DK165358B - Acellulaert eller renset bordetella pertussis antigen, vaccine indeholdende et saadant antigen og fremgangsmaade til isolering af et antigent praeparat indeholdende et saadant antigen, samt anvendelse af antigenet - Google Patents
Acellulaert eller renset bordetella pertussis antigen, vaccine indeholdende et saadant antigen og fremgangsmaade til isolering af et antigent praeparat indeholdende et saadant antigen, samt anvendelse af antigenet Download PDFInfo
- Publication number
- DK165358B DK165358B DK208985A DK208985A DK165358B DK 165358 B DK165358 B DK 165358B DK 208985 A DK208985 A DK 208985A DK 208985 A DK208985 A DK 208985A DK 165358 B DK165358 B DK 165358B
- Authority
- DK
- Denmark
- Prior art keywords
- antigen
- pertussis
- vaccine
- amino acid
- supernatant
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 title claims abstract description 12
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims description 45
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims description 45
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims description 45
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims abstract description 45
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 32
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims abstract description 20
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims abstract 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 25
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 22
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 19
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 15
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 11
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 7
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 7
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 claims description 6
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 4
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 claims description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 3
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 3
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 claims description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 claims description 3
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 claims description 3
- VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N chloramine T Chemical compound [Na+].CC1=CC=C(S(=O)(=O)[N-]Cl)C=C1 VDQQXEISLMTGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 claims 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 claims 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 claims 1
- 229960001479 tosylchloramide sodium Drugs 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 20
- 102000030621 adenylate cyclase Human genes 0.000 abstract description 18
- 108060000200 adenylate cyclase Proteins 0.000 abstract description 18
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 21
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 21
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 21
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 18
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 13
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 6
- 101710116435 Outer membrane protein Proteins 0.000 description 6
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 6
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 6
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 6
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 6
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710154643 Filamentous hemagglutinin Proteins 0.000 description 4
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 4
- 206010043376 Tetanus Diseases 0.000 description 4
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 4
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 4
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 4
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 4
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 4
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N succinic acid Chemical compound OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 3
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 3
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 3
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 3
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 229960003983 diphtheria toxoid Drugs 0.000 description 3
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 3
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229960004906 thiomersal Drugs 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 3
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 3
- 108700012359 toxins Proteins 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- FBEHFRAORPEGFH-UHFFFAOYSA-N Allyxycarb Chemical compound CNC(=O)OC1=CC(C)=C(N(CC=C)CC=C)C(C)=C1 FBEHFRAORPEGFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710110818 Dermonecrotic toxin Proteins 0.000 description 2
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 2
- 229960002766 tetanus vaccines Drugs 0.000 description 2
- BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N trisodium borate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]B([O-])[O-] BSVBQGMMJUBVOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- APUIQTDTBPKWKE-RNPGEKFLSA-N (2r,6s)-6-[[(4r)-4-[[(2s)-2-[2-[[(1r,2s,3r,4r,5r)-4-acetamido-2-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-acetamido-4,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6,8-dioxabicyclo[3.2.1]octan-3-yl]oxy]propanoylamino]propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-2-amino-7-[[(2r)-2-am Chemical compound O([C@@H]1[C@H]2CO[C@H](O2)[C@H](NC(C)=O)[C@H]1OC(C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(=O)N[C@@H](CCC[C@@H](N)C(O)=O)C(=O)NC(=O)[C@H](N)C)C(O)=O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1NC(C)=O APUIQTDTBPKWKE-RNPGEKFLSA-N 0.000 description 1
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 241000588779 Bordetella bronchiseptica Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 108010038061 Chymotrypsinogen Proteins 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 206010024769 Local reaction Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 101000716700 Mesobuthus martensii Toxin BmKT Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229920002807 Thiomer Polymers 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 1
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 1
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N beta-propiolactone Chemical compound O=C1CCO1 VEZXCJBBBCKRPI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 238000007664 blowing Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 230000006931 brain damage Effects 0.000 description 1
- 231100000874 brain damage Toxicity 0.000 description 1
- 208000029028 brain injury Diseases 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000010668 complexation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960005097 diphtheria vaccines Drugs 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical class C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 239000007973 glycine-HCl buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000224 granular leucocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000005457 ice water Substances 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000003345 natural gas Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000013618 particulate matter Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229960000380 propiolactone Drugs 0.000 description 1
- 239000005297 pyrex Substances 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012925 reference material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000008399 tap water Substances 0.000 description 1
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/235—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Bordetella (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/806—Antigenic peptides or proteins
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/82—Proteins from microorganisms
- Y10S530/825—Bacteria
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
Description
DK 165358B
Den foreliggende opfindelse angår et acellulært eller renset Bordetella pertussis antigen, vacciner indeholdende et sådant antigen og en fremgangsmåde til isolering af et antigent præparat indeholdende et sådant antigen, samt anvendelse af antigenet til fremstilling 5 af en vaccine.
Bordetella pertussis forårsager en alvorlig og svækkende sygdom hos mennesker, idet børn er særlig modtagelige, hvilken sygdom holdes under kontrol i de udviklede lande ved hjælp af stort anlagte immuniserings-10 programmer. Det har vist sig, at immunisering er en meget vigtig faktor ved begrænsningen af sygdommen, og at undladelse af at vaccinere kan føre til forøget forekomst af sygdommen. Praktisk taget alle steder fremkaldes immunisering ved anvendelse af helcelle B. pertus-15 sis-vaccine, der har vist sig at være forholdsvis effektiv til forhindring af sygdommen. Man har imidlertid erkendt, at helcellevacciner kan have adskillige ulemper.
Således optræder der f.eks. hos ca. 1 ud af hver 10.000 vaccinerede børn kliniske symptomer, som kan omfatte 20 feber, lokale reaktioner og vedvarende skrigen. Endvidere vil det vise sig, at nogle batche af helcellevaccine overhovedet ikke giver nogen beskyttelse, medens de stadig indebærer muligheden for uønskede bivirkninger.
Med den for nærværende ringe forekomst af sygdom-25 men i udviklede lande med immuniseringsprogrammer er nytte/risiko-forholdet dårligt defineret, og mange klinikere mener, at risiciene ved vaccinering vejer tungere end de fordele, der opnås ved immunisering. Som følge heraf vaccineres mange børn ikke, og der er derfor en 30 alvorlig risiko for en pandemi af kighoste. En betydelig forskningsindsats er derfor blevet rettet mod udviklingen af forbedrede pertussis-vacciner og navnlig acellulære vacciner, der ikke indeholder de komponenter, som er forbundet med de toxiske virkninger af de hidtil an-35 vendte helcellevacciner, medens de indeholder de komponenter, der er nødvendige til beskyttelse mod sygdommen.
DK 165358 B
2
Eftersøgningen efter en sikrere, effektiv, acellulær B. pertussis-vaccine er tidligere blevet vanskeliggjort af knapheden på oplysninger vedrørende identiteten og virkningsmekanismerne af de patogene, toxiske 5 og beskyttende dele af i helcellevacciner indeholdt B. pertussis. Arbejdet har derfor koncentreret sig om at isolere og rense de 20 eller flere overfladeantigener hos' B. pertussis-organismen og karakterisere deres evne til at fremkalde immunreaktioner (se f.eks. J. Am. Med.
10 Soc., 248 (1) 22-23). Som eksempler på antigener, der er blevet foreslået til undersøgelse, kan der nævnes lym-focytosis-fremmende faktor (pertussis toxin/LPF), filamentformet hæmagglutinin (FHA), lipopolysaccharid (LPS), agglutinogener, dermonekrotisk toxin (DNT), varmelabile 15 og varmestabile toxiner, polymorfonukleær leukocyt-inhibitor faktor, adenylat-cyclase og andre overfladekomponenter (Pertussis Vaccine Workshop, 11. februar 1982,
Bureau of Biologies, U.S.A.). Af andre til undersøgelse foreslåede antigener kan der nævnes trachealt cytotoxin 20 og forskellige ydre membran-proteiner.
En tidlig ekstraktvaccine udvikledes af L. Pille-mer (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. (1950) 75, 704-705), hvilken vaccine var baseret på sprængte B. pertussis-celler og viste sig at give beskyttelse, men ikke vandt 25 indpas kommercielt som følge af præparatets toxicitet.
Som eksempler på senere B. pertussis-ekstraktvac-ciner, der er blevet foreslået, kan der nævnes de i britisk patentbeskrivelse nr. 2.083.358A (Takeda) beskrevne, der indebærer fjernelse af endotoxin fra kultur-su-30 pernatanter; de i fransk patentskrift nr. 2.047.886 (Institut Merrieux) beskrevne, der indebærer ekstraktion af en mikrobesuspension med et anionisk overfladeaktivt middel; og de i japansk patentbeskrivelse nr. 58-222032 (Teijin) beskrevne, der omfatter et underenheds-protein 35 baseret på pertussis-toxin (LPF).
Meget af det arbejde, der er udført på acellulære pertussis-vacciner, koncentrerer sig om muligheden for
DK 165358B
3 at basere en sådan vaccine på LPF. Det antages imidlertid, at de fleste af (om ikke alle) de hidtil observerede ugunstige virkninger, der forbindes med pertussis-vaccination, står i forbindelse med toxinet. I kombina-5 tion med tetanus- eller difteri-toxoid og LPS er det i stand til at fremkalde eksperimentel encephalopati hos modtagelige mus (L. Steinman et al., Nature (1982) 299, 738-740; Redhead et al., Workshop on B. pertussis. Nat.
Inst, of Biol. Standards & Controls, Holy Hill, Hamp-10 stead, London, 1983). LPF kan således muligvis være ansvarligt for hjerneskader, hvis sådanne komplikationer optræder efter vaccination.
Det har nu vist sig, at et vist proteinmateriale, der er forbundet med adenylat-cyclase-aktivitet som be-15 skrevet i det følgende, og som findes i kulturer af B. pertussis, er i stand til at give beskyttelse mod angreb af B. pertussis, når det administreres til forsøgsdyr.
Denne erkendelse, at det med adenylat-cyclase-aktivitet sædvanligvis forbundne proteinmateriale er et vigtigt 20 beskyttende antigen mod B. pertussis, muliggør fremstillingen af vaccineformuleringer omfattende antigene præ-• parater, der er fri for, eller indeholder reducerede mængder af, andre kendte B. pertussis-komponenter, der kan være ansvalige for de toxiske bivirkninger, som .25 helcellevacciner udviser.
Udtrykket "med adenylat-cyclase-aktivitet forbundet proteinmateriale" (i det følgende forkortet til "AGAP") anvendes heri som betegnelse for proteinmateriale, der ekstraheres sammen med adenylat-cyclase-aktivi-30 tet, når ekstraktionen af adenylat-cyclase-aktiviteten udføres under anvendelse af en vandig, sur (pH 3) opløsning af glycin (0,25 M). Adenylat-cyclase-aktiviteten bestemtes ved den metode, der er beskrevet af Hewlett, E., og Wolff, J. (J. Bacteriol. (1976) 127, 890-898).
35 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der et acellulært eller renset Bordetella pertussis an-
DK 165358 B
4 tigen, der er ejendommeligt ved følgende træk: en relativ molekylvægt på 67.000-73.000 som bestemt ved 12% (vægt/vægt) polyacrylamidgel-elektroforese og et forhold mellem prolin og glutaminsyre på i det væ-5 sentlige 1:1 som bestemt ved aminosyreanalyse, hvorhos antigenet er i det væsentlige fri for intracel-lulært B. pertussis materiale.
Antigenet kan yderligere karakteriseres ved at have følgende aminosyresammensætning: 10
Rester
Asparaginsyre (+asparagin) 48
Threonin 3 3
Serin 33 15 Glutaminsyre (+glutamin) 62
Prolin 60
Glycin 77
Alanin 82
Valin 54 20 Methionin 4
Isoleucin 22
Leucin 50
Tyrosin 7
Phenylalanin li 25 Histidin 13
Lysin 19
Arginin 37
Aminosyreanalyse har desuden vist, at ACAP inde-30 holder en usædvanlig høj andel af prolin, således at prolin:glutaminsyre-forholdet er ca. 1:1, og dette karakteristiske træk tjener til at skelne ACAP fra andre B. pertussis-proteiner. Et yderligere karakteristisk kendemærke for ACAP er den omstændighed, at det ikke kan 35 påvises ved radio-iodering af dets tyrosinrester hverken ved chloramin-T- eller iodogen-metoden.
DK 165358B
5
Antigenet ifølge den foreliggende opfindelse kan desuden karakteriseres ved at have et isoelektrisk punkt på 4,5-6,0 under analytiske isoelektriske betingelser under anvendelse af en agarosegel i nærværelse af 10% 5 sorbitol. Antigenet kan karakteriseres ved at være syre-• labilt under en pH-værdi på ca. 3.
ACAP'et i de ovennævnte præparater har almindeligvis en relativ molekylvægt på ca. 67.000 til 73.000, især 69.000, og et isoelektrisk punkt på 7,0-7,4 under 10 præparative betingelser som beskrevet nedenfor. Med "relativ molekylvægt" menes den tilsyneladende molekylvægt som bestemt ved 12% (vægt/vægt) polyacrylamidgel-elektroforese og standardmolekylvægtmarkører. Molekylvægten for de antigene proteiner ifølge opfindelsen kan 15 således bekvemt bestemmes ved de metoder, der er beskrevet af U. K. Laemmli, Natur, 1970, 227, 680-685. Af passende standardmolekylvægtmarkører kan der f.eks. nævnes okseserumalbumin, chymotrypsinogen A og ribonuclease.
Nærmere angivet kan ACAP'et påvises ved isoelek-20 trisk fokusering som to bånd, det ene med et isoelektrisk punkt (pi) på ca. 7,0, det andet (diffuse) bånd med et isoelektrisk punkt på 7,2-7,4. Adenylat-cyclase-aktiviteten var næsten fuldstændig forbundet med det neutrale bånd (pi = 7,0), men monoklonale antistoffer 25 mod ACAP bandt begge bånd stærkt.
Ifølge en foretrukken udførelsesform for den foreliggende opfindelse er det ovennævnte ACAP et proteinmateriale, der er karakteriseret ved at have en eller flere af følgende egenskaber: 30 (i) et forhold mellem prolin og glutaminsyre på i det væsentlige 1:1, (ii) tyrosinresterne er ikke ioderbare, (iii) det er i det væsentlige fri for intracel-lulært B. pertussis-materiale,
DK 165358 B
6 (iv) en relativ molekylvægt på 67.000 til 73.000, (v) et isoelektrisk punkt på 7,0 til 7,4, og (vi) det er syrelabilt under en pH-værdi på ca. 3.
Ifølge opfindelsen tilvejebringes der desuden en 5 vaccine som angivet i krav 8 og 9-12.
Opfindelsen angår endvidere en fremgangsmåde til isolering af et antigent præparat indeholdende et B. pertussis antigen, hvilken fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man behandler en kultur af B. pertussis-celler 10 med en vandig aminosyrepuffer med pH 2,5-3,5 og indeholdende en hypertonisk koncentration af nævnte aminosyre med hensyn til cellerne, skiller cellerne fra den fremkomne supernatant og isolerer et antigent præparat indeholdende antigenet ifølge opfindelsen fra supernatanten.
15 Ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes der også en vaccineformulering til beskyttelse mod B. pertussis, hvilken formulering omfatter et fra B. .pertussis afledt antigent præparat omfattende ACAP, der eventuelt er toxoideret f.eks. under anvendelse af for-20 malin, glutaraldehyd eller β-propiolacton, sammen med en farmaceutisk acceptabel bærer herfor..
De ovennævnte antigene præparater til anvendelse i vaccineformuleringen ifølge opfindelsen kan om ønsket indeholde mindre mængder af andre antigene forbin-25 delser, foruden ACAP'et, f.eks. materialer opnået sammen med det fra B. pertussis-organismen ekstraherede ACAP. Sådanne materialer kan omfatte fragmenter af LPS og LPF, der som følge af deres mulige skadelige bivirkninger kræver toxoidering, f.eks. med formalin. De antigene 30 præparater er imidlertid fortrinsvis i det væsentlige fri for andre antigene komponenter.
Adenylat-cyclase er tidligere blevet isoleret fra B. pertussis (Chemical Abstracts 85^, 105868x, 1976; E.
L. Hewlett et al., J. Bacteriol, 127, (1976) 890-898, og 35 Proc. Nat. Acad. Sci., U.S.A., 73, (1976) 1926-1930).
Adskillige kommercielle pertussis vacciner har vist sig
DK 165358B
7 at indeholde adenylcyclaseaktivitet (Chemical Abstracts 87, 130172 g, 1977). Der har imidlertid ikke været nogen som helst antydning af, at dette materiale repræsenterer et beskyttende antigen mod B. pertussis. Ifølge det af 5 Hewlett et al. udførte arbejde fandt man i kultur-super-natanten kun ca. 20% af den totale adenylat-cyclase-aktivitet fra B. pertussis-organismen, hvilket repræsenterer ca. 0,5% af det totale enzym, idet de resterende 80% var bundet til celler. Det er derfor nødvendigt med 10 en ekstraktionsproces, ved hvilken ACAP'et kan opnås i høj renhed og højt udbytte, for i kommerciel målestok at opnå tilstrækkelige mængder af ACAP til anvendelse i de ovennævnte antigene præparater. En betydelig vanskelighed, der skal overvindes med en sådan ekstrakt:onspro-15 ces, er, at ACAP'et, blandt andre proteiner, er bundet, en del af det meget fast, til LPS-grundstammen i den ydre membran. Tidligere har man almindeligvis anvendt detergenter til opløseliggørelse af membranen for at frigøre de hertil knyttede proteiner. Anvendelsen af de-20 tergenter til ekstraktion af ydre membran-proteiner fra B. pertussis-organismer har imidlertid vist sig at have følgende ulemper: a) den ydre membran opløseliggøres til dannelse af micellære aggregater omfattende blandinger af 25 ydre membran-proteiner, b) de ydre membran-proteiner kan beskadiges, c) nye antigener, der ikke forekommer i bakterien, kan frembringes, og d) det ekstraherede materiale viser sig sædvanligvis 30 at være vanduopløseligt, efter at detergenten er fjernet.
I modsætning til hvad der opnås ved anvendelse af detergenter, har det nu vist sig, at ekstraktion af B. pertussis-organismer under anvendelse af regulerede, 35 svagt sure betingelser resulterer i ekstraktion af væsentligt forøgede udbytter (ca. 40 gange bedre end tid-
DK 165358 B
8 ligere rapporterede metoder) af adenylat-cyclase fra den ydre membran i en form, der er vandopløselig.
Den foreliggende fremgangsmåde til isolering af et antigent præparat indeholdende ACAP fra B. pertussis 5 består i, at man behandler en kultur af B. pertussis-celler med en vandig aminosyrepuffer med pH 2,5-3,5 og indeholdende en hypertonisk koncentration af nævnte aminosyre med hensyn til cellerne, skiller cellerne fra den opnåede supernatant og isolerer et antigent præparat 10 indeholdende ACAP fra supernatanten.
Den ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde anvendte puffer giver fortrinsvis en pH-værdi på ca. 3 og indeholder fordelagtigt en mineralsyre, fortrinsvis saltsyre, som den sure komponent i pufferen og enten 15 glycin eller alanin som aminosyren. Behandlingen af cellerne med pufferen foretages fortrinsvis ved en temperatur på 5 til 50°C, fortrinsvis 30 til 45°C, ideelt 37°C, fordelagtigt i 1 til 24 timer, fortrinsvis 10 til 20 timer, med en aminosyrekoncentration på 0,1-1M, for-20 trinsvis 0,25M. ACAP'et er syrelabilt og kan ødelægges, hvis pH-værdien falder til under 3 under ekstraktionen.
Efter inkubering af cellerne med pufferen bortkastes cellerne, og supernatanten, der opnås efter centrifugering, f.eks. ved ca. 100.000 g (til fjernelse af 25 alt partikelformet materiale), underkastes om ønsket precipitation, f.eks. under anvendelse af ammoniumsulfat, koldt ethanol eller acetone.
Den opnåede supernatant-ekstrakt afprøvedes ved Kendrick-testen, som beskrevet nedenfor, og viste sig at 30 give beskyttelse hos mus mod intracerebrale angreb af B. pertussis. Kontrolvacciner, der ikke indeholdt adenylat-cyclase-aktivitet, viste sig at give kun ringe eller ingen beskyttelse mod angreb af B. pertussis, hvilket tyder på, at ACAP faktisk kan være den vigtigste faktor 35 med hensyn til immunitet. Analyse af batcher af ikke-be-skyttende helcellevaccine har desuden vist, at ikke-be-
DK 165358B
9 skyttelse viser tilbøjelighed til at være forbundet med manglende tilstedeværelse af adenylat-cyclase-aktivitet, hvilket yderligere tyder på, at ACAP kan være det nøgleantigen, der er nødvendigt til fremkaldelse af en immun-5 respons mod B. pertussis.
Den ved Kendrick-testen anvendte supernatant-eks-trakt kan imidlertid også indeholde ACAP'et i små mængder i kompleksforbindelse med andre proteiner, herunder fragmenter af LPS, i hvilke tilfælde det kan være ønske-10 ligt at rense materialet til anvendelse i vaccineformuleringerne ifølge opfindelsen yderligere. Således kan yderligere rensning f.eks. foretages ved ionbytnings-chromatografi og/eller ved præparativ isoelektro-fokuse-. ring til eliminering af som kompleksforbindelser fore-15 liggende materiale. Alternativt kan de to rensningsmetoder kombineres, dvs. det materiale, der ikke tilbageholdes af DEAE-gelen (dvs. det ikke-komplekserede materiale), kan underkastes elektrofokusering. Rensningsmetoden kan også omfatte chromatofokusering. Efter de ovenfor 20 beskrevne rensningstrin kan ACAP*et om ønsket renses yderligere, f.eks. ved at passere materialet gennem en immunosorbenskolonne indeholdende et passende monoklo-nalt antistof mod ACAP'et.
De ovenfor beskrevne antigene præparater, herun-25 der de ved den ovenfor beskrevne fremgangsmåde ifølge opfindelsen fremstillede, kan inkorporeres i en vaccineformulering til fremkaldelse af immunitet mod kighoste hos mennesker. En vaccine ifølge den foreliggende opfindelse omfatter derfor et antigen ifølge opfindelsen i 30 blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.
Farmaceutisk acceptable bærere er i dette tilfælde flydende medier, der er egnede til anvendelse som vehikler til indføring af antigenet i patienten. Et eksempel på en sådan bærer er saltopløsning. Det antigene 35 protein kan være i opløsning eller suspenderet som et fast stof i bæreren.
DK 165358 B
10
Vaccineformuleringen kan også indeholde et adju-vans til stimulering af immunresponsen og dermed forøgelse af virkningen af vaccinen. Passende adjuvanser til anvendelse ved den foreliggende opfindelse omfatter 5 f.eks. aluminiumhydroxid og aluminiumphosphat.
Vaccineformuleringerne præsenteres passende således, at de indeholder en slutkoncentration af antigent protein i området fra 0,01 til 5 mg/ml, fortrinsvis 0,03 til 2 mg/ml, mest foretrukket 0,3 mg/ml. Efter formule-10 ring kan vaccinen inkorporeres i en steril beholder, som derefter lukkes tæt til og opbevares ved lav temperatur, f.eks. 4°C, eller den kan frysetørres.
Til fremkaldelse af immunitet hos mennesker mod' kighoste kan der administreres en eller flere doser af 15 den passende formulerede vaccine. Det anbefales, at hver dosis er 0,1 til 2 ml, fortrinsvis 0,2 til 1 ml, mest foretrukket 0,5 ml vaccine.
Den foreliggende opfindelse omfatter også anvendelsen af et antigen ifølge opfindelsen til fremstilling 20 af en vaccine til anvendelse ved fremkaldelsen af immunitet mod kighoste hos mennesker.
Vaccinerne ifølge den foreliggende opfindelse kan administreres ved en vilkårlig konventionel fremgangsmåde til administrering af vacciner, herunder oral ind-25 givelse og parenteral (f.eks. subkutan eller intramu-skulær) injektion. Behandlingen kan bestå i en enkelt dosis vaccine eller flere doser over et vist tidsrum.
Vacciner ifølge den foreliggende opfindelse kan også omfatte en eller flere andre antigener, f.eks. pas-30 sende toxoiderede typhoid- og difteri-toxiner, eller andre B. pertussis-antigener, såsom toxoideret LPF, til formindskelse af sandsynligheden for at mutantstammer af B. pertussis undgår den ledsagende immunrespons.
Opfindelsen belyses nærmere ved hjælp af de ef-35 terfølgende eksempler.
DK 165358B
11
Eksempel 1
Sur qlycin-hydrolyse og fremstilling af rå ydre-membran-proteiner♦ 5 Cellerne høstedes efter 3/4 af vejen gennem den eksponentielle fase og centrifugeredes ved 8000 g (Sor-vall, GSA vinkelhoved) i 20 minutter ved 4°C. Superna-tanten fjernedes ved hjælp af en hævert, og cellerne blev straks forsigtigt resuspenderet i destilleret vand 10 til en densitet på 20-30 mg/ml celletørvægt. En tredjedel af dette volumen af 1M glycin-HCl-puffer, pH 3,0, tilsattes under forsigtig omrøring til opnåelse af en slutkoncentration på 250 mM glycin. Glycinopløsningen indeholdt EDTA (til opnåelse af 5 mM i den endelige 15 blanding) til standsning af enzymatisk aktivitet. pH-Værdien kontrolleredes og genindstilledes om nødvendigt til pH 3,0 under anvendelse af 1-2 M HC1. Blandingen om-rørtes forsigtigt i et 37°C vandbad, indtil der var opnået temperaturligevægt, og inkuberedes derefter natten 20 over (18 timer) ved 37°C (uden omrøring). pH-Værdien indstilledes derefter på 7,2-7,4 ved anvendelse af 10M NaOH, der tilsattes langsomt for at undgå lokalt overskud. Cellerne sedimenteredes ved 5000 g i 20 minutter ved 5°C, supernatanten fjernedes ved hjælp af en hævert 25 og afkøledes i et is-vand-bad til 1-2°c, og der tilsattes langsomt 2 rumfang af forafkølet acetone (-20 til -40°C) for at undgå, at temperaturen steg over 1-2°C. Blandingen holdtes derefter ved -20°C i 3-5 timer, og precipitatet opsamledes i et forafkølet (-10°C) vinkel-30 hoved ved 4000 g i 20 minutter. Supernatanten fjernedes ved hjælp af en hævert og bortkastedes. Det sedimenterede precipitat opløstes i isafkølet destilleret vand til ca. 1/20 af det oprindelige rumfang af cellesuspension. Opløsningen befriedes derefter for uopløselige 35 stoffer og småblærer ved centrifugering ved 50000 g i 90-120 minutter ved 5°C. Supernatanten opsamledes og *
DK 165358 B
12 holdtes nedfrosset eller frysetørredes. Der tilsattes l vægt/vol-% mannitol før frysetørring. Der opnåede 40-80 mg protein pr. gram celletørvægt.
5 Eksempel 2 (a) Fraskillelse af de rå ydre-membran-proteinpræpara-ter ved DEAE-trisacryl-chromatoqrafi.
En DEAE-trisacryl-kolonne, 3 x 16 cm, ækvilibre-redes med 0,025 M TRIS, 0,035 M NaCl-puffer, pH 8,8, og.
10 det i eksempel 1 opnåede materiale (op til 1 g protein) dialyseredes mod den ækvilibrerende puffer og pumpedes med 60 ml/time gennem kolonnen. Fraktionerne (99 dråber pr. rørglas, ca. 5 ml) hældtes sammen i puljer 1-13. En del af det totalt anvendte protein (ca. 1/4) forsinkes 15 ikke af gellejet, og vil blive opsamlet som en stor top (0,035 M). Det tilbageholdte materiale elueredes derefter under anvendelse af 0,1, 0,2, 0,3 og 1,0 M NaCl i 0,025 M tris-puffer (pH 8,8). Fraktionerne hældtes sammen og overførtes til en SDS-PAGE-plade for at iværk-20 sætte adskillelsen af proteiner. ACAP'et var til stede i det af kolonnen ikke-forsinkede materiale, som eftervist ved SDS-PAGE, men var også til stede i det forsinkede materiale, der elueredes med 0,2 M NaCl.
25 (b) Præparativ fladlags-isoelektrofokusering i granuleret gel (IEF).
Denne operation udførtes i overensstemmelse med LKB-rekommanderingerne (anvendelsesnote 198, LKB-Produc-ter AB, Bromma, Sverige). En suspension af 4 g Ultrodex 30 (en granulær gel af en modificeret glucosepolymer) (LKB) og 5 ml forblandet ampholin (puffer, handelsbetegnelse), pH 3,5-9,5, suspenderedes i destilleret vand til et slutrumfang på 100 ml, hældtes ud i en vandret bakke 10,8 x 24,3 cm og inddampedes under en lufstrøm til den 35 anbefalede grænse. I lag samledes strimler af tre papirsvæge (LKB, 2117-106), gennemvædet i en l:20-fortyn- 13 DK Ί6ϋ3ϋ8 Β ding af det samme ampholin i destilleret vand, anbragtes i hver ende af bakken. Materialet fra eksempel 2a indlejredes i gelen under anvendelse af en indføringsskabelon (2 x 9,4 cm), som pressedes ind i gelen ved 1/3 til 5 1/4 af afstanden langs dens længde fra den anodiske en de, den indesluttede gel fjernedes, overførtes til en 10 ml engangssprøjte, suspenderedes i 3 ml af det nævnte materialet fra eksempel 2a (indeholdende op til 500 mg protein) og sprøjtedes til sidst tilbage i det tomme rum 10 dannet ved dens fjernelse. Gelen udglattedes derefter med en spatel, hvis det var nødvendigt, og man lod den henstå til ækvilibrering i 20 minutter. I mellemtiden gennemblødtes én papirsvæge i en l:l00-fortyr.ding af phosphorsyre (vægtfylde 1,75 g/cm3) og føjedes til 15 strimlerne ved den anodiske ende, og en anden gennemvædedes i 1 M NaOH og anbragtes ved den katod i ske ende. Bakkeunderstøtningen i fladlags-IEF-apparatet (Pharmacia type FBE-3000) afkøledes ved hjælp af rindende ledningsvand (15°C) under operationen. Gelen underkastedes ope-20 rationen ved konstant 8 watt.
ACAP'et kunne påvises som to bånd, det ene ved pi 7,0, og det andet (diffuse) bånd ved pi 7,2-7,4. Adeny-lat-cyclase-aktiviteten var næsten fuldstændigt forbundet med det centrale bånd (pi 7,0), men monoklonale an-25 tistoffer mod ACAP bandt begge bånd stærkt.
Under anvendelse af en metalskabelon deltes gellaget derefter i 30 parallelle felter, og gelen blev skrabet af hvert felt under anvendelse af en spatel og overførtes til reagensglas indeholdende 1 ml destilleret 30 vand. pH-Værdien af hver fraktion måltes på dette stade. Gelsuspensionerne overførtes derefter til små plastkolonner og elueredes med 2 ml 0,2 M ammoniumhydrogencar-bonatpuffer, pH 7,0, og dé gelfri eluater blev nedfrosset (-40°C).
DK 165358 B
14 (c) Analytisk isoelektrisk fokusering.
(i) Der anvendtes den samme procedure som for 2(b) ovenfor, men der anvendtes en 12% polyacrylamid-gel i nærværelse af 8M urinstof. Der opnåedes de 5 samme resultater som for 2(b).
(ii) Den samme* metode, men under anvendelse af en agarosegel i nærværelse af 10% sorbitol, viste 4 immuno-reaktive bånd ved pi 4,5-6,0. Båndet ved pi 4,0 tilbageholdt størstedelen af adenylat-10 cyclase-aktiviteten.
Eksempel 3
Rensning af ACAP under anvendelse af en monoklonal-immunsorbens-kolonne.
15 Museascitesvæske indeholdende et for ACAP speci fikt monoklonalt immunoglobulin underkastedes precipite-ring ved stuetemperatur ved tilsætning af 2 rumfang 27 vægt/vol-% Na2S04 og henstilledes i 2-4 timer., før den underkastedes sedimentering (2000 g i 15 minutter). Se-20 dimentet genopløstes og dialyseredes mod PBS. 500 mg af dette protein (UV-bestemmelse) kobledes til 70 ml pakket CNBr-Sepharose ® CL4B efter fabrikantens instruktioner (Pharmacia). Sephadex® G-50 (medium) hældtes på en 500 mm x 25 mm kolonne til en laghøjde på 220 mm. Efter 25 vaskning af kolonnen med elueringspuffer (0,2 M ammoni-umhydrogencarbonat, pH 7,0, indholdende 0,01% thiomer-sal) hældtes et 5 mm tykt lag af nr. 12 Ballotini glasperler ovenpå Sephadex ®-laget. "Ballotini" er handelsnavnet for glasperler, der anvendes i en perlemølle-30 knuser. En suspension af bakterie- eller gærceller sættes f.eks. til glasperlerne, og perlerne rystes for at bryde cellerne itu. Efter yderligere vaskning hældtes immunosorbensgelen på Ballotini-glasperlelaget, idet dette var adskilt fra Sephadex ®-laget, hvilket mulig-35 gjorde fraskillelse af begge. Kolonnen vaskedes yderligere med elueringspuffer, og til sidst anbragtes der
LHV 109090 D
15 endnu et Ballotini-glasperlelag ovenpå det 100 mm høje immunosorbenslag til beskyttelse af toppen af kolonnen.
Til fraskillelse af ACAP'et på immunosorbensko-lonnen tilførtes 180 ml af det ikke-tilbageholdte eluat 5 fra DEAE-trisacryl-adskillelsen (eksempel 2) indeholdende 1 mg/ml protein (Lowry) ved 5°C til immunosorbens-kolonnen med 0,25 ml/min., vaskedes med elueringspuffer (0,2 M ammoniumhydrogencarbonat, pH 7, 0,01 vægt/vol-% thiomersal), og, efter at basislinien havde stabiliseret 10 sig, tilførtes der 50 ml 6M urinstof i elueringspuffer til kolonnen til eluering af det adsorberede materiale. Anbringelsen af immunosorbensmaterialet over et Sepha-dex ® -G-50-lag muliggjorde den samtidige fraskillelse af proteinet fra urinstoffet under oprationen.
15
Eksempel 4
Dyrkning af B. pertussis.
Det til organismens vækst anvendte definerede medium var baseret på den formel, der er angivet af 20 Steiner· og Scholte (J. Gen. Microbiol. 6_3, 211-220, 1971) som tidligere beskrevet (Novotny og Brookes, J.
Biol. Stand. 3, 11-29, 1975). Alle kulturer dyrkedes ved 36-37°C. De flydende kulturer, i løst tilkapslede rystekolber (500 ml konisk kolbe med 200 ml medium), podedes 25 med en kultur dyrket i 48 timer på Cohen-Wheeler-medium (dette medium er beskrevet i Novotny og Brookes, J.
Biol. Stand. 3, 11-29, 1975) med 2% agar og 5% hesteblod og omrørtes til opnåelse af en gasudskiftningshastighed på 20-40 yM 02/time. Sådanne flydende kulturer anvendtes 30 til at pode mediet i 5 liter eller 70 liter fermentere fremstillet helt i glas, medens pH-værdien holdtes på 7,6 ved reguleret tilsætning af 2M HC1, og mætningen med opløst oxygen holdtes på 5-10% ved omrøring med en bladomrøre. Kulturerne høstedes før afslutningen af den 35 eksponentionelle fase, dvs. efter ca. 36 timers inkube-ring (Novotny og Cownley, "Effect of growth conditions
DK 165358B
16 on the composition and stability of the outer membrane of Bordetella pertussis11 i Manclark and Hill (editors), International Symposium' on Pertussis, U.S. Government Printing Office, Washington D.C., 1979, 99-123).
5
Eksempel 5
Kendrick-test.
Denne test udførtes i overensstemmelse med W.H.O-kravene til pertussisvaccine under anvendelse af 10 MF1 eller' NIH-mus (OLAC, kategori 3, fri for de fleste patogener indbefattet B. bronchiseptica) af en vægt på 14-16 g. Antigenet, i 0,5 ml rumfang, indpodedes intra-peritonealt og omfattede en topfortynding og tre fire-fold seriefortyndinger. Efter to ugers forløb udsattes 15 musene for intracerebrale angreb under anvendelse af den anbefalede angrebsstamme 18-323 (100-200 LD50). Antallet af overlevende dyr i hver gruppe anvendtes til beregning af EDgg og af den relative styrke i forhold til British Pertussis Reference Vaccine 66/84 under anvendelse af et 20 program med parallellinie-probitanalyse. Der udførtes også en sammenligningstest under anvendelse af en kombineret FHA- og LPF-vaccine. Resultaterne er anført i tabel l.
Til nærmere forklaring af hvad tabel 1 angiver, 25 skal der anføres følgende. Gruppen af mus injiceredes med graduerede doser som ovenfor anført af testmaterialet. Som ovenfor -anført udsattes musene efter et vist tidsrum for intracerebrale angreb, og antallet af overlevende dyr i hver gruppe registreredes. Procenttallene 30 med hensyn til overlevende dyr i hver gruppe (udtrykt som probits) afsattes mod log-fortyndinger af de ved testen anvendte doser. På basis heraf beregnedes en dosis, efter hvilken 50% af dyrene overlevede, dvs. ED50 (= 50% effektiv dosis). Ved sammenligning af ED50 for 35 testmateriale og referencepræparatet kan der bestemmes en "relativ styrke", dvs. hvor meget af testmaterialet 17 DK TbbcJbb b der har samme styrke som referencematerialet. Dette kan udtrykkes direkte i internationale enheder (= i.e.) (næstsidste kolonne i tabel 1) og, idet man kender den til beskyttelse nødvendige dosis, ved den sandsynlige 5 mængde af testmateriale, der udgør en enkelt human dosis (sidste kolonne i tabel 1).
DK 165358B
18
Tabel 1
Beskyttende styrke af Bordetella pertussis-fraktioner ved musebeskyttelsestesten mod intracerebralt angreb af B. pertussis 18-323 ( "Kendrick-test11).
5
Materiale ED50 Relativ 4 I.E.i yg pro- yg styrke tein (= enkelt I.E./yg human dosis) _protein_ 10 Råt glycin-hydrol. af B.pertussis hydrolyseret ved 37°C 20 0,02 190 15 Råt glycin-hydrol. af B.pertussis hydrolyseret 20 ved 4°C 77 0,003 1333
Hydrolyseret ved 37°C 20 0,011 363 25 Hydrolyseret ved 53°C 149 0,001 4000 B.pertussis immunorenset 30 adenylat- cyclase 19 0,011 364
FHA/LPF
vaccine 77 0,003 1333
DK 165358B
19
Eksempel 6
Aminosyreanalyse af ACAP.
Aminosyreanalysen udførtes under anvendelse af en 5 Rank Hilger Chromaspek aminosyreanalysator. Prøver fremstilledes ved tilsætning af 250 μΐ af 6N HC1 (fortyndet ud fra BDH Aristar-kvalitet) indeholdende 0,1% (vægt/ vol) phenol til det tørrede prøvemateriale i et tykvæg-get Pyrex-reagensglas (7,5 x 1,2 cm). Rørene blev der-10 efter trukket ud i en af oxygen og naturgas frembragt blæselampeflamme til frembringelse af en snæver åbning.
Efter frysning af indholdet i et fast-C02--ethanol-bad blev hvert reagensglas forbundet gennem en manifold og fælde til en høj vakuumpumpe, og man lod det stå i 10 15 minutter til fjernelse af luft. Reagensglassene blev derefter lukket tæt til og anbragt i en ovn ved 110°C til hydrolyse. De hydrolyserede prøver tørredes i en vakuumekssikkator over natriumhydroxidperler. Den tørrede remanens opløstes i 250 μΐ aminosyreanalysator-startpuf-20 fer til automatisk analyse.
De i tabel 2 anførte aminosyreværdier er gennemsnitstal af resultaterne opnået fra dobbelte 24, 48 og 68 timers hydrolyser, undtagen i tilfældene med valin og isoleucin, hvor der anvendtes 68 timers hydrolyseværdi-25 erne.
Værdier for cystin, cystein og tryptophan kunne ikke bestemmes ved denne metode.
DK 165358B
20
Tabel 2
Rester
Asparaginsyre (+asparagin) 48
Threonin 3 3 5 Serin , 33
Glutaminsyre (+glutamin) 6 2
Prolin 60
Glycin 77
Alanin 82 10 Valin 54
Methionin 4
Isoleucin 22
Leucin 50
Tyrosin 7 15 Phenylalanin 11
Histidin 13
Lysin 19
Arginin 37 20 Eksempel 7
Vaccineformulerinqer.
Vacciner til anvendelse ved immunisering kan fremstilles ved konventionelle metoder med følgende bestanddele: 25 a) Difteri-/ tetanus- og pertussis-vaccine i simpel opløsning.
Hver 1 ml vaccine indeholder: 21
Difteri-toxoid >60 I.E.
Tetanus-toxoid >120 I.E.
Pertussis-antigen ifølge opfindelsen >0,363 mg Natriumborat <10,03 mg 5 Ravsyre <3,10 mg
Thiomersal 0,04-0,2 mg
Natriumchlorid <8,5 mg
Vand til 1 ml 10 b) Adsorberet difteri-, tetanus- og pertussis-vaccine.
Difteri-, tetanus- og pertussis-komponenterne ad-sorberes til aluminiumhydroxidgel ved hjælp af standardmetoder.
Hver 1 ml vaccine indeholder: 15 Difteri-toxoid >60 I.E.
Tetanus-toxoid >120 U.L.
Antigen ifølge opfindelsen >0,363 mg
Uopløselige aluminiumsalte <ækvivalent med 0,093 20 mmol (2,5 mg)
Al.
Natriumborat <8,01 mg
Ravsyre <2,48 mg
Thiomersalt 0,04-0,2 mg 25 Natriumchlorid <6,8 mg vand til l ml c) Pertussis-vaccine.
Hver 1 ml vaccine indeholder: 30 Antigen ifølge opfindelsen >0,363 mg
Thiomersal 0,04-0,2 mg
Natriumchlorid <8,5 mg
Vand til 1 ml
Claims (19)
1. Acellulært eller renset Bordetella pertussis antigen, kendetegnet ved følgende træk: en relativ molekylvægt på 67.000-73.000 som bestemt ved 12% (vægt/vægt) polyacrylamidgel-elektroforese og 5 et forhold mellem prolin og glutaminsyre på i det væsentlige 1:1 som bestemt ved aminosyreanalyse, hvorhos antigenet er i det væsentlige fri for intracel-lulært B. pertussis materiale.
2. Antigen ifølge krav 1, kendetegnet 10 ved, at det har følgende aminosyresammensætning: Rester Asparaginsyre (+asparagin) 48 Threonin 3 3
3. Antigen ifølge krav 1 eller 2, kende tegnet ved, at dets tyrosinrester er ikke-ioder-bare ved hverken chloramin-T- eller iodogen-metoden.
4. Antigen ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at det har relativ mo- DK 165358B lekylvægt på 69.000 som bestemt ved 12% (vægt/vægt) polyacrylamldgel-elektroforese.
5. Antigen ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at det har et isoe- 5 lektrisk punkt på 7,0-7,4 under betingelserne for præparativ isoelektrisk fokusering.
6. Antigen ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at det har et isoelektrisk punkt på 4,5-6,0 under analytiske isoelektriske 10 betingelser under anvendelse af en agarosegel i nærværelse af 10% sorbitol.
7. Antigen ifølge et vilkårligt af de foregående krav, kendetegnet ved, at det er syrelabilt under en pH-værdi på ca. 3.
8. Vaccine, kendetegnet ved, at den omfatter et antigen ifølge et vilkårligt af de foregående krav i blanding med en farmaceutisk acceptabel bærer.
9. Vaccine ifølge krav 8, kendetegnet ved, at antigenet er til stede i en mængde på fra 0,01 20 til 5 mg/ml.
10. Vaccine ifølge krav 9, kendetegnet ved, at antigenet er til stede i en mængde på fra 0,03 til 2 mg/ml.
11. Vaccine ifølge et vilkårligt af kravene 8-10, 25 kendetegnet ved, at den yderligere indeholder en farmaceutisk acceptabel adjuvans.
12. Vaccine ifølge et vilkårligt af kravene 8-11, kendetegnet ved, at den yderligere indeholder et eller flere andre antigener.
13. Fremgangsmåde til isolering af et antigent præparat indeholdende et B. pertussis antigen, kendetegnet ved, at man behandler en kultur af B. pertussis-celler med en vandig aminosyrepuffer med pH 2,5-3,5 og indeholdende en hypertonisk koncentration af 35 nævnte aminosyre med hensyn til cellerne, skiller cellerne fra den fremkomne supernatant og isolerer et an- DK 165358B tigent præparat indeholdende antigenet ifølge et vilkårligt af kravene 1-7 fra supernatanten.
14. Fremgangsmåde ifølge krav 13, kendetegnet ved, at aminosyren er valgt blandt glycin 5 og alanin.
15. Fremgangsmåde ifølge krav 13 eller 14, kendetegnet ved, at den nævnte isolering fra supernatanten omfatter anvendelse af ionbytningschroma-tografi. 10
16: Fremgangsmåde ifølge krav 13 eller 14, kendetegnet ved, at den nævnte isolering fra supernatanten omfatter anvendelse af isoelektrisk fokusering .
15 Serin 33 Glutaminsyre (+glutamin) 62 Prolin 60 Glycin 77 Alanin 82
20 Valin 54 Methionin 4 Isoleucin 22 Leucin 50 f Tyrosin 7
25 Phenylalanin 11 Histidin 13 Lysin 19 Arginin 37
17. Fremgangsmåde ifølge krav 15 eller 16, 15 kendetegnet ved, at den nævnte isolering yderligere omfatter passage af det isolerede materiale gennem en immunoabsorptionskolonne indeholdende et passende monoklonalt antistof mod antigenet.
18. Antigen ifølge et vilkårligt åf kravene 1-7 20 til anvendelse til terapi eller profylakse hos mennesker.
19. Anvendelse af et antigen ifølge et vilkårligt af kravene 1-7 til fremstilling af en vaccine til anvendelse ved fremkaldelsen af immunitet mod kighoste hos 25 mennesker.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB8412207 | 1984-05-12 | ||
| GB848412207A GB8412207D0 (en) | 1984-05-12 | 1984-05-12 | Antigenic preparations |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DK208985D0 DK208985D0 (da) | 1985-05-10 |
| DK208985A DK208985A (da) | 1985-11-13 |
| DK165358B true DK165358B (da) | 1992-11-16 |
| DK165358C DK165358C (da) | 2000-11-06 |
Family
ID=10560891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DK198502089A DK165358C (da) | 1984-05-12 | 1985-05-10 | Renset Bordetella pertussis antigen, vaccine indeholdende et sådant antigen og fremgangsmåde til isolering af et sådant ant |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (8) | US5648080A (da) |
| EP (1) | EP0162639B1 (da) |
| JP (3) | JPH07116053B2 (da) |
| AT (1) | ATE61937T1 (da) |
| CA (1) | CA1253073A (da) |
| DE (1) | DE3582272D1 (da) |
| DK (1) | DK165358C (da) |
| ES (1) | ES8802275A1 (da) |
| FI (1) | FI81262C (da) |
| GB (1) | GB8412207D0 (da) |
| LU (1) | LU90203I2 (da) |
| NL (1) | NL980006I1 (da) |
| NO (2) | NO165478C (da) |
Families Citing this family (25)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB8412207D0 (en) | 1984-05-12 | 1984-06-20 | Wellcome Found | Antigenic preparations |
| FR2597344B1 (fr) * | 1986-04-16 | 1989-06-23 | Merieux Inst | Perfectionnement au procede de purification d'antigenes proteiques de bacteries appartenant au genre bordetella, en vue de l'obtention d'un vaccin acellulaire. |
| US4762710A (en) * | 1986-06-16 | 1988-08-09 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Novel method of preparing toxoid by oxidation and metal ions |
| SE455946B (sv) * | 1986-10-20 | 1988-08-22 | Trion Forskning & Utveckling | Nya pertussistoxin-polypeptider och antigener samt testsatser, vacciner och intradermala hudtestkompositioner |
| EP0267998A1 (en) * | 1986-11-17 | 1988-05-25 | Institut Pasteur | Means for protecting against bordetella infections and toxic processes |
| FR2606789B1 (fr) * | 1986-11-17 | 1991-05-31 | Pasteur Institut | Preparations d'adenylate cyclase purifiees, procede d'obtention de ces preparations et leurs applications biologiques |
| CA1337859C (en) * | 1987-04-24 | 1996-01-02 | Masashi Chazono | Method for culturing bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
| US5139776A (en) * | 1987-04-24 | 1992-08-18 | The Research Foundation For Microbial Diseases Of Osaka University | Method for culturing Bordetella pertussis, a pertussis toxoid and a pertussis vaccine |
| ATE140729T1 (de) * | 1988-04-19 | 1996-08-15 | Pasteur Institut | Verfahren zur gewinnung von schutzantigenen gegen bordetella-infektionen und toxische prozesse |
| EP0338170A1 (en) * | 1988-04-19 | 1989-10-25 | Institut Pasteur | Immunoprotective antigenic protein against pathogenic bacteria |
| GB8910570D0 (en) * | 1989-05-08 | 1989-06-21 | Wellcome Found | Acellular vaccine |
| FR2646776B1 (fr) | 1989-05-12 | 1994-06-03 | Pasteur Institut | Utilisation de preparations vaccinantes a base d'adenyl cyclase ou de bacteries les produisant en tant qu'antigenes protecteurs contre les effets des bordetella |
| DE69018926T2 (de) * | 1989-09-04 | 1995-08-24 | Wellcome Found | Vakzine gegen Bordetella. |
| US5276142A (en) * | 1989-12-11 | 1994-01-04 | American Cyanamid Company | Process for purification of a 69000 dalton antigenic protein from Bordetella pertussis |
| US6197548B1 (en) | 1990-04-02 | 2001-03-06 | Medeva Pharma Limited | Transformed Pichia expressing the pertactin antigen |
| GB9007657D0 (en) * | 1990-04-04 | 1990-05-30 | Connaught Lab | Purification of a pertussis outer membrane protein(omp69) |
| EP0484621A3 (en) * | 1990-07-11 | 1992-08-26 | American Cyanamid Company | Efficacious vaccines against bordetella pertussis comprising a combination of individually purified pertussis antigens |
| GB9021004D0 (en) * | 1990-09-27 | 1990-11-07 | Wellcome Found | Acellular vaccines |
| US6444211B2 (en) | 1991-04-03 | 2002-09-03 | Connaught Laboratories, Inc. | Purification of a pertussis outer membrane protein |
| GB9304399D0 (en) * | 1993-03-04 | 1993-04-21 | Smithkline Beecham Biolog | Novel process |
| FR2728170A1 (fr) * | 1994-12-15 | 1996-06-21 | Pasteur Institut | Vaccin de type acellulaire anti-bordetella |
| FR2736064B1 (fr) * | 1995-06-30 | 1997-09-05 | Pasteur Institut | Epitopes protecteurs de l'adenyl cyclase-hemolysine(ac-hty). leur application au traitement ou a la prevention des infections par bordetella |
| ZA981370B (en) * | 1997-02-20 | 1998-09-07 | Cerberus Developments Bv | Method and apparatus for continuous flow isoelectric focusing for purifying biological substances |
| GB201105981D0 (en) | 2011-04-08 | 2011-05-18 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
| MX362793B (es) | 2013-03-08 | 2019-02-13 | Janssen Vaccines & Prevention Bv | Vacuna acelular contra pertussis. |
Family Cites Families (22)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3141824A (en) * | 1961-05-19 | 1964-07-21 | Lilly Co Eli | Pertussis antigen |
| US3395219A (en) * | 1964-12-11 | 1968-07-30 | Merck & Co Inc | Process for production of pertussis antigen |
| US3465078A (en) * | 1965-10-21 | 1969-09-02 | Sydney Z Spiesel | Method of recovering antigens from bordetella pertussis cells |
| FR2047886A1 (en) * | 1969-06-30 | 1971-03-19 | Merieux Inst | Non-toxic anti-whooping cough vaccine |
| FR2393065A1 (fr) * | 1977-05-31 | 1978-12-29 | Merieux Inst | Procede de separation de lipides d'endotoxines bacteriennes et notamment d'endotoxine de bordetella pertussis |
| DE2961293D1 (en) * | 1978-02-17 | 1982-01-14 | Nat Res Dev | Immunogenic cell envelope preparations |
| GB2014452B (en) * | 1978-02-17 | 1982-07-21 | Secr Social Service Brit | Producing cell envelope preparations |
| JPS5750925A (en) * | 1980-09-12 | 1982-03-25 | Takeda Chem Ind Ltd | Preparation of pertussis toxoid |
| US4551429A (en) * | 1983-09-15 | 1985-11-05 | American Home Products Corporation | Stimulation of antigen production by Bordetella pertussis |
| US5237052A (en) * | 1984-05-12 | 1993-08-17 | Burroughs Wellcome Company | Antigenic preparations and isolation of such preparations |
| GB8412207D0 (en) * | 1984-05-12 | 1984-06-20 | Wellcome Found | Antigenic preparations |
| US4705686A (en) * | 1986-05-09 | 1987-11-10 | American Cyanamid | Process for the preparation of acellular Bordetalla pertussis vaccine |
| EP0267998A1 (en) * | 1986-11-17 | 1988-05-25 | Institut Pasteur | Means for protecting against bordetella infections and toxic processes |
| FR2606789B1 (fr) * | 1986-11-17 | 1991-05-31 | Pasteur Institut | Preparations d'adenylate cyclase purifiees, procede d'obtention de ces preparations et leurs applications biologiques |
| GB8807860D0 (en) * | 1988-04-05 | 1988-05-05 | Connaught Lab | Pertussis vaccine |
| US5101014A (en) * | 1989-02-10 | 1992-03-31 | United States Of America | Process for the purification of a 69,000 da outer membrane protein of Bordetella pertussis |
| GB8910570D0 (en) * | 1989-05-08 | 1989-06-21 | Wellcome Found | Acellular vaccine |
| US5276142A (en) * | 1989-12-11 | 1994-01-04 | American Cyanamid Company | Process for purification of a 69000 dalton antigenic protein from Bordetella pertussis |
| GB9007416D0 (en) * | 1990-04-02 | 1990-05-30 | Wellcome Found | Expression of heterologous protein in yeast |
| GB9007657D0 (en) | 1990-04-04 | 1990-05-30 | Connaught Lab | Purification of a pertussis outer membrane protein(omp69) |
| IT1248735B (it) * | 1990-06-21 | 1995-01-26 | Sclavo Spa | Vaccini acellulari contro la pertosse |
| EP0484621A3 (en) | 1990-07-11 | 1992-08-26 | American Cyanamid Company | Efficacious vaccines against bordetella pertussis comprising a combination of individually purified pertussis antigens |
-
1984
- 1984-05-12 GB GB848412207A patent/GB8412207D0/en active Pending
-
1985
- 1985-05-10 ES ES543026A patent/ES8802275A1/es not_active Expired
- 1985-05-10 JP JP60099413A patent/JPH07116053B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-10 DE DE8585303302T patent/DE3582272D1/de not_active Revoked
- 1985-05-10 CA CA000481336A patent/CA1253073A/en not_active Expired
- 1985-05-10 FI FI851859A patent/FI81262C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-05-10 DK DK198502089A patent/DK165358C/da not_active IP Right Cessation
- 1985-05-10 AT AT85303302T patent/ATE61937T1/de active
- 1985-05-10 EP EP85303302A patent/EP0162639B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-05-10 NO NO851878A patent/NO165478C/no not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-03-21 US US08/210,458 patent/US5648080A/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-05-11 US US08/240,814 patent/US5438120A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-06-07 US US08/478,046 patent/US6048700A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-06-07 US US08/470,590 patent/US6127151A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-08-01 NO NO1997010C patent/NO1997010I1/no unknown
-
1998
- 1998-01-27 NL NL980006C patent/NL980006I1/nl unknown
- 1998-01-28 LU LU90203C patent/LU90203I2/fr unknown
-
1999
- 1999-06-17 US US09/334,690 patent/US6210685B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1999-06-30 US US09/343,399 patent/US20020150595A1/en not_active Abandoned
- 1999-07-07 JP JP11193312A patent/JP2000053585A/ja active Pending
- 1999-07-07 JP JP11193416A patent/JP2000072690A/ja active Pending
-
2002
- 2002-09-16 US US10/243,930 patent/US20030077294A1/en not_active Abandoned
- 2002-12-27 US US10/329,946 patent/US20030108572A1/en not_active Abandoned
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20030077294A1 (en) | 2003-04-24 |
| JPS60246321A (ja) | 1985-12-06 |
| EP0162639B1 (en) | 1991-03-27 |
| JP2000072690A (ja) | 2000-03-07 |
| DK208985A (da) | 1985-11-13 |
| NL980006I1 (nl) | 1998-04-01 |
| JP2000053585A (ja) | 2000-02-22 |
| GB8412207D0 (en) | 1984-06-20 |
| EP0162639A2 (en) | 1985-11-27 |
| NO165478C (no) | 1991-02-20 |
| NO851878L (no) | 1985-11-13 |
| CA1253073A (en) | 1989-04-25 |
| DK208985D0 (da) | 1985-05-10 |
| US6210685B1 (en) | 2001-04-03 |
| ATE61937T1 (de) | 1991-04-15 |
| US6048700A (en) | 2000-04-11 |
| US5648080A (en) | 1997-07-15 |
| US20020150595A1 (en) | 2002-10-17 |
| ES543026A0 (es) | 1988-05-01 |
| US6127151A (en) | 2000-10-03 |
| FI851859A0 (fi) | 1985-05-10 |
| NO1997010I1 (no) | 1997-08-25 |
| LU90203I2 (fr) | 1998-04-06 |
| FI851859L (fi) | 1985-11-13 |
| JPH07116053B2 (ja) | 1995-12-13 |
| NO165478B (no) | 1990-11-12 |
| EP0162639A3 (en) | 1988-02-03 |
| DE3582272D1 (de) | 1991-05-02 |
| ES8802275A1 (es) | 1988-05-01 |
| DK165358C (da) | 2000-11-06 |
| US5438120A (en) | 1995-08-01 |
| FI81262C (fi) | 1990-10-10 |
| US20030108572A1 (en) | 2003-06-12 |
| FI81262B (fi) | 1990-06-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| DK165358C (da) | Renset Bordetella pertussis antigen, vaccine indeholdende et sådant antigen og fremgangsmåde til isolering af et sådant ant | |
| Blake et al. | Purification and partial characterization of the opacity-associated proteins of Neisseria gonorrhoeae. | |
| EP0432203A1 (en) | Legionellosis vaccines and methods for their production | |
| AU641711B2 (en) | Process for purification of a 69 000 dalton antigenetic protein from bordetella pertussis | |
| KR950010323B1 (ko) | 백일해 항원의 정제 방법 | |
| KR101617464B1 (ko) | Ｉｐｖ―ｄｐｔ 백신 | |
| JP2999480B2 (ja) | 百日咳感染及び毒性過程に対する保護抗原を得るための方法 | |
| US4220638A (en) | Antigenic complex from N. Gonorrhoeae | |
| WO2010074126A1 (ja) | 組換え鶏伝染性コリーザワクチン及びその製造方法 | |
| JPS61111695A (ja) | Ｂ型肝炎ビールス又はｂ型肝炎ビールス成分からのｄｎａフラグメント、ポリペプチド及びオリゴペプチド、組み換えｄｎａ分子、ｄｎａベクター、エシエリヒア・コリｋ１２変異体、ポリペプチドの製法、ｂ型肝炎ビールス疾患に対する接種物質、モノクロナール抗体ｍａ１８／７、マウス雑種細胞ｇｏ１ａ１８／７‐１並びにモノクロナール抗体ｍａ１８／７の製法 | |
| RU97108362A (ru) | Главный белок cd внешней мембраны moraxella | |
| US5237052A (en) | Antigenic preparations and isolation of such preparations | |
| DK172329B1 (da) | Polydisperse, native Pseudomonas-flagella(H)-antigener (FAg) i polymer form og fremgangsmåde til deres udvinding | |
| EP0298991B1 (en) | Novel lectins derived from bacterial pili | |
| US4288557A (en) | Antigenic complex from N. gonorrhoeae | |
| GB2062463A (en) | Babesiosis vaccine | |
| EP0002645B1 (en) | Antigenic complex from neisseria gonorrhoeae, process and vaccine | |
| JPS59110626A (ja) | Ｂ−オリゴマ−含有百日咳ワクチンおよびその製造方法 | |
| RU2109520C1 (ru) | Способ получения протективного гликопротеина возбудителя мелиоидоза |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PPF | Opposition filed | ||
| PUP | Patent expired |