JPS60246321A - 抗原性調製物および該調製物の単離法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 百日咳菌は人間において重いそして衰弱させる疾病を生
じきせ、子供が％Ｋかかりゃすく、それは先進国におい
て大規模免疫計画により管理下に保たれている。免疫は
この疾病の減少において非常に重要な因子であることお
よびワクチン接種の失敗はこの疾病の発生率の増加を導
きうろことが見出されている。特に、すべての地域にお
いて、この疾病の予防に比較的有効であると認められて
いる全細胞百日咳ワクチンを使用して免疫が行われてい
るｏ　しかしながら、全細胞ワクチンはいくつかの欠点
のあることが認識されている。即ち、たとえば、接種さ
れた子供１０，０００人のうち約１人に、発熱、局所反
応および泣き続けを包含する臨床症状が生じる。更に１
全細胞ワクチンのいくつかのバッチは、望ましくない副
作用の可能性となお結合しながら全く保護を提供しない
らしい。

免疫計画により先進国におけるこの疾病の現在の低い発
現で、便宜／危険比率は不充分に定義されており、そし
て多くの臨床医師は接種の危険が免疫により獲得される
便宜にまさると信じている。

その結果、多くの子供が接種されず、そこで百日咳の全
国流行の重大な危険が存在している。従って、かなりの
研究努力は改善された百日咳ワクチン、そして特にこの
疾病に対する保護に必要な成分を合体しながら、従来使
用された全細胞ワクチンと結合した成分を欠く無細胞ワ
クチンの開発に向けられてきた。

安全で有効な無細胞百日咳菌ワクチンについ℃の研究は
、過去において全細胞ワクチン中に含有される百日咳菌
の病原性、毒性そして保護性の部分の本体および作用の
メカニズムに関する情報不足により制約されてきた。従
って、作業は百日咳菌体の２０種もしくはそれ以上の表
面抗原な単離および精製し、そして免疫反応を誘導する
それらの能力を特徴づけることに集中した〔たとえば、
ザ・ジャーナル・オシ・ジアメリヵン・メディカル・ン
サエティ（Ｊ、Ａｍ、Ｍｅｄ、Ｓｏｃ、）、２４８　（
１）２２〜２６、参照〕。調査が示唆されてきた抗原の
例は、リンホサイトーシス・プロモーティング・ファク
ター（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｏａｉｅ　ｐｒｏｍｏｔｉｎ
ｇ　ｆａｃｔｏｒ）［パーツシス・トキシン（ｐｅｒｔ
ｕｓｓｉａ　ｔｏｘｉｎ）／ＩＪＰ？］、フィラメンタ
ス・ヘムアグルチニン（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ　ｈａ
ｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）　［ＦＨＡ　］、リポポリ
サッカライド（１ｉｐｏｐｏｌｙｓＥＬｏｃｈａｒｉｄ
ｅ）　［ＬＰＳＩ、アグルチノーｒン（＆ｇｇｌｕｔｉ
ｎｏｇｅｎａ）、デルモネクロチック・トキシン（ｄｅ
ｒｍｏｎｅｃｒｏｔｉｃ　ｔｏｘｉｎ）〔ＤＮＴ〕、熱
不安定性および安定性トキシン、ボリモルホニュクレア
・リューコサイト・インヒビター８フアクター（ｐｏｌ
ｙｍｏｒｐｈｏｎｕｃｌｅａｒ　１ｅｕｋＱｏｙｔｅｉ
ｎｈｉｂｉｔｏｒ　ｆａｃｔｏｒ）、アデニレートΦサ
イクラーゼ（ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｃｙｃｌａｅｅ）お
よび他の表面成分を包含スる〔パーツシス・バクシーン
・ワークショップ（Ｆｌｅｒｔｕｓｓｉｓ　ｖａｃｃｉ
ｎｅ　Ｗｏｒｋｓｈｏｐ）　、１９８２年２月１１日、
ビュロー・オプ・バイオロジックス（Ｂｕｒｅａｕ　ｏ
ｆ　Ｅｉｏｌｏｇｉｏｓ）、アメリカ〕。調査のための
他の提案された候補抗原は、トレイキアル・サイトトキ
シン（ｔｒａｏｈｅａｌ　ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）および
各種外膜蛋白質を包含する。

初期の抽出物ワクチンはビレマー（Ｌ、Ｐｉｌｌθｍθ
ｒ）〔プロシーデイングズ・オプ・ソサエティ・エキス
ペリメンタル・バイオロジー・アンド・メデイシン（Ｐ
ｒｏｃ、Ｓｏｃ、Ｅｘｐ４１ｏ１．Ｍｅｄ、）、（１９
５０）７５．７０４〜７０５〕により開発され、それは
崩壊させた百日咳菌細胞に基くものであり、そして保護
を提供することが認められたがこの製剤の毒性の見地か
ら商業的には採用されなかった。

示唆されたより最近の百日咳菌抽出物ワクチンの例は、
培養物上澄液からのエンドトキシンの除去を含む英国特
許明細門弟２．０８３，３５８Ａ号（武田）中に記載さ
れたもの；アニオン界面活性剤での微生物懸濁液の抽出
を含むフランス特許明細門弟２，０４７，８８６号〔イ
ンスチチュート・メリーＬ　−（Ｉｎ５ｔｉｔｕｔ　Ｍ
ｅｒｒｉｅｕｘ）］中に記載されたもの；およびパーツ
シス・トキシン（ＬＰＦ　）に基くサシユニット蛋白質
からなる日本特許昭５８−２２２．０３２号（量大）中
に記載されたものを包含する。

無細胞百日咳ワクチンについて行われた作業の多くはた
とえばＬＰＦについてのワクチンを基礎とすることの可
能性に集中している。しがしながら、百日咳ワクチン接
種と結合している従来観察された悪効果の大部分（全部
でないとしても）はトキシンに関係している。破傷風ま
たはシフテリアトキンイドおよびＬＰＳの組合せにおい
て、感受性マウスに実験的脳障害（ｅｎｏａｐｈａｌｏ
ｐａｔｈｙ）を誘導することが可能である〔スティンマ
ン（Ｌ、Ｓｔｅｉｎｍａｎ）等、ネーチュ７　（Ｎａｔ
ｕｒｅ）、（１９８２）、２９９．７６８〜７４ｏ；レ
ッドヘッド（ｕｅａｈｅａａ）等、ワークショップ・オ
ン・ボルデテラ・パーツシス（Ｗｏｒｋｓｈｏｐ　ｏｎ
　Ｂ、ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ナショナルΦインスチチ
ュート・オブ・バイオロジ−（Ｎａｔ、Ｉｎ５ｔ。

、ｔ　ＢＩＯｌ、）　、スタンターツ・アンド・コント
ロールズ（５ｔａｎｄａｒｄｓ　＆　０ｏｎｔｒｏｌｓ
）、ホリーヒル（Ｈｏ１ｌｙ　Ｈｌｌｌ）、ハンプステ
ッド（Ｈａｍｐｓｔｅｄ）、ロンドン、１９８３］。従
つＣＬＰＦは、そのような合併症がワクチン接種の後に
生じるならば、多分脳損傷に責を有するであろう。

ａ日咳菌の培養物中に見出され、以下に記載する如きア
デニレートサイクラーゼ活性と結合したある種の蛋白性
物質は、実験動物に投与するときη日咳菌による攻撃に
対し保護を提供しうろことが今や発見された。′アデニ
レートサイクラーゼ活性と通常結合した蛋白性物質が百
日咳菌に対する主要な保護抗原であるとのこの発見は、
全細胞ワクチンで実証された毒性副作用に責を有する他
の公知百日咳菌成分を含有しないかまたは減少した量で
含有する抗原製剤からなるワクチン調合物（ｖａｏｃｉ
ｎｅ　ｆｏｒｍｕｌ＆ｔｉｏｎ）の製造を許容する。

“アデニレートサイクラーゼ活性と結合した蛋白性物質
（ｐｒｏｔｅｉｎａｏｅｏｕｓ　ｍａｔｅｒｉａｌ　ａ
ｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈ　ａｄｅｎｙｌａｔｅ　ｏ
ｙｃｌａｓｅ　ａｃｔｉｖｉｔｙ）’なる胎（以下、’
　ＡＯＡＰ　′と略記する）は、ここではアデニレート
サイクラーゼ活性の抽出宛グリシン（ａ２５Ｍ）の水性
の酸性（ｐＨ３）溶液を用いて行うとき、アデニレート
サイクラーゼ活性と一緒に抽出される蛋白性物質を示す
ものである。上記に限定した如きＡＯＡＰは、アデニレ
ートサイクラーゼ酵素力れ自体あるいはこの酵素のため
の結合蛋白質を包含しうる。

アデニレートサイクラーゼ活性は、ヒユーレット（Ｅ、
Ｊ（ｅｗｌｅｔｔ）およびウォルフ（Ｊ、Ｗｏｌｆｆ）
の方法〔ザ・ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（、
Ｔ、Ｂａｏｔｅｒｉｏｌ、）、（１９７６）、１２７．
８９０〜８９８〕により検定した。

本発明の第１の態様においては、医薬的に受容しうる担
体と一緒で、随意にたとえばホルマリン、ゲルタールア
ルデヒドまたはβ−プロピオノラクトンを使用してトキ
ンイド化されていてもよいＡＯＡ　Ｐからなる百日咳菌
に由来する抗原製剤を包含する百日咳菌に対する保護の
ためのワクチン調合物が提供される。

より＃［Ｋは、ＡＯＡＰは等亀点濃＠　（ｉｓｏｅｌｅ
ｏｔｒｉ。

ｒｏｃｕｓｓｉｎｇ）　Ｋより２つのバンドとして検出
でき、１つは等電点（Ｐｌ）約７．０を有し、他方（拡
散）のパンＦは等１点７．２〜７．４を有する。アデニ
レートサイクララーゼ活性は中性パン）’（Ｐｉご７．
０）と殆んど完全に結合したが、ＡＯＡＰに対するモノ
クロナール抗体は両方のバンドに強く結合した。

上記製剤中のＡＯＡＰは一般に、下記の如き製造条件下
に、相対分子■約６７．０００から７３．ＯｏＯまで、
特に６９，０００．および等電点７．０〜７．４を有す
る。

１相対分子量（ｒｅｌａｔｉｖｅ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
　ｗｅｉｇｈｔ）　’は、１２％（ｗ／ｗ　）　Ｘｌ？
’）アクリルアミドデル電気泳動および標準分子量標識
により決定されたみかけ分子量を意味する。従って、本
発明の抗原蛋白質の分子量はレムＩＪ　（Ｕ、に、Ｌａ
ｅｍｍｌｉ）により記載された技術〔ネーチュア（Ｎａ
ｔｕｒｅ）、１９７０゜２２７．６８０〜６８５］Ｋよ
って便宜に決定し５る。便宜な標準分子量標識は、たと
えばウシ血清アルブミン、キモトリプシノーダンＡおよ
びリボヌクレアーゼを包含する。

アミノ酸分析はまた、ＡＯＡＰが通常、たとえばプロリ
ン：グルタミン酸比率が約１＝１であるように高比率の
ゾロリンを含有し、そしてこの％微はＡＯＡ　Ｐを他の
百日咳蛋白質と区別するのに役立つ。更にＡＯＡＰを区
別する特徴は、それがクロラミンＴまたはヨウドｒン法
のいずれかＫよるそのチロシン残基の放射ヨウ素化によ
り検出できないという事実である。

本発明の好ましい態様に従えば、上記ＡＯＡＰは次の性
質の１つもしくはそれ以上を有することで特徴づけられ
る蛋白性物質である： （１）　プロリン対グルタミン酸比率約１＝１；（１）
　チロシン残基がヨウ素化されない；（Ｉｌ＋）　細胞
内百日咳菌物質を実質的に含有しない；Ｏｖ）相対分子
量６７．ＯＤ　Ｏがら７３，００　Ｄまで；（ｖ）　等
電点７．０から７．４まで；および、（ＶＤ　ｐＨ約６
以下で酸不安定性である。

本発明に従うワクチン調合物における使用のための上記
抗原製剤は、もしも所望ならば、ＡＯＡＰＫ加えて、Ｆ
ＩｋＭの他の抗原性化学物質、たとえば百日咳菌体から
抽出されるＡＯＡＰと一緒で得られる物質を含有しうる
。そのような物質はＬＰＳおよびＬＰＦの断片を包含し
え、それらは有害な副作用の可能性の見地において、た
とえばホルマリンでトキンイド化することが必要である
。しかしながら、本抗原製剤は、好ましくは他の抗原成
分を実質的に含有していない。

アデニレートサイクラーゼは、以前に百日咳菌から単離
されている〔ヒユーレット（Ｅ、Ｌ、Ｈｅｗｌｅｔｔ）
等、ザ・ジャーナル・オプ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂ
ａｃｔｅｒｌｏｌ、）、１２７．８９０〜８９８、およ
びプロシーディングズ・オブ・ナショナル・アカデミ−
・オブ・サイエンス（Ｐｒｏｏ、Ｎａｔ、Ａｃａｄ。

ｓｅｌ、）、アメリカ、■、１９２６〜１９３０］が、
この物質が百日咳菌に対する保護抗原を示すことについ
ては示唆されていない。ヒユーレット等の研究に従えば
、総酵素量の約０．５％を示す百日咳菌体かもの総アデ
ニレートサイクラーゼ活性の約２０チのみが培養上澄液
中に見出され、残りの８０チは細胞と結合していた。従
って、抽出工程は、上記抗原製剤における使用のために
充分な量のＡＯＡＰを商業規模で生成させるために、Ａ
＋１！ＡＰが高い純度および収率で得られることを必要
とする。そのような抽出工程で克服しなければならない
主要な困難は、他の蛋白質の中でＡＯＡＰは外膜のＬＰ
Ｓ骨格に１部分非常に強固に結合していることである。

過去においては、その結合した蛋白質を遊離させるため
に、洗浄剤が一般に膜の可溶化のために使用されてきた
。しかしながら、百日咳菌体かもの外膜蛋白質のための
洗浄剤の使用は、次の欠点を有することが見出されてい
る：（＆）　外膜は外膜蛋白質の混合物からなるミセル
凝集物を形成するために可溶化される；（ｂ）外膜蛋白
質は損傷されうる； （→　細菌中忙存在しない新規抗原が創成される；そし
て、 （ｄ）　抽出された物質は、通常洗浄剤が除去された後
に水不溶性であると認められる。

我々は、洗浄剤の使用と対照的に、規制した緩和な酸性
条件を使用する百日咳菌体の抽出は、外膜から水溶性の
形でアデニレートサイクラーゼの著しく増加した収率（
先に報告された技術に比し約４０Ｘ良い）の抽出を生じ
る。

従って、本発明の別態様においては、百日咳菌の培養物
を細胞に関しアミノ酸の高張濃度からなる−２．５〜６
．５の水性アミノ酸バッファーで処理し、生成した上澄
液から細胞を分離し、モしてＡＯＡＰを含有する抗原製
剤を上澄液から単離することからなる、百日咳菌からＡ
ＯＡＰを含有する抗原製剤の単離法が提供される。

上記方法において使用されるバッファーは、好ましくは
…約６を提供し、そして有利にはバッファーの酸成分と
して鉱酸、好ましくは塩酸、およびアミノ酸としてグリ
シンまたはアラニンのいずれかを有利に包含する。バッ
ファーでの細胞の処理は、５から５０℃まで、好ましく
は６０かも４５℃まで、理想的には６７°Ｃの湿度で、
有利には１か５２４時間、好ましくは１０かも２０時間
まで、０．１〜１Ｍ、好ましくは０．２５　Ｍのアミノ
酸濃度で好適に行われる。ＡＯＡＰは酸不安定性であり
、そしてもしも−が抽出の間に６以下に低下するならば
破壊されうる。

細胞とバッファーとのインキュベーションの後、細胞は
捨て、そしてたとえば１００，０００　Ｆにおける遠心
分離（粒子物質のすべてを除去）の後に得られた上澄液
は、もしも所望ならば、たとえば硫酸アンモニウム、冷
エタノールまたはアセトンを使用して沈澱させる。

得られた上澄抽出液は下記の如きケンドリック試験（Ｋ
ｅｎｄｒｉｃｋ　Ｔｅ５ｔ）で試験し、そしてマウスに
おける百日咳菌での脳内攻撃に対し保護を提供すること
が見出された。アデニレートサイクラーゼ活性を含有し
ない対照ワクチンは百日咳菌での攻撃に対して保護を少
ししかまたは全く提供しないことが見出され、ＡＯＡＰ
は、実際に、免疫において最も重要な因子でありうるこ
とが示唆された。

非保設全細胞ワクチンのパッチの分析はまた非保護がア
デニレートサイクラーゼ活性の欠乏と結合する傾向のあ
ることを示し、ＡＯＡＰは百日咳菌に対する免疫応答の
誘導に必要な鍵抗原であり５ることを更に示唆した。

しかしながら、ケンドリンク試験に使用される上澄抽出
液はまたＬＰＳの断片を包含する他の蛋白質と複合体化
したＡＯＡＰを少量含有し、この場合、本発明に従うワ
クチン調合物における使用のために本物質を更に精製す
ることが望ましい。従って、たとえば更にこの精製は、
複合体化物質を除去するためのイオン交換クロマトグラ
フィおよび（または）製造等電点濃縮法によって行いう
る。別途に、２つの精製法は組合せることができ、即ち
、ＤＥＡ］Ｉｃデルに保持されない物１！（即ち、非複
合体化物質）は等電点濃縮されうる。精製法はまたクロ
マト濃縮（ｏｈｒｏｍａｔｏｆｏｏｕｓａｉｎｇ　）を
包含しうる。

上記精製工程の後、ＡＯＡＰは、もしも所望ならば、た
とえば本物質なＡＯＡＰＫ対する適当なモノクロナール
抗体を含有する免疫吸着カラムに通すことＫより更に精
製し５る。

本発明に従う上記方法により製造されたものを包含する
上記抗原製剤は、人における百日咳に対する免疫を誘導
するためのワクチン調合物中に合体しうる。この目的の
ために１抗原蛋白質は、医薬的に受容しうる担体または
アジュバントとの結合において存在しうる。

この場合、医薬的に受容しうる担体は、患者に抗原を導
入するために担体として適当な液体媒質である。そのよ
うな担体の例は、食塩溶液である。

抗原蛋白質は溶液中に、あるいは担体中に固体として懸
濁化されうる。

ワクチン調合物はまた、免疫応答を刺激するためのアジ
ュバントを包含しえ、それによってワクチンの効果が高
められる。本発明における使用のための便宜なアジュバ
ントは、たとえば水酸化アルミニウムおよびリン酸アル
ミニウムを包含する。

便宜には、ワクチン調合物は、０．０１がら５ｗｙ／ｍ
ｌまで、好ましくは０．０６から２１１１Ｐ／ｄまでの
範囲内、最も好ましくは０．３η／１の最終濃度の抗原
蛋白質を含有して存在する。調合の後、ワクチンは滅菌
容器中に入れられ、それはついで密封しそして低温たと
えば４℃で貯蔵され、あるいは凍結乾燥しうる。

百日咳に対し人間に免疫を誘導するために、適当に調合
されたワクチンの１もしくはそれ以上の用量が投薬され
うる。各投薬は、ワクチン０．１から２ｄまで、好まし
くは０．２から１Ｍまで、好ましくは０．５１１／であ
るのが推奨される。本発明は、更に他の態様において、
宿主に対し上記に限定した如きワクチン調合物の有効量
の投与からなる、六において百日咳に対する免疫を誘導
する方法を提供する。

本発明はまた、人において百日咳に対する免疫の誘導に
おける使用のためのワクチンの製造においてＡＣ！ＡＰ
（上記に限定した如き）の使用を包含する。

本発明のワクチンは、経口および非経口（たとえば皮下
または筋肉内）注射を包含するワクチンの投与のための
任意の通常の方法により投与しうる。処置はワクチンの
１回投薬、あるいはある時間内の複数回の投薬からなり
うる。

本発明に従うワクチンはまた、１種もしくはそれ以上の
他の抗原性成分、たとえば適当にトキソイド化されたチ
フスおよびジフテリアトキシン、あるいは随伴する免疫
応答を回避する百日咳菌の変異株の出現可能性を減少さ
せるために他の百日咳菌抗原たとえばトキソイド化ＬＰ
Ｆを包含しうる。

以下の実施例で本発明を説明する： 例１ 酸グリシン加水分解および粗性膜蛋白質の製造細胞を指
数相に至るＸで採取し、そして８０００ｙ〔ンルバール
（５Ｏｒｖａｌｌ　）、ＧＳＡ、アングルヘッド〕で、
４℃において２０分間回転した。上澄液をサイホン除去
し、そして細胞を直ちに蒸留水中に、２０〜３０Ｆｎ９
／Ｉｕ細胞乾燥重量の濃度で緩和に再懸濁した。この容
量の兄の１Ｍグリシン−ＨＯｔバッファー（ｐｉ−１３
，０）を緩和な攪拌下に加えて、２５０ｍＭグリシンの
最終濃度を得た。グリシン溶液は、酵素活性を停止させ
るためにＥＤＴＡ（最終混合物中に５　ｍＭを得るため
）を含有しヘーをチェックし、そして必要な場合、１〜
２Ｍｐａｔを使用して…６．０に再調節した。混合物を
６７℃の水浴上で温度が平衡に達するまで緩和に攪拌し
、ついで６７°Ｃで（攪拌なしＫ）１夜（１８時間）イ
ンキュベートした。−をついで、１ｏＭＮａＯＨを使用
して７．２〜７．４に調節し、それは局所過剰を避ける
ためＫゆっくり加えた。細胞を５０［１０ｇで、５℃に
おいて２０分間沈降させ、上澄液をサイホンで取り出し
、氷水浴中で１〜２°Ｇに冷却し、そして予冷却アセト
ン（−２０から一４０’Ｃまで）２容量を温度が１〜２
°Ｃ以上に上昇するのを避けるためにゆつ＜ｐ７Ｊ］え
た。ついで混合物を一２０°Ｃに６〜５時間保ち、そし
て沈澱を予冷却（−１００Ｇ）アングルヘッド中に４０
００＆、２０分間で採取した。上澄液をサイホンで取り
出し、そして捨てた。沈降した沈澱を、水冷蒸留水中に
、細胞懸濁液のもとの容量の約ｌ／２ｏＫ溶がした。つ
いで溶液から、５００００＆で、５°Ｃにおいて９０〜
１２０分間回転することにより不溶物および担体を除去
した。上澄液を採取し、そして凍結して保存しまたは凍
結乾燥した。凍結乾燥前に１％Ｗ／Ｖマンニトールを加
えた。細胞の乾燥重量１ｙ当り４０から８０１Ｒ９まで
の蛋白質が得られた。

例２ ＤＥＡＥ−トリスアクリルカラム（３Ｘ１６傭）を０．
０２５　Ｍ　Ｔ　ＲＩ　Ｓ　、０．０３５　Ｍ　Ｎａ０
ｔバツフアー（ＦＪ（８，８）で平衡化し、そして例１
で得られた物質（蛋白質１１１まで）を平衡化バッファ
ーに対し透析し、そしてカラムに６０１１／時間でポン
プ注入した。画分（１管当り９９滴、約５１）を、プー
ル（ｐｏｏｌｓ　）　１〜１３において組合せた。適用
した全蛋白質の１部分（約４）はゲルベラ）Ｋよって遅
延されず、そして大きなピークとして採取されたく第１
図、０．０３５Ｍ）。ついで保持された物質を、０．０
２５　Ｍ　）リスバッファー（ｐＨ８，８）中の０．１
．０．２．０．６および１．０　Ｍ　Ｎａ０ｔを使用し
て溶出した。画分を保持し、そして蛋白の分離を確認す
るためＫＳＤＳ−ＰＡＧＥ板に適用した。ＡＣＡＰは、
５ＤＳ−ＰＡＧＥにより示される如くカラムによって遅
延されない物質中に存在したが、０．２　Ｍ　ＮａＣ！
ｔＩｃより溶出される遅延された物質中にまた存在した
。

（ｂ）顆粒化ゲル中の製造フラットベット等電薫製縮（
ＩＥＦ） これはＬＫＢ勧告（ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎ　）
　（アプリケーション・ノー）　（Ａｐｐｌｉｃａｔｉ
ｏｎ　Ｎｏｔｅ　）　１９８、ＬＫＢ−プロダクターＡ
　Ｂ　（Ｌ　Ｋ　Ｂ　−ＰｒｏｄｕｃｔａｒＡＢ）、プ
ｏ　’ｖ　（Ｂｒ０ｍｍ＆　）、スエーデン〕Ｋ従い行
った。ウルトロデックス（Ｕｌｔｒｏｄｅｘ　）　（Ｌ
ＫＥ　）１’および予混合アムポリン（’Ａｍｐｈｏｌ
ｉｎｅ　）　５　ｄの懸濁液（ｐｉ−１３，５〜９．５
）を、蒸留水中に最終容量１０　Ｑｄ１ｃ懸濁し、水平
）　１’　−Ｃ１０，８Ｘ　２４．３ｃＩｎ）　Ｋ注入
いそして空気流下洗勧告限界内に蒸発した。蒸留水中の
同じアムポリンの１：２１釈中に浸した砥石（ｐａｐｅ
ｒ　ｗｉｃｋ８）　（Ｌ　Ｋ　Ｂ　％２１１７−１０６
）３個の層にした片をトレーの各片に置いた。例２ａか
らの物質を、適用型板（ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ　ｔｅ
ｍｐｌａｔｅ　）　（２Ｘ　９．４　ｃｍ　）を使用し
て埋めこみ、それは陰イオン末端からのその長さに沿っ
て込〜スの距離においてデル中に圧しつけ、密封したデ
ルを除去し、１０ｄ容の使い捨て注射器に移し、例２ａ
かもの該物質３ｍ（蛋白質５００Ｒ９までを含有）中に
懸濁し、そして最後にその除去によ勺形成した空のスペ
ースに戻し注入した。ついでデルを必要ならばへらで平
滑にし、そして２０分間平衡化した。その間、砥石１個
をリン酸（比重１．７５）の１：１００希釈中に浸し、
そして陰イオン末端において紙片に加え、そしてｌ　Ｍ
　ＮａＯＨ中の他のものは陽イオン末端においた。

フラットベッドＩＫＦ装置〔ファルマシア（Ｐｈａｒｍ
ａｃｉａ　）型ｙＢｘ−３０００）中のトレー支持体を
、操作の間、水道水（１５°Ｇ）を流すこと忙より冷却
した。ピルを一定の８ワツトで操作した。

ＡＯＡＰは２つのバンドとして検出され、１つはｐＩ　
７．０のもの、そして他方（拡散）バンドは１）Ｉ　７
．２〜７．４のものであった。アデニレートサイクラー
ゼ活性は中心バンド（ｐｒ　７．０　）と殆んど完全に
結合したが、ＡＣＡＰ’に対するモノクロナール抗体は
両方のパンＰに強く結合した。

ついで、金属型板を使用して３０の平行な場に分割し、
ピルをへらで冬場からかき取り、そして蒸留水１ｄを含
有する試験管に移した。各画分の−をこの段階で測定し
た。ついでゲル懸濁液を小さなプラスチックカラムに移
し、０．２Ｍ重炭酸アンモニウムバッファー（ｐＨ７，
０）２．ｗＪで溶出し、そしてｒル不含溶出液を凍結（
−４０°Ｏ）した。

（Ｃ）　分析等電点濃縮 （１）上記例２（ｂ）と同じ方法を用いたが、８Ｍ尿素
の存在における１２％ポリアクリルアミドデルを使用し
た。例２（ｂ）と同じ結果が得られた。

（−）同じ技術であるが１０％ンルビトールの存在にお
けるアガロースデルを使用して、Ｉ）Ｉ　４．５から６
．０までの４つの免疫反応性バンドが示された。

ｐＩ　４．０のバンドは大部分のアデニレートサイクラ
ーゼ活性を保持した。

例　３ モノクロナール免疫吸着カラムを使用するＡＣＡＰの精
製 ＡＣＡＰに特異のモノクロナールイムノグロブリンを含
有するマウス腹水を、室温において２７％ｗ／ｖ　Ｎａ
２ＳＯ４２容量の添加により沈殿させ、そして２〜４時
間放置し、その後沈降（２０００，９゜１５分間）させ
た。沈降物を再溶解し、そしてＰＢＳに対し透析した。

この蛋白質５００η（ＵＶ決定）を、製造者（ファルマ
シア）の指示に従い、充填ＣＮ　Ｂｒ−セファロースＣ
Ｌ　４　Ｂ　７０ｄＫカツプリングさせた。セファデッ
クスＧ−５０（中程度）を５００１ｍＸ２５龍カラムに
２２０ｏ＋＋のベッドの高さにつめた。カラムを溶出バ
ッファー（０，０１％チオメルサール（Ｔｈｉｏｍｅｒ
ｓａｌ　）を含有する０、２Ｍ重炭酸アンモニウム、ｐ
Ｈ７，０）で溶出した後、腐１２バロチーニ（Ｂａ１ｌ
ｏｔｉｎｉ　）ガラス玉を５　ｍｍの層の厚さにセファ
デックスベットの頂上部に注入した。更に洗滌した後、
免疫吸着ｒルをバロチーニガラス玉層に注入し、これは
セフ７デツクスベツドから分離して両者を分離させた。

カラムを溶出バッファーで更に洗滌し、そして最後に別
のバロチー二ガラス玉層を１００朋の高さの免疫吸着ベ
ッドの頂上部に入れてカラムの頂上部を保護した。

免疫吸着カラム上のＡＣＡＰを分離するために、蛋白質
〔ロウリー（Ｌｏｗｒｙ　）　）　１　’Ｒ９／　ｉｌ
ｊを含有するＤＥＡＥ−）リスアクリル分離（例２）か
らの非保持溶出液を、免疫吸着カラムに５°Ｏにおいて
０．２５＋ｗＪ／分で適用し、溶出バッファー（０，２
Ｍ重炭酸アンモニウム、−７，０，０１％Ｗ／Ｖチオメ
ルサール〕で洗滌し、そしてベースラインが安定化され
た後ＫＸ溶出バッファー中の６Ｍ尿＄５０１−／νをカ
ラムに適用して吸着物質を溶出した。セファデックスＧ
−５０ペツげ上の免疫吸着物質の位置決定は、操作中に
尿素からの蛋白質の同時分離を可能とした。

例　４ 百日咳菌の培養 微生物の生育のために使用した限定培地は従来記載〔ノ
ボ）　ニー　（Ｎｏｖｏｔｎｙ　）およびプルマウス（
Ｂｒ０Ｏｋｅ５　）、１９７５　）された如きスタイナ
ー（８ｔｅｉｎｅｒ　）およびショルト（５ｃｈＯ１ｔ
ｅ）　（１９７１）の組成に基（ものであった。すべて
の培地は３６〜３７℃で生育させた。ゆる（栓をした振
盪フラスコ（培地２００−を入れた５００ｄ容円錐フラ
スコ）中の液体培地に、２％寒天および５％ウマ血液を
加えたニーエン・ウイラー培地（Ｃｏｈｅｎ　−Ｗｈｅ
ｅｌｅｒ　ｍｅｄｉｕｍ　）上４８時間生育させ、セし
てを使用して５１または７０１容の全ガラス醗酵器中の
培地に接種し、−男声は２　Ｍ　ＨＣｊの管理した添加
により７．６に維持し、セして渦動振盪により５〜１０
チ罠おける溶存酸素飽和を維持した。培養物を指数相終
末期の前、即ち約６６時間のインキュベーションの後採
取した〔ノボトニー（Ｎｏｖｏｔ、ｆｆｙ）およびコラ
ンレイ（Ｃｏｗｎｌｅｙ　）、１９７８）。

例　５ ケンドリック（Ｋｅｎｄｒｉｃｋ　）試験これは、体重
１４〜１６ｇのＭＦｌまたはＮＩＨマウス（ＯＬＡＣ，
カテゴリー３、気管支敗血多くを含まない〕を使用し、
百日咳ワクチンについてのＷ、　Ｈ，Ｏ，要求に従い遂
行した。０．５ｄ容量中の抗原を腹腔内に接種し、そし
て最高希釈および６回の４倍連続希釈からなった。２週
間後Ｋ、推奨された攻撃株１８−３２３　（１００〜２
００ＬＤａｏ　）を使用して、マウスを攻撃した。各群
の生存数を、パラノル・ライン・ゾロ♂ット分析（ｐａ
ｒａｌｌｅｌ　１ｉｎｅ　ｐｒｏｂｉｔ　ａｎａｌｙｓ
ｌｓ　）の計画表を使用し、プリティッシュ・パーツシ
ス・リファレンス・ワクチン（Ｂｒ１ｔｉｓｈ　Ｐｅｒ
ｔｕｓｉｓ　ＲｅｆｅｒｅｎｃｅＶａｃｃｉｎｅ　）　
６６　／　８４に関係して、ＲＤ、ｏおよび相対強度の
計算に使用した。ＦＨＡ／ＬＰＦワクチンを使用して、
比較試験をまた行った。結果を表１に示す。

例　６ ＡＣＡＰのアミノ酸分析 アミノ酸分析を、ランク・ヒルが−・クロマスペック（
Ｒａｎｋ　Ｈｌｌｇｅｒ　Ｃｈｒｏｍａｓｐｅｋ　）ア
ミノ酸分析機を使用して行った。検体は、厚壁（ｔｈｉ
Ｃｋ−ｗａｌｌｅｄ　）パイレックス試験管（７，５Ｘ
　１．２ｃｍ　）中の乾燥した検体物質Ｋ、０．１％（
Ｗ／ｖ）フェノールを含有する６ＮＨＣｊ（ＢＤＨアリ
スター（Ａｒ１５ｔａｒ　）等級から希釈〕２５０μｌ
の添加により製造した。ついで狭い穴を導くために試験
管を、酸素−天然ガス流−トーチ焔中で引き延ばした。

内容物をドライアイス−エタノール浴中で凍結した後、
各試験管を分岐管およびトラップを経て高真空ポンプに
連結し、そして空気を除去するために１０分間放置した
。ついで試験管を封印し、そして加水分解のために１１
０°Ｃにおいて炉中に入れた。加水分解した検体を真空
乾燥器中、粒状水酸化ナトリウム上で乾燥した。乾燥し
た残渣を、自動分析のために、アミノ酸分析器出発バッ
ファー２５０μｊに溶かした。表２に示すアミノ酸値は
、６８時間加水分解値を使用したバリンおよびインロイ
シンの場合を除いて、２回の２４．４８および６８時間
加水分解から得られた結果の平均である。

シスチン、システィンおよびトリプトファンの値は、こ
の方法によっては決定できなかった。

表　２ 残基 アスパライン酸（＋アスパライン）４８スレオニン　３
３ セリン　６６ グルタミン酸（＋グルタミン）６２ プロリン　６０ グリシン　７７ アラニン　８２ バリン　５４ メチオニン　４ インロイシン　２２ ０イシン　５０ チ０シン　７ フェニルアラニン　１１ ヒスチゾン　１６ リジン　１９ アルギニン　３７ 例　７ ワクチン調合物 免疫における使用のためのワクチンは、通常の技術によ
り次の成分から製造し５る： 咳ワクチン ワクチン各１ｄは次のものを含有する：ジフテリアトキ
ンイド　＞６０ｘ、ｔｒ。

破傷風トキソイド　＞１２０１．Ｕ。

本発明罠従う百日咳菌抗体　＞　０．３６３■ホウ酸ナ
トリウム　＜　１０．０３　ダコハク酸　＜　３．１０
　〜 チオメルサール　０．０４〜０．２ダ 塩化ナトリクム　＜８．５　雫 水　適量　全量１ｄ ｂ）吸着したジフテリア、破傷風および百日咳ワジフテ
リア、破傷風および百日咳菌成分を、水酸化アルミニウ
ムデル上に標準技術により吸着させる。

ワクチン各１罰は次のものを含有する：ジフテリアトキ
ンイド　＞　６Ｄ　１．Ｕ。

破傷風トキソイド　＞　１２００．Ｌ。

本発明に従う抗原　＞０．３６３　１Ｒｙ不溶性アルミ
ニウム塩　＜０．０９３ミリモル（２，５１Ｒ９）Ａ／
、に当量ホウ酸ナトリウム　＜８．０１ｍ９ コハク酸　＜　２．４８１Ｊ９ チオメルサール　０．０４〜０．２■ 塩化ナトリウム　＜６．８　ダ 水　適量　全量１ｄ Ｃ）百日咳ワクチン ワクチン各１ｄは次のものを含有する：本発明に従５抗
原＞　０．３６３１１１６チオ）ｋｔ−ル０．０４〜０
．２１１９塩化ナトリウム　＜８．５　ダ 水　適量　全量　１ｄ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）医薬的に受容しうる担体と一緒で、アデニレート
   サイクラーゼ活性と結合した蛋白性物質日咳菌に対する
   保鏝のためのワクチン調合物。 （２）該ＡＯＡＰが相対分子量（ＭＹ　）　６７．００
   ０〜７３．０００を有する、特許請求の範囲第１項に従
   うワクチン調合物。 （３）該ＡＯＡＰが分子量約６９，０００を有する、特
   許請求の範囲第１項および第２項のいずれかに従うワク
   チン調合物。 （４）該ＡＯＡＰが製造光電点濃縮法（工ＩＣＰ）条件
   下に等電点（ＰＩ）７．０〜７．４を有する、特許請求
   の範囲第１項から第４項までのいずれかに従うワクチン
   調合物。 （５）　ＡＯＡＰが等電点約７．０を有する、特許請求
   の範囲第４項に従うワクチン調合物。 （６）該ＡＯＡＰにおけるプロリン対グルタミン酸残基
   の比率がほぼ１：１である、特許請求の範囲第１項から
   第５項までのいずれかに従うワクチン調合物。 （力　該Ａ　ＯＡＰ中に含有されるチロシン残基がヨー
   ド化しえないものである、特許請求の範囲第１項から第
   ６項までのいずれかに従うワクチン調合物。 （８）百日咳菌に由来する細胞内物質を実質的に含有し
   ℃いない、特許請求の範囲第１項から第７項までのいず
   れかに従うワクチン調合物。 （９）医薬的に受容しうるアゾユパントを特徴とする特
   許請求の範囲第１項から第８項までのいずれかに従うワ
   クチン調合物。 ＣＩ（１１種もしくはそれ以上の他の抗原成分を特徴と
   する特許請求の範囲第１項から第９項までのいずれかに
   従うワクチン調合物。 仕り　百日咳菌細胞の培養物を、細胞に関しアミノ酸の
   高張濃度からなるｐ）１２．５〜６．５の水性アミノ酸
   バッファーで処理し、生成した上澄液から細胞を分離し
   、干してＡＯＡＰを含有する抗原製剤を上澄液から単離
   することからなる、百日咳菌からＡＯＡＰを含有する抗
   原製剤を単離する方法。 Ｏ２アミノ酸がグリシンおよびアラニンから選択される
   、特許請求の範囲第１１項に従う方法。 Ｏ３１上澄液からの該単離がイオン交換クロマトグラフ
   ィからなる、特許請求の範囲第１１項および第１２項の
   いずれかに従う方法。 ０４）上澄液からの該単離が等′畦点濃縮からなる、特
   許請求の範囲第１１項から第１６項までのいずれかに従
   ５方法。 （ｌ！９　該単離が該ＡＯＡＰに対する適当なモノクロ
   ナール抗体を包含する免疫吸着カラムへの単離した物質
   の通過から更になる、特許請求の範囲第１３項および第
   １４項のいずれかに従う方法。 ＯＱ　該ＡＯＡ　Ｐが特許請求の範囲第１１項がら第１
   ５項までのいずれかに従う方法により製造される、特許
   請求の範囲第１項から第１０項までのいずれかに従５ワ
   クチン調合物。 ０η　ＡＯＡＰｏ ０〜　次の性質を有することを特徴とする、ＡＯＡＰ：
   （１）　ゾロリン対グルタミン酸の比率約１＝１；（Ｍ
   ）　チロシン残基がヨード化されない；（＃Ｉ）　Ｍ胸
   肉百日咳菌物質を実質的に含有しない；Ｇｙ）　相対分
   子ｆｆ１６７，０００カラ７３，０００１Ｔ；（ｖ）等
   電点７．０から７．４まで；および、（ＶＯｐＨ約６以
   下で酸不安定性である。