JP2560069B2 - エリスロポエチンの製造方法 - Google Patents
エリスロポエチンの製造方法Info
- Publication number
- JP2560069B2 JP2560069B2 JP63055782A JP5578288A JP2560069B2 JP 2560069 B2 JP2560069 B2 JP 2560069B2 JP 63055782 A JP63055782 A JP 63055782A JP 5578288 A JP5578288 A JP 5578288A JP 2560069 B2 JP2560069 B2 JP 2560069B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- erythropoietin
- epo
- antibody
- cells
- purity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、エリスロポエチン（以下EPOと略記する）
の製造のみならず、EPOの精製に際してのアフイニテイ
ークロマトグラフイ及びEPOの測定に際しての免疫学的
測定法にも有効に利用されるモノクローナル抗EPO抗体
の調整法並びに該モノクローナル抗EPO抗体を用いてEPO
を製造する方法に関する。
の製造のみならず、EPOの精製に際してのアフイニテイ
ークロマトグラフイ及びEPOの測定に際しての免疫学的
測定法にも有効に利用されるモノクローナル抗EPO抗体
の調整法並びに該モノクローナル抗EPO抗体を用いてEPO
を製造する方法に関する。
従来技術 赤血球生成促進因子として知られるEPOを、モノクロ
ーナル抗EPO抗体を結合してなる吸着剤を用いて、エリ
スロポエチン含有物より高純度で製造する方法は、既に
提案されている（特開昭59−155395号、特開昭60−4161
4号）。これらの公知の方法は、EPOで免疫した実験動
物、例えばマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞
融合させたハイフリドーマ細胞より得られるモノクロー
ナル抗EPO抗体を結合した吸着剤、例えばアフイゲルを
用いてEPO含有物からEPOを取得することから成る。
ーナル抗EPO抗体を結合してなる吸着剤を用いて、エリ
スロポエチン含有物より高純度で製造する方法は、既に
提案されている（特開昭59−155395号、特開昭60−4161
4号）。これらの公知の方法は、EPOで免疫した実験動
物、例えばマウスの脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞
融合させたハイフリドーマ細胞より得られるモノクロー
ナル抗EPO抗体を結合した吸着剤、例えばアフイゲルを
用いてEPO含有物からEPOを取得することから成る。
なお、上記各方法で出発物質として用いるEPOは、EPO
含有物、例えば貧血患者の尿より得た全尿タンパク質粉
末を、各種のクロマトグラフイ処理により、25,000単位
/mg（純度28％）に精製した後、SDS電気泳動により、5
0,000単位/mg（純度57％）に精製したものであつて、謂
わば部分精製したEPOである。
含有物、例えば貧血患者の尿より得た全尿タンパク質粉
末を、各種のクロマトグラフイ処理により、25,000単位
/mg（純度28％）に精製した後、SDS電気泳動により、5
0,000単位/mg（純度57％）に精製したものであつて、謂
わば部分精製したEPOである。
また、これらの方法においては、細胞融合により得ら
れたハイブリドーマ細胞をスクリーニングして抗−EPO
抗体産生ハイブリドーマを選出するのに、いわゆるソリ
ツドフエース法を（固相抗原結合分析）用いるものであ
る。
れたハイブリドーマ細胞をスクリーニングして抗−EPO
抗体産生ハイブリドーマを選出するのに、いわゆるソリ
ツドフエース法を（固相抗原結合分析）用いるものであ
る。
しかしながら、これらの公知方法では、それに使用す
るモノクローナル抗EPO抗体は、調製に際して、SDS電気
泳動で部分精製したEPOを抗原とするため、該抗体にEPO
溶液を吸着させる場合、それに先立つて、このEPO溶液
を予めSDS（ラウリル硫酸ナトリウム）処理という煩雑
な操作を行う必要があるといる問題がある。
るモノクローナル抗EPO抗体は、調製に際して、SDS電気
泳動で部分精製したEPOを抗原とするため、該抗体にEPO
溶液を吸着させる場合、それに先立つて、このEPO溶液
を予めSDS（ラウリル硫酸ナトリウム）処理という煩雑
な操作を行う必要があるといる問題がある。
発明が解決しようとする課題 本発明は、上述したSDS処理を行なうことなく、EPO含
有物から直接高純度のEPOを製造するためのモノクロー
ナル抗EPO抗体を調製する方法及びこのモノクローナル
抗体を用いてEPO含有液からEPOを製造する方法を提供す
ることを課題とする。
有物から直接高純度のEPOを製造するためのモノクロー
ナル抗EPO抗体を調製する方法及びこのモノクローナル
抗体を用いてEPO含有液からEPOを製造する方法を提供す
ることを課題とする。
また、本発明は、上記スクリーニングにより得られる
抗−EPO抗体産生ハイブリドーマより、叙上のEPOの製造
のみならず、EPOの精製に際してのアフイニテイークロ
マトグラフイ及びEPOの測定に際しての免疫学的測定法
にも有効に利用されるモノクローナル抗EPO抗体を調製
するための方法を提供することも課題とする。
抗−EPO抗体産生ハイブリドーマより、叙上のEPOの製造
のみならず、EPOの精製に際してのアフイニテイークロ
マトグラフイ及びEPOの測定に際しての免疫学的測定法
にも有効に利用されるモノクローナル抗EPO抗体を調製
するための方法を提供することも課題とする。
課題を解決するための手段 本発明において抗原として用いられるEPOは、貧血患
者尿濃縮物をSDS処理後、抗体吸着処理及びゲル濾過に
よって取得したEPO標品を、PBSに溶解し、約９倍量の9
9.5％エタノールでEPO選択的に沈澱させ、この沈澱を回
収し、さらに再溶解させ、これヒドロキシアパタイトカ
ラムに付して非吸着画分を回収し、得られる非吸着画分
が用いられる。
者尿濃縮物をSDS処理後、抗体吸着処理及びゲル濾過に
よって取得したEPO標品を、PBSに溶解し、約９倍量の9
9.5％エタノールでEPO選択的に沈澱させ、この沈澱を回
収し、さらに再溶解させ、これヒドロキシアパタイトカ
ラムに付して非吸着画分を回収し、得られる非吸着画分
が用いられる。
本発明では、このようにして得られた純度が60％以上
の純化EPO標品を用いて、常法により免疫した実験動
物、例えばマウスの脾臓細胞とミエローマ（骨髄腫）細
胞とを細胞融合してハイブリドーマ細胞を作成する。次
いで、このハイブリドーマ細胞を、培養し、培養物のな
かからEPOと特異的に結合し得る抗体産生するハイブリ
ドーマを選出するために、125I−EPO（ヒト尿由来純化E
POをIODO−GEN法にて125Iで標識したものであつて、98
μ Ci/μg EPOの粗成から成る）を用いてスクリーニン
グを行う。
の純化EPO標品を用いて、常法により免疫した実験動
物、例えばマウスの脾臓細胞とミエローマ（骨髄腫）細
胞とを細胞融合してハイブリドーマ細胞を作成する。次
いで、このハイブリドーマ細胞を、培養し、培養物のな
かからEPOと特異的に結合し得る抗体産生するハイブリ
ドーマを選出するために、125I−EPO（ヒト尿由来純化E
POをIODO−GEN法にて125Iで標識したものであつて、98
μ Ci/μg EPOの粗成から成る）を用いてスクリーニン
グを行う。
すなわち、高純度（純度が99％以上）のEPOで作製し
た125I−EPOと特異的に結合する抗体がハイブリドーマ
細胞の培養的中に存在することを確認して選出を行う。
た125I−EPOと特異的に結合する抗体がハイブリドーマ
細胞の培養的中に存在することを確認して選出を行う。
次に、このようにして選出した細胞のうち、125I−EP
Oとの結合生の特に高いものについて継代培養を続けて
行い、限界希釈法にてモノクローン化を行つて安定的に
抗体選出を行つて抗−エリスロポエチン抗体産生ハイブ
リドーマを得る。なお、得られた上記ハイブリドーマの
EPOの吸着−溶出能を実際の抗体吸着カラムを用いて検
定する。
Oとの結合生の特に高いものについて継代培養を続けて
行い、限界希釈法にてモノクローン化を行つて安定的に
抗体選出を行つて抗−エリスロポエチン抗体産生ハイブ
リドーマを得る。なお、得られた上記ハイブリドーマの
EPOの吸着−溶出能を実際の抗体吸着カラムを用いて検
定する。
このようにして得られた抗−エリスロポエチン抗体産
生ハイブリドーマより目的のモノクローナル抗EPO抗体
の産生は、常法によりマウス腹腔内で行う。
生ハイブリドーマより目的のモノクローナル抗EPO抗体
の産生は、常法によりマウス腹腔内で行う。
上述のようにして得られたモノクローナル抗EPO抗体
は、それ自体でEPO精製に際してのアフイニテイークロ
マトグラフイ並びにEPO測定に際しての免疫学的測定法
に利用することができる。
は、それ自体でEPO精製に際してのアフイニテイークロ
マトグラフイ並びにEPO測定に際しての免疫学的測定法
に利用することができる。
次に、上記モノクローナル抗EPO抗体を用いてEPO含有
物から高純度EPOを製造するには、該抗体を例えばアフ
イゲルと結合させて作製した吸着剤に、例えば貧血患者
の尿から調製した全尿タンパク粉末をPBSに溶解し、透
析を行つて遠心後得られる上清液を原料液として接触さ
せてEPOを吸着させ、次いで溶出することにより、吸着
画分として高純度のEPOを得ることができる。この場
合、EPO原料液は、上記吸着剤に接触させるに先立つてS
DS処理を行う必要がない。
物から高純度EPOを製造するには、該抗体を例えばアフ
イゲルと結合させて作製した吸着剤に、例えば貧血患者
の尿から調製した全尿タンパク粉末をPBSに溶解し、透
析を行つて遠心後得られる上清液を原料液として接触さ
せてEPOを吸着させ、次いで溶出することにより、吸着
画分として高純度のEPOを得ることができる。この場
合、EPO原料液は、上記吸着剤に接触させるに先立つてS
DS処理を行う必要がない。
以下実施例により本発明及びその効果を具体的に説明
する。
する。
実施例１ 抗原EPOの調製： 特開昭60−41614号公報に記載の方法に従つて、貧血
患者尿より分離したEPO（貧血患者尿濃縮物をSDS処理
後、抗体吸着処理及びゲル濾過により取得したEPO標
品）のPBS溶解物を氷冷し、−20℃に冷却した99.5％エ
タノールの９倍量を添加してEPOを沈澱させた。この沈
澱を−20℃を90％エタロール溶液で洗浄した後、減圧下
に乾燥し、0.01mM CaCl2を含む10mM Napiバツフアー（p
H6.8）に溶解し、予め同じバツフアーで平衡化したハイ
ドロキシアパタイトカラムに通し、非吸着画分にEPOを
回収した。得られたEPOの純度は99％であつた。
患者尿より分離したEPO（貧血患者尿濃縮物をSDS処理
後、抗体吸着処理及びゲル濾過により取得したEPO標
品）のPBS溶解物を氷冷し、−20℃に冷却した99.5％エ
タノールの９倍量を添加してEPOを沈澱させた。この沈
澱を−20℃を90％エタロール溶液で洗浄した後、減圧下
に乾燥し、0.01mM CaCl2を含む10mM Napiバツフアー（p
H6.8）に溶解し、予め同じバツフアーで平衡化したハイ
ドロキシアパタイトカラムに通し、非吸着画分にEPOを
回収した。得られたEPOの純度は99％であつた。
上記EPOによる実験動物の免疫： 前記の方法にて調製した純化EPOを抗原として使用
し、実験動物としてマウス（BALB/cマウス）を用い、こ
のマウスに対し、次のとおり２週間間隔で３回免疫を行
つた。
し、実験動物としてマウス（BALB/cマウス）を用い、こ
のマウスに対し、次のとおり２週間間隔で３回免疫を行
つた。
第１回免疫： PBS中に純化EPOタンパク質を1mg/mlで溶解し、これに
等量のフロイント完全アジュバンドを混合して得たエマ
ルジヨン0.2mlをマウスに対し腹腔内注射で投与した。
等量のフロイント完全アジュバンドを混合して得たエマ
ルジヨン0.2mlをマウスに対し腹腔内注射で投与した。
第２回免疫： ２週間後に同上のエマルジヨン液100μｌをマウスウ
に対し腹腔内注射で投与した。
に対し腹腔内注射で投与した。
第３回免疫： PBS中に純化EPOを0.5mg/mlで溶解し、100μｌをマウ
スに対し、２週間後に腹腔内投与した。
スに対し、２週間後に腹腔内投与した。
抗EPO抗体産生ハイブリドーマの調製： ｉ）細胞融合の作製 前記免疫処理終了から３日後に免疫マウスの脾細胞を
無菌的に摘出し、合成培養液（RPMI1640液）と15％牛胎
児血清（FCS）との混合液で洗浄後、該混合液中で脾臓
細胞をハサミで細断して単細胞化を行い、該混合液で２
回洗浄した後、単細胞化した細胞をRPMI1640液に分散し
た。細胞数は８×108個であつた。別にマウスのミエロ
ーマ細胞（P3/NSI/1−Ag4−１）を前記RPMI及びFCSの混
合溶液中で培養し、増殖した細胞をRPMI 1640液で洗浄
した。細胞数は４×108個であつた。
無菌的に摘出し、合成培養液（RPMI1640液）と15％牛胎
児血清（FCS）との混合液で洗浄後、該混合液中で脾臓
細胞をハサミで細断して単細胞化を行い、該混合液で２
回洗浄した後、単細胞化した細胞をRPMI1640液に分散し
た。細胞数は８×108個であつた。別にマウスのミエロ
ーマ細胞（P3/NSI/1−Ag4−１）を前記RPMI及びFCSの混
合溶液中で培養し、増殖した細胞をRPMI 1640液で洗浄
した。細胞数は４×108個であつた。
次に前記で調製した免疫マウス脾細胞とマウスミエロ
ーマ細胞とをRPMI 1640液に分散し、混合した後、遠心
し、上清を除去した。混合細胞をポリエチレングリコー
ル1500の50％溶液中で細胞融合させた後、融合細胞をHT
培養液（ヒポキサンチン、チミジン及び15％牛胎児血清
を含むRPMI 1640液）に混合し、混合液を８枚の96穴マ
イクロタイタープレートにまいて２日目以降、HAT培養
液（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン及び15
％牛胎児血清を含むRPMI 1640液）を添加して、各穴で
２週間培養してHAT選択を行つた。増殖したハイブリド
ーマ細胞を236穴において確認した。
ーマ細胞とをRPMI 1640液に分散し、混合した後、遠心
し、上清を除去した。混合細胞をポリエチレングリコー
ル1500の50％溶液中で細胞融合させた後、融合細胞をHT
培養液（ヒポキサンチン、チミジン及び15％牛胎児血清
を含むRPMI 1640液）に混合し、混合液を８枚の96穴マ
イクロタイタープレートにまいて２日目以降、HAT培養
液（ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン及び15
％牛胎児血清を含むRPMI 1640液）を添加して、各穴で
２週間培養してHAT選択を行つた。増殖したハイブリド
ーマ細胞を236穴において確認した。
ii）上記ハイブリドーマ細胞のスクリーニングによる選
出 前記で得た236種類のハイブリドーマより特定の細
胞、すなわち、EPOと特異的に結合し得る抗体を産生す
るハイブリドーマを選び出すために、125I−EPO（ヒト
尿由来純化EPOをIODO−GEN法にて125Iで標識したもの98
μCi/μgEPO）を用いて125I−EPOと特異的に結合する抗
体が、ハイブリドーマ培養液中に存在することを確認し
て選出した。
出 前記で得た236種類のハイブリドーマより特定の細
胞、すなわち、EPOと特異的に結合し得る抗体を産生す
るハイブリドーマを選び出すために、125I−EPO（ヒト
尿由来純化EPOをIODO−GEN法にて125Iで標識したもの98
μCi/μgEPO）を用いて125I−EPOと特異的に結合する抗
体が、ハイブリドーマ培養液中に存在することを確認し
て選出した。
その結果、目的に適合したものとして25種類の細胞が
選出され、そのうち125I−EPOとの結合値の高かつたも
の８種についてハイブリドーマの継代培養を続け、限界
希釈報によりモノクローン化を行い、安定的に抗体産出
を行う５種のハイブリドーマ細胞（ｎ−＃２、ｎ−＃
３、ｎ−＃４、ｎ−＃11、ｎ−＃16）を得た。この５種
類のうち、EPO活性の吸着、溶出の最も良好なｎ−＃２
を採用してモノクローナル抗EPO抗体の生産を行つた。
選出され、そのうち125I−EPOとの結合値の高かつたも
の８種についてハイブリドーマの継代培養を続け、限界
希釈報によりモノクローン化を行い、安定的に抗体産出
を行う５種のハイブリドーマ細胞（ｎ−＃２、ｎ−＃
３、ｎ−＃４、ｎ−＃11、ｎ−＃16）を得た。この５種
類のうち、EPO活性の吸着、溶出の最も良好なｎ−＃２
を採用してモノクローナル抗EPO抗体の生産を行つた。
モノクローナル抗EPO抗体の生産： 前記のハイブリドーマ細胞ｎ−＃２を用いて、抗体産
生を行つた。すなわち、前記と同様にマウス腹腔内で抗
体を生産させ、50％硫安分画に付した後、DE 52（ワツ
トマン社製、DEAE−セルロース）充填カラムを通し、0.
1M〜0.2M NaCl画分として精製免疫グロブリン（IgG）を
得た。マウス30匹を用い、900mgの精製モノクローナル
抗体を得た。
生を行つた。すなわち、前記と同様にマウス腹腔内で抗
体を生産させ、50％硫安分画に付した後、DE 52（ワツ
トマン社製、DEAE−セルロース）充填カラムを通し、0.
1M〜0.2M NaCl画分として精製免疫グロブリン（IgG）を
得た。マウス30匹を用い、900mgの精製モノクローナル
抗体を得た。
実施例２ 本例は実施例１で取得したモノクローナル抗EPO抗体
を用いてEPOを製造する態様に示したものである。
を用いてEPOを製造する態様に示したものである。
抗体吸着カラムの作成： 市販のアフイゲル10をガラスフイルター上で氷水冷却
下にイソプロパノールで洗浄し、さらに氷水で３回洗浄
してゲルを回収し、このゲルと、実施例１で得た抗体を
含む液（0.2M NaHCO3、pH8.3−0.3M NaCl）と等容量で
混和し、４℃で５時間撹拌しながら結合反応を行つた。
反応後、遠心を行つて結合物を回収し、0.1M NaHCO3と
0.15M NaClの混合液で２回洗浄後、0.1Mエタノールアミ
ン塩酸塩（pH8）と室温で１時間よく混合して抗体結合
ゲルを得た。
下にイソプロパノールで洗浄し、さらに氷水で３回洗浄
してゲルを回収し、このゲルと、実施例１で得た抗体を
含む液（0.2M NaHCO3、pH8.3−0.3M NaCl）と等容量で
混和し、４℃で５時間撹拌しながら結合反応を行つた。
反応後、遠心を行つて結合物を回収し、0.1M NaHCO3と
0.15M NaClの混合液で２回洗浄後、0.1Mエタノールアミ
ン塩酸塩（pH8）と室温で１時間よく混合して抗体結合
ゲルを得た。
このゲルをカラム（1.6cm×5cm）に充填し、吸着カラ
ムを作成した。なお、上記抗体結合ゲルにおけるアフイ
ゲル10に対する抗体（IgG）の結合量は約15mg/mlであつ
た。
ムを作成した。なお、上記抗体結合ゲルにおけるアフイ
ゲル10に対する抗体（IgG）の結合量は約15mg/mlであつ
た。
EPOの製造： 出発原料としてEPO含有貧血患者尿濃縮物を用いた。
この濃縮物（分子量分画10000で濃縮し、PBSにて洗浄置
換したもの）200mlを前記で作製した抗体吸着カラム
（1.6cm×5cm、床容量10mlで予め、PBS100ml、次いで0.
2M酢酸と0.15M NaClとの混合液100ml、さらにPBS100ml
の順に25ml/hrで流し、平衡化したもの）に対し、10ml/
hrの流速で流した。次にPBS500ml、0.5M NaClを含む10m
Mリン酸緩衝液（pH7.4）100ml、0.15M NaCl1100mlの順
に30ml/hrでカラムを洗浄した後、0.2M酢酸と0.15M NaC
lとの混合液を10ml/hrの流速で流し、溶出液として15ml
を得た。
この濃縮物（分子量分画10000で濃縮し、PBSにて洗浄置
換したもの）200mlを前記で作製した抗体吸着カラム
（1.6cm×5cm、床容量10mlで予め、PBS100ml、次いで0.
2M酢酸と0.15M NaClとの混合液100ml、さらにPBS100ml
の順に25ml/hrで流し、平衡化したもの）に対し、10ml/
hrの流速で流した。次にPBS500ml、0.5M NaClを含む10m
Mリン酸緩衝液（pH7.4）100ml、0.15M NaCl1100mlの順
に30ml/hrでカラムを洗浄した後、0.2M酢酸と0.15M NaC
lとの混合液を10ml/hrの流速で流し、溶出液として15ml
を得た。
本溶液中にはタンパク質が1.8AU（OD280＝AU）RIA活
性測定で95000単位含まれており、原液に比し、約2300
倍純度が向上した。さらに本溶液を3.4Mトリス溶液0.7m
lを加え中和後水に対し透析後、凍結乾燥を行つた。次
に、本凍結乾燥粉末をPBS3mlに溶解し、予め前記と同じ
PBSで平衡化したセフアデツクスG100充填カラム（1.2cm
×120cm、床容積136ml）に4ml/hrで前記溶液を通し、分
子量による分画を行い、高分子不純物を除去し、EPO活
性画分を得た。本溶液中にEPOタンパク質が1.1AU包含さ
れ、86000単位が含まれていた。また、SDSポリアクリル
アミド電気泳動法により純度検定を行つた結果、不純タ
ンパク質は認められなかつた。
性測定で95000単位含まれており、原液に比し、約2300
倍純度が向上した。さらに本溶液を3.4Mトリス溶液0.7m
lを加え中和後水に対し透析後、凍結乾燥を行つた。次
に、本凍結乾燥粉末をPBS3mlに溶解し、予め前記と同じ
PBSで平衡化したセフアデツクスG100充填カラム（1.2cm
×120cm、床容積136ml）に4ml/hrで前記溶液を通し、分
子量による分画を行い、高分子不純物を除去し、EPO活
性画分を得た。本溶液中にEPOタンパク質が1.1AU包含さ
れ、86000単位が含まれていた。また、SDSポリアクリル
アミド電気泳動法により純度検定を行つた結果、不純タ
ンパク質は認められなかつた。
本例に示したように、本発明に従つて調製したモノク
ローナル抗EPO抗体を用いると、EPO原料液をSDS処理す
ることなく、高純度のEPOを分離、取得することが可能
となる。
ローナル抗EPO抗体を用いると、EPO原料液をSDS処理す
ることなく、高純度のEPOを分離、取得することが可能
となる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 上田 正次 埼玉県川越市今福1672―１ メゾンむさ し野719 (56)参考文献 特開 昭60−41614（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−78999（ＪＰ，Ａ) 特開 昭59−110626（ＪＰ，Ａ) 特表 昭60−500558（ＪＰ，Ａ)
Claims (2)
- 【請求項１】（ｉ）貧血患者尿濃縮物をラウリル硫酸ナ
トリウム（SDS）処理後、抗体吸着処理及びゲル濾過に
より取得したエリスロポエチン標品を、PBSを溶解し、
約９倍量の99.5％エタノールでエリスロポエチンを選択
的に沈澱させ、この沈澱を回収し、さらに再溶解させ、
これをヒドロキシアパタイトカラムに付し、非吸着画分
を回収し、60％以上の純度を有するエリスロポエチンを
得、 （ii）得られたエリスロポエチンを抗原エリスロポエチ
ンとして用い、この抗原エリスロポエチルで免疫した実
験動物から得られる脾臓細胞とミエローマ細胞とを細胞
融合させてハイブリドーマ細胞を作り、 （iii）このハイブリドーマ細胞を培養し、その培養液
をヨードジェン法によりラベルした98μ Ci/μｇ以上の
放射比活性を有する125I−エリスロポエチンを用いて直
接スクリーニングすることによって抗エリスロポエチン
抗体産生ハイブリドーマを選出し、 （iv）得られる抗エリスロポエチン抗体産生ハイブリド
ーマよりモノクローナル抗エリスロポエチン抗体を産生
させ、これを採取することを特徴とするモノクローナル
抗エリスロポエチン抗体の調製法。 - 【請求項２】請求項（１）で得られたモノクローナル抗
エリスロポエチン抗体を結合させた吸着剤に、SDS処理
を行なっていないエリスロポエチン含有液を接触させて
エリスロポエチンを吸着させた後、これを溶出し、エリ
スロポエチン画分を取得することを特徴とする高純度エ
リスロポエチンの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63055782A JP2560069B2 (ja) | 1988-03-09 | 1988-03-09 | エリスロポエチンの製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63055782A JP2560069B2 (ja) | 1988-03-09 | 1988-03-09 | エリスロポエチンの製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01228492A JPH01228492A (ja) | 1989-09-12 |
| JP2560069B2 true JP2560069B2 (ja) | 1996-12-04 |
Family
ID=13008468
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP63055782A Expired - Lifetime JP2560069B2 (ja) | 1988-03-09 | 1988-03-09 | エリスロポエチンの製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2560069B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS62269697A (ja) * | 1986-05-19 | 1987-11-24 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | エリスロポエチンの製造方法 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS59110626A (ja) * | 1982-12-17 | 1984-06-26 | Kaken Pharmaceut Co Ltd | Ｂ−オリゴマ−含有百日咳ワクチンおよびその製造方法 |
| JPH0794475B2 (ja) * | 1983-08-16 | 1995-10-11 | 雪印乳業株式会社 | 純粋なエリスロポエチンの製造法 |
| JPS6078999A (ja) * | 1983-10-05 | 1985-05-04 | Chemo Sero Therapeut Res Inst | ＨＢｓ抗原の精製方法 |
-
1988
- 1988-03-09 JP JP63055782A patent/JP2560069B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH01228492A (ja) | 1989-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Neoh et al. | The purification of mouse monoclonal antibodies from ascitic fluid | |
| US4668771A (en) | Method for separating bovine lactoferrin from cow's milk and purifying same | |
| US5945311A (en) | Method for producing heterologous bi-specific antibodies | |
| JPH09506001A (ja) | 異種二重特異性抗体の製造法 | |
| US4504586A (en) | Hybridoma tumor cell lines and their monoclonal antibodies to human colony stimulating factor subclass number 1 | |
| JPH0686480B2 (ja) | エリスロポエチン製造用モノクローナル抗体 | |
| IE80638B1 (en) | Monoclonal antibodies to new factor VIII coagulant polypeptides | |
| US4558005A (en) | Monoclonal anti-erythropoietin | |
| JPS59116231A (ja) | 抗−インタ−ロイキン−２単クロ−ン抗体 | |
| Lennox et al. | A search for biosynthetic subunits of light and heavy chains of immunoglobulins | |
| JP2560069B2 (ja) | エリスロポエチンの製造方法 | |
| Roggenbuck et al. | Purification and immunochemical characterization of a natural human polyreactive monoclonal IgM antibody | |
| CA1330768C (en) | Monoclonal anti-human granulocyte colony stimulating factor antibody | |
| EP0253331B1 (en) | Thrombin-binding substance and process for its preparation | |
| JP2519561B2 (ja) | 酸性糖タンパク質 | |
| US4751183A (en) | Monoclonal antibody that recognizes a structure common to human interleukin-2 (TCGF) and to the light lambda chain of human immunoglobulin and lines of hybridoma cells that produce these monoclonal antibodies | |
| KR100245542B1 (ko) | 응고 인자 xiii 또는 xiiia의 정제방법 및 인자 xiiia에 대한 모노클로날 항체 | |
| EP0345811B1 (en) | Monoclonal abtibodies specific for human fibrinopeptide A | |
| Stiehm et al. | Some immunologic properties of papain digest fragments of multiple myeloma proteins | |
| JPH0794475B2 (ja) | 純粋なエリスロポエチンの製造法 | |
| Gupta et al. | Affinity chromatography and co-chromatography of bispecific monoclonal antibody immunoconjugates | |
| JPS61167621A (ja) | 高純度な上皮成長因子の調製法 | |
| JP2735986B2 (ja) | 癌抑制遺伝子ｗｔの産物に対する抗体 | |
| EP0354408A1 (en) | Anti-urokinase monoclonal antibodies | |
| Morse III et al. | Murine Plasma Cells Secreting More Than One Class of Immunoglobulin Heavy Chain: IV. Sequence Differences Between κ-Chains of SAMM 368 IgG2b and IgA |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20070919 Year of fee payment: 11 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080919 Year of fee payment: 12 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term | ||
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20080919 Year of fee payment: 12 |