JPS61207334A - 腫瘍細胞障害性物質 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、腫瘍細胞障害性作用を有する新規な物質およ
び当該物質を含有する医薬組成物に関するものである。

〔従来技術〕

腫瘍細胞障害性物質としては、リンホトキシン、腫瘍壊
死因子などが知られている。

リンホトキシンは、グランジャーら（Ｇｒａｎｇｅｒ＋
　　。

Ｇ、Ａ、　　ｅｔ　ａｌ、Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　　Ｉｍｍ
ｕｎｏｌｏｇｙ＋　　３８＋　　３８８　　＝４０２　
　（１９７Ｂ）　）による報告や、青木隆−ほか共著「
リンホカイン」　（新色疫学叢書６、医学書院、１９７
９年）、プルームとブレイド（Ｂｌｏｏｍ、　Ｂ、　Ｒ
。

＆　Ｇｌａｄｅ、　Ｐ、　Ｒ，）の共１ｉ　ｒ　Ｉｎ　
ｖｔｔｒｏ　ｍｅｔｈｏｄｓ　１ｎｃｅｌｌ　ｍｅｄｉ
ａｔｅｄ　ｉｎ＋ｍｕｎｉｔｙＪ　（Ａｃａｄｅｍｉｃ
　Ｐｒｅｓｓ、１９７１年）などに記載されているよう
に、たとえば、感作されたリンパ細胞に抗原を作用させ
るか、マイトジェン（ｍｉｔｏｇｅｎ　）としてフィト
ヘマグルチニン（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎ
ｉｎ　：　Ｐ　ＨＡ）　、、コンカナバリンＡ　（ｃｏ
ｎｃａｎａｖａｌｉｎ　Ａ　：　Ｃｏ　ｎ　Ａ）をはじ
めとするリンホトキシン誘導剤を細胞に作用させること
によって、その細胞内外に誘導生成する蛋白様物質であ
って、細胞障害機能を持つ物質に与えられた名称である
。リンホトキシンは、マウス上−９２９細胞のみならず
、ヒト腫瘍細胞、さらにはヒト正常細胞にも障害を与え
ることが知られている。また、腫瘍壊死因子は、カース
ウェルら〔Ｃａｒｓｗｅｌｌ、　Ｅ、　Ａ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、　Ｐｒ、　Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、　７２．９　、３６６６〜３６７０　（１９７
５）　）の報告や、ピンク　（Ｐｉｃｋ、　［！、）　
ｋｍ　ｒＴｕｍｏｒ　Ｎｅｃｒｏｓｉｓ　Ｆａｃｔｏｒ
　ｉｎＬｙｍｐｈｏｋｉｎｅｓ　Ｊ　　（２巻、２３５
〜２７２頁、ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ　（１９８１
））などにも記載されているように、例えば、ウサギに
バチラス　カルメソティ　グエリン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
　Ｃａｌｍｅｔｔｅ　Ｇｕｅｒｉｎ　：　Ｂ　ＣＧ）　
、コリネバクテリウム　パルバム（ｃｏｒｙｎｅｂａｃ
ｔｅｒｉｕｍｐａｒｖｕａ＋）　、エンドトキシンなど
の腫瘍壊死因子誘導剤を非経口的に投与することによっ
て、その血清中マクロファージ細胞が誘導生成する蛋白
様物質であって、Ｍｅｔｈ　Ａ肉腫出血性壊死能を持つ
物質に与えられた名称である。腫瘍壊死因子は、マウス
Ｌ−９２９細胞のみならず、ヒト腫瘍細胞にも障害を与
え、それを死滅破壊させるがヒト正常細胞には実質的に
障害を与えないことが知られている。

上記の如く、リンホトキシンならびに腫瘍壊死因子は、
腫瘍細胞に対して細胞障害作用を有することより、当初
より悪性腫瘍治療剤として期待されてきたが、まず、リ
ンホトキシンは前述の如く、その細胞障害作用において
細胞選択性がな（、腫瘍細胞および正常細胞を同様に障
害するため悪性腫瘍治療上の使用に厳密な制限−を要す
る。さらに腫瘍壊死因子は、ヒト以外の動物血清から製
造され、工業的規模での製造が困難であること、精製が
困難であること、またヒト以外の動物に由来する蛋白成
分であるため、抗原性の問題等があり、ヒトの治療上の
安全性等に問題があった。

本発明者らは、これらの問題を解決すべく腫瘍細胞に対
して細胞障害作用を有する物質に′ついて、多年にわた
り鋭意研究を重ねてきた。その結果、ヒト由来の末梢リ
ンパ球細胞から、上記障害作用を有する新規な物質を分
離することに成功し、この物質が極めて強力か一つ選択
的な腫瘍細胞への障害作用を有することを見出して本発
明を完成した。

〔発明が解決しようとする問題点〕

本発明は、新規腫瘍細胞障害性物質を提供するものであ
り、正常細胞への障害の少ない腫瘍細胞への選択的作用
を有する、従来にない腫瘍細胞障害性物質を提供するこ
とを目的とする。

〔問題点を解決するための手段及び作用の説明〕■原料
細胞の調製 原料細胞は、ヒト由来の末梢リンパ球細胞が利用される
。末梢リンパ球は、公知の方法に従い調製できる。たと
えば、健康成人より採取した末梢血液を遠心することに
より、血漿及び赤血球とリンパ球を分離する。分離した
リンパ球に赤血球が混入した場合は、塩化アンモニウム
塩を加えて、これを溶血させ、遠心分離して上清を除去
する。

得られた遠心沈澱は、末梢リンパ球として必要に応じて
栄養培地中で使用できる。

■培養条件 培地としては、たとえばＲＰＭＩ　１６４０、Ｅａｇｌ
ｅ’ｓＭＥＭ等が好適に用いられる。当該培地中には、
０〜１０％の牛血清又はヒト血清などを添加して改質し
てもよいが、最終産物を精製後医薬として用いることを
意図する場合には、血清無添加培地、たとえばＲＩＴＣ
−５５−２培地、ＲＩＴＣ−５６−２培地、ＲＩＴＣ−
５５−９培地等が好適に利用される。

■誘導剤の添加 本発明において細胞の誘発に用いられる誘導剤としては
、公知の各種マイトジェンが用いられる。

例えば、タチナタマメレクチン（ｃｏｎＡ）、アカイン
ゲンマメレクチン（ＰＨＡ）　、レンズマメレクチン（
ＬｃＨ）、エントウマメレクチン（ＰＳＡＤ、ダイズレ
クチン（ＳＢＡ）、さらにアメリカヤマゴボウレクチン
（ＰＷＭ）等の’＆質を例示することができ、これらの
１種あるいは２種以上を組み合わせて用いることもでき
る。

誘導処理は、細胞濃度をｌＸ１０５〜ｌＸ１０７個／ｍ
ｌに調整し、これに前記誘導剤を添加・作用させること
によって行われる。誘導剤の濃度は、何個の誘導剤によ
って異なるが、一般的には１０〜５００　ｐ　ｇ／ｍ４
程度である。処理温度は、約２０〜４０℃、処理時間は
Ｉ〜６日間程度が好ましい。

かくして、本発明からなる細胞障害性物質が栄養培地中
に産生される。

■本発明からなる細胞障害性物質の精製誘導・産生され
た本発明からなる新規物質は、当該物質の物理化学的・
生化学的性状を利用して精製される。例えば、濃縮、イ
オン交換体処理、分子量に基づく分画処理等を適宜組み
合わせることによって行われる。

より具体的には、たとえ・ば次の如き方法によって回収
される。即ち、まず培地を遠心分離（例えば１５００回
転、５分）し、上清を回収する。この上清を分子Ｎ１万
カツトの濾過膜を用いて濃縮する。濃縮のためには、そ
の他減圧透析あるいは試料の量に応じて、＾ｍ１ｃｏｎ
　Ｄｉａ　Ｆｌｏｗ　Ｓｙｓｔｅｍ等を用いてもよい。

濃縮液は、所望により次いで塩濃度を調整するために透
析を行った後、各種クロマトグラフィー処理がなされる
。クロマトグラフィーとしては、陰イオン交換体処理、
アフィニティークロマト処理、ゲル濾過処理、高速液体
クロマトグラフィー処理等が例示される。陰イオン交換
体としては、例えば、ＤＥＡＥ交換体が例示される。

担体をｐＨ７〜９、より好ましくは９Ｈ７，５〜８．５
に調整した後、前記濃縮液を展開して担体に本発明物質
を吸着させる。緩衝液で洗浄した後、塩濃度を上昇させ
本発明物質を溶出させる。好適な緩衝液としては、リン
酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液等が例示される。溶出液は
、さらに高度精製をするためにアフィニティークロマト
グラフィーにかける。使用担体としては、ポリクローナ
ル抗体、モノクローナル抗体、ハイドロキシアパタイト
等のカラムが好適に用いられる。

ポリクローナル法の場合、本発明物質に対する抗体は、
高度に精製した本発明物質を動物に免疫し、得られた血
清から回収・精製することによって得られる。

当該抗血清の製造は公知の方法にて行えばよく、たとえ
ば高度精製本発明物質とフロイントの完全アジュバント
の混合乳液を作り、動物の皮内に２〜３回注射し、最終
免疫の数日後採血を行い、室温で凝固せしめた後、４℃
で一夜放置し、３　、００Ｏｒｐｍ　、２０分間の遠心
分離により当該抗血清が得られる。

免疫に用いる動物としては、特に動物種を選ぶ必要はな
く、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヤギ、ウマ等が
挙げられる。当該抗血清の精製は、たとえば、Ｊ、＾ｍ
、　Ｃｈｅｗ、　Ｓａｃ、、　６２．３３８６　（１９
４０）。

Ｆｅｄ、　Ｐｒｏｃｌ、　１７．）６１　（１９５８）
に記載の方法にて行われる。

モノクローナル法の場合、細胞融合法により抗体を得る
。細胞融合法は自体既知の手段にて行われ、その−例は
増殖性を持った細胞と目的とする抗体を産生じているリ
ンパ球とをポリエチレングリコールの存在下で反応せし
めることにより、増殖性と抗体産生能とを同時に兼ねそ
なえた細胞を製するもので、この細胞の産生ずる抗体は
一個の抗原決定基に対してのみ反応する単一の抗体であ
る。

本発明では増殖性を持つ細胞としてマウスミエローマ細
胞を、抗体産生リンパ球として本発明物質で免疫された
マウス肺臓細胞（Ｂ細胞）を用いて融合させ、さらに目
的とする抗体を産生じている細胞をスクリーニングして
、本発明物質のモノクローナル抗体を得る。

また、このようにして得られた本発明物質の抗体を、そ
の活性を失うことなく固定化する方法としては、以下の
不溶性マトリックスを応用することができる。アミノ酸
のコポリマー（Ｊ、Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、２３６．１９７０　（１９６１））　、セ
ルロース（Ｎａｔｕｒｅ＋１８９、５７６　（１９６１
）　）　、アガロースあるいはセファデックス■（Ｎａ
ｔｕｒｅ、　２１５．１４９１　（１９６７）、　Ｎａ
ｔｕｒｅ。

２４５、３０５９　（１９７０））　、ポリアクリルア
ミド（Ｂｉｏ−ｃｈｅｍ、、８．４０７４　　（１９６
６）　）　、これらの方法により抗体を効率良く固定化
しうる。また、このようにして得られた吸着剤を用いる
ことにより、収率良く、しかも高純度の本発明物質を得
ることができる。

本発明に係る細胞障害性物質の抗体を用いたアフィニテ
ィークロマトグラフィーは以下の通りである。イオン交
換体により部分精製した本発明物質を、ｐＨ７〜８の緩
衝液で平衡化した前記抗体カラムと接触・吸着させる。

カラムを洗浄後、チオシアン酸カリウム（ＫＳＣＮ）を
含む水溶液で溶出する。

ハイドロキシアパタイトは、商品名バイオゲル（ＨＴ）
としてバイオランド社によって販売されており、これを
用いる場合は、担体をカラムに充填後、ｐＨ７〜９の低
塩濃度緩衝液で平衡化し、これに本発明物質を含有する
溶液を接触・吸着させる。カラムを洗浄後塩濃度を上昇
させ、本発明物質を溶出させる。

所望により、本発明物質の精製のためには、さらに分子
量に基づく分画手法も利用できる。たとえば、ゲル濾過
法による場合、担体として分子量１０．０００〜１００
，０００の化合物の分子篩に適したセファデックス、ア
ガロース、バイオゲル、セファクリル等を用いる。これ
ら担体は、使用に際してあらかじめｐＨ７〜９程度の低
イオン強度緩衝液で平衡化したものを用いることが好ま
しい。また、高速液体クロマトグラフィーにより分離す
る方法も有用である。その条件は、ＴＳＫ−３０００Ｓ
ＷＧ　　（東洋曹達社製）あるいはそれに相当するよう
な充填カラムをｐＨ７〜８の緩衝液で平衡化したものを
用いることが望ましい。

以上の精製法において、本発明物質の追跡は、例えば分
子量と細胞障害活性をマーカーとして行つ。

かくして得られた細胞障害性物質は、以下に示す特性か
ら新規物質であり、生化学用、薬理学用の試薬として用
いてもよく、また、医薬品として用いる場合には医薬品
製造の通例技術にしたがって、要すれば滅菌・除菌処理
、製剤化を行えばよい。かくして新規な細胞障害性物質
を含有する医薬が提供される。

■本発明物質の特性 本発明からなる新規細胞障害性物質の特性は次の通りで
ある。

（）分子量 Ａ　：　Ｕｌｔｒｏｇｅｌ　ＡｃＡ４４を用いたゲル濾
過法による分子量 Ｕｌｔｒｏｇｅｌ＾ｃＡ４４（ＬＫＢ社製）をカラム（
径２．５ｃｆｆｌ×長さ１００ｃｍ）に充填し、本発明
物質試料を含む液（３０００ＬＬＩ／　ｍｌ）　３　ｍ
ｌを添加し、ｐＨ７，２の０、ＯＩＭ　ＩＪン酸緩衝液
（以下、ＰＢＳ）を用いゲル濾過を行った。試料の溶出
位置より標準分子量キット（ファルマシア社製）から求
めた標準曲線を用いて分子量を産出した。得られた結果
は第１図に示す通りである。

第１図において各記号は次のことを意味する。

（ｂ）は牛血清アルブミン（分子量６７．０００　）を
、（ｃ１は卵白アルブミン（分子量４３，０００　）を
、（ｄｌはキモトリプシノーゲンＡ（分子量２５，００
０　’）を、（ｅｌはリボヌクレアーゼ（分子量１３，
７００　）を示し、本発明物質は（ｅ）に示した。第１
図より、本発明物質の分子量は約ｓｏ、ｏｏｏであると
認められる。

Ｂ：ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動
法を用いた分子量 Ｌｏｅｍｍ　ｌ　ｉの方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７．
６８０　（１９７０）　）に従い、ＳＤＳを含むアクリ
ルアミドゲルを用い、ＳＤＳ　００１％添加したトリス
緩衝液に溶解した本発明物質（３０００ＬＵ／ｍｌ）　
５０−の電気泳動を行った。泳動条件は３０ｍＡで約４
時間であり、標準分子量キット（ファルマシア社製）を
用いて分子量曲線を作成し、本発明物質の生理活性及び
染色像による泳動距離により分子量を求めた。その結果
を第２図に示す。

第２図において各記号は次のことを意味する。

ｆａ＋はフォスフォリラーゼｂ（分子量９４，０００　
）を、（ｂｌは牛血清アルブミン（分子量６７．０００
　）を、（ｃ１は卵白アルブミン（分子量４３，０００
　）を、ｆｄｌはカルボニックアンバイトラーゼ（分子
量３０，０００　）を、（ｅ）はソイビアントリプシソ
インヒビター（分子量２０，１００　＞を、Ｔｇｌはア
ルファラクトアルブミン（分子量１４．４００　）をそ
れぞれ示す。（ｆ）が本発明物質で分子量は約１８，０
００と算出される。

（２）等電点 等電点電気泳動用カラム（ＬＫＢ社製）とアンホライン
（ＬＫＢ社製）を用い、ショ糖密度勾配等電点電気泳動
法により等電点を測定した。即ち、上記カラム内にｐｌ
（３〜６のアンホラインを均等に含む不連続シー）１！
密度勾配を作成し、本発明物質試料（１００００ＬＵ）
をその中程に添加し、電圧を５００ｖ〜１５００Ｖかけ
、７２時間泳動を行った。

泳動後、シｇ糖密度勾配を乱さないように下方より液を
流出させ、３ｍｌずつ分取していき、各フラクションに
ついてｐＨと本発明物質の活性を測定し、等電点を求め
た。その結果、本発明物質の等電点はｐＨ５，４±０．
３と求められた。

（３１ｐ　Ｈ安定性 ｐＨ７，２，０，ＯＩＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓに溶解した本発明
物質（５００ＬＵ／ｍｌ）をそれぞれｌＮＮａＯＨ及び
ＩＮＨＣＪを用い、ｐＨ３，４，５，６，７，８，９に
調整し、＋４℃で２４時間放置した後、ＰＢＳを用いて
一晩透析を行い、ｐＨを７に戻した。それぞれの試料に
つき本発明物質の活性を測定し、その増減を示したのが
表１である。この結果により本発明物質はｐＨ５より失
活し始め、ｐＨ４以下では非常に不安定であることが示
される。

表１ Ｔ４）　ｔｊ！鎖の有無 フィトヘマグルチニン、コンカナバリンＡルンズ豆レク
チン固定化セファロースへノ吸着本発明物質３０００単
位を含む０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液溶液をそれぞれフィ
トヘマグルチニン（ディフコ社製）を固定化したセファ
ロース４Ｂ（ファルマシア社製）、コンカナバリンＡを
固定化したセファロース（ファルマシア社製）、レンズ
豆レクチンを固定化したセファロース各３ｍｌを充填カ
ラムに流した後、０．４Ｍメチル−α−Ｄ−マンノシド
を含む０．０１Ｍリン酸緩衝液で溶出を行った。

カラム通過画分および溶出画分について本発明物質の活
性を測定したところ、上記すべての種類のカラムにおい
て通過画分に投入量の１００％の活性が測定された。こ
のことから本発明物質は、フィトヘマグルチニン、コン
カナバリンＡルンズ豆レクチンに吸着しないことがわか
った。

かくして、本発明物質は、ＣｏｎＡ、ＰＨＡｓＬｅｔｉ
　Ｉ−ｌｅｃｔｉｎに吸着しないものであることから、
糖鎖の含有は８％以下であることが推定された。

（５）保存安定性 （ヒト血清アルブミン、糖の添加による安定化の検討） 本発明物質は、アルブミンまたは糖によって安定化され
ることを見出したが、その安定化効果は、アルブミンに
あっては１〜２０ｍｇ／ｍｌが、また糖にあってはｌ　
Ｏ〜１０００ｍｇ／　ｍｌが好ましい。

本発明物質を５００単位含む０．ＯＩＭＩＪン酸緩衝液
（ｐＨ７，２＞にそれぞれヒト血清アルブミン５ｍｇ／
ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、　Ｄ−グルコ−７，、２００ｍ
ｇ／ｍｌ、トレハロース２００＋＋＋ｇ／ｍｌとなるよ
う添加した後、＋４℃で放置した。

放置後、２日目、７日目に一部を採取し、本発明物質の
活性を測定したところ表２のような結果が得られた。こ
の結果により、ヒト血清アルブミン、Ｄ−グルコース、
トレハロースに本発明物ｙを安定化させる作用があるこ
とがわかった。

（以下余白） 表２：＋４℃下保存の残存活性 （６）マウスＬ−細胞に対する細胞障害活性本発明物質
の活性の評価は、一般的なリンホトキシンの活性測定法
に従って行われる。即ち、マウス結合組織由来のＬ−９
２９細胞を０．４μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤと２
５０単位／ｍｌのペニシリンと１２５μｇ／）＋１のス
トレプトマイシンヲ含むイーグルミニマルエッセンシャ
ルメディウム培地に１４０Ｘ１０４１ａＴ胞／１となる
濃度で懸濁させ、このＬ　、−９，２９細胞懸濁後、０
．０５ｍ１および適当濃度に希釈した本発明物質試料各
０．０５ｍ１を９６穴マイクロプレート（コーニング社
製）の各穴に入れ、これを５％炭酸ガス含有空気中、３
７℃で１８時間培養する。培養後１．生存細胞をクリス
タルバイオレットで染色し、生存細胞数をタイターテン
クマルチスキャン（フローラボラトリーズ社製）に本り
比色定量する。活性はＬ−９２９細胞を５０％殺す力を
、１単位とし、これに試料の希釈倍数を乗じる。

（７）ヒト腫瘍由来株化細胞に対する細胞障害作用およ
びヒト正常ｍ織由来株化細胞に対する無害性　、　　　
。

上記（６）のマウスＬ−９２９細胞に対する細胞障害活
性の方法に準じ、ヒト腫瘍由来の株化細胞であルＨｅｐ
−２（喉頭癌由来：　ＡＴＣＣＣＣＬ−２３）　、Ｇ−
３６１（悪性黒色腫由来：　ＡＴＣＣＣＲＬ−１４２４
）、ＫＢ　（鼻咽腔癌由来：　ＡＴＣＣＣＣＬ−６２）
およびヒト正常組織由来の株化細胞であるＦＬ　（ヒト
羊膜由来：　ＡＴＣＣＣＣＬ−６２）細胞、ＨＥＬ（ヒ
）胎児肺細胞：　ＡＴＣＣＣＣＬ−１３７）を用いて本
発明物質の細胞障害活、性を調べた。

即ち、上記（６）に述べた培地に上記４種の細胞を１４
０　Ｘ１０４細胞／ｍｌとなる濃度で懸濁させ、この細
胞懸濁液０．０５　ｍｌと上記（６）の方法による単位
で１〜１００単位に希釈した本発明物質０．０５　ｍｌ
を９６穴マイクロプレートの各穴に入れ、５％炭酸ガス
含有空気中、３７°Ｃで１８時間培養し、生存細胞をク
リスタルバイオレットで染色する。タイターチックマル
チスキャンの比色定量により、細胞を５０％殺すのに必
要な本発明物質の単位数を求めた結果が表３である。

このように本発明物質は腫瘍由来の細胞に対しては２〜
９単位の非常に少ない量で強力な細胞障害作用を示した
のに対し、正常ｍ織由来の細胞に対しては、１００単位
添加しても全（無害であった。

（以下余白） 表３ 〔発明の効果〕 かくして得られた本発明物質は、新規細胞障害性物質で
ある。つまり本発明物質は、網内系細胞、リンパ球系細
胞もしくは線維芽細胞から取得されるリンホトキシンや
腫瘍壊死因子など、あるいはイサック（ｌ５ｓａｃｓ＋
　Ａ、、　Ｐｒｏｃ、　Ｒｏｙ、　Ｓｏｃ、　Ｓｅｒ。

Ｂ、、　１４７．２６８　（１９５７）　〕により報告
されたインターフェロンとは次の点で明確な区別がなさ
れ、明らかに異なる物質である。リンホトキシンは、そ
の分子量から７０．０００〜９０．０００のα−リンホ
トキシン、３５，０００〜５０　、０００のβ−リンホ
トキシン、ｔｏ、ｏｏｏ〜２０，０００のγ−リンホト
キシンの３種が存在することが知られている（ｃｏｈｅ
ｎら編「Ｂｉｏｌｏｇｙｏｆ　ｔｈｅ　Ｌｙｍｐｈｏｋ
ｉｎｅｓＪ　、Ａｃａｄｅｍｉｃ　Ｐｒｅｓｓ、　１９
７９年）が、β−リンホトキシンおよびγ−リンホトキ
シンはその分子量から明らかに本発明物質と異なる。

更にリンホトキシンは、ルーカスら（Ｌｕｃａｓ、　Ｚ
。

Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇＶ＋
　１０９．１２３３　（１９７２））が報告しているよ
うに、その細胞障害作用において選択性がなく、腫瘍細
胞および正常細胞を同様に障害する。しかし本発明物質
は、その細胞障害作用において腫瘍選択性であり、α−
リンホトキシンとも明らかに異なっている。また、アガ
ーワルら（Ａｇｇａｒｗａｌ、　Ｂ、　Ｂ、、　ｅｔ　
ａｌ、、　Ｊ、　ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔ
ｒｙ、　２５９．６８６　　（１９８４）　）は、リン
パ芽球細胞由来のリンホトキシンが、Ｌｅｎ　をローｌ
ｅｃｔｉｎ担体に吸着性であり、その分子量はゲル濾過
法により６４　、０００であると報告している。しかし
本発明’Ｊｂｎ　’ｆｌ　ｌ十Ｉ　ａ＊　＋　＋　１−
１　ｅｒｒ◆；７　量ｆｌ　Ｉｋ　ｌ−＃　Ｗ　Ｉ　　
プ４Ｌ動牟１井プある点で異なっている。

実施例１ ０．１％ヒト血清アルブミン加ＲＩＴＣ−５６−２無血
清培地を用いて、ヒト末梢リンパ球細胞を容量７０１規
模で、ステンレス製タンク（ＮＢＳ社製５ｅｅｄＣｕｌ
ｔｕｒｅ　Ｖｅｓｓｅｌ）にて浮遊した。細胞数を２０
０〜３００　Ｘ１０４細胞／ｌｌ１ｌに調整し、そこへ
インデューサーであるホークライード（Ｐｏｋｗｅｅｄ
　）マイトジェンを２μｇ／ｍｌの割合にて添加し、さ
らに３〜４日間培養した。遠心操作により細胞と培養上
清を分離した。

培養上清を分子量１万カフトのベリコンカセットシステ
ム（ミリボア社製）を用いて濃縮する。

濃縮液を透析用チューブ（三光純薬社製）を用い、５０
〜１００倍量の０．０２Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８
）で４℃の温度で一晩透析した。透析液をｐＨ８のＯ，
ＯＬＭ　Ｐ　Ｂ　Ｓで平衡化したＤＥＡＥ−セファロー
ス６Ｂを充填したカラム（径５　ｃｍ　Ｘ長さ２０ｃｍ
）に通し、本発明物質を吸着させた後、上記緩衝液に塩
化ナトリウムで０．０２５〜０．２５Ｍの連続的濃度勾
配をつけて溶離し、本発明物質の活性画分を回収した。

一方、本発明物質で予め免疫しておいたマウスＢＡＬＢ
−ｃの肺臓細胞とマウスミエローマ細胞をポリエチレン
グリコールにより融合させたハイブリドーマのうち、本
発明物質に対する抗体産生の高いクローンを選択した。

この融合細胞の培養液から杭木発明物質モノクローナル
抗体を回収した。このモノクローナル抗体をＣＮＢ　ｒ
活性化セファロース４Ｂ（ファルマシア社製）に固定し
た。

このモノクローナル抗体カラムを０．４Ｍ　ＮａＣＪ！
含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，０）で平衡化し、
これに前記の本発明物質を含有する溶出液を接触した。

０．４Ｍ　ＮａＣ１含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７
，０）でカラムを洗浄した後、吸着していた本発明物質
を３．５Ｍチオシアン酸カリウム＋０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム（ｐＨ８）で溶出させた。溶出液を除菌濾過した後
、凍結乾燥し比活性が少な（とも１．５Ｘ１０？ＬＵ／
＋１ｇの高度精製本発明物質を得た。

なお、この精製品は５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電
気泳動法により分子量１８，０００の１本の帯を示した
。

実施例２ ５％ヒト血清加ＲＰＭＩ　１６４０培地を用いて、ヒト
末梢リンパ球細胞を、容量６０１規模で、ガラス製タン
ク（コーニング社製）にて浮遊した。細胞数は４００〜
５００　Ｘ１０４細胞／ｍｌであった。そこへ、インデ
ューサーであるＰＨＡを１０Ｉ！ｇ／ｍｌの割合にて添
加し、４〜５日間培養した。遠心操作により細胞と培養
上清を分離した。

培養上清を分子量１万力７トのペリコンカセットシステ
ム（ミリボア社製）を用いて濃縮する。

濃縮液を透析用チューブ（三光純薬社製）を用い、５０
〜１００倍量の０．０２Ｍ　）リス塩酸緩衝液（ｐＨ８
）で４℃の温度で一晩透析した。透析液をｐＨ８の０．
０１Ｍ　Ｐ　Ｂ　Ｓで平衡化したＤＥＡＥ−セファロー
ス６Ｂを充填したカラム（径５　ａａ　Ｘ長さ２０１）
に通し、本発明物質を吸着させた後、上記緩衝液に塩化
ナトリウムで０．０２５〜０．２５Ｍの連続的濃度勾配
をつけて溶離ｔ、本発明物質の活性画分を回収した。得
られた本発明物質の活性画分を、ハイドロキシアパタイ
トを充填したカラム（径５　ｃｍ　Ｘ長さ５ｃｍ）に通
し、本発明物質を吸着させた後、リン酸緩衝液で０．０
１Ｍ〜０．４Ｍの連続的濃度勾配をつけて溶出させ、本
発明物質の活性画分を回収した。得られた活性画分をＹ
Ｍ−１０膜を付けたＴＣＰ−１０濃縮装置（アミコン社
製）を用い濃縮を行った。Ｔ　Ｓ　Ｋ　−３０００３Ｗ
Ｇ　（東洋曹達社製）にＷ１’ａ液を付し、高速液体ク
ロマトグラフィーを行い、本発明物質の活性画分を溶出
回収した。溶出液を除菌濾過した後、凍結乾燥し、比活
性が少なくとも１．２　Ｘ　１０７ＬＵ／ｍｇ蛋白の高
度精製本発明物質を得た。

【図面の簡単な説明】

第１図は、本発明物質のゲル濾過法による分子量測定図
を、第２図は、本発明物質のＳＯ３／ポリアクリルアミ
ドゲルを用いた電気泳動法による分子量測定図を示す。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト由来の末梢リンパ球細胞を、腫瘍細胞障害性
   物質誘導剤（マイトジェン）で刺激することによって産
   生される蛋白質であり、以下の性質を有する腫瘍細胞障
   害性物質。 （ａ）分子量：ゲル濾過分析により ８０，０００±５，０００ダルトン （ｂ）分子量：ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲルを
   用いる電気泳動法によ り１８，０００±１，５００ダルトン （ｃ）等電点：ｐＨ５．４±０．３ （ｄ）安定性：ｐＨ５．０以下で失活 （ｅ）コンカナバリンＡ、 ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、
   Ｌｅｎｔｉｌ−ｌｅｃｔｉｎとの結合性：非吸着（ｆ）
   生理活性：少なくともマウス結合組織由来Ｌ細胞に対し
   て細胞障害作用を 有する。 （ｇ）障害特異性：正常細胞には実質的に障害を与えず
   、腫瘍細胞に対して選 択的に障害を与える。
2. （２）ヒト由来の末梢リンパ球細胞を、腫瘍細胞障害性
   物質誘導剤で刺激することによって産生される以下の性
   質を有する腫瘍細胞障害性物質に糖および／またはアル
   ブミンから選ばれる安定剤を添加することを特徴とする
   安定化方法。 （ａ）分子量：ゲル濾過分析により ８０，０００±５，０００ダルトン （ｂ）分子量：ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲルを
   用いる電気泳動法によ り１８，０００±１，５００ダルトン （ｃ）等電点：ｐＨ５．４±０．３ （ｄ）安定性：ｐＨ５．０以下で失活 （ｅ）コンカナバリンＡ、 ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、
   Ｌｅｎｔｉｌ−ｌｅｃｔｉｎとの結合性：非吸着（ｆ）
   生理活性：少なくともマウス結合組織由来Ｌ細胞に対し
   て細胞障害作用を 有する。 （ｇ）障害特異性：正常細胞には実質的に障害を与えず
   、腫瘍細胞に対して選 択的に障害を与える。
3. （３）ヒト由来の末梢リンパ球細胞を、腫瘍細胞障害性
   物質誘導剤で刺激することによって産生される蛋白質で
   あり、以下の性質を有する腫瘍細胞障害性物質を含有す
   る医薬組成物。 （ａ）分子量：ゲル濾過分析により ８０，０００±５，０００ダルトン （ｂ）分子量：ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲルを
   用いる電気泳動法によ り１８，０００±１，５００ダルトン （ｃ）等電点：ｐＨ５．４±０．３ （ｄ）安定性：ｐＨ５．０以下で失活 （ｅ）コンカナバリンＡ、 ＰＨＡ（Ｐｈｙｔｏｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ）、
   Ｌｅｎｔｉｌ−ｌｅｃｔｉｎとの結合性：非吸着（ｆ）
   生理活性：少なくともマウス結合組織由来Ｌ細胞に対し
   て細胞障害作用を 有する。 （ｇ）障害特異性：正常細胞には実質的に障害を与えず
   、腫瘍細胞に対して選 択的に障害を与える。