JPH07116053B2 - 抗原性調製物および該調製物の単離法 - Google Patents

抗原性調製物および該調製物の単離法

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JPH07116053B2
JPH07116053B2 JP60099413A JP9941385A JPH07116053B2 JP H07116053 B2 JPH07116053 B2 JP H07116053B2 JP 60099413 A JP60099413 A JP 60099413A JP 9941385 A JP9941385 A JP 9941385A JP H07116053 B2 JPH07116053 B2 JP H07116053B2
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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、百日咳菌（Bordetella pertussis）に対する
無細胞ワクチンに使用するための抗原性調製物（antige
nic preparations）に関する。
百日咳菌は人間において重いそして衰弱させる疾病を生
じさせ、子供が特にかかりやすく、それは先進国におい
て大規模免疫計画により管理下に保たれている。免疫は
この疾病の減少において非常に重要な因子であることお
よびワクチン接種の失敗はこの疾病の発生率の増加を導
きうることが見出されている。特に、すべての地域にお
いて、この疾病の予防に比較的有効であると認められて
いる全細胞百日咳ワクチンを使用して免疫が行われてい
る。しかしながら、全細胞ワクチンはいくつかの欠点の
あることが認識されている。即ち、たとえば、接種され
た子供10,000人のうち約１人に、発熱、局所反応および
泣き続けを包含する臨床症状が生じる。更に、全細胞ワ
クチンのいくつかのバッチは、全く無効であるか、望ま
しくない副作用を依然として付随するものと見做され
る。
免疫計画により先進国におけるこの疾病の現在の低い発
現で、便宜／危険比率は不充分に定義されており、そし
て多くの臨床医師は接種の危険が免疫により獲得される
便宜にまさると信じている。その結果、多くの子供が接
種されず、そこで百日咳の全国流行の重大な危険が存在
している。従つて、かなりの研究努力は改善された百日
咳ワクチン、そして特にこの疾病に対する保護に必要な
成分を合体しながら、従来使用された全細胞ワクチンと
結合した成分を欠く無細胞ワクチンの開発に向けられて
きた。
安全で有効な無細胞百日咳菌ワクチンについての研究
は、過去において全細胞ワクチン中に含有される百日咳
菌の病原性、毒性そして保護性の部分の本体および作用
のメカニズムに関する情報不足により制約されてきた。
従つて、作業は百日咳菌体の20種もしくはそれ以上の表
面抗原を単離および精製し、そして免疫反応を誘導する
それらの能力を特徴づけることに集中した〔たとえば、
ザ・ジヤーナル・オブ・ジアメリカン・メデイカル・ソ
サエテイ（J.Am.Med.Soc.）、248（１）22〜23、参
照〕。調査が示唆されてきた抗原の例は、リンホサイト
ーシス・プロモーテイング・フアクター（lymphocytosi
s promoting factor）〔パーツシス・トキシン（pertus
sis toxin）/LPF〕、フイラメンタス・ヘムアグルチニ
ン（filamentous haemagglutinin）〔FHA〕、リポポリ
サツカライド（lipopolysaccharide）〔LPS〕、アグル
チノーゲン（agglutinogens）、デルモネクロチツク・
トキシン（dermonecrotic toxin）〔DNT〕、熱不安定性
および安定性トキシン、ポリモルホニユクレア・リユー
コサイト・インヒビター・フアクター（polymorphonucl
ear leukocyte inhibitor factor）、アデニレート・サ
イクラーゼ（adenylate cyclase）および他の表面成分
を包含する〔パーツシス・バクシーン・ワークシヨツプ
（Pertussis vaccine Workshop）、1982年２月11日、ビ
ユロー・オブ・バイオロジツクス（Bureau of Biologic
s）、アメリカ〕。調査のための他の提案された候補抗
原は、トレイキアル・サイトトキシン（tracheal cytot
oxin）および各種外膜蛋白質を包含する。
初期の抽出物ワクチンはピレマー（L.Pillemer）〔プロ
シーデイングズ・オブ・ソサエテイ・エキスペリメンタ
ル・バイオロジー・アンド・メデイシン（Proc.Soc.Ex
p.Biol.Med.）、（1950）75、704〜705〕により開発さ
れ、それは崩壊させた百日咳菌細胞に基くものであり、
そして保護を提供することが認められたがこの製剤の毒
性の見地から商業的には採用されなかつた。
示唆されたより最近の百日咳菌抽出物ワクチンの例は、
培養物上澄液からのエンドトキシンの除去を含む英国特
許明細書第2,083,358A号（武田）中に記載されたもの；
アニオン界面活性剤での微生物懸濁液の抽出を含むフラ
ンス特許明細書第2,047,886号〔インスチチユート・メ
リユー（Institut Merrieux）〕中に記載されたもの；
およびパーツシス・トキシン（LPE）に基くサブユニツ
ト蛋白質からなる日本特許昭58−222,032号（帝人）中
に記載されたものを包含する。
無細胞百日咳ワクチンについて行われた作業の多くはた
とえばLPEについてのワクチンを基礎とすることの可能
性に集中している。しかしながら、百日咳ワクチン接種
と結合している従来観察された悪効果の大部分（全部で
ないとしても）はトキシンに関係している。破傷風また
はジフテリアトキソイドおよびLPSの組合せにおいて、
感受性マウスに実験的脳障害（encephalopathy）を誘導
することが可能である〔ステインマン（L.Steinman）
等、ネーチユア（Nature）、（1982）、299、738〜740;
レツドヘツド（Redhead）等、ワークシヨツプ・オン・
ボルデテラ・パーツシス（Workshop on B.pertussi
s）、ナシヨナル・インスチチユート・オブ・バイオロ
ジー（Nat.Inst.of Biol.）、スタンダーツ・アンド・
コントロールズ（Standards ＆ Controls）、ホリーヒ
ル（Holly Hill）、ハンプステツド（Hampsted）、ロン
ドン、1983〕。従つてLPFは、そのような合併症がワク
チン接種の後に生じるならば、多分脳損傷に責を有する
であろう。
百日咳菌の培養物中に見出され、以下に記載する如きア
デニレートサイクラーゼ活性と結合したある種の蛋白性
物質は、実験動物に投与するとき百日咳菌による攻撃に
対し保護を提供しうることが今や発見された。アデニレ
ートサイクラーゼ活性と通常結合した蛋白性物質が百日
咳菌に対する主要な保護抗原であるとのこの発見は、全
細胞ワクチンで実証された毒性副作用に責を有する他の
公知百日咳菌成分を含有しないかまたは減少した量で含
有する抗原製剤からなるワクチン調合物（vaccine form
ulation）の製造を許容する。
“アデニレートサイクラーゼ活性と結合した蛋白性物質
（proteinaceous material associated with adenylate
cyclase activity）”なる語（以下、“ACAP"と略記す
る）は、ここではアデニレートサイクラーゼ活性の抽出
をグリシン（0.25M）の水性の酸性（pH3）溶液を用いて
行うとき、アデニレートサイクラーゼ活性と一緒に抽出
される蛋白性物質を示すものである。
アデニレートサイクラーゼ活性は、ヒユーレツト（E.He
wlett）およびウオルフ（J.Wolff）の方法〔ザ・ジヤー
ナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、（19
76）、127、890〜898〕により検定した。
本発明は、次の特徴を有する精製百日咳菌（Bordetella
pertussis）抗原を提供する： 12％（w/w）ポリアクリルアミド ゲル電気泳動により
測定して、67,000−73,000の相対分子量；および アミノ酸分析により測定して、実質的に1:1であるプロ
リン対グルタミン酸比。
本発明はまた、上記定義のとおりの百日咳菌抗原を、医
薬として許容される担体と混合して含有するワクチンを
提供する。本発明の抗原は、たとえばホルマリン、グル
タルアルデヒドまたはβ−プロピオラクトンを使用して
トキソイド化されていてもよい。
このACAPは、67,000−73,000、一般に、67,000−69,00
0、特に69,000の相対分子量を有する。さらにまた、こ
のACAPは一般に、上記調製条件の下に、7.0−7.4の等電
点を有する。
「相対分子量（relative molecular weight）」の用語
は、12％（（w/w）ポリアクリルアミド ゲル電気泳動
および標準分子量マーカーにより決定された見掛けの分
子量を意味する。従って、本発明の抗原蛋白質の分子量
は、レムリ（U.K.Laemmli）によりNature、1970、227、
680−685に記載された技術によって便宜に決定しうる。
便宜な標準分子量マーカーには、たとえばウシ血清アル
ブミン、キモトリプシノーゲンＡおよびボヌクレアーゼ
が包含される。
このACAPは、等電点電気泳動により２つのバンドとして
検出でき、その１つは等電点（PI）約7.0を有し、そし
て他の１つ（拡散）は等電点7.2−7.4を有する。アデニ
レートサイクラーゼ活性は中性バンド（PI7.0）と殆
ど完全に連合したが、ACAPに対するモノクローナル抗体
は両方のバンドに強く結合した。
アミノ酸分析はまた、ACAPが通常、たとえばプロリン：
グルタミン酸比率が約1:1であるように高比率のプロリ
ンを含有し、そしてこの特徴はACAPを他の百日咳蛋白質
と区別するのに役立つ。更にACAPを区別する特徴は、そ
れがクロラミンＴまたはヨウドゲン法をいずれかによる
そのチロシン残基の放射ヨウ素化により検出できないと
いう事実である。
ACAPはさらにまた、次の性質の１つもしくは２つ以上を
有するという特徴を有する： （ｉ）チロシン残基がヨウ素化されえない； （ii）細胞内百日咳菌物質を実質的に含有していない； （iii）7.0から7.4までの等電点を有する；および （iv）pH約３以下で酸不安定性である。
本発明に従うワクチン調合物における使用のための上記
抗原調製物は、もしも所望ならば、ACAPに加えて、小量
の他の抗原性化学物質、たとえば百日咳菌体から抽出さ
れるACAPと一緒で得られる物質を含有しうる。そのよう
な物質はLPSおよびLPFの断片を包含しえ、それらは有害
な副作用の可能性の見地において、たとえばホルマリン
でトキソイド化することが必要である。しかしながら、
本抗原調製物は、好ましくは他の抗原成分を実質的に含
有していない。
アデニレートサイクラーゼは、以前に百日咳菌から単離
されている〔ヒユーレツト（E.L.Hewlett）等、ザ・ジ
ヤーナル・オブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、
127、890〜898、およびブロシーデイングズ・オブ・ナ
シヨナル・アカデミー・オブ・サイエンス（Proc.Nat.A
cad.Sci.）、アメリカ、73、1926〜1930〕が、この物質
が百日咳菌に対する保護抗原を示すことについては示唆
されていない。ヒユーレツト等の研究に従えば、総酵素
量の約0.5％を示す百日咳菌体からの総アデニレートサ
イクラーゼ活性の約20％のみが培養上澄液中に見出さ
れ、残りの80％は細胞と結合していた。従つて、抽出工
程は、上記抗原調製物における使用のために充分な量の
ACAPを商業規模で生成させるために、ACAPが高い純度お
よび収率で得られることを必要とする。そのような抽出
工程で克服しなければならない主要な困難は、他の蛋白
質の中でACAPは外膜のLPS骨格に１部分非常に強固に結
合していることである。過去においては、その結合した
蛋白質を遊離させるために、洗浄剤が一般に膜の可溶化
のために使用されてきた。しかしながら、百日咳菌体か
らの外膜蛋白質のための洗浄剤の使用は、次の欠点を有
することが見出されている： （ａ）外膜は外膜蛋白質の混合物からなるミセル凝集物
を形成するために可溶化される； （ｂ）外膜蛋白質は損傷されうる； （ｃ）細菌中に存在しない新規抗原が創成される；そし
て、 （ｄ）抽出された物質は、通常洗浄剤が除去された後に
水不溶性であると認められる。
我々は、洗浄剤の使用と対照的に、規制した緩和な酸性
条件を使用する百日咳菌体の抽出は、外膜から水溶性の
形でアデニレートサイクラーゼの著しく増加した収率
（先に報告された技術に比し約40×良い）の抽出をもた
らすことを見出だした。
従つて、百日咳菌Bordetella pertussisからのACAPを含
有する抗原調製物は、百日咳菌の培養物を細胞に関しア
ミノ酸の高張濃度からなるpH2.5〜3.5の水性アミノ酸バ
ツフアーで処理し、生成した上澄液から細胞を分離し、
そしてACAPを含有する抗原調製物を上澄液から単離する
ことからなる方法によって製造することができる。
上記方法において使用されるバツフアーは、好ましくは
pH約３を提供し、そして有利にはバツフアーの酸成分と
して鉱酸、好ましくは塩酸、およびアミノ酸としてグリ
シンまたはアラニンのいずれかを有利に包含する。バツ
フアーでの細胞の処理は、５から50℃まで、好ましくは
30から45℃まで、理想的には37℃の温度で、有利には１
から24時間、好ましくは10から20時間まで、0.1〜1M、
好ましくは0.25Mのアミノ酸濃度で好適に行われる。ACA
Pは酸不安定性であり、そしてもしもpHが抽出の間に３
以下に低下するならば破壊されうる。
細胞とバツフアーとのインキユベーシヨンの後、細胞は
捨て、そしてたとえば100,000gにおける遠心分離（粒子
物質のすべてを除去）の後に得られた上澄液は、もしも
所望ならば、たとえば硫酸アンモニウム、冷エタノール
またはアセトンを使用して沈澱させる。
得られた上澄抽出液は下記の如きケンドリツク試験（Ke
ndrick Test）で試験し、そしてマウスにおける百日咳
菌での脳内攻撃に対し保護を提供することが見出され
た。アデニレートサイクラーゼ活性を含有しない対照ワ
クチンは百日咳菌での攻撃に対して保護を少ししかまた
は全く提供しないことが見出され、ACAPは、実際に、免
疫において最も重要な因子でありうることが示唆され
た。非保護全細胞ワクチンのバツチの分析はまた非保護
がアデニレートサイクラーゼ活性の欠乏と結合する傾向
のあることを示し、ACAPは百日咳菌に対する免疫応答の
誘導に必要な鍵抗原でありうることを更に示唆した。
しかしながら、ケンドリツク試験に使用される上澄抽出
液はまたLPSの断片を包含する他の蛋白質と複合体化し
たACAPを少量含有し、この場合、本発明に従うワクチン
調合物における使用のために本物質を更に精製すること
が望ましい。従つて、たとえば更にこの精製は、複合体
化物質を除去するためのイオン交換クロマトグラフイお
よび（または）調製等電点電気泳動によつて行いうる。
別途に、２つの精製法は組合せることができ、即ち、DE
AEゲルに保持されない物質（即ち、非複合体化物質）は
等電点濃縮されうる。精製法はまた等電点クロマトグラ
フィを包含しうる。上記精製工程の後、ACAPは、もしも
所望ならば、たとえば本物質をACAPに対する適当なモノ
クロナール抗体を含有する免疫吸着カラムに通すことに
より更に精製しうる。
本発明に従う上記方法により製造されたものを包含する
上記抗原調製物は、人における百日咳に対する免疫を誘
導するためのワクチン調合物中に合体しうる。この目的
のために、抗原蛋白質は、医薬的に受容しうる担体また
はアジユバントとの結合において存在しうる。
この場合、医薬的に受容しうる担体は、患者に抗原を導
入するために担体として適当な液体媒質である。そのよ
うな担体の例は、食塩溶液である。抗原蛋白質は溶液中
に、あるいは担体中に固体として懸濁化されうる。
ワクチン調合物はまた、免疫応答を刺激するためのアジ
ユバントを包含しえ、それによつてワクチンの効果が高
められる。本発明における使用のための便宜なアジユバ
ントは、たとえば水酸化アルミニウムおよびリン酸アル
ミニウムを包含する。
便宜には、ワクチン調合物は、0.01から5mg/mlまで、好
ましくは0.03から2mg/mlまでの範囲内、最も好ましくは
0.3mg/mlの最終濃度の抗原蛋白質を含有して存在する。
調合の後、ワクチンは滅菌容器中に入れられ、それはつ
いで密封しそして低温たとえば４℃で貯蔵され、あるい
は凍結乾燥しうる。
百日咳に対し人間に免疫を誘導するために、適当に調合
されたワクチンの１もしくはそれ以上の用量が投薬され
うる。各投薬は、ワクチン0.1から2mlまで、好ましくは
0.2から1mlまで、好ましくは0.5mlであるのが推奨され
る。本発明は、更に他の態様において、宿主に対し上記
に限定した如きワクチン調合物の有効量の投与からな
る、人において百日咳に対する免疫を誘導する方法を提
供する。
本発明はまた、人において百日咳に対する免疫の誘導に
おける使用のためのワクチンの製造においてACAP（上記
に限定した如き）の使用を包含する。
本発明のワクチンは、経口および非経口（たとえば皮下
または筋肉内）注射を包含するワクチンの投与のための
任意の通常の方法により投与しうる。処置はワクチンの
１回投薬、あるいはある時間内の複数回の投薬からなり
うる。
本発明に従うワクチンはまた、１種もしくはそれ以上の
他の抗原性成分、たとえば適当にトキソイド化されたチ
フスおよびジフテリアトキシン、あるいは随伴する免疫
応答を回避する百日咳菌水の変異株の出現可能性を減少
させるために他の百日咳菌抗原たとえばトキソイド化LP
Fを包含しうる。
以下の実施例で本発明を説明する： 例１ 酸グリシン加水分解および粗外膜蛋白質の製造 細胞を指数相に至る3/4で採取し、そして8000g〔ソルバ
ール（Sorvall）、GSA、アングルヘツド〕で、４℃にお
いて20分間回転した。上澄液をサイホン除去し、そして
細胞を直ちに蒸留水中に、20〜30mg/ml細胞乾燥重量の
濃度で緩和に再懸濁した。この容量の1/3の1Mグリシン
−HClバツフアー（pH3.0）を緩和な攪拌下に加えて、25
0mMグリシンの最終濃度を得た。グリシン溶液は、酵素
活性を停止させるためにEDTA（最終混合物中に5mMを得
るため）を含有した。pHをチエツクし、そして必要な場
合、１〜2M HClを使用してpH3.0に再調節した。混合物
を37℃の水浴上で温度が平衡に達するまで緩和に攪拌
し、ついで37℃で（攪拌なしに）１夜（18時間）インキ
ユベートした。pHをついで、10M NaOHを使用して7.2〜
7.4に調節し、それは局所過剰を避けるためにゆつくり
加えた。細胞を5000gで、５℃において20分間沈降さ
せ、上澄液をサイホンで取り出し、氷水浴上で１〜２℃
に冷却し、そして予冷却アセトン（−20から−40℃ま
で）２容量を温度が１〜２℃以上に上昇するのを避ける
ためにゆつくり加えた。ついで混合物を−20℃に３〜５
時間保ち、そして沈澱を予冷却（−10℃）アングルヘツ
ド中に4000g、20分間で採取した。上澄液をサイホンで
取り出し、そして捨てた。沈降した沈澱を、氷冷蒸留水
中に、細胞懸濁液のもとの容量の約1/20に溶かした。つ
いで溶液から、50000gで、５℃において90〜120分間回
転することにより不溶物および担体を除去した。上澄液
を採取し、そして凍結して保存しまたは凍結乾燥した。
凍結乾燥前に１％W/Vマンニトールを加えた。細胞の乾
燥重量1g当り40から80mgまでの蛋白質が得られた。
例２ （ａ）DEAE−トリスアクリルクロマトグラフイによる粗
外膜蛋白質調製物の分離 DEAE−トリスアクリルカラム（３×16cm）を0.025MTRI
S、0.035M NaClバツフアー（pH8.8）で平衡化し、そし
て例１で得られた物質（蛋白質1gまで）を平衡化バツフ
アーに対し透析し、そしてカラムに60ml/時間でポンプ
注入した。画分（１管当り99滴、約5ml）を、プール（p
ools）１〜13において組合せた。適用した全蛋白質の１
部分（約1/4）はゲルベツトによつて遅延されず、そし
て大きなピークとして採取された（第１図、0.035M）。
ついで保持された物質を、0.025Mトリスバツフアー（pH
8.8）中の0.1、0.2、0.3および1.0M NaClを使用して溶
出した。画分を保持し、そして蛋白質の分離を確認する
ためにSDS−PAGE板に適用した。ACAPは、SDS−PAGEによ
り示される如くカラムによつて遅延されない物質中に存
在したが、0.2M NaClにより溶出される遅延された物質
中にまた存在した。
（ｂ）顆粒化ゲル中の調製フラットベット等電点電気泳
動（IEF） これはLKB勧告（recommendation）〔アプリケーシヨン
・ノート（Application Note）198、LKB−プロダクタ−
AB（LKB−Producter AB）、ブロマ（Bromma）、スエー
デン〕に従い行つた。ウルトロデツクス（Ultrodex）
（LKB）4gおよび予混合アムホリン（Ampholine）5mlの
懸濁液（pH3.5〜9.5）を、蒸留水中に最終容量100mlに
懸濁し、水平トレー（10.8×24.3cm）に注入し、そして
空気流下に勧告限界内に蒸発した。蒸留水中の同じアム
ホリンの1:20希釈中に浸した紙心（paper wicks）（LK
B、2117−106）３個の層にした片をトレーの各片に置い
た。例2aからの物質を、適用型板（application templa
te）（２×9.4cm）を使用して埋めこみ、それは陰イオ
ン末端からのその長さに沿つて1/3〜1/4の距離において
ゲル中に圧しつけ、密封したゲルを除去し、10ml容の使
い捨て注射器に移し、例2aからの該物質3ml（蛋白質500
mgまでを含有）中に懸濁し、そして最後にその除去によ
り形成した空のスペースに戻し注入した。ついでゲルを
必要ならばへらで平滑にし、そして20分間平衡化した。
その間、紙心１個をリン酸（比重1.75）の1:100希釈中
に浸し、そして陰イオン末端において紙片に加え、そし
て1M NaOH中の他のものは陽イオン末端においた。フラ
ツトベツドIEF装置〔フアルマシア（Pharmacia）型FBE
−3000〕中のトレー支持体を、操作の間、水道水（15
℃）を流すことにより冷却した。ゲルを一定の８ワツト
で操作した。
ACAPは２つのバンドとして検出され、１つはpI7.0のも
の、そして他方（拡散）バンドはpI7.2〜7.4のものであ
つた。アデニレートサイクラーゼ活性は中心バンド（pI
7.0）と殆んど完全に結合したが、ACAPに対するモノク
ロナール抗体は両方のバンドに強く結合した。
ついで、金属型板を使用して30の平行な場に分割し、ゲ
ルをへらで各場からかき取り、そして蒸留水1mlを含有
する試験管に移した。各画分のpHをこの段階で測定し
た。ついでゲル懸濁液を小さなプラスチツクカラムに移
し、0.2M重炭酸アンモニウムバツフアー（pH7.0）2mlで
溶出し、そしてゲル不含溶出液を凍結（−40℃）した。
（ｃ）分析等電点電気泳動 （ｉ）上記例２（ｂ）と同じ方法を用いたが、8M尿素の
存在における12％ポリアクリルアミドゲルを使用した。
例２（ｂ）と同じ結果が得られた。
（ii）同じ技術であるが10％ソルビトールの存在におけ
るアガロースゲルを使用して、pI4.5から6.0までの４つ
の免疫反応性バンドが示された。pI4.0のバンドは大部
分のアデニレートサイクラーゼ活性を保持した。
例３ モノクロナール免疫吸着カラムを使用するACAPの精製 ACAPに特異のモノクロナールイムノグロブリンを含有す
るマウス腹水を、室温において27％W/V Na2SO4２容量の
添加により沈殿させ、そして２〜４時間放置し、その後
沈降（2000g、15分間）させた。沈降物を再溶解し、そ
してPBSに対し透析した。この蛋白質500mg（UV決定）
を、製造者（フアルマシア）の指示に従い、充填CNBr−
セフアロースCL4B70mlにカツプリングさせた。セフアデ
ツクスＧ−50（中程度）を500mm×25mmカラムに220mmの
ベツドの高さにつめた。カラムを溶出バツフアー〔0.01
％チオメルサール（Thiomersal）を含有する0.2M重炭酸
アンモニウム、pH7.0〕で溶出した後、No.12バロチーニ
（Ballotini）ガラス玉を5mmの層の厚さにセフアデツク
スベツトの頂上部に注入した。更に洗滌した後、免疫吸
着ゲルをバロチーニガラス玉層に注入し、これはセフア
デツクスベツドから分離して両者を分離させた。カラム
を溶出バツフアーで更に洗滌し、そして最後に別のバロ
チーニガラス玉層を100mmの高さの免疫吸着ベツドの頂
上部に入れてカラムの頂上部を保護した。
免疫吸着カラム上のACAPを分離するために、蛋白質〔ロ
ウリー（Lowry）〕1mg/mlを含有するDEAE−トリスアク
リル分離（例２）からの非保持溶出液を、免疫吸着カラ
ムに５℃において0.25ml/分で適用し、溶出バツフアー
〔0.2M重炭酸アンモニウム、pH7、0.01％W/Vチオメルサ
ール〕で洗滌し、そしてベースラインが安定化された後
に、溶出バツフアー中の6M尿素50mlをカラムに適用して
吸着物質を溶出した。セフアデツクスＧ−50ベツド上の
免疫吸着物質の位置決定は、操作中に尿素からの蛋白質
の同時分離を可能とした。
例４ 百日咳菌の培養 微生物の生育のために使用した限定培地は従来記載〔ノ
ボトニー（Novotny）およびブルツクス（Brookes）、19
75〕された如きスタイナー（Steiner）およびシヨルト
（Scholte）（1971）の組成に基くものであつた。すべ
ての培地は36〜37℃で生育させた。ゆるく栓をした振盪
フラスコ（培地200mlを入れた500ml容円錐フラスコ）中
の液体培地に、２％寒天および５％ウマ血液を加えたコ
ーエン・ウイラー培地（Cohen−Wheeler medium）上48
時間生育させ、そして20〜40μM O2／時間のガス交換率
を与えるために振盪した培養物を接種した。そのような
培養物を使用して5lまたは70l容の全ガラス醗酵器中の
培地に接種し、一方はpHは2M HClの管理した添加により
7.6に維持し、そして渦動振盪により５〜10％における
溶存酸素飽和を維持した。培養物を指数相終末期の前、
即ち約36時間のインキユベーシヨンの後採取した〔ノボ
トニー（Novotny）およびコウンレイ（Cownley）、197
8〕。
例５ ケンドリツク（Kendrick）試験 これは、体重14〜16gのMF1またはNIHマウス〔OLAC、カ
テゴリー３、気管支敗血症菌（B.bronchiseptica）を包
含する病原菌の多くを含まない〕を使用し、百日咳ワク
チンについてのW.H.O.要求に従い遂行した。0.5ml容量
中の抗原を腹腔内に接種し、そして最高希釈および３回
の４倍連続希釈からなつた。２週間後に、推奨された攻
撃株18−323（100〜200LD50）を使用して、マウスを攻
撃した。各群の生存数を、パラレル・ライン・プロビツ
ト分析（parallel line probit analysis）の計画表を
使用し、ブリテイツシユ・パーツシス・リフアレンス・
ワクチン（British Pertusis Reference Vaccine）66/8
4に関係して、ＥD50および相対強度の計算に使用した。
FHA/LPFワクチンを使用して、比較試験をまた行つた。
結果を表１に示す。
例６ ACAPのアミノ酸分析 アミノ酸分析を、ランク・ヒルガー・クロマスペツク
（Rank Hilger Chromaspek）アミノ酸分析機を使用して
行つた。検体は、厚壁（thick−walled）パイレツクス
試験管（7.5×1.2cm）中の乾燥した検体物質に、0.1％
（W/V）フエノールを含有する6N HCl〔BDHアリスター
（Aristar）等級から希釈〕250μｌの添加により製造し
た。ついで狭い穴を導くために試験管を、酸素−天然ガ
ス流−トーチ焔中で引き延ばした。内容物をドライアイ
ス−エタノール浴中で凍結した後、各試験管を分岐管お
よびトラツプを経て高真空ポンプに連結し、そして空気
を除去するために10分間放置した。ついで試験管を封印
し、そして加水分解のために110℃において炉中に入れ
た。加水分解した検体を真空乾燥器中、粒状水酸化ナト
リウム上で乾燥した。乾燥した残渣を、自動分析のため
に、アミノ酸分析器出発バツフアー250μｌに溶かし
た。表２に示すアミノ酸値は、68時間加水分解値を使用
したバリンおよびイソロイシンの場合を除いて、２回の
24、48および68時間加水分解から得られた結果の平均で
ある。
シスチン、システインおよびトリプトフアンの値は、こ
の方法によつては決定できなかつた。
表２ 残基 アスパラギン酸（＋アスパラギン） 48 スレオニン 33 セリン 33 グルタミン酸（＋グルタミン） 62 プロリン 60 グリシン 77 アラニン 82 バリン 54 メチオニン ４ イソロイシン 22 ロイシン 50 チロシン ７ フエニルアラニン 11 ヒスチジン 13 リジン 19 アルギニン 37 例７ ワクチン調合物 免疫における使用のためのワクチンは、通常の技術によ
り次の成分から製造しうる： ａ）単一溶液中のジフテリア、破傷風および百日咳ワク
チン ワクチン各1mlは次のものを含有する： ジフテリアトキソイド ＞60 I.U. 破傷風トキソイド ＞120 I.U. 本発明の百日咳菌抗原 ＞0.363 mg ホウ酸ナトリウム ＜10.03 mg コハク酸 ＜3.10 mg チオメルサール 0.04〜0.2 mg 塩化ナトリウム ＜8.5 mg 水 適量 全量 1ml ｂ）吸着したジフテリア、破傷風および百日咳ワクチン ジフテリア、破傷風および百日咳菌成分を、水酸化アル
ミニウムゲル上に標準技術により吸着させる。
ワクチン各1mlは次のものを含有する： ジフテリアトキソイド ＞60 I.U. 破傷風トキソイド ＞120 U.L. 本発明に従う抗原 ＞0.363 mg 不溶性アルミニウム塩 ＜0.093ミリモル（2.5mg）Al.に
当量 ホウ酸ナトリウム ＜8.01 mg コハク酸 ＜2.48 mg チオメルサール 0.04〜0.2 mg 塩化ナトリウム ＜6.8 mg 水 適量 全量 1ml ｃ）百日咳ワクチン ワクチン各1mlは次のものを含有する： 本発明に従う抗原 ＞0.363 mg チオメルサール 0.04〜0.2 mg 塩化ナトリウム ＜8.5 mg 水 適量 全量 1ml

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】12％（w/w）ポリアクリルアミド ゲル電
    気泳動で測定して相対分子量67,000〜73,000であり、か
    つアミノ酸分析によりプロリン対グルタミン酸の割合が
    実質的に1:1であることを特徴とする精製百日咳菌（Bor
    detella pertussis）抗原。
  2. 【請求項２】12％（w/w）ポリアクリルアミド ゲル電
    気泳動で測定して相対分子量67,000〜69,000を有するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項の抗原。
  3. 【請求項３】12％（w/w）ポリアクリルアミド ゲル電
    気泳動で測定して相対分子量69,000を有することを特徴
    とする特許請求の範囲第２項の抗原。
  4. 【請求項４】医薬として使用可能な担体を混合した、12
    ％（w/w）ポリアクリルアミド ゲル電気泳動で測定し
    て相対分子量67,000〜73,000であり、かつアミノ酸分析
    によりプロリン対グルタミン酸の割合が実質的に1:1で
    あることを特徴とする百日咳菌（Bordetella pertussi
    s）抗原からなるワクチン。
  5. 【請求項５】抗原が12％（w/w）ポリアクリルアミド
    ゲル電気泳動で測定して相対分子量67,000〜69,000を有
    することを特徴とする特許請求の範囲第４項のワクチ
    ン。
  6. 【請求項６】抗原が12％（w/w）ポリアクリルアミド
    ゲル電気泳動で測定して相対分子量69,000を有すること
    を特徴とする特許請求の範囲第５項のワクチン。
  7. 【請求項７】抗原が0.01〜5mg/mlの範囲で存在する特許
    請求の範囲第４項、５項または６項のいずれか一つのワ
    クチン。
  8. 【請求項８】抗原が0.03〜2mg/mlの範囲で存在する特許
    請求の範囲第７項のワクチン。
  9. 【請求項９】医薬として使用可能なアジュバントを含有
    する特許請求の範囲第４項〜８項のいずれか一つのワク
    チン。
  10. 【請求項１０】１個以上の他の抗原を含有する特許請求
    の範囲第４項〜９項のいずれか一つのワクチン。
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