NO165478B - Fremgangsmaate for fremstilling av antigeniske preparater. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for

fremstilling av antigeniske preparater for bruk i åcellu-

lære vaksiner mot Bordetella pertussis.

Bordetella pertussis forårsaker en alvorlig og svekkende

sykdom hos mennesker; barn er særlig mottagelige, og sykdom-

men holdes under kontroll i de utviklede land ved hjelp av immuniseringsprogrammer i stor målestokk. Det er funnet at immunisering er en meget viktig • faktor i bekjempelsen av sykdommen, og at unnlatelse av vaksinasjon kan lede til forøket hyppighet av sykdommen. På praktisk talt alle områder bevirkes immunisering ved bruk av'en B. pertussis helcelle-vaksine som er funnet å være relativt effektiv når det gjelder å hindre sykdommen. Man har imidlertid erkjent at helcelle-vaksiner kan være forbundet med flere ulemper.

F.eks. f or ca. ett av hvert 10.000 barn som er inokulert, opp-

står kliniske symptomer som kan innbefatte feber, lokale reaksjoner og vedvarende gråt. Videre synes det som om noen porsjoner av helcelle-vaksine ikke gir noen beskyttelse i det hele tatt mens den fremdeles er forbundet med mulig-

heten av uønskede bivirkninger.

Med den for tiden lave forekomst av sykdommen i utviklede

land med immuniseringsprogrammer, er nyttevirkning/risiko-forholdet dårlig definert, og mange leger er av den opp-

fatning at inokuleringsrisikoene oppveier nyttevirkningene som oppnås ved immunisering. Som et resultat blir mange barn ikke inokulert, og det er da en alvorlig risiko for en tandemisk kikhoste. Betydelig forskning har derfor vært rettet mot utvikling av forbedrede pertussis-vaksiner,

og spesielt åcellulære vaksiner som mangler de komponenter som er forbundet med de toksiske effektene til de hittil benyttede helcelle-vaksinene, mens de inneholder de kompo-

nenter som er nødvendig for å beskytte mot sykdommen.

Forskningen for en sikrere, effektiv, acellulær B. pertussis-vaksine har hittil vært vanskeliggjort av knappheten på informasjon-angående identiteten og virkningsmekanismene for de patogene, toksiske og beskyttende deler av B. pertussis som inneholdes i helcelle-vaksinene. Arbeidet har derfor blitt konsentrert om isolasjon og rensing av de 20 eller flere over-flateantigenene i B. pertussis-organismen og karakterisering av deres evne til å indusere immunreaksjoner, (se f.eks.

J. Am. Med. Soc., 248 (1) 22-23). Eksempler på antigener som har vært foreslått for undersøkelse, innbefatter lymfocytosis-fremmende faktor (pertussis toksin/LPF), trådaktig hemaglu-tinin (FHA), lipbpolysakkarid (LPS), agglutinogener, dermo-nekrotisk toksin (DNT), varmelabile og varmestabile toksiner, polymorfonukleær leukocytt-inhibitorfaktor, adenylat cyklase og andre overflatekomponenter (Pertussis Vaccine Workshop, February 11, 1982, Bureau of Biologics, USA). Andre fore-slåtte kandidat-antigener for undersøkelse innbefatter traké-cytoksin og forskjellige ytre membranproteiner.

En tidlig ekstraktvaksine ble utviklet av L. Pillemer (Proe. Soc. Exp. Biol. Med (1950) 75, 704-705) som var basert på nedbrutte B. pertussis-celler og funnet å gi beskyttelse,

men var ikke tatt i bruk kommersielt i betraktning av preparatets toksisitet.

Eksempler på mer nylige B. pertussis-ekstraktvaksiner som har vært foreslått, innbefatter de som er beskrevet i britisk patent 2.083.358A, som innebærer fjerning av endotoksin fra kultursupernatanter; fransk patent 2.04 7.886 som innebærer ekstraksjon av en mikrobiell suspensjon med et anionisk overflateaktivt middel; og japansk patent 58-222032 som omfatter et underenhet-protein basert på pertussis toksin (LPF).

Mye av arbeidet som er utført på åcellulære pertussis-vaksiner, er konsentrert om muligheten av å basere en slik vaksine på LPF. Det antas imidlertid at de fleste av (hvis ikke alle)

de uheldige effektene som hittil har vært observert som tilknyttet til pertussis-vaksinasjon, er relatert til toksinet. I kombinasjon med tetanus- eller diferi-toksoid og LPS,

er det i stand til å indusere eksperimentell encefalopati i mottagelige mus (L. Steinman, et al. Nature (1982) 299,

738-740; Redhead et al., Workshop on B. pertussis, Nat. Inst. of Biol. Standards & Controls, Holy Hill, Hampstead, London, 1983). Således kan LPF muligens være ansvarlig

for hjerneskade dersom slike komplikasjoner forekommer etter vaksinasjon.

Det er nå blitt observert at et bestemt proteinholdig materiale som er forbundet med adenylatcyklase-aktivitet, som beskrevet i det følgende, funnet i kulturen av B. pertussis, kan gi beskyttelse mot angrep av B. pertussis ved administrasjon til forsøksdyr. Denne oppdagelse at det proteinholdige materiale som vanligvis er forbundet med adenylatcyklase-aktivitet, er et viktig beskyttende antigen mot B. pertussis, tillater fremstilling av vaksineformuleringer omfattende antigeniske preparater som er frie for, eller inneholder reduserte mengder av, andre kjente B. pertussis-komponenter som kan være ansvarlige for de toksiske bivirkningene som har blitt utvist av helcelle-vaksiner.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av et antigenisk preparat inneholdende proteinholdig materiale forbundet med adenylat - cyklase-aktivitet (ACAP) fra B. pertussis, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man behandler en kultur av B. pertussis-celler i 1-24 timer ved en temperatur mellom

5 og 50°C, med en vandig aminosyrebuffer av pH 2,5-3,5, hvor aminosyrekomponentene er enten glycin eller alanin, og hvor bufferen omfatter en hypertonisk konsentrasjon av nevnte aminosyre m.h.t. cellene og i området 0,1-1 M, separerer cellene fra den resulterende supernatanten, og eventuelt isolerer den antigeniske preparatet fra supernatanten ved hvilket som helst, av eller kombinasjonen av følgende trinn hvorved: i) det ekstraherte materiale utsettes for DEAE-ione-utvekslingskromatografi;

ii) materialet utsettes for isoelektrisk fokusering;

iii) det isolerte materiale behandles ved passasje gjennom en immunoabsorberende kolonne omfattende et passende monoklonalt antistoff for ACAP-materiale.

Betegnelsen "proteinholdig materiale forbundet med adenylat-cyklaseaktivitet" (i det følgende forkortet til "ACAP")

er her benyttet for å referere til proteinholdig materiale som ekstraheres sammen med adenylatcyklase-aktivitet når ekstraksjon av adenylatcyklase-aktiviteten foretas ved anvendelse av en vandig, sur (pH 3) oppløsning av glycin (0,25 M). ACAP som definert ovenfor, kan omfatte adenylatcyklase-enzymet per se, eller et bindingsprotein for enzymet.

Adenylatcyklase-aktiviteten ble analysert ved metoden ifølge Hewlett, E. og Wolf, J. (J. Bacteriol. (1976) 127, 890-898) .

En vaksineformulering for beskyttelse mot B. pertussis kan innbefatte det ifølge oppfinnelsen fremstilte antigeniske preparat avledet fra B. pertussis omfattende ACAP, eventuelt toksoidert f.eks. ved bruk av formalin, glutaraldehyd eller 3-propiolakton, sammen med en farmasøytisk akseptabel bærer.

Mer detaljert kan ACAP detekteres ved isoelektrisk fokusering som to bånd, ett med et isoelektrisk punkt (pl) på ca. 7,0, det andre (diffuse) båndet med et isoelektrisk punkt på 7,2-7,4. Adenylatcyklase-aktiviteten ble knyttet nesten fullstendig med det nøytrale båndet (pl=7,0), men monoklonale antistoffer til ACAP bandt begge bånd sterkt.

ACAP i de ovennevnte preparater har vanligvis en relativ molekylvekt fra 67.000 til 73.000, spesielt 69.000,

og et isoelektrisk punkt på 7,0-7,4 under preparative betingelser som beskrevet nedenfor.

Med betegnelsen "relativ molekylvekt" menes den tilsyne-latende molekylvekt som bestemt ved 12% (vekt/vekt) polyakrylamidgel-elektroforese og standard molekylvekt-markører. Molekylvekten til de antigeniske proteinene kan således hensiktsmessig bestemmes ved hjelp av de teknikker som er beskrevet av U.K. Laemmli, Nature, 1970, 227, 680-695 . Hensiktsmessige standard molekylvekt-amarkører innbefatter f.eks. storfeserumalbmin, kymo-trypsinogen A og ribonuklease.

Aminosyreanalyse har også vist at ACAP inneholder en uvan-lig høy andel prolin, slik at forholdet for prolin:glutaminsyre er ca. 1:1, og dette trekk tjener til å skjelne ACAP fra andre B. pertussis-proteiner. En ytterligere for-skjellig egenskap for ACAP er det faktum at det ikke kan detekteres ved hjelp av radio-iodinering av dens tyrosin-rester ved hjelp av hverken kloramin T eller iodigen-metodene.

Det nevnte ACAP er proteinholdig materiale som fortrinnsvis er kjennetegnet ved at det har en eller flere av følgende egenskaper: (i) et forhold for prolin til glutaminsyre på vesentlig 1:1; (ii) tyrosinrestene er ikke iodinerbare; (iii) vesentlig fritt for intracellulært B. pertussis-materiale; (iv) en relativ molekylvekt på 6 7.000-73.000;

(v) et isoelektrisk punkt på 7,0-7,4; og

(vi) syrelabilt under en pH-verdi på ca. 3.

For bruk i'vaksineformuleringer kan de antigeniske preparatene om ønsket inneholde mindre mengder av andre antigeniske forbindelser, i tillegg til ACAP, f.eks. materialer oppnådd sammen med ACAP ekstrahert fra B. pertussis-orgamismen. Sike materialer kan omfatte fragmenter av LPS og LPF som, i betraktning av deres mulige skadelige bivirkninger, krever toksoidbehandling f.eks. med formalin.

De antigeniske preparatene er imidlertid fortrinnsvis vesentlig frie for andre antigeniske komponenter.

Adenylatcyklase har tidligere blitt isolert fra B. per-

tussis (E. L. Hewlett et al., J. Bacteriol, 127, 890-898

og Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 73, 1926-1930), men det har ikke vært noe forslag om at dette materialet representerer et beskyttende antigen mot B. pertussis. Ifølge arbeidet til Hewlett et al. ble bare ca. 20% av den totale adenylatcyklase-aktiviteten fra B. pertussis-organismen, hvilket representerer 0,5% av det totale enzym funnet i kultur-supernatanten idet de gjenværende 80% var bundet til celler. Det er derfor nødvendig med en ekstraksjonsprosess hvor ACAP kan oppnås i høy renhet og utbytte, for å kunne tilveiebringe tilstrekkelige mengder,.i en kommersiell målestokk, (av ACAP) for bruk i ovennevnte antigeniske. preparater. En større vanskelighet som må overvinnes med en slik ekstraksjonsprosess, er at ACAP, blant andre proteiner, er bundet, og en del derav meget sterkt, til den ytre membrans LPS-hovedkjede. Tidligere har detergeh-ter generelt blitt benyttet for oppløseliggjøring av membranen for å frigjøre dens tilknyttede proteiner.

Bruken av detergenter for ekstraksjon av ytre membran-, proteiner fra B. pertussis-organismer har imidlertid blitt funnet å ha følgende ulemper:

a) den ytre membranen oppløseliggjøres for dannelse av miscellære aggregater omfattende blandinger av ytre membranproteiner;

b) de ytre membranproteinene kan skades; c) nye antigener, som ikke eksisterer i bakterien,

kan dannes; og

d) det ekstraherte materiale' finnes vanligvis å være

.vannuoppløselig etter at detergenten er fjernet.

Man har nå oppdaget, at i motsetning til bruken av detergenter, så resulterer ekstraksjon av B. pertussis-organismer ved bruk av kontrollerte, svakt sure betingelser i ekstrak-sjonen av vesentlig forøkede utbytter, ca. 40 ganger bedre enn tidligere rapporterte teknikker, av adenylatcyklase fra den ytre membranen i en form som er vannoppløselig.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer derfor en fremgangsmåte for fremstilling av et antigenisk preparat inneholdende ACAP fra B. pertussis, og denne fremgangsmåten • innbefatter som nevnt behandling av en kultur av B. pertussis-celler med en vandig aminosyrebuffer med pH 2,5-3,5, omfattende en hypertonisk konsentrasjon av nevnte aminosyre med henblikk på cellene, preparering av cellene fra den resulterende supernatanten og isolasjon av et antigenisk preparat inneholdende ACAP fra supernatanten.

Bufferen benyttet i den ovenfor beskrevne fremgangsmåte gir fortrinnsvis en pH-verdi på ca. 3, og innbefatter fordelaktig en mineralsyre, fortrinnsvis saltsyre, som den sure komponenten i bufferen og enten glycin eller alanin som aminosyren. Behandlingen av cellene med bufferen foretas fortrinnsvis ved en temperatur på 5-50°C, fortrinnsvis 30-45°C, ideelt 37°C, med fordel i 1-24 timer, fortrinnsvis 10-20 timer med en aminosyrekonsentrasjon på 0,1-1 M, fortrinnsvis 0,25 M. ACAP-materialet er syrelabilt, og kan ødelegges dersom pH-verdien faller under 3 under ekstraksjon.

Etter inkubasjon av cellene med bufferen blir cellene kassert, og supernatanten oppnådd etter sentrifugering, f.eks. ved ca. 100.000 g (for å fjerne alt partikkelformig materiale), blir, om ønsket, utfelt f.eks. ved bruk av ammoniumsulfat, kald etanol eller aceton.

Det oppnådde supernatantekstraktet har blitt testet i Kendrick-testen, som beskrevet nedenfor, og har blitt funnet å gi beskyttelse hos mus mot intracerebralt angrep av B. pertussis. Kontrollvaksiner som ikke inneholder noen adenylat cyklase-aktivitet, ble funnet å gi liten eller ingen,beskyttelse mot angrep av B. pertussis, og dette foreslår at ACAP faktisk kan være den viktigste faktoren når det gjelder immunitet. Analyse av porsjoner av ikke-beskyttende helcelle-vaksine har også vist at ikke-beskyttelse er tilbøyelig til å være forbundet med en mangel på adenylat cyklase-aktivitet, hvilket ytterligere foreslår at ACAP kan være det nøkkel-antigen som er nød-vendig for å frembringe en immunresponse mot B. pertussis.

Supernatantekstraktet benyttet i Kendrick-testen kan imidlertid også inneholde ACAP i små mengder kompleksdannet med andre proteiner inkludert fragmenter av LPS, og i et slikt tilfelle kan det være ønskelig å rense materialet ytterligere for bruk i foreliggende vaksineformuleringer.

Således kan f.eks. ytterligere rensing foretas ved ione-utvekslingskromatografi og/eller preparativ isoelektrisk fokusering for å eliminere kompleksdannet materiale. De to rensemetodene kan alternativt kombineres,, dvs. det materiale som ikke holdes tilbake av DEAE-gelen (dvs. det ikke-kompleksdannende materiale) kan elektrofokuseres. Rensemetoden kan også omfatte kromatofokusering. Etter

de ovenfor beskrevne rensetrinn kan ACAP-materiale, om ønsket, ytterligere renses, f.eks. ved å føre materialet gjennom en immunoabsorberende kolonne inneholdende et hensiktsmessig monoklonalt antistoff mot ACAP-materialet.

De ovenfor beskrevne antigeniske preparatene, inkludert de som er fremstilt som beskrevet ovenfor, kan inkorporeres i en vaksineformulering for indusering av immunitet overfor kikhoste hos mennesker. For dette formål kan det antigeniske proteinet tilveiebringes i forbindelse med en farmasøytisk akseptabel bærer eller hjelpemiddel.

Farmasøytisk akseptable bærere er i dette tilfelle væske-formige media egnet for bruk som bærere for innføring av antigenet i pasienten. Et eksempel på en slik bærer er saltoppløsning. Det antigeniske proteinet kan være i opp-løsning eller suspendert som et fast stoff i bæreren.

Vaksineformuleringen kan også omfatte et hjelpemiddel for stimulering av immunresponsen, og derved fremme vaksinens effekt. Hensiktsmessige hjelpemidler for bruk i foreliggende oppfinnelse innbefatter f.eks. aluminiumhydroksyd og aluminiumfosfat.

Vaksineformuleringene tilveiebringes hensiktsmessig slik at de inneholder en sluttkonsentrasjon av antigenisk protein i området 0,01-5 mg/ml, fortrinnsvis 0,03-2 mg/ml, helst 0,3 mg/ml. Etter formulering kan vaksinen korporeres i en steril beholder som deretter forsegles og lagres ved en lav temperatur, f.eks. 4°C, eller kan frysetørkes.

For hos mennesker å indusere immunitet overfor kikhoste

kan en eller flere doser av den formulerte vaksinen administreres. Det anbefales at hver dose er 0,1-1 ml, fortrinnsvis 0,2-1 ml, helst 0,5 ml vaksine. For indusering av immunitet overfor kikhoste hos mennsker foretas administrasjon av en effektiv mengde av en vaksineformulering, som definert ovenfor, til verten.

ACAP (som definert ovenfor) kan benyttes ved fremstilling av en vaksine for bruk ved indusering av immunitet overfor kikhoste hos mennesker.

Vaksiner fremstilt av antigen fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres ved en hvilken som helst kon-vensjonell metode for administrasjon av vaksiner inkludert oral og parenteral (f.eks. subkutan eller intramuskulær) injeksjon. Behandlingen kan bestå av en enkelt dose vaskine eller flere doser over en tidsperiode.

Vaksiner fremstilt av antigen fremstilt ifølge foreliggende fremgangsmåte kan også omfatte en eller flere andre antigeniske komponenter slik som f.eks. hensiktsmessig toksoi-derte tyfoid- og difteritoksiner, eller andre B. pertussis-antigener, slik som toksoidert LPF, for å redusere sannsynligheten for mutante stammer av B. pertussis som unngår den ledsagende immunrespons.

Følgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1

Sur glycinhydrolyse og fremstilling av ytre membran-råproteiner.

Cellene ble høstet 3/4 av veien gjennom eksponensialfasen og sentrifugert ned ved 8000 g (Sorvall, GSA-vinkelhode i 20 min. ved 4° C) .Supernatanten ble fjernet gjennom hevertprinsippet og cellene ble umiddelbart forsiktig resuspendert i destillert vann til en densitet på 20-30 mg/ml tørrvekt av celler. En tredjedel av dette volumet'av IM glycin-HCl-buffer, pH 3,0, ble tilsatt under forsiktig omrøring for oppnåelse av en sluttkonsentrasjon på 250 mM glycin. Glycinoppløsningen inneholdt EDTA (for oppnåelse av 5mM i sluttblandingen)

for å stoppe enzymatisk aktivitet. pH-verdien ble kontrol-lert, og der det var nødvendig, justert på ny til pH 3,0

ved anvendelse av 1-2 M HCl. Blandingen ble forsiktig om-rørt i et 3 7°C vannbad inntil temperaturen var ekvilibrert og deretter inkubert natten over (18 timer) ved 37°C (uten omrøring). pH-verdien ble deretter justert til 7,2-7,4

ved anvendelse av 10 M NaOH, som ble tilsatt langsomt for å unngå lokalt overskudd. Cellene ble sedimentert ved 5000 g i 20 min. ved 5°C, supernatanten ble fjernet ved hjelp av hevert, avkjølt i et is-vannbad til 1-2°C og to volum-

deler på forhånd avkjølt aceton (-20 til -40°C) ble langsomt tilsatt for å unngå at temperaturen steg over 1-2°C. Blandingen ble deretter holdt ved -20°C i 3-5 timer og bunnfallet oppsamlet i et på forhånd avkjølt (-10°C) vinkelhode ved 4000 g i 20 min. Supernatanten ble fjernet ved hjelp av hevert og kassert. Det sedimenterte bunnfallet ble oppløst i isavkjølt, destillert vann til omkring 1/20 av det opprinnelige volumet av cellesuspensjon. Oppløsningen ble deretter frigjort for uoppløselige stoffer og vesikler ved sentrifugering ved 50.000 g i 90-120 min. ved 5°C. Supernatanten ble oppsamlet og holdt frosset eller fryse-tørket. 1% vekt/vol mannitol ble tilsatt før frysetørking. 40-80 mg protein ble oppnådd pr. g tørrvekt av celler.

Eksempel 2

(a) Separering av ytre membran- råproteinpreparatene ved DEAE- trisakryl- kromatografi

En DEAE-trisakryl-kolonne, 3 x 16 cm, ble ekvilibrert med 0,025 M Tris, 0,035 M NaCl buffer, pH 8,8 og materialet oppnådd i eksempel 1 (opptil lg protein) dialysert mot ekvilibreringsbufferen og pumpet ved 60 ml/time gjennom kolonnen. Fraksjonene (99 dråper pr. rør, ca. 5 ml) ble kombinert i ansamlinger 1-13. En del av det totalt påførte protein (ca. 1/4) forsinkes ikke av gelsjiktet og ville bli oppsamlet som en stor topp (fig. 1, 0,035 M) . Materialet holdt tilbake ble deretter eluert ved bruk av 0,1, 0,2,

0,3 og 1,0 M NaCl i 0,025 M Tris-buffer (pH 8,8). Fraksjonene ble kombinert og påført på en SDS-PAGE-plate for å etablere separeringen av proteiner. ACAP-materialet var til stede i det materiale som ikke ble forsinket av kolonnen, som vist ved SDS-PAGE, men var også til stede i det tilbakeholdte materiale eluert av 0,2 M NaCl.

(b) Preparativ flatsjikt- isoelektrofokusering i granulert

gel ( IEF)

Dette ble foretatt ifølge LKB-anbefålinger (application Note 198, LKB-Produkter AB, Bromma, Sverige). En suspensjon av 4 g "Ultrodex" (LKB) og 5 ml på forhånd blandet amfolin,

pH 3,5-9,5, ble suspendert i destillert vann til et slutt-volum på 100 ml, helt på en horisontal plate 10,8 x 24,3 cm og fordampet under en luftstrøm til den foreskrevne grensen. Lagdelte strimler av tre papirveker (LKB, 2117-106) bløt-lagt i 1:20 oppløsning av det samme amfolin i destillert vann, ble anbragt ved hver ende av platen. Materialet fra eksempel 2a ble innleiret i gelen ved bruk av en påførings-sjablon (2 x 9,4 cm) som ble presset inn i gelen ved 1/3-1/4 av avstanden langs dens lengde fra den anodiske enden, den omsluttede gelen ble fjernet, overført til en 10 ml engangssprøyte, suspendert i 3 ml av nevnte materiale fra eksempel 2a (inneholdende opp til 500 mg protein) og til slutt injisert tilbake inn i det tomme rommet dannet ved dens fjerning. Gelen ble deretter utglattet med en spatel der det var nødvendig, og hensatt for likevekts-innstilling i 20 min. I mellomtiden ble en papirveke bløt-lagt i en 1:100 fortynning av fosforsyre (spesifikk vekt

1,75) og tilsatt til strimlene ved anodeenden, og en annen i 1 M NaOH og anbragt ved katodeenden. Plateunderstøttelsen i flatsjikt-IEF-apparatet (Pharmacia type FBE-3000) ble av-kjølt ved hjelp av rennende ledningsvann (15°C) i løpet av forsøket. Gelen ble benyttet ved konstant 8 watt.

ACAP-materialet kunne detekteres som to bånd, ett på pl 7,0

og det andre (diffuse) båndet på pl 7,2-7,4. Adenylatcyklase-aktivitet ble nesten fullstendig knyttet til det sentrale båndet (pl 7,0), men monoklonale antistoffer til ACAP bandt begge bånd sterkt.

Ved bruk av en metallsjablon ble gelen deretter oppdelt i

30 parallelle felter, gelen ble skrapet fra hvert felt under anvendelse av en spatel og overført til reagensrør inneholdende 1 ml destillert vann. pH-verdien til hver fraksjon ble målt ved dette trinnet. Gelsuspensjonene ble deretter overført til små plastkolonner, eluert med 2 ml 0,2 M ammoniumbikarbonat-buffer, pH 7,0, og de gelfrie eluatene frosset (-40°C).

(c) Analytisk isoelektrisk fokusering

(i) Den samme metoden ble benyttet som for 2(b) ovenfor,

men en 12% polyakrylamidgel i nærvær av 8 M urea ble benyttet. De samme resultatene som for 2(b) ble oppnådd . (ii) Den samme teknikken, men ved bruk av en agarosegel i nærvær av 10% sorbitol, viste fire immunoreaktive bånd på pl 4,5-6,0. pl 4,0-båndet holdt tilbake størsteparten av adenylatcyklase-aktivitet.

E ksempel 3

Rensing av ACAP under anvendelse av en monoklonal immunsor-berende kolonne

Ascitisk væske fra mus inneholde et monoklonalt immuno-globelin som var spesifikt for ACAP, ble utfelt ved rom- . temperatur ved tilsetning av 2 volumdeler 27% vekt/vol Na2SO^ og hensatt i 2-4 timer før sedimentering (2000 g i 15 min.) Sedimentet ble gjenoppløst og dialysert mot PBS. 500 mg

av dette protein (UV-bestemmelse) ble koblet til 70 ml pakket CNBr-sefarose C14B etter produsentens instruksjoner (Pharmacia). "Sephadex G-50" (medium) ble påført på en 500 mm x 25 mm kolonne til en sjikthøyde på 220 mm. Etter vasking av kolonnen med elueringsbuffer (0,2 M ammoniumbikarbonat, pH 7,0, inholdende 0,01% tiomersal) ble ét

5 mm tykt lag av nr. 12 Ballotini-glasskuler helt på

toppen av "Sephadex"-laget. Etter ytterligere vasking ble den immunosorberende gelen helt på laget av Ballotini-glasskuler, og siden dette var adskilt fra "Sephadex"-laget, kunne begge separeres. Kolonnen ble ytterligere vasket med elueringsbuffer, og til slutt ble et annet lag av Ballotini-glasskuler anbragt på toppen av det 100 mm høye immunosorberende laget for å beskytte toppen av kolonnen.

For å separere ACAP-materialet på den immunosorberende kolonnen, ble 180 ml av det ikke-tilbakeholdte eluatet

fra DEAE-trisacrylsepareringen (eksempel 2) inneholdende 1 mg/ml protein (Lowry) påført ved 5°C på den immunosorberende kolonnen ved 0,25 ml/min., vasket med eluerings-buf fer (0,2 M ammoniumbikarbonat, pH 7, 0,01% vekt/vol tiomersal) og, etter at basislinjen hadde stabilisert seg, ble 50 ml 6 M urea i elueringsbuffer påført på kolonnen

for å eluere det absorberte materiale. Posisjoneringen av det immunosorberende materiale over et "Sephadex G-50"-

lag ga anledning for samtidig separering av proteinet fra urea i løpet av forsøket.

E ksempel 4

Kultur av B. pertussis

Det definerte medium benyttet for vekst av organismen, var

basert på formelen til Steiner og Scholte (1971) som be-

skrevet tidligere (Novotny og Brookes, 1975). Alle kulturer ble dyrket ved 36-37°C. De flytende kulturene, i løst korkede rystekolber (500 ml konisk kolbe med 200 ml medium),

ble inokulert med en kultur dyrket i 48 timer på Cohen-Wheeler-

medium med 2% agar og 5% hesteblod og agitert for oppnåelse av en gassutvekslingshastighet på 20-40^um C^/time. Slike flytende kulturer ble benyttet for å inokulere mediet i 5 1 eller 70 1 fermentorer av glass, mens pH-verdien ble holdt ved 7,6 ved regulert tilsetning av 2 M HC1 og oppløst oksygen-metningen ved 5-10% ved agitasjon med propellrører.

Kulturene ble innhøstet før slutten av eksponensialfasen,

dvs. etter omkring 36 timers inkubering (Novotny og Cownley,

1978) .

Eksempel 5

K endrick- test

Denne ble foretatt ifølge W.H.O. bestemmelser for Pertussis-

vaksine under anvendelse av MFl eller NIH mus (OLAC,

kategori 3, fri for de fleste patogener inkludert B. bronchi-septica), med en vekt på 14-16 g. Antigenet, i volumer på

0,5 ml, ble inokulert intraperitonealt og omfattet en topp-

fortynning og 3-4 gangers serlefortynninger. Etter to uker ble musen angrepet intracerebralt ved bruk av den anbefalte-

stamme 18-323 (100-200 LD5Q). Antall overlevende i hver gruppe ble benyttet for beregning av EDj-q og den relative

styrke 1 forhold til British Pertussis Reference Vaccine

66/84 ved bruk av et program av parallell-linjé-probitanalyse.

En sammenligningstest ble også foretatt ved bruk av en FHA/LPF-vaksine. Resultatene er vist,i tabell 1.

Eksempel 6

Aminosyreanalyse av ACAP

Aminosyreanalysen ble utført ved bruk av en Rank Hilger Chromaspek-aminosyreanalysator. Prøver ble fremstilt ved tilsetning av 250^ul 6N HC1 (fortynnet fra BDH-Aristar-kvalitet) inneholdende 0,1% (vekt/vol) fenol til det tørkede prøvemateriale i et tykkvegget "Pyrex"-reagensrør (7,5 x 1,2 cm). Rør ble deretter uttrukket i en oksygen-naturgass-blåselampeflamme for å gi en smal åpning. Etter frysing av innholdet i et fast C02-etanol-bad, ble hvert rør forbundet via en manifold og felle til en høyvakuum-pumpe, og hensatt i 10 min. for fjerning av luft. Rørene ble deretter forseglet og anbragt i en ovn ved 110°C for hydrolyse.

De hydrolyserte prøvene ble tørket i en vakuum-eksikator over natriumhydroksydpellets. Den tørkede resten ble opp-løst i 250^ul aminosyreanalysator-startbuffer for automatisk analyse.

Aminosyreverdiene vist i tabell 2 er gjennomsnitt av resultatene oppnådd fra duplikat 24, 48 og 68 timers hydrolyse, unn-tatt i tilfellet for valin og isoleucin hvor 68-timer hydro-lyseverdiene ble benyttet.

Verdier for cystin, cystein og tryptofan kunne ikke bestemmes ved denne metoden.

E ksempel 7

Vaksine- formuleringer

Vaksiner for bruk ved immunisering kan fremstilles ved hjelp av konvensjonelle teknikker med følgende bestanddeler:

a) Difteri-, tetanus- og pertussis- vaksine i enkel oppløsning Hver 1 ml vaksine inneholder:

b) Adsorbert difteri-, tetanus- og pertussis-va ksine

Difteri, tetanus- og pertussis-komponentene adsorberes på

aluminiumhydroksydgel ved standard teknikker.

Hver 1 ml vaksine inneholder:

c) Pertussis- vaksine Hver 1 ml vaksine inneholder:

Claims (5)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et antigenisk preparat inneholdende proteinholdig materiale forbundet med adenylatcyklase-aktivitet, (ACAP) fra B. pertussis, karakterisert ved at man behandler en kultur av B. pertussis-celler i 1-24 timer ved en temperatur mellom 5 og 50°C, med en vandig aminosyrebuffer av pH 2,5-3,5, hvor aminosyrekomponentene er enten glycin eller alanin, og hvor bufferen omfatter en hypertonisk konsentrasjon av nevnte aminosyre m.h.t. cellene og i området 0,1-1 M, separerer cellene fra den resulterende supernatanten, og eventuelt isolerer det antigeniske preparatet fra supernatanten ved en hvilket som helst av eller kombinasjonen av følgende trinn hvorved: i) det ekstraherte materiale utsettes for DEAE-ioneutvekslingskromatografi; ii) materiale utsettes for isoelektrisk fokusering; iii) det isolerte materiale behandles ved passasje gjennom en immunoabsorberende kolonne omfattende et passende monoklonalt antistoff mot ACAP-materiale.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes en pH-verdi på 3.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at behandlingen utføres med en buffer i en tid mellom 10 og 20 timer.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1-3, karakterisert ved at behandlingen med buffer foretas ved en temperatur på 30-45°C.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at behandlingen med buffer foretas fortrinnsvis ved en temperatur på 37°C.