JPS61103895A - ＨＢｓＡｇの精製方法 - Google Patents
ＨＢｓＡｇの精製方法Info
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- JPS61103895A JPS61103895A JP59224116A JP22411684A JPS61103895A JP S61103895 A JPS61103895 A JP S61103895A JP 59224116 A JP59224116 A JP 59224116A JP 22411684 A JP22411684 A JP 22411684A JP S61103895 A JPS61103895 A JP S61103895A
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- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
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- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
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- C12N2730/10011—Hepadnaviridae
- C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
- C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
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- Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
- Y10S530/808—Materials and products related to genetic engineering or hybrid or fused cell technology, e.g. hybridoma, monoclonal products
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
本発明は遺伝子操作により得られるＢ型肝炎抗原（以下
、ＨＢｓＡｇという。）の精製方法に関する。
、ＨＢｓＡｇという。）の精製方法に関する。
ＨＢｓＡｇはＢ型肝炎ワクチンの主成分である。
Ｂ型肝炎ワクチンは、ＨＢｓＡｇ陽性のキャリアー血液
からＨＢｓＡｇ粒子を分離精製し、ホルマリン処理など
の不活化操作を行った後＋ ＨＢｓＡｇの免疫原性を高
めるために、アジュノセントとしてアラム・ゲルを加え
たものとして開発、実用化された。
からＨＢｓＡｇ粒子を分離精製し、ホルマリン処理など
の不活化操作を行った後＋ ＨＢｓＡｇの免疫原性を高
めるために、アジュノセントとしてアラム・ゲルを加え
たものとして開発、実用化された。
こりよ５にして作られたＢ型肝炎ワクチンは感染発症の
予防だけでなく、感染源となるキャリアーの発生阻止に
も有効であることから、Ｂ型肝炎の絶滅も可能である。
予防だけでなく、感染源となるキャリアーの発生阻止に
も有効であることから、Ｂ型肝炎の絶滅も可能である。
しかし、Ｂ型肝炎ワクチン、の生産についてはいくつか
の問題点がある。第１は、ＨＢｓＡｇの原材料をキャリ
アーの血液に依存していることから、ワクチンの供給が
制約されるということである。第２は、キャリアーの血
液中には少量ながら感染性のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ
’）が含まれることから、唯一の感染しえる動物である
チンＡンジーを用いての安全試験が必要になるというこ
とである。
の問題点がある。第１は、ＨＢｓＡｇの原材料をキャリ
アーの血液に依存していることから、ワクチンの供給が
制約されるということである。第２は、キャリアーの血
液中には少量ながら感染性のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ
’）が含まれることから、唯一の感染しえる動物である
チンＡンジーを用いての安全試験が必要になるというこ
とである。
このようなワクチンの生産上の難点を克服する方法とし
て、遺伝子操作の技術が導入された。
て、遺伝子操作の技術が導入された。
組換えＤＮＡ技術は異種のＤＮＡをファージ又はプラス
ミドＤ Ｎ Ａにつなぎ、大腸菌で増やすという方法で
開始された。そして、ＨＢＶ−ＤＮＡの全塩基配列の決
定、ワクチンとして使われるべきＨＢｓＡｇ遺伝子の同
定、大腸菌での形質発現を経て酵母でのＨＢｓＡｇの産
生へと発展していった。
ミドＤ Ｎ Ａにつなぎ、大腸菌で増やすという方法で
開始された。そして、ＨＢＶ−ＤＮＡの全塩基配列の決
定、ワクチンとして使われるべきＨＢｓＡｇ遺伝子の同
定、大腸菌での形質発現を経て酵母でのＨＢｓＡｇの産
生へと発展していった。
たとえば、酵母由来ＨＢｓＡｇ （ｙ−ＨＢｓＡｇ ）
は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると
、分子量２３，０００〜２５．１１００のポリペプチド
のみからなり、これはヒト由来ＨＢ ｓＡｇ （ｈ −
ＨＢ ｓＡｇ ）のグリコジル化されていないポリペプ
チドと一致するものである。また、ｈ−ＨＢｓＡｇと同
じ２２ｎｍの直径をもち、塩化セシウム溶液中での浮上
密度は、ｈ−ＨＢｓＡｇと同じである。
は、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によると
、分子量２３，０００〜２５．１１００のポリペプチド
のみからなり、これはヒト由来ＨＢ ｓＡｇ （ｈ −
ＨＢ ｓＡｇ ）のグリコジル化されていないポリペプ
チドと一致するものである。また、ｈ−ＨＢｓＡｇと同
じ２２ｎｍの直径をもち、塩化セシウム溶液中での浮上
密度は、ｈ−ＨＢｓＡｇと同じである。
前述したＢ型肝炎ワクチンの生産上の難点を克服するた
めに、遺伝子操作の技術によりＨＢｓＡｇを大量に得、
それを高度精製することによりワクチンとする方法が確
豆されつつある。
めに、遺伝子操作の技術によりＨＢｓＡｇを大量に得、
それを高度精製することによりワクチンとする方法が確
豆されつつある。
ところが、遺伝子操作を経た菌よりＨＢｓＡｇを精製し
てＢ型肝炎ワクチンを製造する際には、原料中に蛋白質
を主とする菌体成分が夾雑してくる。
てＢ型肝炎ワクチンを製造する際には、原料中に蛋白質
を主とする菌体成分が夾雑してくる。
これらの夾雑物質は、従来の血漿由来ＨＢｓＡｇの鋭意
研究を重ねた結果、遺伝子操作を経た菌体内または菌体
外に産生されたＨＢｓＡｇを効率よく精製する方法を見
出し、本発明を完成した。
研究を重ねた結果、遺伝子操作を経た菌体内または菌体
外に産生されたＨＢｓＡｇを効率よく精製する方法を見
出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は、遺伝子操作により得られるＨＢｓ
Ａｇを比較的高濃度の無機塩存在下で担体に特異的に吸
着させることによりＨＢｓＡｇを効率よく精製する方法
である。
Ａｇを比較的高濃度の無機塩存在下で担体に特異的に吸
着させることによりＨＢｓＡｇを効率よく精製する方法
である。
〔問題点を解決するための手段及び作用〕本発明におい
て用いられるＨＢｓＡｇは遺伝子操作に由来して調製さ
れたものであれば、特に限定されない。従って遺伝子操
作を経てＨＢｓＡｇを発現する菌体（例えば、大腸菌、
酵母、枯草菌など）を、凍結融解法、ガラスピーズ法、
高圧法、超音波処理法、酵素処理法等の公知の方法で処
理して得られるＨＢｓＡｇ抽出画分、あるいはこの抽出
画分を各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフイニ
テイクロマトグラフイー、ゲルｆ過、密度勾配遠心分離
法、透析等の公知の方法で部分精製した両分などを用い
ることができる（特開昭５８−１０４８８７号、同５９
−４８０８２号、特願昭５９−１１５１８９号等参照）
。
て用いられるＨＢｓＡｇは遺伝子操作に由来して調製さ
れたものであれば、特に限定されない。従って遺伝子操
作を経てＨＢｓＡｇを発現する菌体（例えば、大腸菌、
酵母、枯草菌など）を、凍結融解法、ガラスピーズ法、
高圧法、超音波処理法、酵素処理法等の公知の方法で処
理して得られるＨＢｓＡｇ抽出画分、あるいはこの抽出
画分を各種分画法、吸着クロマトグラフィー、アフイニ
テイクロマトグラフイー、ゲルｆ過、密度勾配遠心分離
法、透析等の公知の方法で部分精製した両分などを用い
ることができる（特開昭５８−１０４８８７号、同５９
−４８０８２号、特願昭５９−１１５１８９号等参照）
。
本発明において用いられる無機塩としては、陰イオン側
から見て、硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩などが、また陽イ
オン側から見て、アンモニウム塩。
から見て、硫酸塩、リン酸塩、塩酸塩などが、また陽イ
オン側から見て、アンモニウム塩。
ナトリウム塩、カリウム塩などが例示されるが、好適に
は硫酸アンモニウム、、硫酸ナトリウム、塩化す） Ｉ
Ｊウム、あるいはリン酸塩の一種（例えばリン酸１ナト
リウム、リン酸１カリウム、リン酸２ナトリウムなど）
が用いられる。
は硫酸アンモニウム、、硫酸ナトリウム、塩化す） Ｉ
Ｊウム、あるいはリン酸塩の一種（例えばリン酸１ナト
リウム、リン酸１カリウム、リン酸２ナトリウムなど）
が用いられる。
添加濃度は５〜２５Ｗ／Ｖ％が好適である。
５Ｗ／’Ｖ％以下ではＨＢｓＡｇが担体に吸着されず、
また２ ５ Ｗ／Ｖ％以りではＨＢｓＡｇとともに夾雑
蛋白質も吸着されてしまうのでいずれも不適当である。
また２ ５ Ｗ／Ｖ％以りではＨＢｓＡｇとともに夾雑
蛋白質も吸着されてしまうのでいずれも不適当である。
本発明において用いられる担体としては疎水性基を有す
る固定化担体が挙げられる。固定化担体としてはアミノ
酸コポリマー、セルロース、アガロース、デキストラン
、２リアクリルアミド等が用いられ、疎水性基としては
フェニルアラニン、炭素数２〜８のアルキル基、フェニ
ル基が用イラれる。その固定化方法は公知の方法を用い
ればよい。−例を挙げれば、臭化シアンで活性化したセ
ファロース４Ｂとフェニルアラニン溶液を混合シ、室温
で１６時間反応させることにより固定化フェニルアラニ
ンを得ることができる。
る固定化担体が挙げられる。固定化担体としてはアミノ
酸コポリマー、セルロース、アガロース、デキストラン
、２リアクリルアミド等が用いられ、疎水性基としては
フェニルアラニン、炭素数２〜８のアルキル基、フェニ
ル基が用イラれる。その固定化方法は公知の方法を用い
ればよい。−例を挙げれば、臭化シアンで活性化したセ
ファロース４Ｂとフェニルアラニン溶液を混合シ、室温
で１６時間反応させることにより固定化フェニルアラニ
ンを得ることができる。
このようにして得られた担体を用いることにより、収率
良（、しかも高純度のＨＢｓＡｇを得ることができる。
良（、しかも高純度のＨＢｓＡｇを得ることができる。
本発明に係るＨＢｓＡｇの吸着クロマトグラフィーは以
下の通りである。なお本発明においてクロマトグラフィ
ーはカラム法、パッチ法のどちらを用いても良い。
下の通りである。なお本発明においてクロマトグラフィ
ーはカラム法、パッチ法のどちらを用いても良い。
すなわち、粗ＨＢｓＡｇ液に無機塩を５〜２５ ｗ／ｖ
％になるように添加調整後、同濃度の無機塩溶液で平衡
化した担体と接触、吸着させる。その後、２〜５倍量の
上記無機塩溶液で洗って、未吸着の夾雑蛋白質を洗い流
した後、５〜２０ ｖ／ｖ％（好ましくは１０ ｖ／ｖ
％）エタノールを含むｐＨ６〜８の緩衝液（例えばリン
酸緩衝液）で吸着されているＨＢｓＡｇを溶出する。溶
出液は担体１−当たり１〜２−程度用いられろ。
％になるように添加調整後、同濃度の無機塩溶液で平衡
化した担体と接触、吸着させる。その後、２〜５倍量の
上記無機塩溶液で洗って、未吸着の夾雑蛋白質を洗い流
した後、５〜２０ ｖ／ｖ％（好ましくは１０ ｖ／ｖ
％）エタノールを含むｐＨ６〜８の緩衝液（例えばリン
酸緩衝液）で吸着されているＨＢｓＡｇを溶出する。溶
出液は担体１−当たり１〜２−程度用いられろ。
このようにして得られる溶出画分は、公知の精製方法を
用いることにより、さらに高度に精製される。また、公
知の製剤化技術を施すことにより旧ワクチンとして臨床
に供することができる。
用いることにより、さらに高度に精製される。また、公
知の製剤化技術を施すことにより旧ワクチンとして臨床
に供することができる。
本方法で精製されたＨＢｓＡｇは、ＳＤＳ（Ｓｏｄｉｕ
ｍＤｏｄｅｃｙｌ ５ｕｌｆａｔｅ）存在下でポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行う際に分子量２５．０００
の部分に単一のバンドを示し、発熱性物質の混入もなく
、また動物に免疫すると強い…ｈ抗体を産生せしめる作
用を有している。
ｍＤｏｄｅｃｙｌ ５ｕｌｆａｔｅ）存在下でポリアク
リルアミドゲル電気泳動を行う際に分子量２５．０００
の部分に単一のバンドを示し、発熱性物質の混入もなく
、また動物に免疫すると強い…ｈ抗体を産生せしめる作
用を有している。
本発明により得られる）（ＢｓＡｇは夾雑物質の極めて
少ない高品質のＨＢｓＡｇである。従来の血漿由来ＨＢ
ｓＡｇの精製方法では充分に取り除くことができなかっ
た菌体由来の夾雑蛋白を、本発明の精製方法により取り
除くことができる。従って、遺伝子操作を経て得られた
ＨＢｓＡｇを用いても、従来品と同等の安全性に優れた
Ｉ（Ｂワクチンを製造することが可能である。
少ない高品質のＨＢｓＡｇである。従来の血漿由来ＨＢ
ｓＡｇの精製方法では充分に取り除くことができなかっ
た菌体由来の夾雑蛋白を、本発明の精製方法により取り
除くことができる。従って、遺伝子操作を経て得られた
ＨＢｓＡｇを用いても、従来品と同等の安全性に優れた
Ｉ（Ｂワクチンを製造することが可能である。
実施例 Ｉ
ＨＢｓ抗原産生酵母１に？を０．１ Ｍ １７ノ酸緩衝
液（ｐＨ１０，０）ＩＡ！に懸濁し、ｐＨ１０に調整し
たのち、超音波処理することによりＨＢｓＡｇを抽出し
た。
液（ｐＨ１０，０）ＩＡ！に懸濁し、ｐＨ１０に調整し
たのち、超音波処理することによりＨＢｓＡｇを抽出し
た。
抽出中に再度ｐＨを１０に調整した。超音波処理後１０
．０００．９で２０分間遠心分離することにより沈殿を
除去し、抽出液を得た。
．０００．９で２０分間遠心分離することにより沈殿を
除去し、抽出液を得た。
このようにして得た抽出液のｐＨを７．２に調整したの
ち、抽出ｇＩＪ当り硫安を７０．９添加し、別途調Ｈサ
レｆ、：：、フェニルアラニン−セファロ−２４Ｂのカ
ラムへ注入しＨＢｓ抗原を吸着させた。上記と同じ濃度
の硫安液で十分に洗浄し、不純物質を除去した後、１０
ｖ／ｖ％エタノール含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）を用いてＨＢｓ抗原を溶出した。
ｆ溶出液中のＨＢｓ抗原の精製度は抽出液の２８０倍
ＣＲＰＨＡ法によりＨＢｓＡｇ比活性（ＲＰＨＡｔｉｔ
ｅｒ／Ａ２８０）を測定〕で回収率は７０％であった。
ち、抽出ｇＩＪ当り硫安を７０．９添加し、別途調Ｈサ
レｆ、：：、フェニルアラニン−セファロ−２４Ｂのカ
ラムへ注入しＨＢｓ抗原を吸着させた。上記と同じ濃度
の硫安液で十分に洗浄し、不純物質を除去した後、１０
ｖ／ｖ％エタノール含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ
７，２）を用いてＨＢｓ抗原を溶出した。
ｆ溶出液中のＨＢｓ抗原の精製度は抽出液の２８０倍
ＣＲＰＨＡ法によりＨＢｓＡｇ比活性（ＲＰＨＡｔｉｔ
ｅｒ／Ａ２８０）を測定〕で回収率は７０％であった。
尚フェニルアラニン−セファローズ４Ｂの調製法は臭化
シアンで活性化したセファローズ４ＢＫフエニルアラニ
ン溶液を加え、室温で１６時間反応させることにより行
った。
シアンで活性化したセファローズ４ＢＫフエニルアラニ
ン溶液を加え、室温で１６時間反応させることにより行
った。
同様にして、抽出原液に各種無機塩を添加した後、同濃
度の無機塩溶液で平衡化したフェニルアラニン−セファ
ロース４Ｂカラムに注入し、充分に洗浄後１０ ｖ／ｖ
％エタノ〜ル含有０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
，２）で溶出した。この溶出画分のＨＢｓＡｇ比活性（
ＲＰＨＡ Ｔｉ ｔｅｒ／Ａ ２８０ ）を測定した。
度の無機塩溶液で平衡化したフェニルアラニン−セファ
ロース４Ｂカラムに注入し、充分に洗浄後１０ ｖ／ｖ
％エタノ〜ル含有０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液（ｐＨ７
，２）で溶出した。この溶出画分のＨＢｓＡｇ比活性（
ＲＰＨＡ Ｔｉ ｔｅｒ／Ａ ２８０ ）を測定した。
結果を第１表に示す。
斧（）内は溶出液の回収率
実施例 ２
゛ 実施例１と同様にして得た抽出液にエアロジル′を
２Ｗ／Ｙ％添加し、ＨＢｓ抗原を吸着させ、更に生理食
塩水で洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ９，
５）でＨＢｓ抗原を溶出させた。
２Ｗ／Ｙ％添加し、ＨＢｓ抗原を吸着させ、更に生理食
塩水で洗浄した後、０．５Ｍ塩化ナトリウム（ｐＨ９，
５）でＨＢｓ抗原を溶出させた。
本溶出工程でのＨＢｓ抗原の回収率は１００％であった
。この溶出液に硫安を６Ｃｌ添加し、実施例ト同様にフ
ェニルアラニン−セファローズ４ＢにてＨＢｓ抗原を精
製した。
。この溶出液に硫安を６Ｃｌ添加し、実施例ト同様にフ
ェニルアラニン−セファローズ４ＢにてＨＢｓ抗原を精
製した。
溶出液中のＨＢｓ抗原の精製度はエアロゾＩＶ 溶出
液の５２倍で１回収率は８０％であった。
液の５２倍で１回収率は８０％であった。
実施例 ６
ＨＢｓＡｇ産生酵母より得られる抽出原液に硫酸アルミ
ニウム（最終濃度６．８ｗ／ｖ）を添加した後、同濃度
の無機塩溶液で平衡化した各種疎水性基（リガンド）−
セファロース４Ｂ力ラムニ注入し、充分に洗浄後Ｉ Ｑ
ｖ／ｖ％エタノール含有０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）で溶出した。この溶出画分のＨＢｓＡｇ
比活性（ＲＰＩ（Ａ Ｔｉ ｔｅｒ／Ａ２８０ ）を測
定した。
ニウム（最終濃度６．８ｗ／ｖ）を添加した後、同濃度
の無機塩溶液で平衡化した各種疎水性基（リガンド）−
セファロース４Ｂ力ラムニ注入し、充分に洗浄後Ｉ Ｑ
ｖ／ｖ％エタノール含有０．１ Ｍ ＩＪン酸緩衝液
（ｐＨ８，０）で溶出した。この溶出画分のＨＢｓＡｇ
比活性（ＲＰＩ（Ａ Ｔｉ ｔｅｒ／Ａ２８０ ）を測
定した。
結果を第２表に示す。
第２表
（ほか３名）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 １）遺伝子操作により得られるＨＢｓＡｇを５〜２５ｗ
／ｖ％の無機塩存在下で担体に特異的に吸着させること
を特徴とするＨＢｓＡｇの精製方法。 ２）無機塩が、硫酸アンモニウム、硫酸ナトリウム、塩
化ナトリウム、あるいはリン酸塩の一種を少なくとも含
む特許請求の範囲第１項記載のＨＢｓＡｇの精製方法。 ３）担体が疎水性基を有する固定化担体である特許請求
の範囲第１項または第２項記載のＨＢｓＡｇの精製方法
。
Priority Applications (7)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59224116A JPS61103895A (ja) | 1984-10-26 | 1984-10-26 | ＨＢｓＡｇの精製方法 |
| ES548174A ES8605295A1 (es) | 1984-10-26 | 1985-10-24 | Procedimiento de depuracion de antigeno del tipo de la hepa-titis |
| KR1019850007837A KR890001069B1 (ko) | 1984-10-26 | 1985-10-24 | B형 간염 항원의 정제방법 |
| CA000493846A CA1256042A (en) | 1984-10-26 | 1985-10-25 | Process for the purification of hbsag |
| EP85113597A EP0179485B1 (en) | 1984-10-26 | 1985-10-25 | A process for the purification of hbsag |
| DE8585113597T DE3579100D1 (de) | 1984-10-26 | 1985-10-25 | Verfahren zur reinigung von hbsag. |
| US06/792,081 US4694074A (en) | 1984-10-26 | 1985-10-28 | Process for the purification of HBsAg |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59224116A JPS61103895A (ja) | 1984-10-26 | 1984-10-26 | ＨＢｓＡｇの精製方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61103895A true JPS61103895A (ja) | 1986-05-22 |
| JPH0548240B2 JPH0548240B2 (ja) | 1993-07-20 |
Family
ID=16808783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59224116A Granted JPS61103895A (ja) | 1984-10-26 | 1984-10-26 | ＨＢｓＡｇの精製方法 |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4694074A (ja) |
| EP (1) | EP0179485B1 (ja) |
| JP (1) | JPS61103895A (ja) |
| KR (1) | KR890001069B1 (ja) |
| CA (1) | CA1256042A (ja) |
| DE (1) | DE3579100D1 (ja) |
| ES (1) | ES8605295A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| SE8402861L (sv) * | 1984-05-28 | 1985-11-29 | Stefan Svenson | Rening av biologiskt material |
| US4883865A (en) * | 1987-09-30 | 1989-11-28 | Merck & Co. Inc. | Recovery of pres2+s antigen |
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| EP2265129B1 (en) | 2008-04-08 | 2015-10-28 | Bio-Rad Laboratories, Inc. | Chromatography purification of antibodies |
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