JPS59110626A - B−オリゴマ−含有百日咳ワクチンおよびその製造方法 - Google Patents
B−オリゴマ−含有百日咳ワクチンおよびその製造方法Info
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- JPS59110626A JPS59110626A JP22126082A JP22126082A JPS59110626A JP S59110626 A JPS59110626 A JP S59110626A JP 22126082 A JP22126082 A JP 22126082A JP 22126082 A JP22126082 A JP 22126082A JP S59110626 A JPS59110626 A JP S59110626A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、高活性で且つ安全性の高い百日咳ワクチンお
よび百日咳ワクチンの活性成分の製造方法に関する。
よび百日咳ワクチンの活性成分の製造方法に関する。
古来、小児における百日咳菌による百日咳感染は、しば
しば重篤な作用を引きおこすので、我国においては幼児
期にワクチン接種が義務づけらnている。従来、百日咳
感染を予防する目的で百日咳菌死菌体から調製されたも
のがワクチンとして用いられてきたが、百8咳丙の種々
の構成成分(例えば内毒素、外毒素等)に起因すると思
わiする副作用がかなりの頻度で発現するために、百日
咳ワクチンの改良が待望されている。
しば重篤な作用を引きおこすので、我国においては幼児
期にワクチン接種が義務づけらnている。従来、百日咳
感染を予防する目的で百日咳菌死菌体から調製されたも
のがワクチンとして用いられてきたが、百8咳丙の種々
の構成成分(例えば内毒素、外毒素等)に起因すると思
わiする副作用がかなりの頻度で発現するために、百日
咳ワクチンの改良が待望されている。
近年、百日咳ワクチンの副作用の軽減を目的として百日
I亥HAワクチンが開発された(%開昭55−1414
16号参照)。百日咳HAワクチンは、百日咳菌の産生
ずる多くの蛋白質のうち、赤血球凝集活性を有する分子
量約11〜13万の蛋白質をホルマリンでトキンイド化
したものである。
I亥HAワクチンが開発された(%開昭55−1414
16号参照)。百日咳HAワクチンは、百日咳菌の産生
ずる多くの蛋白質のうち、赤血球凝集活性を有する分子
量約11〜13万の蛋白質をホルマリンでトキンイド化
したものである。
本発明者らは、6日咳HAワクチンよりもさらに改良さ
れた百日咳ワクチンを開発すべく鋭意研究した結果、ボ
ルデテラ属に属する微生物が産生するインシュリン分泌
増強活性を有する蛋白質物質の構成成分に洒8I亥菌感
染防御活性があることを知見し本発明に到達したもので
ある。
れた百日咳ワクチンを開発すべく鋭意研究した結果、ボ
ルデテラ属に属する微生物が産生するインシュリン分泌
増強活性を有する蛋白質物質の構成成分に洒8I亥菌感
染防御活性があることを知見し本発明に到達したもので
ある。
本発明のワクチンは、ボルデテラ楓に属する微生物が江
生ずるインシュリン増強活性因子(以下、IAPまたは
N −工APと略称する)の構成成分の1種である塩基
性蛋白質(以下、B−オリゴマーと略称する)を活性成
分とするものである。不発明の百日咳ワクチンの活性成
分であるB−オリゴマーは、特開昭57−67591号
に開示の塩基性蛋白B−オリゴマーの物性を下記に示す
。
生ずるインシュリン増強活性因子(以下、IAPまたは
N −工APと略称する)の構成成分の1種である塩基
性蛋白質(以下、B−オリゴマーと略称する)を活性成
分とするものである。不発明の百日咳ワクチンの活性成
分であるB−オリゴマーは、特開昭57−67591号
に開示の塩基性蛋白B−オリゴマーの物性を下記に示す
。
分子量:5DS−ゲル電気泳動法
75000±5000
塩基性蛋白質
アミノ酸分析−
Asp、 6.4±0.7. Thr、 7.3士0.
8. Ber、 8.2±帆9. Glu、 9.3±
1.0. Pro、 6.3±0.7゜Gly、 1
1.1 ± 1.0. A土a、 90±0.9.
cye、/zu1.2±0.3. Val、6.
2±0.6. Met、2.7±t)、4. Ile
、 3.4上帆4. Leu、 8.4±0.9. T
yr。
8. Ber、 8.2±帆9. Glu、 9.3±
1.0. Pro、 6.3±0.7゜Gly、 1
1.1 ± 1.0. A土a、 90±0.9.
cye、/zu1.2±0.3. Val、6.
2±0.6. Met、2.7±t)、4. Ile
、 3.4上帆4. Leu、 8.4±0.9. T
yr。
5.6±(J、6. Phe、 3.6±0.5. L
ys、 4.7±0.5゜1(is、 1.1±0.3
. Arg、 41±0.5組成′ L’o W r y 法による蛋白質98重量係以上
。
ys、 4.7±0.5゜1(is、 1.1±0.3
. Arg、 41±0.5組成′ L’o W r y 法による蛋白質98重量係以上
。
不発明の百日咳ワクチンは、精製した上記B −オリゴ
マーを緩衝生理食塩液等のワクチン製造に本発明のワク
チンは、B−オリゴマーのN量で換算して0.1μy〜
100μ2を小児に対して1回またI″i数回投与すれ
ば、免疫を付与し得る。ワクチンの投与法として、皮下
、静脈内、経口、筋肉日。
マーを緩衝生理食塩液等のワクチン製造に本発明のワク
チンは、B−オリゴマーのN量で換算して0.1μy〜
100μ2を小児に対して1回またI″i数回投与すれ
ば、免疫を付与し得る。ワクチンの投与法として、皮下
、静脈内、経口、筋肉日。
皮内、直腸内投与が可能であるが、皮下膜力が最も好ま
しい。
しい。
皮下投与用ワクチン削としては、下記処方か挙けられる
。
。
処方 下記成分と無菌蒸留水を混合して金倉を1祠と
する。
する。
B−オリコマ−20μ?
KH2PC1+ 12.2 ”?N
aHPO4’ 40.6 mpNail
36.0Inf/水酸化アルミニウ
ム 0.2m9上記処方のワクチン0.005
m1〜0.5mlを小児に対して1回または複数回皮下
投与すれば免疫性を付与し得る。
aHPO4’ 40.6 mpNail
36.0Inf/水酸化アルミニウ
ム 0.2m9上記処方のワクチン0.005
m1〜0.5mlを小児に対して1回または複数回皮下
投与すれば免疫性を付与し得る。
ワクチン中のB−オリゴマーの製度は、1〜200μf
/me好ましくは10〜50 It?7 mlである。
/me好ましくは10〜50 It?7 mlである。
また、アジュバントとしてざ≦加する水酸化アルミニウ
ムまたはリン酸アルミニウムの濃度は0.01 Tnf
/rd、 〜] OTnf/ml、好tL<は0.1n
q/ml〜1mf/mlである。因みに、マウスを使用
した測足によれば、B−オリゴマーの皮下投与によるL
D5D U 1(10ff/l’+以上であp1静注に
よるLD5Dは50η/に9以上である。
へ本発明ワクチンは、マウスを使用した検査にお
いて、百日・iHAワクチンよりも優れていることが判
明した。すなわち、副作用の比較では、現行の66咳H
Aワクチンが筒用量になると白血球増多作用やヒスタミ
ン増感作用を明らかに示すのに対して、本発明のワクチ
ンはこれらの副作用を実質的に示ざない。また、ワクチ
ン投与後の体重変化においても現行の百日咳HAワクチ
ンが対照よシも体重減少を引きおこすことからワクチン
中に内毒素が任在すること全示唆しているのに対して、
本発明ワクチン中に内毒素は実負的にほとんど検出され
なかった。さらに、感染防御作用において本発明ワクチ
ンは、低投与童で埃行百日咳HAワクチンよりも強い感
染防御作用を示した。
ムまたはリン酸アルミニウムの濃度は0.01 Tnf
/rd、 〜] OTnf/ml、好tL<は0.1n
q/ml〜1mf/mlである。因みに、マウスを使用
した測足によれば、B−オリゴマーの皮下投与によるL
D5D U 1(10ff/l’+以上であp1静注に
よるLD5Dは50η/に9以上である。
へ本発明ワクチンは、マウスを使用した検査にお
いて、百日・iHAワクチンよりも優れていることが判
明した。すなわち、副作用の比較では、現行の66咳H
Aワクチンが筒用量になると白血球増多作用やヒスタミ
ン増感作用を明らかに示すのに対して、本発明のワクチ
ンはこれらの副作用を実質的に示ざない。また、ワクチ
ン投与後の体重変化においても現行の百日咳HAワクチ
ンが対照よシも体重減少を引きおこすことからワクチン
中に内毒素が任在すること全示唆しているのに対して、
本発明ワクチン中に内毒素は実負的にほとんど検出され
なかった。さらに、感染防御作用において本発明ワクチ
ンは、低投与童で埃行百日咳HAワクチンよりも強い感
染防御作用を示した。
次tこ、B−オリゴマーの効率の艮い製造方法に関して
詳述する。
詳述する。
本発明の製造方法では、ボルテテラ属に属する微/l:
′物、好丑しくは杓日咳1相菌またはD相菌(Bord
etella pertussis phase l
or If )を培養し・層養後の培養上精液をノ・イ
ドロキシアパタイトで処理することによりインシュリン
分泌増強活性因子である工APまたはN −工APを含
有する粗製画分を得、得られた粗製画分に最終尿素濃度
が3〜6Mとなるように尿素を絡刀口し、・ぢ8〃[」
後2〜48時1uJインキユベートし・イン千ユペート
後の浴准ヲパフトグロビンセファロースで処理すること
によυB−万リプリゴマ−製・単離する。また、同様な
製造方法として、工APまたはN−工AP含有の粗製画
分中の塩類を限外濾過法で脱塩し、脱塩後の溶液に尿素
を添加して#液中の最終成葉濃度を4〜6Mとし、溶液
のpHを7.5〜10.0にυ59後1〜4日IMJイ
ンキュベートし、その後にDEARセファロースカラム
およびハプトグロビンセファロースカラムを通して精製
・単離する方法がある。尚、本発明における最終求5A
濃度とは、尿素の液景をふくめた全液量に対する尿素の
#厩である。
′物、好丑しくは杓日咳1相菌またはD相菌(Bord
etella pertussis phase l
or If )を培養し・層養後の培養上精液をノ・イ
ドロキシアパタイトで処理することによりインシュリン
分泌増強活性因子である工APまたはN −工APを含
有する粗製画分を得、得られた粗製画分に最終尿素濃度
が3〜6Mとなるように尿素を絡刀口し、・ぢ8〃[」
後2〜48時1uJインキユベートし・イン千ユペート
後の浴准ヲパフトグロビンセファロースで処理すること
によυB−万リプリゴマ−製・単離する。また、同様な
製造方法として、工APまたはN−工AP含有の粗製画
分中の塩類を限外濾過法で脱塩し、脱塩後の溶液に尿素
を添加して#液中の最終成葉濃度を4〜6Mとし、溶液
のpHを7.5〜10.0にυ59後1〜4日IMJイ
ンキュベートし、その後にDEARセファロースカラム
およびハプトグロビンセファロースカラムを通して精製
・単離する方法がある。尚、本発明における最終求5A
濃度とは、尿素の液景をふくめた全液量に対する尿素の
#厩である。
また、B−オリゴマーは特開昭57〜67591 Mに
Ch示これである如く製造される。すなわち、ボルテテ
ラ属に属する微生物の+8#、、Jl−消液を出発原料
として多数の精製工程を経て工AP’EたはN−工AP
を精製し、絹製した工APまたはN−工A−Pを4〜5
MFR紫含肩リン酸緩衝液(pH5,8〜6.5)中で
24〜4s時1ffiインキユペートシ、インキュベー
ト後の溶液を前記リン酸緩衝液で平衡化したCM−セフ
ァロースカラムクロマトグラムで精製し、ざらにゲルF
遇することによりディスク電気泳動的に単一な物質とし
てB−オリゴマーが得られる。
Ch示これである如く製造される。すなわち、ボルテテ
ラ属に属する微生物の+8#、、Jl−消液を出発原料
として多数の精製工程を経て工AP’EたはN−工AP
を精製し、絹製した工APまたはN−工A−Pを4〜5
MFR紫含肩リン酸緩衝液(pH5,8〜6.5)中で
24〜4s時1ffiインキユペートシ、インキュベー
ト後の溶液を前記リン酸緩衝液で平衡化したCM−セフ
ァロースカラムクロマトグラムで精製し、ざらにゲルF
遇することによりディスク電気泳動的に単一な物質とし
てB−オリゴマーが得られる。
前述の如く、精製工AP凍たはN −IAPを調製する
には数段階からなる精製過程を要し、ざらにB−オリゴ
マーヲ得るためにCM−セファロースクロマトグラムを
経てグルp過をおこなう等、製造操作が煩雑であシ、B
−オリゴマーの収率が悪い。
には数段階からなる精製過程を要し、ざらにB−オリゴ
マーヲ得るためにCM−セファロースクロマトグラムを
経てグルp過をおこなう等、製造操作が煩雑であシ、B
−オリゴマーの収率が悪い。
例えば、蛋白質4001ng含有のハイドロキシアパタ
イト溶出液 (またはN−工AP )が得られ、これを処理して46
〜(7)B−オリゴマーが得られる。尚、かようにして
得らnたB−オリゴマーもまた高活性で且つ安全性の高
い本発明の百日咳ワクチン中の百日咳菌感染防御活性を
有する活性成分として使用される。
イト溶出液 (またはN−工AP )が得られ、これを処理して46
〜(7)B−オリゴマーが得られる。尚、かようにして
得らnたB−オリゴマーもまた高活性で且つ安全性の高
い本発明の百日咳ワクチン中の百日咳菌感染防御活性を
有する活性成分として使用される。
一万、本発明の製造方法は、インキュベート後の溶液を
ハブトゲビンをセファロースに固定したハプトグロビン
セファロースアフィニティー力ラムニ通スカ、まりki
DFiAFiセファロースカラムに通シて後にハプトグ
ロビンセファロースアフィニティーカラムに通すのみで
あり操作が非常に簡便である。ざらに、収量の点でも本
発明の製造方法は優れている。例えば、蛋白質400〜
含有のハイドロキシアパタイト溶出液(工APの粗製画
分)から約150ツもの多量のB−オリゴマーが得られ
る。
ハブトゲビンをセファロースに固定したハプトグロビン
セファロースアフィニティー力ラムニ通スカ、まりki
DFiAFiセファロースカラムに通シて後にハプトグ
ロビンセファロースアフィニティーカラムに通すのみで
あり操作が非常に簡便である。ざらに、収量の点でも本
発明の製造方法は優れている。例えば、蛋白質400〜
含有のハイドロキシアパタイト溶出液(工APの粗製画
分)から約150ツもの多量のB−オリゴマーが得られ
る。
すなわち、本発明の製造方法はB−オリゴマーの収率を
従来法に比べて格段に向上させ得る。
従来法に比べて格段に向上させ得る。
実施例 1
百日咳l相菌東浜株(BOrclJtella per
−tussisphase l、 Tohama 5t
rain )の凍結乾燥保存菌株(北里大学薬学部微生
物学教室提供)をBordθt−Gengou XfL
a培地で37℃、2日間培養後、下記第1表に組成を示
すイオン交換樹脂加Cohen−wheeter の
変法培地(CW培地) 200−を分注した500 r
ntの振盪コルベンに1白金耳接種し、37℃、20〜
22時間振贅培養した・このJ@養液の菌量を、分光光
置引(波長650nm)で測定し、〃口えた時の菌i、
が最終濃度約0.lXlO個/mlとなるように、イオ
ン交換樹脂加CW@地Xtを分注した2tの振盪コルベ
ンに加え、37℃、48時間振盪培養(振盪回数97回
/分)を行った。
−tussisphase l、 Tohama 5t
rain )の凍結乾燥保存菌株(北里大学薬学部微生
物学教室提供)をBordθt−Gengou XfL
a培地で37℃、2日間培養後、下記第1表に組成を示
すイオン交換樹脂加Cohen−wheeter の
変法培地(CW培地) 200−を分注した500 r
ntの振盪コルベンに1白金耳接種し、37℃、20〜
22時間振贅培養した・このJ@養液の菌量を、分光光
置引(波長650nm)で測定し、〃口えた時の菌i、
が最終濃度約0.lXlO個/mlとなるように、イオ
ン交換樹脂加CW@地Xtを分注した2tの振盪コルベ
ンに加え、37℃、48時間振盪培養(振盪回数97回
/分)を行った。
尚、上記菌株の菌学的性質は、百日咳1相菌に関する上
記文献の記載と一致した。
記文献の記載と一致した。
’ Bergy’e Manual−of Deter
mlnatlveBacteriology 第8版1974年11aitimore : The
Willi−ame &、 Willkns Go、。
mlnatlveBacteriology 第8版1974年11aitimore : The
Willi−ame &、 Willkns Go、。
−J、 Fixp、 Med、 129 : 523〜
550 (1969)、・細菌学火習提要:纂3版第6
貞以下、昭和47年(丸@(株)発行) 第1表 カザミノ酸 log 酵母エキス I7 リン醸二水素カリウム 11 可溶性澱粉 リ 0.5係硫酸銅液 t4 1%塩1ヒ力ルンウム’tL tJ4%塩化
マグ坏ンウム液 1アCポリペプトン
9 1%シスチン液 i、fJo、5係硫酸
鉄液 /、/塩1どす1“1つ”
ν→(蒸留水を加えて総量1000+++7
!とじ、20%NaOH水溶液でpH7,2に調整後、
陰イオン交換樹脂(ダイヤイオン5A−20AP:三菱
化成(株)製)31を加え、121℃で15分間、高圧
蒸気滅菌して使用に供した。)得られた48時間振盪培
養液を、56℃で30分間加温した後、4℃で遠心分離
(15,000rpm )して培養上溝液と菌体とに分
離した。得られた培養土消液を本発明に係るB−オリゴ
マーの出発原料とした。
550 (1969)、・細菌学火習提要:纂3版第6
貞以下、昭和47年(丸@(株)発行) 第1表 カザミノ酸 log 酵母エキス I7 リン醸二水素カリウム 11 可溶性澱粉 リ 0.5係硫酸銅液 t4 1%塩1ヒ力ルンウム’tL tJ4%塩化
マグ坏ンウム液 1アCポリペプトン
9 1%シスチン液 i、fJo、5係硫酸
鉄液 /、/塩1どす1“1つ”
ν→(蒸留水を加えて総量1000+++7
!とじ、20%NaOH水溶液でpH7,2に調整後、
陰イオン交換樹脂(ダイヤイオン5A−20AP:三菱
化成(株)製)31を加え、121℃で15分間、高圧
蒸気滅菌して使用に供した。)得られた48時間振盪培
養液を、56℃で30分間加温した後、4℃で遠心分離
(15,000rpm )して培養上溝液と菌体とに分
離した。得られた培養土消液を本発明に係るB−オリゴ
マーの出発原料とした。
200 tの培養上清液をIN塩酸でpH6,0に訣i
整後、第1精製工程としてハイドロキシアパタイトカラ
ム(2,5X4cn1)に流速2UOTnl/時間で流
した。
整後、第1精製工程としてハイドロキシアパタイトカラ
ム(2,5X4cn1)に流速2UOTnl/時間で流
した。
大部分の蛋白質は吸着はれずそのま捷カラムを通過した
。
。
次に、吸着きれた物質についてFi丑す0.01 Mリ
ン酸緩衝放(pH6,0)でカラムを洗い、次いでリン
酸緩衝液のモル濃度を0.1[pHを7.0に夫々上け
て吸着された蛋白質を順次溶出した。しかしながら、N
−工APはまだこの条件では溶出はれず、更に同じ条件
のリン酸緩衝液に0.5MのNa06を含む組成のリン
酸緩衝液で溶出した。この条件で溶出された蛋白質に一
致してN−工APを効率よく回収することができた。
ン酸緩衝放(pH6,0)でカラムを洗い、次いでリン
酸緩衝液のモル濃度を0.1[pHを7.0に夫々上け
て吸着された蛋白質を順次溶出した。しかしながら、N
−工APはまだこの条件では溶出はれず、更に同じ条件
のリン酸緩衝液に0.5MのNa06を含む組成のリン
酸緩衝液で溶出した。この条件で溶出された蛋白質に一
致してN−工APを効率よく回収することができた。
得られたN−工AP粗製画分1z(蛋白質400 ′I
ng、加えて温度4℃の雰囲気下に5時間放置した。放
置後の溶液を工rons & mac Lennan
(B、B、A。
ng、加えて温度4℃の雰囲気下に5時間放置した。放
置後の溶液を工rons & mac Lennan
(B、B、A。
1978、580 、175〜185)の方法に従って
作成したハプトグロビン−セファロース4Bカラム(1
0X25crn)に添加した。添加後のカラムを、2M
尿素を含有する帆IMIJン酸緩衝* (pH7,0)
300コで洗浄した後に、3MKEIONを含有する0
、1Mトリス−塩酸緩衝液(pH10,0)でB−オリ
ゴマーを溶出した。B−オリゴマー画分は、限外濾過法
によりKSCNを除去した後に2M尿素を含有する0、
iM’Jン酸緩衝液(pa7.0) で平衡化すること
により、B−オリゴマー150■を得た。
作成したハプトグロビン−セファロース4Bカラム(1
0X25crn)に添加した。添加後のカラムを、2M
尿素を含有する帆IMIJン酸緩衝* (pH7,0)
300コで洗浄した後に、3MKEIONを含有する0
、1Mトリス−塩酸緩衝液(pH10,0)でB−オリ
ゴマーを溶出した。B−オリゴマー画分は、限外濾過法
によりKSCNを除去した後に2M尿素を含有する0、
iM’Jン酸緩衝液(pa7.0) で平衡化すること
により、B−オリゴマー150■を得た。
(工AP粗製画分に含有されている蛋白質からの収率:
37.5 % ) 尚、得られたB−オリゴマーの物性は特開昭57−14
2325号に記載のCP−Aの物性値と一致した。
37.5 % ) 尚、得られたB−オリゴマーの物性は特開昭57−14
2325号に記載のCP−Aの物性値と一致した。
実施例2
N−IAPM製画分40ゴ(N−工AP 200■、リ
ン酸塩0.56f、Mail 1.2F含有)に尿素x
syを加えて温度4℃の雰囲気下に5時間放置した。
ン酸塩0.56f、Mail 1.2F含有)に尿素x
syを加えて温度4℃の雰囲気下に5時間放置した。
放置後の溶液をハプトグロビンセファロースカラム(4
X20cr++)に添加した。添加後に、2M尿素を含
有する0、1Mリン酸緩衝液(pH7,0) 160−
で洗浄した。流出洗液の蛋白量が50μf / m7!
以下になった後、3 M KSONおよび帆5M1Il
aC4を含有するトリス−塩酸緩衝液(pH10,0)
100m1 テit速30 ml/ hr 、 1フ
ラクション3−の条件で溶出処理をおこなった。溶出状
態を第1図に示す。次に、溶出されたB−オリゴマー含
有画分を実施例1と同様に処理してB−オリゴマー14
2qを得た。
X20cr++)に添加した。添加後に、2M尿素を含
有する0、1Mリン酸緩衝液(pH7,0) 160−
で洗浄した。流出洗液の蛋白量が50μf / m7!
以下になった後、3 M KSONおよび帆5M1Il
aC4を含有するトリス−塩酸緩衝液(pH10,0)
100m1 テit速30 ml/ hr 、 1フ
ラクション3−の条件で溶出処理をおこなった。溶出状
態を第1図に示す。次に、溶出されたB−オリゴマー含
有画分を実施例1と同様に処理してB−オリゴマー14
2qを得た。
実施例3
実施例1と同様にして調製した工AP粗製画分1t(蛋
白質400Tq含有)に尿素40Ofを加え、IN N
aOH約24 mlを使用してpH9に調整後室温で1
日間放置した。放置後、溶液をDIICJIセファロー
スカラム(toxtotTn)に雄刃0し、カラムに吸
着され7rかった未吸着蛋白質のフラクションを収集し
た。収集したフラクションの溶液1.6tに0.1Mリ
ン酸緩衝液(pH7,o ) I Lを力口えて充分攪
拌した後に室温で1日間放置した。放置後の蛋白質含有
溶液をノ・ブトグロビンセファロースカラム(4X20
Crn)に添加し、0.5MNa0tを含有するO、1
MIJン酸緩衝液で洗浄後、3 M KSONを含有す
る0、1Mトリス−塩酸緩衝油(pH10,0)でB−
オリゴマーを溶出した。以下、実施例1と同様に処理し
てB−オリゴマー160mgを得た。
白質400Tq含有)に尿素40Ofを加え、IN N
aOH約24 mlを使用してpH9に調整後室温で1
日間放置した。放置後、溶液をDIICJIセファロー
スカラム(toxtotTn)に雄刃0し、カラムに吸
着され7rかった未吸着蛋白質のフラクションを収集し
た。収集したフラクションの溶液1.6tに0.1Mリ
ン酸緩衝液(pH7,o ) I Lを力口えて充分攪
拌した後に室温で1日間放置した。放置後の蛋白質含有
溶液をノ・ブトグロビンセファロースカラム(4X20
Crn)に添加し、0.5MNa0tを含有するO、1
MIJン酸緩衝液で洗浄後、3 M KSONを含有す
る0、1Mトリス−塩酸緩衝油(pH10,0)でB−
オリゴマーを溶出した。以下、実施例1と同様に処理し
てB−オリゴマー160mgを得た。
比較例1
特開昭57−67591号に記載の実施例1およびHに
基づいて、培養上清液200tからN−工AP粗製画分
1t(蛋白質4001nq含有)を得、次に単離精製し
たN−IAPを114〜得、そして単離・精製L7たN
−■AP114■を処理してB−オリゴマー46■を得
た。N−工APQ製両分含有蛋白質から換算すると収率
は11.5 %であった。
基づいて、培養上清液200tからN−工AP粗製画分
1t(蛋白質4001nq含有)を得、次に単離精製し
たN−IAPを114〜得、そして単離・精製L7たN
−■AP114■を処理してB−オリゴマー46■を得
た。N−工APQ製両分含有蛋白質から換算すると収率
は11.5 %であった。
実施例4
実施例1で生成したB−オリゴマー20μ21KH2P
O412,2ml 、 NaHPOA40.6 ml
、 Na0t36、Omfおよび水酸化アルミニウム0
.21nqを容器に入れ、ざらに無菌蒸留水を加えて全
量をl mlとし、充分に混合し2て皮下注射用百日咳
ワクチンを製造した。
O412,2ml 、 NaHPOA40.6 ml
、 Na0t36、Omfおよび水酸化アルミニウム0
.21nqを容器に入れ、ざらに無菌蒸留水を加えて全
量をl mlとし、充分に混合し2て皮下注射用百日咳
ワクチンを製造した。
実施例5
水酸化アルミニウムのかわジにリン敵アルミニウム0.
2■を使用する以外は、実施例4と同様にして百日咳ワ
クチンを製造した。
2■を使用する以外は、実施例4と同様にして百日咳ワ
クチンを製造した。
比較例2
百日咳HAワクチンを特開昭55−141416号に記
載の実施例に基づいて下記の如く調製した。
載の実施例に基づいて下記の如く調製した。
百日咳1相直(東浜株)をコーエン・ウイーラーの液体
培地で5日間静置培養し、その培養遠心上清に硫安を5
0%飽和に加え、生じた沈殿を110000rp 30
分の遠心で集め、I M NaCL加0.05M’Jン
酸緩衝液に懸濁、溶解した。このIMNaOt溶液を1
0〜30%の蔗糖密度勾配で39000rpm 20時
間遠心し、HA活性画分を回収した。このHA画分のL
PF、 H8F活性を失活させるため、0.1%濃度に
なるようにフォルマリンを冷加し、室温(22℃)で7
日間静置後、芒らに0.2%磯度になるようにフォルマ
リンを添加し、温匿37℃で2日間静置した。静置後の
溶液に緩衝生理食塩水(pH7,0)を添加して、最終
蛋白質濃度が各々12.5.25.50.100119
/ meであり、水緻化アルミニウムを0.2り/−含
Mする百日咳HAワクチンを4種調製した。
培地で5日間静置培養し、その培養遠心上清に硫安を5
0%飽和に加え、生じた沈殿を110000rp 30
分の遠心で集め、I M NaCL加0.05M’Jン
酸緩衝液に懸濁、溶解した。このIMNaOt溶液を1
0〜30%の蔗糖密度勾配で39000rpm 20時
間遠心し、HA活性画分を回収した。このHA画分のL
PF、 H8F活性を失活させるため、0.1%濃度に
なるようにフォルマリンを冷加し、室温(22℃)で7
日間静置後、芒らに0.2%磯度になるようにフォルマ
リンを添加し、温匿37℃で2日間静置した。静置後の
溶液に緩衝生理食塩水(pH7,0)を添加して、最終
蛋白質濃度が各々12.5.25.50.100119
/ meであり、水緻化アルミニウムを0.2り/−含
Mする百日咳HAワクチンを4種調製した。
試験例1
体重変化:
水酸化アルミニウム帆2 IQ / mZを含有する無
菌生理食塩水1m中にB−オリゴマー12.5μ7゜2
5μ?、50μF、 100μ2をそれぞれ含有してい
る本発明ワクチン0.4mlを、4群(1群10匹)の
ddY系マウス(雄性、4週令、平均体B;i9.s2
)の腹腔内にそれぞれ投与した。投与してから24時間
後の体重の増減の程度から本発明ラクチン中の内毒素の
有無を検査した。
菌生理食塩水1m中にB−オリゴマー12.5μ7゜2
5μ?、50μF、 100μ2をそれぞれ含有してい
る本発明ワクチン0.4mlを、4群(1群10匹)の
ddY系マウス(雄性、4週令、平均体B;i9.s2
)の腹腔内にそれぞれ投与した。投与してから24時間
後の体重の増減の程度から本発明ラクチン中の内毒素の
有無を検査した。
1だ、比較例で調製した4種の百日咳HAワクチン0.
4mlを同様にして別の4群のマウスにそれぞれ投与し
た。尚、無菌生理食塩水口4ゴを投与した群を対照群と
した。
4mlを同様にして別の4群のマウスにそれぞれ投与し
た。尚、無菌生理食塩水口4ゴを投与した群を対照群と
した。
本発明ワクチン投与群と百日咳HAワクチン投与群の体
重の増減を下記第2表に示す。
重の増減を下記第2表に示す。
本発明ワクチン投与群は対照群と比較しても体重の減少
がなかったことから本発明ワクチンは内毒素が夾角的に
存在しないことが知見された。−万、従来の百日咳HA
ワクチン投与群は、対照群よりも体重が減少しているこ
とから、百日咳HAワクチン中に内毒素が存在すること
が知見された。
がなかったことから本発明ワクチンは内毒素が夾角的に
存在しないことが知見された。−万、従来の百日咳HA
ワクチン投与群は、対照群よりも体重が減少しているこ
とから、百日咳HAワクチン中に内毒素が存在すること
が知見された。
試験例2
試験例1と同様にしてB−オリゴマーの含有量が違なる
4種の本発明ワクチン0.4mlよだ(よ比較例として
トキソイド化HA画分蛋白質の含41茄゛の異なる4種
の6日1亥HAワクチンを各群のマウスの腹腔内に投与
し、投与から3日後に末梢白血球の増減を調べた。その
結果を第2図に示す。
4種の本発明ワクチン0.4mlよだ(よ比較例として
トキソイド化HA画分蛋白質の含41茄゛の異なる4種
の6日1亥HAワクチンを各群のマウスの腹腔内に投与
し、投与から3日後に末梢白血球の増減を調べた。その
結果を第2図に示す。
第2図のグラフから明白なように、本発明ワクチンはB
−オリゴマーの投与量が増加しても白血球の童が僅かし
か増加し、ないのに対して、比較の百日咳HAワクチン
はトキンイド化HA画分蛋白質の投与量が増加すると顕
著に白血球数が増加した。
−オリゴマーの投与量が増加しても白血球の童が僅かし
か増加し、ないのに対して、比較の百日咳HAワクチン
はトキンイド化HA画分蛋白質の投与量が増加すると顕
著に白血球数が増加した。
試験例3
試験例1と同様にして、B−オリゴマーの含有量が異な
る4種の本発明ワクチン0.4mlよ・九lよ比較例と
してトキソイド化HA画分蛋白質の含有量の異なる4柚
の百日咳HAワクチンを各群のマウスの腹腔内に投与し
、投与から3日後にヒスタミン1 mgを含有する生理
食塩水0 、2 mlを腹腔内に投与して2時間後の生
存率を調べた。結果を第3図に示す。第3図のグラフか
ら明白なように、本発明ワクチンはB−オリゴマーの投
与蓋が増力口しても100qb生存しているのに対して
、比較の百日咳HAワクチンはトキソイド化HA画分蛋
白質の投与量が増加すると極めて顕著に生存率が低下し
た。
る4種の本発明ワクチン0.4mlよ・九lよ比較例と
してトキソイド化HA画分蛋白質の含有量の異なる4柚
の百日咳HAワクチンを各群のマウスの腹腔内に投与し
、投与から3日後にヒスタミン1 mgを含有する生理
食塩水0 、2 mlを腹腔内に投与して2時間後の生
存率を調べた。結果を第3図に示す。第3図のグラフか
ら明白なように、本発明ワクチンはB−オリゴマーの投
与蓋が増力口しても100qb生存しているのに対して
、比較の百日咳HAワクチンはトキソイド化HA画分蛋
白質の投与量が増加すると極めて顕著に生存率が低下し
た。
試験例4
水酸化アルミニウム帆2 m’i / mgを含有する
無菌生理食塩水ld中にB−オリゴマー0.25μグ。
無菌生理食塩水ld中にB−オリゴマー0.25μグ。
2.5μ2,25μiをそれぞれ含有しているX発明ワ
クチン帆4fnlを、3群(1群16匹)のddエマウ
ス(雄性、4週令)の腹腔内にそれぞれ投与し、投与か
ら2週間後にマウス1匹当り白日咳閑18〜323株(
■相菌)の生[4x10’個をマウスの脳内に接種し、
接種後2週間にわたって生死を観察し、生存率を求めた
。結果を第3表如示す。
クチン帆4fnlを、3群(1群16匹)のddエマウ
ス(雄性、4週令)の腹腔内にそれぞれ投与し、投与か
ら2週間後にマウス1匹当り白日咳閑18〜323株(
■相菌)の生[4x10’個をマウスの脳内に接種し、
接種後2週間にわたって生死を観察し、生存率を求めた
。結果を第3表如示す。
−万、水酸化アルミニウム0.21q/mlを含有する
無菌生理食塩水1ml中にトキンイド化したHA画分蛋
白質0.25μf、2.5μり、25μ7をそれぞれ添
力口・混合して調製した白−1咳HAワクチンを比較例
2と同様にして調製し、調製した3種の百日咳HAワク
チン0.41nlを3群のマウスの腹腔内にそれぞれ投
与し、以下X発明ワクチン投与群と同様VCしてb日咳
菌の生菌を脳内に接種し、接種後2週間にわたって生死
を観察し、生存率を求めた。結果を第3表に示す。
無菌生理食塩水1ml中にトキンイド化したHA画分蛋
白質0.25μf、2.5μり、25μ7をそれぞれ添
力口・混合して調製した白−1咳HAワクチンを比較例
2と同様にして調製し、調製した3種の百日咳HAワク
チン0.41nlを3群のマウスの腹腔内にそれぞれ投
与し、以下X発明ワクチン投与群と同様VCしてb日咳
菌の生菌を脳内に接種し、接種後2週間にわたって生死
を観察し、生存率を求めた。結果を第3表に示す。
尚、無菌生理良塩水0.4−のみ腹腔内に投与すること
以外は、ワクチン投与群と同様に処置したマウスを対照
群とした。
以外は、ワクチン投与群と同様に処置したマウスを対照
群とした。
第3表から明らかなように、本発明ワクチンは感染防御
試験において百日咳HAワクチンよりも優れた感染防御
作用を示した。
試験において百日咳HAワクチンよりも優れた感染防御
作用を示した。
添付図面中、第1図は実施例2におけるノ・ブトグロビ
ンセファロースカラムに関する溶出グラフを示し、第2
図は試験例2における白血球数の増減を示すグラフであ
シ、第3図は試験例3におけるヒスタミン増感作用に係
る生存高のグラフを示す図である。 代理人りI埋土 今 村 兄 弟1図 第3図 (〃9/ンウス)
ンセファロースカラムに関する溶出グラフを示し、第2
図は試験例2における白血球数の増減を示すグラフであ
シ、第3図は試験例3におけるヒスタミン増感作用に係
る生存高のグラフを示す図である。 代理人りI埋土 今 村 兄 弟1図 第3図 (〃9/ンウス)
Claims (7)
- (1) 5DS−ゲル電気泳動法による分子量が75
000±5000 ; Lowry法による蛋白質が9
8重重量板上であり、且つ蛋白質成分のアミノ酸組成及
び組成比(μM7100μM)は、Asp、 6.4±
0.7. Thr、 7.3±0.8. Ser、 8
.2上帆9゜Glu、 9.3±1.0. Pro、
6.3±0.7. Gly、 11.1±1.0. A
la、 9.0±0.9. CyS−/ 2++、、2
.±0.31Va1.6.2±0.6. Met、 2
.7±0,4.工1e、 3.4±0.4. Leu、
8.4±0.9. Tyr、 5.6±0,6゜Ph
e、3.6±0.5. Lye、 4.7±0.5.
His、 1.1±0.3及びArg、 4.9±0.
5でアシ;且つ塩基性蛋白質であるB−オリゴマーを活
性成分として含有する百日咳ワクチン。 - (2) アジュバントとしてリン酸アルミニウムまた
は水酸化アルミニウムを含有することを特徴とする特許
請求の範囲第1項に記載の百日咳ワクチン。 - (3)ボルデテラ属に属する微生物を培養し、培養後の
培養上清液をノ・イドロキシアバタイトで処理すること
によジインシュリン分泌増強活性因子を含有する粗製画
分を得、得られた粗製画分に最終尿素濃度が3〜6Mと
なるように尿素を添加し、添力O後2〜48時間インキ
ユペートシ、次いでパフトグロピンセファロースで処理
して精製することを特徴とするB−オリゴマーの製造方
法。 - (4) ボルデテラ属に属する微生物が百日咳I相菌
または■相菌(Borcletella pertus
sisphase l or II )であることを特
徴とする特許請求の範囲第3項に記載のル造方法。 - (5) インキュベートがpH5,4〜6.8#の3
M〜6M尿素メ含有リン酸緩衝液中でおこなわれること
を特徴とする特許請求の範囲第3項または第4項に記載
の製造方法。 - (6) ボルデテラ属に属する微生物を培養し、培養
後の培養上精液をハイドロキシアパタイトで処理するこ
とによりインシュリン分泌増強活性因子を含有する粗製
画分を得、得られた粗製画分を限外濾過法で処理して脱
塩し、脱塩後の溶液に尿素を添力口して溶液中の最終尿
素娘度を4〜6Mとし、溶液のpHを7.5〜10.0
に調整後1〜4日間インキュベートし、インキュベー
ト後の溶液をDEARセファロースカラムに通して未吸
着蛋白質を得、得られた未吸着蛋白質を含有する溶液を
水で希釈し、希釈後の溶液をハブトダロビンセファロー
スで処理して精製することを特徴とするB−オリゴマー
の製造方法。 - (7) ボルデテラ属に属する微生物が百日咳■相菌
または■相菌(Bordetella pertuss
isphase l or U )でおることを特徴と
する特許請求の範囲第6項に記載の製造方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22126082A JPS59110626A (ja) | 1982-12-17 | 1982-12-17 | B−オリゴマ−含有百日咳ワクチンおよびその製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP22126082A JPS59110626A (ja) | 1982-12-17 | 1982-12-17 | B−オリゴマ−含有百日咳ワクチンおよびその製造方法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS59110626A true JPS59110626A (ja) | 1984-06-26 |
JPH0344054B2 JPH0344054B2 (ja) | 1991-07-04 |
Family
ID=16763977
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP22126082A Granted JPS59110626A (ja) | 1982-12-17 | 1982-12-17 | B−オリゴマ−含有百日咳ワクチンおよびその製造方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS59110626A (ja) |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4849358A (en) * | 1987-04-24 | 1989-07-18 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
JPH01228492A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | エリスロポエチンの製造方法 |
US4911918A (en) * | 1985-06-14 | 1990-03-27 | Lion Corporation | Oral composition containing stabilized antibody |
-
1982
- 1982-12-17 JP JP22126082A patent/JPS59110626A/ja active Granted
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4911918A (en) * | 1985-06-14 | 1990-03-27 | Lion Corporation | Oral composition containing stabilized antibody |
US4849358A (en) * | 1987-04-24 | 1989-07-18 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
JPH01228492A (ja) * | 1988-03-09 | 1989-09-12 | Snow Brand Milk Prod Co Ltd | エリスロポエチンの製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH0344054B2 (ja) | 1991-07-04 |
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