、ペニ
シリン（100単位/ml）及びストレプトマイシン（100μg
/ml）さらに2mMグルタミン,1mMピルビン酸を添加したRP
MI 1640 合成培養液（以下RPMI 1640液と記す）と牛退
治血清（FCS）との混合液中で前記脾臓組織を細断し、
単細胞化して充分細胞を分散したのち、RPMI 1640液に
分散し、これに前記ミエローマ細胞を融合し、遠心後、
上清を除去した混合細胞に対し、細胞融合剤のポリエチ
レングリコール1500の50％溶液を添加して細胞融合させ
る。
シリン（100単位/ml）及びストレプトマイシン（100μg
/ml）さらに2mMグルタミン,1mMピルビン酸を添加したRP
MI 1640 合成培養液（以下RPMI 1640液と記す）と牛退
治血清（FCS）との混合液中で前記脾臓組織を細断し、
単細胞化して充分細胞を分散したのち、RPMI 1640液に
分散し、これに前記ミエローマ細胞を融合し、遠心後、
上清を除去した混合細胞に対し、細胞融合剤のポリエチ
レングリコール1500の50％溶液を添加して細胞融合させ
る。
かくして作られた融合細胞の中から雑種のいわゆるハイ
ブリドーマ細胞を公知のHAT選択によって選び出す。
ブリドーマ細胞を公知のHAT選択によって選び出す。
HAT選択は、マイクロタイタープレートを使用して行う
ことができる。例えば、同種及び雑種の融合細胞を96穴
マイクロタイタープレート上にまいて、HAT（ヒポキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン）培養液で培養を行
い、約２週間後、ハイブリドーマが死滅しないで増殖し
ている穴を確認し、ハイブリドーマを得る。
ことができる。例えば、同種及び雑種の融合細胞を96穴
マイクロタイタープレート上にまいて、HAT（ヒポキサ
ンチン−アミノプテリン−チミジン）培養液で培養を行
い、約２週間後、ハイブリドーマが死滅しないで増殖し
ている穴を確認し、ハイブリドーマを得る。
次に、かくして選ばれたハイブリドーマについて、EPO
と特異的に結合する抗体を産生するか否かをソリッドフ
ェーズ法にて検定したのち、さらに本ハイブリドーマを
マウス腹腔内に移植して腹水を発生させ、腹水から、公
知の方法、例えば硫安分画法及びイオン交換カラムクロ
マト法により、免疫グロブリン（IgO）を得る。この抗
体を吸着剤に結合させ、得られた抗体結合吸着剤をカラ
ムに充填し、抗体吸着カラムを作成し、このカラムに、
EPO標品を通し、EPOの吸着能を調べ、ハイブリドーマが
抗EPO抗体を産生するか否かを検定する。この目的に使
用される吸着剤としては、例えば、アフィゲル（バイオ
ラッド社製）、セファデックス（ファルマシア社製）が
ある。このようにして得られた抗EPO抗体産生ハイブリ
ドーマは、さらに公知の限界希釈法により、モノクロー
ン化を行う。抗EPO抗体の産生能は、前記のソリッドフ
ェーズ法及び抗体吸着カラムへのEPOの吸着能で検定を
行う。この中から、安定してモノクローナル抗体を産生
する細胞を選出する。この細胞は、凍結保存が可能であ
るので、必要に応じて融解してマウスの腹腔内に移植す
ればよく、この点必要な抗体を永続的かつ安定的に供給
することができ好都合である。
と特異的に結合する抗体を産生するか否かをソリッドフ
ェーズ法にて検定したのち、さらに本ハイブリドーマを
マウス腹腔内に移植して腹水を発生させ、腹水から、公
知の方法、例えば硫安分画法及びイオン交換カラムクロ
マト法により、免疫グロブリン（IgO）を得る。この抗
体を吸着剤に結合させ、得られた抗体結合吸着剤をカラ
ムに充填し、抗体吸着カラムを作成し、このカラムに、
EPO標品を通し、EPOの吸着能を調べ、ハイブリドーマが
抗EPO抗体を産生するか否かを検定する。この目的に使
用される吸着剤としては、例えば、アフィゲル（バイオ
ラッド社製）、セファデックス（ファルマシア社製）が
ある。このようにして得られた抗EPO抗体産生ハイブリ
ドーマは、さらに公知の限界希釈法により、モノクロー
ン化を行う。抗EPO抗体の産生能は、前記のソリッドフ
ェーズ法及び抗体吸着カラムへのEPOの吸着能で検定を
行う。この中から、安定してモノクローナル抗体を産生
する細胞を選出する。この細胞は、凍結保存が可能であ
るので、必要に応じて融解してマウスの腹腔内に移植す
ればよく、この点必要な抗体を永続的かつ安定的に供給
することができ好都合である。
以上のようにして選出した、モノクローナル抗EPO抗体
産生ハイブリドーマ細胞により、前記と同様にして、マ
ウス腹腔内で生産させたモノクローナル抗EPO抗体を精
製後、吸着支持体に結合し、抗体結合吸着剤を作成す
る。これを原料のEPO含有物、好ましくは、貧血患者の
尿又はその処理物と接触させ、EPOを吸着させ、次いで
溶出し、吸着画分としてEPOを取得する。本EPO液を濃縮
後、ゲル過に付し、高分子の不純物質を除去して純粋
なEPOを取得する。
産生ハイブリドーマ細胞により、前記と同様にして、マ
ウス腹腔内で生産させたモノクローナル抗EPO抗体を精
製後、吸着支持体に結合し、抗体結合吸着剤を作成す
る。これを原料のEPO含有物、好ましくは、貧血患者の
尿又はその処理物と接触させ、EPOを吸着させ、次いで
溶出し、吸着画分としてEPOを取得する。本EPO液を濃縮
後、ゲル過に付し、高分子の不純物質を除去して純粋
なEPOを取得する。
本発明の原料であるEPO含有物としては、正常人尿若し
くは、貧血患者尿又はその各処理物、或は、EPO産生細
胞の培養上清液又は、EPO産生細胞移植動物の体液、組
織抽出液若しくは、尿などが挙げられる。例えば、尿中
のブロテアーゼを失活させるため、予め、フェノール処
理又は加熱処理を行ってもよい。本発明は、ソジウム
ドデシル サルフェート（SDS）処理を行う。すなわ
ち、不純物を含むEPO含有原料にSDSを加えて加熱処理す
る。EPO含有原料は、前記した原料を限外濾過して濃縮
し、これを凍結乾燥した粉末が望ましい。この粉末をPB
Sに溶解し（約５％前後）、外液をPBSとして透析を行っ
て無機物を除き、これを遠心して得られる上清液に２％
SDSになるようにSDS粉末を加えて100℃で３分間加熱処
理する。これを４℃前後に冷却し、０℃に１夜放置し遠
心分離しSDSを除き、得られる上清液をカラム操作に用
いる。このようにすると、原料中に含有されるEPOが前
記したモノクロナール抗体に特異的に吸着される。
くは、貧血患者尿又はその各処理物、或は、EPO産生細
胞の培養上清液又は、EPO産生細胞移植動物の体液、組
織抽出液若しくは、尿などが挙げられる。例えば、尿中
のブロテアーゼを失活させるため、予め、フェノール処
理又は加熱処理を行ってもよい。本発明は、ソジウム
ドデシル サルフェート（SDS）処理を行う。すなわ
ち、不純物を含むEPO含有原料にSDSを加えて加熱処理す
る。EPO含有原料は、前記した原料を限外濾過して濃縮
し、これを凍結乾燥した粉末が望ましい。この粉末をPB
Sに溶解し（約５％前後）、外液をPBSとして透析を行っ
て無機物を除き、これを遠心して得られる上清液に２％
SDSになるようにSDS粉末を加えて100℃で３分間加熱処
理する。これを４℃前後に冷却し、０℃に１夜放置し遠
心分離しSDSを除き、得られる上清液をカラム操作に用
いる。このようにすると、原料中に含有されるEPOが前
記したモノクロナール抗体に特異的に吸着される。
本発明において、EPOは、アファニティークロマト法の
通常の技法により取得することができる。吸着カラムを
使用する場合には、前記の尿処理液をカラムに通し、EP
Oを吸着し、溶出液としてEPOを取得する。以上のごとき
抗体吸着法では、モノクローナル抗EPO抗体がEPOを特異
的に吸着する結果、カラムを１回通すだけで、溶出液と
してEPOを特異的に高純度で効率よく取得することがで
きる。
通常の技法により取得することができる。吸着カラムを
使用する場合には、前記の尿処理液をカラムに通し、EP
Oを吸着し、溶出液としてEPOを取得する。以上のごとき
抗体吸着法では、モノクローナル抗EPO抗体がEPOを特異
的に吸着する結果、カラムを１回通すだけで、溶出液と
してEPOを特異的に高純度で効率よく取得することがで
きる。
この高純度EPOは、しかし、いくばくかの不純タンパク
質を含んでいるが、さらに本高純度EPO溶液を濃縮後、
ゲル過に付すと、高分子の不純タンパク質を取り除く
ことができ、一層純粋なEPOを効率よく取得することが
できる。
質を含んでいるが、さらに本高純度EPO溶液を濃縮後、
ゲル過に付すと、高分子の不純タンパク質を取り除く
ことができ、一層純粋なEPOを効率よく取得することが
できる。
EPOの純度は、液中のタンパク質のEPO活性（単位）を測
定することにより決めることができる。EPO活性の測定
法としては、マウス胎児肝細胞を用い赤血球系コロニー
を形態学的に観察するコロニー法、3 H−チミジンのDNA
への取り込み率をインビトロ（in vitro）で調べる3 H−
チミジン法、59Feのヘムへの取り込み率をインビトロで
調べる59Fe法（Br.J.Haematol.47,461-468（1981）参
照）、59Feの飢餓状態にしたラットにおいて59Feのヘム
への取り込み率をインビボ（in vivo）で調べる飢餓ラ
ット法（Methods in Enzymology37,109-121（1975）参
照）等が知られている。本発明の後記実施例で示すEPO
活性は、59Fe法，3 H−チミジン法，或は飢餓ラット法で
測定されたものである。EPO測定の標準物質としてはフ
ェニルヒドラジン処理した貧血ヒツジの血しようから調
製されたEPO（カナダ，コンノート社製，エリスロポエ
チンステップ３）を用いることができる。
定することにより決めることができる。EPO活性の測定
法としては、マウス胎児肝細胞を用い赤血球系コロニー
を形態学的に観察するコロニー法、3 H−チミジンのDNA
への取り込み率をインビトロ（in vitro）で調べる3 H−
チミジン法、59Feのヘムへの取り込み率をインビトロで
調べる59Fe法（Br.J.Haematol.47,461-468（1981）参
照）、59Feの飢餓状態にしたラットにおいて59Feのヘム
への取り込み率をインビボ（in vivo）で調べる飢餓ラ
ット法（Methods in Enzymology37,109-121（1975）参
照）等が知られている。本発明の後記実施例で示すEPO
活性は、59Fe法，3 H−チミジン法，或は飢餓ラット法で
測定されたものである。EPO測定の標準物質としてはフ
ェニルヒドラジン処理した貧血ヒツジの血しようから調
製されたEPO（カナダ，コンノート社製，エリスロポエ
チンステップ３）を用いることができる。
本発明ではゲル過を終りの工程で行うことにより、得
られるEPOの純度は格段に向上しており、この製品EPO
は、医薬品としてのみならず、臨床検査時の標準試薬と
しても有用なものである。すなわち、本発明品は、骨髄
細胞の臨床検査における赤血球系幹細胞分析用標準試薬
として用いられ、このものは下記第１表に示すように、
比活性で表した純度が従来の市販品に比し極めて高い。
られるEPOの純度は格段に向上しており、この製品EPO
は、医薬品としてのみならず、臨床検査時の標準試薬と
しても有用なものである。すなわち、本発明品は、骨髄
細胞の臨床検査における赤血球系幹細胞分析用標準試薬
として用いられ、このものは下記第１表に示すように、
比活性で表した純度が従来の市販品に比し極めて高い。
赤血球系幹細胞の分析に従来の市販品をEPO標品として
用いた場合、不純物質による悪影響が現われ、結果は良
好なものではなかった。これに対し、本発明のEPO標品
は高純度のゆえに標準試薬として好結果を与え、極めて
有効なものである。
用いた場合、不純物質による悪影響が現われ、結果は良
好なものではなかった。これに対し、本発明のEPO標品
は高純度のゆえに標準試薬として好結果を与え、極めて
有効なものである。
また、血清用の体液や組織におけるEPOレベルの測定
は、ラジオイムノアツセイ又は赤血球凝集阻止反応によ
りウサギで作成した抗EPO抗体を用いて行われるが、こ
の抗体作成に従来の市販品を使用すると低純度のゆえに
有効な抗EPO抗体がえられず、したがつて良好な測定結
果は得られなかった。このような免疫学的EPOレベル測
定に高純度の本発明品を使用すると、良好な結果が得ら
れる。
は、ラジオイムノアツセイ又は赤血球凝集阻止反応によ
りウサギで作成した抗EPO抗体を用いて行われるが、こ
の抗体作成に従来の市販品を使用すると低純度のゆえに
有効な抗EPO抗体がえられず、したがつて良好な測定結
果は得られなかった。このような免疫学的EPOレベル測
定に高純度の本発明品を使用すると、良好な結果が得ら
れる。
次に本発明を実施例によって説明する。
実施例 （Ａ）実験動物の免疫に使用するEPOの調製 貧血患者の尿600lを限外過装置に通し、分子量10,000
までの低分子物質を除去することにより濃縮を行い、さ
らに水を加えて同様に濃縮することにより脱塩を行っ
た。得られた尿濃縮液20lを凍結乾燥して全尿タンパク
質粉末31.0g（EPO活性1,800,000単位/31.0g）を得た。
（尚、タンパク質量は、以下の操作を含め、OVA（卵白
アルビミン）を標準タンパク質として、バイオラッド社
製プロテインアッセイキットにより測定した。） 〔第１回クロマト〕 この粉末を5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液に溶解し、
予め5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液で平衡化したDEAE
−セルロース充填カラムに通して尿タンパク質を吸着さ
せた後、200mMNaClを含む5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝
液で溶出し、EPO活性画分を得た。このものに含まれる
タンパク質は、16.0gであり、EPO比活性は、99単位/mg
タンパク質であった。
までの低分子物質を除去することにより濃縮を行い、さ
らに水を加えて同様に濃縮することにより脱塩を行っ
た。得られた尿濃縮液20lを凍結乾燥して全尿タンパク
質粉末31.0g（EPO活性1,800,000単位/31.0g）を得た。
（尚、タンパク質量は、以下の操作を含め、OVA（卵白
アルビミン）を標準タンパク質として、バイオラッド社
製プロテインアッセイキットにより測定した。） 〔第１回クロマト〕 この粉末を5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液に溶解し、
予め5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝液で平衡化したDEAE
−セルロース充填カラムに通して尿タンパク質を吸着さ
せた後、200mMNaClを含む5mMトリス−HCl（pH6.8）緩衝
液で溶出し、EPO活性画分を得た。このものに含まれる
タンパク質は、16.0gであり、EPO比活性は、99単位/mg
タンパク質であった。
〔第２回クロマト〕 得られた前記EPO活性画分を水に対し透析し、透析物を
凍結乾燥して粉末を得た。この粉末を10mM燐酸ナトリウ
ム（pH6.8）と4MNaClからなる緩衝液に溶解し、予め10m
M燐酸ナトリウム（pH6.8）と4MNaClからなる緩衝液で平
衡化したフェニルセファロースCL-4B充填カラムに通し
て、タンパク質を吸着させた後、10mM燐酸ナトリウム
（pH7.1）と0.5MNaClからなる緩衝液で洗浄し、次いで1
0mMNaOH、20％エチレングリコール及び6M塩酸グアニジ
ンからなる混合液で溶出し、EPO活性画分を得た。この
ものに含まれるタンパク質は2.3gであり、EPO比活性
は、421単位/mgタンパク質であった。
凍結乾燥して粉末を得た。この粉末を10mM燐酸ナトリウ
ム（pH6.8）と4MNaClからなる緩衝液に溶解し、予め10m
M燐酸ナトリウム（pH6.8）と4MNaClからなる緩衝液で平
衡化したフェニルセファロースCL-4B充填カラムに通し
て、タンパク質を吸着させた後、10mM燐酸ナトリウム
（pH7.1）と0.5MNaClからなる緩衝液で洗浄し、次いで1
0mMNaOH、20％エチレングリコール及び6M塩酸グアニジ
ンからなる混合液で溶出し、EPO活性画分を得た。この
ものに含まれるタンパク質は2.3gであり、EPO比活性
は、421単位/mgタンパク質であった。
〔第３回クロマト〕 得られた前記EPO活性画分を水に対して透析し、透析物
を凍結乾燥させて粉末を得た。このものを5mM燐酸ナト
リウム（pH6.9）緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に対し透
析した。予め5mM燐酸ナトリウム（pH6.9）緩衝液で平衡
化したヒドロキシルアパタイト充填カラムに前記透析溶
液を通し、非吸着画分を得た。このものに含まれるタン
パク質は672mgであり、EPO比活性は1,240単位/mgタンパ
ク質であった。
を凍結乾燥させて粉末を得た。このものを5mM燐酸ナト
リウム（pH6.9）緩衝液に溶解し、同じ緩衝液に対し透
析した。予め5mM燐酸ナトリウム（pH6.9）緩衝液で平衡
化したヒドロキシルアパタイト充填カラムに前記透析溶
液を通し、非吸着画分を得た。このものに含まれるタン
パク質は672mgであり、EPO比活性は1,240単位/mgタンパ
ク質であった。
〔第４回クロマト〕 得られた前記EPO活性画分（非吸着画分）を水に対し透
析し、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このものを10
mM燐酸ナトリウム（pH6.9）と150nMNaClからなる緩衝液
に溶解した。予め、前記と同じ緩衝液で平衡化したセフ
ァデックスG100充填カラムに、前記溶液を通し、分子量
による分画を行い、EPO活性画分を得た。このものに含
まれるタンパク質は83mgであり、EPO比活性は3,000単位
/mgタンパク質であった。
析し、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このものを10
mM燐酸ナトリウム（pH6.9）と150nMNaClからなる緩衝液
に溶解した。予め、前記と同じ緩衝液で平衡化したセフ
ァデックスG100充填カラムに、前記溶液を通し、分子量
による分画を行い、EPO活性画分を得た。このものに含
まれるタンパク質は83mgであり、EPO比活性は3,000単位
/mgタンパク質であった。
〔第５回クロマト〕 前記EPO活性画分を水に対して透析後、透析物を凍結乾
燥して粉末を得た。このものを5mMCaCl2（pH7.0）水溶
液を溶解した後、同じ水溶液に対し透析し、次いで0.1N
HClでpH4.5に調整した。予め5mMCaCl2（pH4.5）水溶液
で平衡化したSP−セファデックス充填カラムに前記調整
後の液を通し、タンパク質を吸着後、5mM酢酸カルシウ
ム（pH4.5）緩衝液で洗浄し、次いで、20mM酢酸カルシ
ウム（pH5.5）緩衝液で溶出し、EPO活性画分を得た。こ
のものに含まれるタンパク質は16mgであり、EPO比活性
は5,100単位/mgタンパク質であった。
燥して粉末を得た。このものを5mMCaCl2（pH7.0）水溶
液を溶解した後、同じ水溶液に対し透析し、次いで0.1N
HClでpH4.5に調整した。予め5mMCaCl2（pH4.5）水溶液
で平衡化したSP−セファデックス充填カラムに前記調整
後の液を通し、タンパク質を吸着後、5mM酢酸カルシウ
ム（pH4.5）緩衝液で洗浄し、次いで、20mM酢酸カルシ
ウム（pH5.5）緩衝液で溶出し、EPO活性画分を得た。こ
のものに含まれるタンパク質は16mgであり、EPO比活性
は5,100単位/mgタンパク質であった。
〔第６回クロマト〕 前記EPO活性画分を、予めPBSで平衡化したセファデック
スG50充填カラムに通した後、前記の緩衝液で溶出してE
PO活性画分を得た。この液を後記の抗体結合吸着カラム
に通して逆相クロマトに付し、未吸着画分を得た。この
ものに含まれるタンパク質は4mgであり、EPO比活性は、
25000単位/mgタンパク質であった。
スG50充填カラムに通した後、前記の緩衝液で溶出してE
PO活性画分を得た。この液を後記の抗体結合吸着カラム
に通して逆相クロマトに付し、未吸着画分を得た。この
ものに含まれるタンパク質は4mgであり、EPO比活性は、
25000単位/mgタンパク質であった。
前記カラムは次のようにして作った。すなわち、第５回
クロマト後のEPO標品で免疫したマウスを用いて本発明
方法の前半部分に準じてハイブリドーマ細胞を作成し、
これより得られる抗体のうちから、SDS電気泳動を作っ
たとき、EPO活性に近接して低分子側に見出される免疫
力の高い主要タンパク質と結合するところの抗体を選び
出し、この抗体をアファゲルー10（バイオラッド社製）
に結合させて抗体結合吸着カラムを作った。
クロマト後のEPO標品で免疫したマウスを用いて本発明
方法の前半部分に準じてハイブリドーマ細胞を作成し、
これより得られる抗体のうちから、SDS電気泳動を作っ
たとき、EPO活性に近接して低分子側に見出される免疫
力の高い主要タンパク質と結合するところの抗体を選び
出し、この抗体をアファゲルー10（バイオラッド社製）
に結合させて抗体結合吸着カラムを作った。
得られたEPO活性画分（未吸着画分）を水に対して透析
し、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このものを２％
SDSを含むトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）に溶解し、常法
により、13％ポリアクリルアミドゲルSDS電気泳動を行
い、EPO活性画分のゲルを切り出した。ゲルに対し３倍
量のPBSを添加し、ゲルを磨細した。このものに含まれ
るタンパク質は1.2mgであり、EPO比活性は50,000単位/m
gタンパク質であった。抽出液を水に対し透析した後凍
結乾燥して粉末を得た。
し、透析物を凍結乾燥して粉末を得た。このものを２％
SDSを含むトリス−塩酸緩衝液（pH6.8）に溶解し、常法
により、13％ポリアクリルアミドゲルSDS電気泳動を行
い、EPO活性画分のゲルを切り出した。ゲルに対し３倍
量のPBSを添加し、ゲルを磨細した。このものに含まれ
るタンパク質は1.2mgであり、EPO比活性は50,000単位/m
gタンパク質であった。抽出液を水に対し透析した後凍
結乾燥して粉末を得た。
（Ｂ）目的物エリスロポエチンの製造 〔マウスの免疫〕 前記のSDS電気泳動精製EPO標品を抗原として使用し、マ
ウス（BALB/Cマウス）に対し次のとおり３回の免疫を行
った。
ウス（BALB/Cマウス）に対し次のとおり３回の免疫を行
った。
第１回−PBS（リン酸塩緩衝食塩水）中に精製EPOタンパ
ク質を200μg/mlで溶解し、これにフロイント完全アジ
ュバンドを混合して得たエマルジョンをマウスに対し、
0.5ml（EPOタンパク質50μｇ）を腹腔内注射で投与し
た。
ク質を200μg/mlで溶解し、これにフロイント完全アジ
ュバンドを混合して得たエマルジョンをマウスに対し、
0.5ml（EPOタンパク質50μｇ）を腹腔内注射で投与し
た。
第２回−PBS中に精製EPOタンパク質100μg/mlで溶解
し、これにフロイント完全アジュバンドを混合して得た
エマルジョンを２週間後にマウスに対し、0.5ml（EPOタ
ンパク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。
し、これにフロイント完全アジュバンドを混合して得た
エマルジョンを２週間後にマウスに対し、0.5ml（EPOタ
ンパク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。
第３回−PBS中に精製EPOタンパク質50μg/mlで溶解した
液をさらに２週間後にマウスに対し、0.5ml（EPOタンパ
ク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。
液をさらに２週間後にマウスに対し、0.5ml（EPOタンパ
ク質25μｇ）を腹腔内注射で投与した。
前記免疫処理終了から３日後に、免疫マウスの脾臓細胞
を無菌的に摘出し、合成培養液RPMI1640液と15％牛胎児
血清（FCS）との混合液で洗浄後、該混合液中で脾臓組
織をハサミで細断して単細胞化を行い、該混合液で２回
洗浄した後、単細胞化した細胞をRPMI 1640液に分散し
た。細胞数は、2.0×108個であった。
を無菌的に摘出し、合成培養液RPMI1640液と15％牛胎児
血清（FCS）との混合液で洗浄後、該混合液中で脾臓組
織をハサミで細断して単細胞化を行い、該混合液で２回
洗浄した後、単細胞化した細胞をRPMI 1640液に分散し
た。細胞数は、2.0×108個であった。
別にマウスのミエローマ細胞（P3−NSI/1−Ag4−１）を
前記RPMI及びFCSの混合液中で培養し、増殖した細胞をR
PMI 1640液で洗浄した。細胞数は1.0×108個であった。
前記RPMI及びFCSの混合液中で培養し、増殖した細胞をR
PMI 1640液で洗浄した。細胞数は1.0×108個であった。
次に前記で調製した免疫マウス脾臓細胞とマウスミエロ
ーマ細胞とをRPMI 1640液に分散し、混合したのち、遠
心し、上清を除去した。混合細胞を、ポリエチレングリ
コール1500の50％溶液中で細胞融合させた後、融合細胞
群をHT培養液（ヒポキサンチン，チミジン及び15％牛胎
児血清を含むRPMI 1640液）に混合し、混合液を３枚の9
6穴マイクロタイターブレートにまいて、２日目以降、H
AT培養液（ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン
及び15％牛胎児血清を含むRPMI 1640液）を添加して、
各穴で２週間培養してHAT選択を行った。増殖したハイ
ブリドーマ細胞を264穴において確認した。
ーマ細胞とをRPMI 1640液に分散し、混合したのち、遠
心し、上清を除去した。混合細胞を、ポリエチレングリ
コール1500の50％溶液中で細胞融合させた後、融合細胞
群をHT培養液（ヒポキサンチン，チミジン及び15％牛胎
児血清を含むRPMI 1640液）に混合し、混合液を３枚の9
6穴マイクロタイターブレートにまいて、２日目以降、H
AT培養液（ヒポキサンチン，アミノプテリン，チミジン
及び15％牛胎児血清を含むRPMI 1640液）を添加して、
各穴で２週間培養してHAT選択を行った。増殖したハイ
ブリドーマ細胞を264穴において確認した。
前記で得た264種類のハイブリドーマより、特定の細
胞、すなわち、精製EPO標品と特異的に結合しうる抗体
を産生するハイブリドーマを選び出すために、ビオチン
−アビジンシステムを用いるソリッドフェーズ法によ
り、スクリーニングを行った。その結果、目的に適合し
たものとして、19種類の細胞が選出され、そのうち７種
類が安定的に抗体産生を行うことを認めた。
胞、すなわち、精製EPO標品と特異的に結合しうる抗体
を産生するハイブリドーマを選び出すために、ビオチン
−アビジンシステムを用いるソリッドフェーズ法によ
り、スクリーニングを行った。その結果、目的に適合し
たものとして、19種類の細胞が選出され、そのうち７種
類が安定的に抗体産生を行うことを認めた。
前記７種類の各細胞を用いて抗体吸着カラムを作成し、
EPO活性の吸着能を検定し、抗EPO抗体産生細胞の選択を
行った。
EPO活性の吸着能を検定し、抗EPO抗体産生細胞の選択を
行った。
すなわち、それぞれの細胞いついて７匹のマウスに対
し、１つの種類の細胞をマウス１匹当り、５×106個腹
腔内に注射して抗体を産生させた後、マウスから腹水を
採取し、これを45％飽和硫安水溶液で硫安分画に付した
後、DE52（DEAE−セルロース）充填カラムに通し、免疫
グロブリン（IgG）20〜30mgを得た。前記で得られたIgG
画分をアフィゲル10（バイオラッド社製）と結合し、抗
体吸着カラムを作成した。すなわち、アフィゲル10をガ
ラスフィルター上で氷水冷却下イソプロパノールで洗浄
し、さらに氷水で３回洗浄し、ゲルを回収した。このゲ
ルと、前記で得た固体を含む液（0.2MNaHCO3 pH8.3-0.3
MNaCl）とを等容量で混合し、４℃で５時間攪拌しなが
ら結合反応を行わせた。反応後、ゲルを遠心回収した。
このものを0.1MNaHCO3と0.15MNaClの混合液で２回洗浄
後、0.1Mエタノールアミン−塩酸塩（pH8）と室温で１
時間よく混合して、抗体結合ゲルを得た。このゲルをカ
ラムに充填して、抗体吸着カラムを作成した）７種類の
ハイブリドーマにつき各１本、合計７本）。ここで得た
７本の抗体吸着カラムに対して、前記精製EPO標品を用
い、EPO活性吸着能を検定した。
し、１つの種類の細胞をマウス１匹当り、５×106個腹
腔内に注射して抗体を産生させた後、マウスから腹水を
採取し、これを45％飽和硫安水溶液で硫安分画に付した
後、DE52（DEAE−セルロース）充填カラムに通し、免疫
グロブリン（IgG）20〜30mgを得た。前記で得られたIgG
画分をアフィゲル10（バイオラッド社製）と結合し、抗
体吸着カラムを作成した。すなわち、アフィゲル10をガ
ラスフィルター上で氷水冷却下イソプロパノールで洗浄
し、さらに氷水で３回洗浄し、ゲルを回収した。このゲ
ルと、前記で得た固体を含む液（0.2MNaHCO3 pH8.3-0.3
MNaCl）とを等容量で混合し、４℃で５時間攪拌しなが
ら結合反応を行わせた。反応後、ゲルを遠心回収した。
このものを0.1MNaHCO3と0.15MNaClの混合液で２回洗浄
後、0.1Mエタノールアミン−塩酸塩（pH8）と室温で１
時間よく混合して、抗体結合ゲルを得た。このゲルをカ
ラムに充填して、抗体吸着カラムを作成した）７種類の
ハイブリドーマにつき各１本、合計７本）。ここで得た
７本の抗体吸着カラムに対して、前記精製EPO標品を用
い、EPO活性吸着能を検定した。
すなわち、EPO標品をPBSに溶解し、この液を予めPBSで
平衡化した前記吸着カラムに通した。溶出は0.2M酢酸と
0.15MNaClとの混合液で行い、未吸着画分及び溶出画分
のEPO活性を測定した。ここで得た７種のカラムのうち
３種類についてEPO活性の吸着を認めた。
平衡化した前記吸着カラムに通した。溶出は0.2M酢酸と
0.15MNaClとの混合液で行い、未吸着画分及び溶出画分
のEPO活性を測定した。ここで得た７種のカラムのうち
３種類についてEPO活性の吸着を認めた。
前記３種類の抗EPO抗体産生ハイブリドーマについて、
常法に従い、限界希釈法により、クローニングを行っ
た。
常法に従い、限界希釈法により、クローニングを行っ
た。
すなわち、ハイブリドーマ細胞50個と４週令BALB/Cマウ
スの胸腺より常法により調製した胸腺細胞108個をRPMI
1640液と15％FCSとの混合液10mlに分散し、96穴マイク
ロタイタープレートの各穴に0.1mlずつまき、５日目及
び12日目にRPMI 1640液と15％FCSの混合液（培養液）を
添加し、増殖したハイブリドーマ細胞について前記と同
様にしてソリッドフェーズ法による抗EPO抗体産生細胞
のスクリーニングを行い、さらにEPO吸着能による抗EPO
抗体産生細胞の選択を行いクローニングを行った。この
ようにして、前記３種類の抗EPO抗体産生ハイブリドー
マよりそれぞれ細胞株Ｅ−1,E−2,E−３を樹立した。
スの胸腺より常法により調製した胸腺細胞108個をRPMI
1640液と15％FCSとの混合液10mlに分散し、96穴マイク
ロタイタープレートの各穴に0.1mlずつまき、５日目及
び12日目にRPMI 1640液と15％FCSの混合液（培養液）を
添加し、増殖したハイブリドーマ細胞について前記と同
様にしてソリッドフェーズ法による抗EPO抗体産生細胞
のスクリーニングを行い、さらにEPO吸着能による抗EPO
抗体産生細胞の選択を行いクローニングを行った。この
ようにして、前記３種類の抗EPO抗体産生ハイブリドー
マよりそれぞれ細胞株Ｅ−1,E−2,E−３を樹立した。
前記のクローニングにより得た抗EPO抗体産生細胞株
（Ｅ−２）を用いて、抗体産生を行った。すなわち、前
記と同様に、マウスの腹腔内で抗体を産生させ、45％硫
安分画に付した後、DE52（ワットマン社製,DEAE−セル
ロース）充填カラムに通し、未吸着画分として精製免疫
グロブリン（IgG）を得た。マウス250匹を用い、750mg
の精製モノクローナル抗体を得た。
（Ｅ−２）を用いて、抗体産生を行った。すなわち、前
記と同様に、マウスの腹腔内で抗体を産生させ、45％硫
安分画に付した後、DE52（ワットマン社製,DEAE−セル
ロース）充填カラムに通し、未吸着画分として精製免疫
グロブリン（IgG）を得た。マウス250匹を用い、750mg
の精製モノクローナル抗体を得た。
前記と同様の操作でIgGとアフィゲル10との間で結合を
行わせ、20mlの抗体結合ゲルを得た。尚、本ゲルにはIg
G710mgが結合した。このゲルをカラムに充填し、吸着カ
ラム（3.2cm×2.5cm）を作成した。
行わせ、20mlの抗体結合ゲルを得た。尚、本ゲルにはIg
G710mgが結合した。このゲルをカラムに充填し、吸着カ
ラム（3.2cm×2.5cm）を作成した。
原料液を調製するため、本実施例の前記「実験動物の免
疫に使用するEPOの精製」の項の冒頭で記載した限外
過装置を用いて700lの貧血患者尿より、調製した全尿タ
ンパク質粉末34g（792,000単位）をPBS700mlに溶解し、
外液60lのPBSに対し、１夜透析を行い、遠心後得られた
上清液に、２％SDSとなる様にSDS粉末を添加した。100
℃３分間加熱後、４℃に冷却後、０℃で１晩放置した後
遠心によりSDSを除去し、上清液700mlを得た。次に４℃
で以下のカラム操作を行った。
疫に使用するEPOの精製」の項の冒頭で記載した限外
過装置を用いて700lの貧血患者尿より、調製した全尿タ
ンパク質粉末34g（792,000単位）をPBS700mlに溶解し、
外液60lのPBSに対し、１夜透析を行い、遠心後得られた
上清液に、２％SDSとなる様にSDS粉末を添加した。100
℃３分間加熱後、４℃に冷却後、０℃で１晩放置した後
遠心によりSDSを除去し、上清液700mlを得た。次に４℃
で以下のカラム操作を行った。
前記で作成した抗体吸着カラム（3.2cm×2.5cm床容量20
ml）PBS200mlを70ml/hrで流し、次いで0.2M酢酸と0.15M
NaClとの混合液500mlを同じ流速で洗浄した後、さらにP
BS200mlを同様に流し、平衡化した。
ml）PBS200mlを70ml/hrで流し、次いで0.2M酢酸と0.15M
NaClとの混合液500mlを同じ流速で洗浄した後、さらにP
BS200mlを同様に流し、平衡化した。
このように前処理した吸着カラムに前記で調製した原料
液700mlを50ml/hrの流速で通した。次に、PBS1000ml,0.
5MNaClを含む10mlM燐酸緩衝液（pH7.4）500ml,0.15MNaC
l500mlの順に65ml/hrでカラムを洗浄した後、0.2M酢酸
と0.15MNaClとの混合液を24ml/hrの流速で流し、溶出液
として100mlを得た。尚、本溶出液中には、EPOタンパク
質が10mg（594,000単位）が含有されており、EPO比活性
は、59.400単位/mgタンパク質であった。
液700mlを50ml/hrの流速で通した。次に、PBS1000ml,0.
5MNaClを含む10mlM燐酸緩衝液（pH7.4）500ml,0.15MNaC
l500mlの順に65ml/hrでカラムを洗浄した後、0.2M酢酸
と0.15MNaClとの混合液を24ml/hrの流速で流し、溶出液
として100mlを得た。尚、本溶出液中には、EPOタンパク
質が10mg（594,000単位）が含有されており、EPO比活性
は、59.400単位/mgタンパク質であった。
さらに、次のようにゲル過を行った。前記溶出液に対
し、3.4Mトリス溶液47mlを加え中和後水に対し透析後、
凍結乾燥を行った。次に本凍結乾燥粉末を0.15MNaClを
含む10mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）3mlに溶解し
た。予め前記と同じ緩衝液で平衡化したセファデックス
G100充填カラム（1.2cm×150cm,床容積170ml）に6ml/hr
で前記溶液を通し、分子量による分画を行い、高分子不
純物を除去し、EPO活性画分を得た。本溶液中にはEPOタ
ンパク質が5.6mg（500,000単位）含有されており、EPO
比活性は、88,000単位/mgタンパクであった。
し、3.4Mトリス溶液47mlを加え中和後水に対し透析後、
凍結乾燥を行った。次に本凍結乾燥粉末を0.15MNaClを
含む10mM燐酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）3mlに溶解し
た。予め前記と同じ緩衝液で平衡化したセファデックス
G100充填カラム（1.2cm×150cm,床容積170ml）に6ml/hr
で前記溶液を通し、分子量による分画を行い、高分子不
純物を除去し、EPO活性画分を得た。本溶液中にはEPOタ
ンパク質が5.6mg（500,000単位）含有されており、EPO
比活性は、88,000単位/mgタンパクであった。
以上の結果をまとめると下記の如くである。
第２表における本発明品のEPO比活性の88,000単位/mgタ
ンパク質はマウス胎児肝細胞を用いたインビトロ法の3H
−チミジン法或は59Fe法では、81,600単位/mgタンパク
質であった。またSDSポリアクリルアミド電気泳動法に
より純度検定を行ったが、不純タンパク質は認められな
かった。第２表の結果から明らかなように、本発明法に
より、原料尿濃縮物に含まれた全EPO活性792,000単位か
ら500,000単位が回収されて63％と高い回収率を達成で
き、また、比活性でみるとおり高度に純粋なEPOを取得
することができた。
ンパク質はマウス胎児肝細胞を用いたインビトロ法の3H
−チミジン法或は59Fe法では、81,600単位/mgタンパク
質であった。またSDSポリアクリルアミド電気泳動法に
より純度検定を行ったが、不純タンパク質は認められな
かった。第２表の結果から明らかなように、本発明法に
より、原料尿濃縮物に含まれた全EPO活性792,000単位か
ら500,000単位が回収されて63％と高い回収率を達成で
き、また、比活性でみるとおり高度に純粋なEPOを取得
することができた。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｖ (56)参考文献 特開 昭57−197224（ＪＰ，Ａ) 特表 昭57−500692（ＪＰ，Ａ) 新実験化学講座 20 生物化学工 Ｐ. 83−86 昭和53年６月20日 丸善株式会社 発行
Claims (2)
- 【請求項１】（ｉ）貧血患者の尿を限外濾過にかけて濃
縮してエリスロポエチン活性を有する粗タンパク質を得
る工程、 （ii）このタンパク質を複数回クロマト処理して吸着と
溶出をくり返して順次エリスロポエチン比活性の高いタ
ンパク質画分を得る工程、 （iii）得られたタンパク質で動物を免疫し、この動物
の脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞融合させて、ハイ
ブリドーマ細胞を作製し、このハイブリドーマ細胞にエ
リスロポエチンに結合せずエリスロポエチン画分にソジ
ウムドデシルサルフェート（以下、SDSという）電気泳
動において近接して低分子側に見出される免疫力の高い
主要タンパク質と結合するモノクローナル抗体を産生さ
せる工程、 （iv）このモノクローナル抗体を結合させたカラムクロ
マトに、工程（ii）で得られた粗精製エリスロポエチン
含有溶液を通過させ、エリスロポエチンに共存する免疫
力の強いタンパク質を除去する工程、 （ｖ）通過液をSDS電気泳動処理してエリスロポエチン
に相当するバンドからタンパク質を抽出し、これを抗原
として動物を免疫し、この動物の脾臓細胞とミエローマ
細胞とを細胞融合させて、ハイブリドーマ細胞を作製
し、このハイブリドーマ細胞からエリスロポエチンに結
合するモノクローナル抗体を産生させる工程、 （vi）このモノクローナル抗体を吸着剤に吸着させる工
程、 （vii）不純物を含むエリスロポエチン含有原料にあら
かじめSDSを加え加熱処理し、ついでSDSを除去する工
程、 （viii）工程（vii）の処理物を工程（vi）で得られた
モノクローナル抗体吸着体にかけ、吸着させ、ついでこ
れを溶出する工程、 （ix）得られた溶出液をゲル濾過処理する工程、 よりなることを特徴とする高純度に精製され、比活性の
高いエリスロポエチンの製造法。 - 【請求項２】工程（ii）におけるクロマト処理が、DEAE
−セルロース、フェニルセファロース、ヒドロキシルア
パタイト、セファデックスを充填したカラムによる処理
である特許請求の範囲第１項記載のエリスロポエチンの
製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58148779A JPH0794475B2 (ja) | 1983-08-16 | 1983-08-16 | 純粋なエリスロポエチンの製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58148779A JPH0794475B2 (ja) | 1983-08-16 | 1983-08-16 | 純粋なエリスロポエチンの製造法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2142420A Division JPH0794476B2 (ja) | 1990-05-31 | 1990-05-31 | 高度に精製され、高い比活性をもつエリスロポエチン |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS6041614A JPS6041614A (ja) | 1985-03-05 |
| JPH0794475B2 true JPH0794475B2 (ja) | 1995-10-11 |
Family
ID=15460478
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58148779A Expired - Lifetime JPH0794475B2 (ja) | 1983-08-16 | 1983-08-16 | 純粋なエリスロポエチンの製造法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH0794475B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62269697A (ja) * | 1986-05-19 | 1987-11-24 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | エリスロポエチンの製造方法 |
| JPS63227527A (ja) * | 1987-03-05 | 1988-09-21 | キリン―アムジエン（デラウエア）インコーポレーテツド | 貧血予防薬 |
| JP2560069B2 (ja) * | 1988-03-09 | 1996-12-04 | 雪印乳業株式会社 | エリスロポエチンの製造方法 |
| KR101443257B1 (ko) * | 2011-10-18 | 2014-09-19 | 주식회사 종근당 | 낮은 등전점을 갖는 에리스로포이에틴 유사체의 정제방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CH651476A5 (en) * | 1981-02-27 | 1985-09-30 | Hoffmann La Roche | Antibodies against proteins |
-
1983
- 1983-08-16 JP JP58148779A patent/JPH0794475B2/ja not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 新実験化学講座２０生物化学工Ｐ．８３−８６昭和５３年６月２０日丸善株式会社発行 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPS6041614A (ja) | 1985-03-05 |
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