JPS6136228A - 肝炎表面抗原の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔発明の背景」 この発明は、組み換え体細胞によって生産されるタンパ
ク質の精製に関する。更に詳しくは、この発明は肝炎表
面抗原（ＨＢｓＡｇ）タンパク質を生産する組み換え体
細胞、特に哺乳類動物の組み換え体細胞の培養から、効
果的にこのタンパク質を精製する方法を提供するもので
ある。

ウィルス性Ｂ型肝炎は、Ｂ型肝炎ウィルス保有者によっ
て、血液および体の分泌物を介しで伝播される。その血
清からＨＢｓＡｇを精製し、ワクチンが製造される〔パ
ーセフＬ／　（Ｐｕｒｃｅｌ　Ｉ　、Ｒ，Ｈｏ）および
ゲリ７　（Ｇｅｒｉｎ、　Ｌ、Ｌ、）、［ハイラル、ヘ
パテイテイス（Ｖｉｒａｌ　Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　）　
Ｊ、ザ、フランクリン、インステイテユート（ＴｈｅＦ
ｒａｎｋｌｉｎ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　）刊（１９７８
年）、４９１頁、およびヒ／ｌ／７７　（Ｈｉｌ　ｌｅ
ｍａｎ、　Ｍ、Ｒ，）ら、同書、５２５頁〕。この刊行
物にはＨＢ　ｓ　Ａｇの分離方法が記載されており、そ
れは、Ｂ型肝炎ウィルス保有者から得た血漿を脱線縁素
化し、血清中のＨＢｓＡｇを（１）硫酸アンモニウム沈
澱法によって濃縮し、（２）臭化ナトリウムをグラジェ
ント（勾配）媒質として使用する遠心ｌこかけで、等密
度ゾーン分離を行ない、（３）シよ糖密度勾配を用いる
レートゾーン沈降処理にかけ、（４）種々の手順を経由
して不活性化し、（５）ゲル濾過処理をして、（６）ワ
クチンを製造する方法である。ＨＢｓＡｇ源として血清
を使用することは、Ｂ型肝炎ウィルスが存在するだけで
なく、未確認の偶発性作用物質が存在しているという理
由で危険である。また、ＨＢｓＡｇの精製に用いる該技
法は多く時間を要し、しかも煩雑である。

ワクチンを目的とする肝炎表面抗原の製剤化は、水酸化
アルミニウム（前記、「バイラル、ヘパティテイス」）
およびリーリンクーブロンガーズ（Ｒｅｅｒｉｎｋ−Ｂ
ｒｏｎｇｅｒｓ、　Ｅ、　Ｅ、）らの記載〔テヘロツプ
メンツ、イン、バイオロジカル、スタンダリゼー’ｉ　
ヨ７　（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｌｏ
ｇｉｃａｌＳｔａｎｄａｒｉｚａｔｉｏｎ　）　　、カ
ーガー編（Ｓ、　Ｋａｒｇｅｒ　）、バーゼル、スイス
（Ｂａ５ｅｌ　、　５ｗ１ｔｚｅｒｌａｎｄ　）、（１
９８３年）、５４巻、１９７頁〕のようにリン酸アルミ
ニウムのようなアルミニウム・アジュバントと結合する
ことにより達成された。

組み換え体細胞内で生産されたＨＢｓＡｇのようなタン
パク質の精製は、血清のような１天然”材料源からＨＢ
ｓＡｇを精製する場合に利用される技法とは、２つの材
料の組成がいちじるしく異なるため、異なった技法を必
要とする。したがってＨＢｓＡｇを天然材料源から精製
するのに有用な技法が、そのままＨＢｓＡｇを組み撲え
体細胞から精製するのに有用であると予断することはで
きない。また、例えばヒト用ワクチンとして使用するよ
うに、最終生成物が極端に純粋であることを要する場合
には、その予測性はますます低下する。この発明は、ク
ロマトグラフィに基盤をおき、組み換え体細胞培養から
ＨＢｓＡｇを効果的に分離し得る方法を提供するもので
ある。独特な一連の分別化技法によって、ヒト用ワクチ
ンに使用し得る高純度のＨＢｓＡｇの生産を達成する。

この生成物中には、活性偶発物質は全く含まれていない
。

〔発明のａ要〕

本発明によれば、組み替え体細胞培養で生産されたＨＢ
ｓＡにの精製方法により、ワクチンに組み入れるのに充
分な純度を有する生成物が得られる。まず、ＨＢｓＡｇ
を含有している細胞培地から、細胞残層を分離する。つ
いで、透明にしたＨＢｓＡｇを含有している培養液を、
好ましくは限外諷過し、つづいて、好ましくは硫酸アン
モニウムによる沈澱で、第１段階で汚染タンパク質を除
去し、第２段階でＨＢｓＡｇを沈澱させる２段階分画法
で処理し、培養液を濃縮する。沈澱した生成物を再溶解
し、透析番こよって塩を除去する。

血清を添加していない細胞培養から得られるＨＢｓＡｇ
にも適用し得る１態様として、透析したＨＢｓＡｇ溶液
をアニオン交換床に通し、ＨＢｓＡｇ含有画分を収得す
る。ついで、この画分を、好ましくはゲル浸透クロマト
グラフィ一番こよって、分子量により分別しで、精製さ
れたＨＢｓＡｇ生成物を製造する。

イオン交換分別化に引き続き、サイズ分別化を行なう別
法では、硫酸アンモニウム沈澱によって得た画分を免疫
親和性吸着法によって精製する。

この別法は、血清を含有している培地からＨＢｓＡｇを
分離するのにも適用可能である。この方法のさらにもう
１つの別法は、沈殿化および透析手順による分別化を要
しない幾つかの例に有用である。

この発明は、前記諸方法のいずれかにより精製されたＨ
ＢｓＡｇに関し、またこのタンパク質から製造されるワ
クチン類、特に先行技術のワクチンより抗原性がはるか
にまさるワクチン類に関する。

〔発明の開示〕

Ａ、定義 この明細書に用いる“肝炎表面抗原”または”ＨＢｓＡ
ｇ”は、Ｂ型肝炎ウィルス・ゲノムによって暗号化され
ている表面抗原アミノ酸配列をもったあらゆる形のタン
パク質を意味する。そのような変異体は全てこの定義に
包含される。またよく知られでいるように、タンパク質
の配列はグリコジル化、アセチル化、またはその他の化
学的誘導によってしばしば修飾されることがあり、脂質
と結合することもできる。最後に、これらのタンパク質
は、２量体、３量体、あるいはさらに大きい集合体とも
なり、またそれらを前記のように変化させることもある
各種の凝集状態で存在することも可能である。これらの
凝集体には脂質も含むことができる。これらは、ＨＢｓ
Ａｇの定義の中にすべて包含される。

７　ツタ−（Ｒｕｔｔｅｒ、　Ｗ、　Ｊ、　）らは、Ｂ
型肝炎がＢ型肝炎表面抗原を暗号化しており、それは２
２．０００　　ダルトンの分子量を有する２２６個の長
さのアミノ酸から成っていると述べている〔ヨーロッパ
公開特許出願第００７２３１８号（１９８３年２月１６
日公告）〕。Ｂ型肝炎ウィルスの慢性保有者の血清から
分離されたＢ型肝炎表面抗原は、直径２２　ｎｍの球状
粒子であり、その分子量は２〜４００万ダルトンである
。この粒子は脂質およびＢ型肝炎表面抗原タンパク質の
２量体から成っていると考えられている。然し、この２
２ｎｍ粒子の精密な構造はまだ充分に決定されていない
。哺乳類動物の組み換え体細胞の培養から分離されたＨ
ＢｓＡｇは２２ｎｍ粒子の形をしており、標準的な実験
室試験による判定では、血清から誘導されたものと区別
がつかなかった。組み換え体酵母から分離された表面抗
原も、２２ｎｍ粒子の形をしているようである〔バレン
ツエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ、　Ｐ、　）　　ら、ネ
ーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２９８巻、３４７頁（１９
８２年）〕。

この発明においで採用した諸技法は、本来、それが有し
ている標準的な意味で使用されでいる。

即ち、限外濾過は、分子量の大きい側の物質を通さない
十分に径の小さい小孔を有する分子ふるいまたはフィル
ターを備えることによって、低分子量の物質、例えば水
、塩類、若干のタンパク質等を高分子量側の物質と分離
し得る方法に属する。アニオン交換クロマトグラフィー
は、アニオン性物質を保持体上に吸着させ、ついで溶媒
条件を変えることによって溶出し得る技法に属する。ゲ
ル浸透クロマトグラフィーは、混在している分子をその
大きさ番こしたがつで分離する分子ふるい操作に属する
。これらの独立した各技法は、運用し得る諸条件の範囲
で、いずれも技術的によく知られているものである。

Ｂ、一般的方法 ＨＢｓＡｇ　は、種々の微生物および組織培養細胞を組
み換え体宿ｔとして使用し、生産されでいる。細菌系〔
ヨーロッパ公開特許公告第００２０２５１号（１９８０
年１２月１０日公告）〕、酵母系〔ヨーロッパ公開特許
公告第０７３６５７号（１９８３年３月９日公告）およ
び同第００７２３１８号〕および細胞培養系〔ヨーロッ
パ公開特許公告第００７３６５６号（１９８３年３月９
日公告）〕が使用されている。このよう番こして作成さ
れたＨＢｓＡｇは免疫原性を示す（前記、ヨーロッパ公
開特許公告第００７３６５６号、参照）。

タンパク質を培地中に分泌する細胞源を使用することは
、そのこと番こより一層純粋な出発材料から開始し得る
ので、特ｔと好ましい。然し所望のタンパク質が分泌さ
れなければ、音波処理、ホモジナイズ化または浸透圧シ
ョック法などのような標準的手段を使用して細胞の溶解
を行なうと、ＨＢｓＡｇを効果的に培地へ遊離すること
ができ、前記精製方法を適用することができる。この発
明の１態様においては、細胞培養培地として、血清の代
わりに、特殊ビタミン、微量元素およびその他の栄養素
から成るある特定の培地を使用する。もう１つの態様で
は、培地中に血清が使用される。

１１．２　　方法の説明 この発明において、実質的に血清を含んでいない培養物
からＨＢｓＡｇを精製する場合に適用し得る１方法を、
第１図に示した工程系統図にしたがつで説明する。変法
を用いれば出発培養物に血清を含んでいても適用できる
。

まず、血清を添加していない細胞培養培地からの精製に
ついて説明を行なう。

第１手順では、濾過または遠心のような通常の固相一液
相分離法によって、宿主細胞残屑、好ましくは非破砕型
の宿主細胞を、上清から分離する。

第２手順では、下記の第３〜４手順に記載する効果的な
２段階分別沈ｆ殿が充分可能となる程度まで可溶性画分
を濃縮する。このためには、この段階でＨＢｓＡｇを少
なくとも２５〜３０倍、さらに５０倍またはそれ以上に
まで濃縮することが望ましい。この目的は、限外濾過に
よって非常によく達成される。セルロースエステルまた
はポリスルホンから作成された市販の膜、例えばアミコ
ン（Ａｍ１ｃｏｎ　）　Ｙ　Ｍ　−３０およびＰＭ−１
Ｑ、およびトルーオリバー（Ｄｏｒｒ　−０３１ｖｅｒ
　）　Ｃ−３０が使用できる。この膜で好適に遮断でき
る分子量は、１００．０００より小さい。好適に加えら
れる圧は、２０〜５Ｑｐｓｉ　　（ボンド）程度である
。ロミコ７　（Ｒｏｍｉｃｏｎ　）　　Ｐ　Ｍ　−１０
０およびＰ’Ｍ−１０のような中空ファイバー束型の限
外濾過膜の使用は、血清加細胞培養培地の場合に効果的
である。

次いで、第２手順の限外濾過によって得られた保持液を
第１図の第３、第４および第５手順に示した２段階法に
よって分別する。前記の限外ｒ過の項で説明した濃縮能
の程度が、好収量を得るための重要な因子となる。

第３手順において、組織培養きりわけＣＨＯ＠胞から生
産されたＨＢｓＡｇには、特に分別沈澱の第１段階が効
果的である。好適な第１段階、即ち予備沈澱段階は、第
２手順で得られた濃縮物にタンパク沈澱剤を加えること
によって行なわれ、不純（汚染）タンパク質の第１画分
を沈澱させる。

これは、遠心またはρ過などの好適な清澄化技法により
、残りの溶液から除去する。ＨＢｓＡｇの沈澱を生じる
ことなく、混入している所望量の不純タンパク質だけを
充分沈澱し得る量の固型硫酸アンモニウムを加えること
によって、第１段階の分別化が特に有効に達成される。

この目的のために、硫酸アンモニウムの濃度が２０〜３
０％、好ましくは２５％飽和となるまで硫酸アンモニウ
ムの充分量を、濃縮培養液に、例えば４〜８℃で添加す
る。

第４手順は、沈澱または沈降に続いて濾過を行なうこと
により、好適Ｏこ実施される清澄化工程であって、これ
より不純タンパク質の沈澱が除去される。

第５手順は、清澄化によって得られた上清画分の硫酸ア
ンモニウム塩濃度を、すべてのＨＢｓＡｇが実質的に溶
液から沈澱する有効沿となるまで増量することにより実
施される分別沈澱の第２段階である。これを成就する好
ましい技法は、硫酸アンモニウムを追加し、約６０％飽
和になるまで硫酸アンモニウム濃度を上げることである
。生成物が沈澱し、これを遠心にかけて採取する。

前記の目的を成就し得るものであれば、他のタンパク沈
澱剤を硫酸アンモニウムの代わり番こ使用できる。この
ような沈澱剤として、ポリエチレングリコール、特に、
ＰＥＧ３０００　　が第３段階では２〜４％（Ｗ／Ｖ）
、第４手順では８〜１０％（Ｗ／Ｖ）の濃度で使用でき
ることが判明した。

第６手順では、沈澱を再溶解し、透析して、アニオン交
換クロマトグラフィーによる第７段階の分別化番ご用い
る調製液の塩除去を行なう。透析は、そのようなアニオ
ン交換クロマトグラフィーを妨害する塩を除去するため
番こ実施する。この段階は好ましくはｐＩ−１約６〜８
の希緩衝液に沈澱を溶解し、主として硫酸アンモニウム
を除去するため、低温で、希緩衝液に対し透析すること
により達成される。好適な緩衝液は、１〜５０ｍＭトリ
ス−ＣＩまたはリン酸ナトリウムであって、好ましくは
約１０ｍＭ１スーＣ／である。その他、塩除去の方法と
しては、ゲル洲過または透析濾過のような方法を用いる
。

第７手順では、さらに溶液をアニオン交換樹脂を使用す
る分別化で処理する。この目的に好適な樹脂は、Ｄ　Ｅ
　−セフ　７　ｏ−ス［ＤＥ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ。

ファルマシア社（Ｐｈａｑｍａｃｉａ　Ｉｎｃ、　）　
〕、〕ＤＥ−トリサクリ／Ｌ／　ＤＥ−Ｔｒｉｓａｃｒ
ｙｌ、ＬＫＢ　　−プロダクｆｉ　−（ＬＫＢ　−Ｐ　
ｒｏｄｕｃｔｏｒ　）　）　　およびＤＥ−５２セルロ
ース〔ワットマン社（Ｗｈａｔｍａｎ　Ｉｎｃ。

）〕が挙げられる。好ましい樹脂はＤＥ−５２セルロー
ス（ワットマン社）である。分離または分別化を行なう
条件は、個々の樹脂に適合するように選ぶ。一般に、樹
脂はカラムに充填して使用する。１０ｍＭ）リス−ＣＩ
をｐＨ７，５で使用する条件が、特に効果的である。第
６手順の生成物を、充分な樹脂を充填したカラムに通し
、すべてのＨＢｓＡｇを吸着させる。血清を含んでいな
い細胞培養によって生産した）ｌＢｓＡｇと、Ｄ　Ｅ　
−５２セルロースを使用する場合、硫酸アンモニウムと
透析した第６手順の画分中に含まれるタンパク質ｉ４ｍ
ｙ当たり、充填する樹脂量は約１ｍＡ’の割合いが好適
である。

カラムに吸着した後、吸着しているＨＢｓＡｇをカラム
から微分的に溶離させるため、濃度勾配を有する溶出系
が好ましく使用される。ｐＨの好適な変化、塩濃度また
は温度などは、この分野の当業者にとって自明のことで
ある。ＤＥ−５２セルロースに吸着しているＨＢｓＡｇ
　に好適な溶離液は、塩化ナトリウムについでＯ→０．
３Ｍの濃度勾配を有するものである。

第７手順の後、好ましくはゲル浸透クロマトグラフィー
によるサイズ分別化を行なうため、ＨＢｓＡｇタンパク
質含有画分をプールする。そのような画分の同定は、好
適なＨＢｓＡｇ検定方法により確認する。このような技
法の１つは、ラエムリ（Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　）が記載し
たドデシル硫酸ナトリウムの存在下に行なうポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）である〔
ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ　）　、２２７巻、７８１頁
（１９７０年）〕。５ＤＳ−ＰＡＣ；Ｅの視覚化は、塩
化銀で染色するメリル（Ｍｅｒｒｉｌｌ　）らの方法〔
サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ　）　、２１１巻、１４３
７頁（１９８１年）〕によって達成される。以下の手順
において６０．０００以−ヒの分子量のタンパク質だけ
を除去するのは困難が伴なうと思われるので、前記の５
ＤＳ−ＰＡＧＥ法によって高分子量の不純タンパク質の
混入量が低いと判定したＨＢｓ−Ａｇ含有画分だけをプ
ールすることが好ましい。

第８手順では、アニオン交換クロマトグラフィーによっ
て得たＨＢｓＡｇ含有画分をゲル浸透クロマトグラフィ
ーによってサイズ分別化処理する。

好適なゲルとしては、ビオゲル（Ｂｉｏｇｅｌ　）　Ａ
　−５ｍ　（ビオ−ラド（Ｂｉｏ　−Ｒａｄ　）　］ま
たはセファロース（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　　ＣＬ　
−５Ｂ　（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　）
　　が挙げられる。ゲルの所要量は、ゲルの性質によっ
て異なる。ビオゲルＡ−５ｍまたはセファロースＣＬ−
５Ｂの好適量は、ＨＢｓＡｇの１５０〜２００〜に対し
樹脂カラム約１ｍｌである。ゲル浸透クロマトグラフィ
ーは、０．５〜ＬＭ濃度でＮ　ａ　ＣＩ！　　を含んで
いるＰＨ６〜８の緩衝液中、温度約２℃〜８℃、好まし
くは４℃で行なわれる。

ゲル浸透クロマトグラフィーにより得られるプールすべ
き画分のＨＢｓＡｇの検定（アッセイ）の場合も、同じ
（ＳＤＳ−ＰＡＣ，Ｅ技法を使用できる。血清を含んで
いない細胞培養液からＨＢｓＡｇまでの通算精製度は、
はぼ５０倍である。通算収率は約４０％である。精製画
分の５ＤＳ−ＰＡＧＥによる分析の結果、Ｂ型肝炎の表
面抗原タンパク質はグリコジル型および非グリコジル型
の典型的な両型の存在がわかる。標品の電子顕微鏡的測
定により、２０〜２５ｎｍのサイズ範囲の粒子の存在が
認められる。

ＨＢｓＡｇの純度は９８％以−Ｌであり、他のタンパク
質を全く含有せず、現在使用し得る如何なる方法で測定
しても本質的にＤＮＡを含有しでぃない。

第２図は、ＨＢｓＡｇ培地に血清が含まれでいても、い
なくても好適に使用し得る変法を示す。

第９〜１４手順は、第１図の第１〜６手順と同様な方法
で行なわれる。

第１５手順では、第１４手順から得た溶液を、ＨＢｓＡ
ｇ　に特異的なモノクロナール抗体を含有している免疫
親和性吸着剤カラムに通して精製する。ＨＢｓＡｇ　は
カラム、に吸着し、不純物はカラムから流れ去るか、ま
たは洗い流される。その後、好適な溶離液を通して、吸
着しているＨＢｓＡｇを脱着させる。

第１５手順に使用される好適な免疫親和性吸着剤カラム
は、セファｏ−ス（５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）　Ｃｌ−−
２Ｂ〔ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　　Ｉｎｃ
、）］のように、ベセＪｌ／　（Ｂｅｔｈｅｌ　ｌ　、
　Ｇ、　Ｓ、　）らの方法〔ジャーナル、オブ、バイオ
ロジカル、ケミスト！Ｊ　　（Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ
、　）　２４４巻、２５７２頁（１９７９年）〕を用い
て、カルボニルジイミダゾールと交叉結合させたアガロ
ースへＨＢｓＡｇの特異的モノクロナール抗体を共有結
合的に結合させることにより作成する。ＨＢｓＡｇは、
動物血清の存在下で培養した哺乳類細胞培養から得られ
た粗細胞培養液をこの免疫親和性吸着剤カラムに１回通
すだけで、はとんど均質な形で得ることができる。

粗培養液をカラムに通した後、塩化ナトリウム１．０Ｍ
を含有している１０ｍＭ）リス−Ｃ／（ｐＨ７，５）の
ような好適な緩衝性溶出液を使用しで、カラムを洗滌す
る。結合しているＨＢｓＡｇ　は、好適な溶離液〔例え
ば、ｌ、　Ｑ　Ｍ　ＮａＣ１！　を含有している０、１
Ｍ酢酸ナトリウム／酢ｅ（ＰＨ４，０）、またはｌ、Ｑ
　ＮａＣ１および３　Ｍ　Ｋ　ＳＣＮを含有しティる１
０ｍＭｌ−リス−Ｃ／　（ｐＨ７，５）　）ｌこよって
溶離する。

第１６手順では、免疫親和性カラムから溶離した溶出液
を、Ｑ、　ｌ　１３　Ｍ　Ｎａ（Ｊ’を含有するｌＱｍ
Ｍトリス−Ｃ／（ＰＨ７，５）　　のような好適な媒質
で好ましく透析または透析ρ過する。透析は第６手順と
同様の方法で行なうことができる。透析濾過はアミ：Ｉ
７　（Ａｍ１ｃｏｎ　）　Ｐ　Ｍ　−Ｉ　ＱまたはＹＭ
−３０膜で行なうことができる。

第１７手順では、第１６手順からの生成物をアニオン交
換クロマトグラフィーにかける。好適な技法は、Ｑ、　
ｌ　８Ｍ　Ｎａ　Ｃ１を含有している１９ｍＭトリス−
Ｃ／（ｐＨ７，５）で洗滌したＤＥ−５２のカラムを通
過させることによって行なう。溶出液と洗滌液をプール
しで精製した生成物を調製する。

もう１つの態様は、ある細胞培養では第１１〜１４手順
を省略できることである。

Ｂ３．医薬組成物 この発明にしたがって精製したＨＢｓＡｇ　は、既知の
方法によって、医薬的に有用な組成物を製造するのに使
用できる。この場合、ＨＢｓＡｇ　は薬学的に許容し得
る担体ビヒクルと混和して結合させる。好適なビヒクル
とその製剤は、参照文献に挙ケタレミントンズ、ファー
マシューティカル、サイエン７、　（’Ｒｅｍ１ｎｔｏ
ｎ’ｓ　ＰｈａｒｍａｃｅｕＬｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅ
　）　　［７−チ７　（Ｅ、Ｗ、　Ｍａｒ　ｔ　ｉｎ　
）編］に記載されている。

Ｂ４．　　ワクチン製剤 これまで記載したように精製したＨＢｓＡ、ｇを含有し
ているこの発明のワクチンは、ＨＢｓＡｇを好適なビヒ
クルと混合して結合させる既知の方法によって調製でき
る。好適なビヒクルは、各種既知のアジュバントから成
る。そのようなワクチンは、宿主に効果的に投与し得る
ワクチンを調製するため、有効量のＨＢｓＡｇと適量の
ビヒクルを含有している。

特に有効なワクチンは、アルミニウム塩をアジュバント
とし、これとＨＢｓＡｇをゲルの形で結のＨＢｓＡｇを
、カリウム硫酸アルミニウム塩のような充分量の可溶性
塩と（例えば、ｐＨ３，５で）混合することにより、溶
解したまま形成し、つ５）でｐＨの高い塩基性滴定液（
例えば、５〜７）で滴定することによりＨＢｓＡｇとア
ルミニウム塩を共沈させてゲルを形成することができる
。そのような塩基性滴定液は水酸化ナトリウムのような
アルカリ水酸化物がよく、またはリン酸ナトリウムのよ
うなアルカリ塩でもよい。ここに示した６水酸化アルミ
ニウム・アジュバント”とは、アルミニウムを主として
水酸化物として含有する注射用製剤の形のこの発明のＨ
ＢｓＡｇワクチンに用いるアジュバントを意味する。一
方、“リン酸アルミニウム・アジュバント”の語は、ア
ルミニウムを主としてリン酸塩として含有している注射
用製剤の形のＨＢｓＡｇワクチンに用いるアジュバント
を意味する。マウスの腹腔内注射実験の成績から、リン
酸アルミニウム・アジュバント・ワクチンは、水酸化ア
ルミニウム・アジュバント・ワクチンと比較しですぐれ
た抗原性を有しでおり、またこれらは、いずれも市販の
血清から調製したワクチン、ヘプタバクスＢ　（Ｈｅｐ
ｔａｖａｘ　Ｂ　）よりすぐれた性質を示すことが判明
した。

これらのワクチンの活性成分を製造する独特な方法から
、得られたワクチン類は、本質的に異種タンパク質、ウ
ィルス性および細胞性成分、およびＤＮＡを全く含有し
ていないようである。したかって、これらは血清から製
造されたウィルス・ワクチン製剤で生じる副作用が更に
少ないであろうと思われる。

また、この発明のワクチンは、ヒルマン（Ｈｉｌｌｍａ
ｎＭ、　Ｒ，）らの報告〔バイラル、ヘパテイテイス、
インターナショナル、シンポジウム（ｖｉｒａｌｌ（ｅ
ｐａｔｉｔｉｓ、　Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ　Ｓｙ
ｍｐｏｓｉｕｍ）、ザ、フランクリン、インステイチュ
ート、プレス（Ｔｈｅ　Ｆｒａｎｋｌｉｎ　　Ｉｎ５ｔ
ｉｔｕｔｅ　ｐｒｅｓｓ　）　〕のように、チンパンジ
ーにおいでへプタバクスＢ（Ｈｅｐｔａｖａｘ　Ｂ　）
　　より抗原性がはるかにすぐれていることが判明した
。これらの成績は、ヘプタバクスが用いているｆ（Ｒｓ
Ａｇの製造について比較的杜撰な精製方法が報告されで
いるのに比べ、この発明の用いでいる精製方法に帰する
ところが大きいと信じられる。とりわけ、これらの方法
ζこ報告されでいる不快なタンパク質分解酵素およびタ
ンパク質変性を、この発明は回避している。比較Ｃご用
いたこの発明の方法は、第１図に示した方法で精製した
が、別の精製方法を行ったとしても、同様の改良結果を
提供し得るであろうと考えられる。

この発明をさらに詳細に説明するため、以下の方法およ
び結果を示すが、但し、これらはこの発明を制限するも
のではない。

Ｃ０実施例１ この実施例は、第１図の方法（第１〜８手順）を説明す
る。細胞培養液は、中国産ハムスターの卵巣細胞を、血
清を含有しでいない回転瓶中で培養した細胞培養から得
る。

培養液を、酢酸セルロースおよびセルロースから作成し
た０、２２ミクロンのザルトリウス・フィルターで濾過
し、細胞培養期間中に生じた細胞および細胞残層を除去
する。細胞培養成約１００１を２平方フイートの膜で急
速ｌこ濾過する。

セルロース・エステルから作成しｆ、＝Ｃ−３０（７）
膜で行なうドール・オリバー・システム（Ｄｏｒｒ−０
１ｉｖｅｒ　　ｓｙｓｔｅｍ）を用いる限外濾過によっ
て、澄明化した細胞培養液を濃縮する。このシステムは
、膜を保持する濾過プレス、濃縮される液の再循環用ポ
ンプ、および貯蔵槽用の加圧容器から成っている。細胞
培養液を濃縮１−１貯留液は系外に排出される。このシ
ステムを精製水０．４Ｍで２回洗い流し、ＨＢｓＡｇを
定量的に回収するため、その水を前記の貯留液と一緒に
する。洗滌液は貯留液とプールする。透過率は約３〜６
１７時／平方フィートで行なう。

濃縮した細胞培養液は２段階で分別する。濃縮細胞培養
液に、４〜８℃で、固型硫酸アンモニウムを加え、２５
％飽和濃度とする（４℃で７０６ｇ／ｌを１００％飽和
として用いた）。６０００Ｇで２０分間遠心し、溶液を
透明にする。ペレットを棄て、上清に塩化アンモニウム
を加えて６０％飽和濃度とする。６０００Ｇで２０分間
遠心し、第２段階のペレットを採取する。

硫酸アンモニウムによる分別の収率は、限外濾過で達成
した濃縮率によって左右される。濃縮率が３５に等しい
かそれより大きい場合番こ、通常この段階の最高収率を
与える。濃縮率が３５以上となっても、硫酸アンモニウ
ム分別化の収率に実質的な増加は見られない。

硫酸アンモニウム分別化によって得た第２段階のペレッ
トを、もとのり地の！容量の０．２５倍にほぼ等しいｔ
ｎｌ容量となるようＩこ、ｐＨ７，５の１０ｍＭ　）　
ＩＪスス−１（ｐＨは室温で測定）ζこ溶解する。この
溶液を１０ｍＭトリフ、　−ＣＩ　　（ｐＨ７，５）に
対して４℃で透析し、硫酸アンモニウムを除去する。限
外濾過、硫酸アンモニウム分別化、およびペレットの再
溶解を組み合わせることによって、出発の細胞培地容量
から約２０００倍の濃縮率となる。

カラムに充填したワットマンＤＥ−５２セルロースを使
用して、透析した６０％硫酸アンモニウム画分を分別す
る。クロマトグラフィ条件は下記の通りである。１０ｍ
Ｍ）ＩＪスーＣＩ！緩衝液を使用して、樹脂をｐＨ７，
５に平衝化する。溶出に用いる勾、配は、ＮａＣ／のＯ
→０．３Ｍの範囲で直線的に変化させる。ＨＢｓＡｇ　
は、このタンパク質バルクの、カラムからの溶出を現わ
しているピークのリーディング（前側）端での部分的溶
解ピークとして溶出する。

ＤＥ−５２セルロース・アニオン交換クロマトグラフィ
ーによって得たＨＢｓＡｇ画分をプールし、次の手順の
ゲル浸透クロマトグラフィーによって処理する。ＤＥ−
５２セルロ一ス処理段階の収率は５０％である。これは
、純度が不充分なためにプールされないＨＢｓＡｇ含有
画分の再処理による追加的な回収分を含んでいない。プ
ールした画分は、２５ｐｓｉ　　の加圧でＹＭ−３９膜
を使用する攪拌セル〔アミコン（Ａｍ１ｃｏｎ　）　）
で濃縮する。約１１／時／ｆｔ２　の流束が得られる。

ＤＥ−５２セルロース・カラムで濃縮したＨＢｓ　−Ａ
ｇ画分をセファロースＣＬ−（ｉＢ樹脂カラムにかける
。細胞培養液２００１！から得られる生成物（ＨＢｓＡ
ｇ約１００ｍ９）はセファロースＣＬ−６Ｂの０．５７
カラムで処理できる。カラムは、１゜９ＭＮａＣ／を含
有している１０ｍＭ）リス−Ｃ／（ＰＨ７，５、室温で
測定）の溶液中、４℃で操作する。

この方法全体を通算した収率は約３５％である。

第８手順または第１７手順を経た生成物は、希釈するか
、または例えばアミコン攪拌セルを使用してＰＭ−ＩＱ
またはＹＭ−３９膜で限外ｒ過を行なって濃縮すること
によって、約０．２ｍ？／艷の濃度に調節する。得られ
た溶液を０．２２ミクロンのフィルターで濾過し、沖液
を３〜１０時間、６０℃で加熱する。

ＨＢｓＡｇは、下記に示すようにアルミニウム塩をアジ
ュバントし、これとゲルの形で結合すること番こよって
、ワクチンに製剤化する。

ＨＢｓＡｇ２０　ｆｉｇをＱ、　ｌ　Ｍ　ＮａＣ１およ
び０゜８８％（Ｗ／■）みょうばんと混合し、さらに防
腐剤として０．０５％（Ｗ／■）チメロサールを加えて
混合する。ついで、ｐＨ１２の０．１　Ｍ　ＩＪン酸ナ
トリウムでこの溶液をｐＨ５〜７（５，５）に滴定する
。アジュバント・ワクチンは、各１−当たり、Ａ、＋３
イオ７０．５　ｍｇ当量、ＨＢｓ　Ａｇ　２０　μｇお
よびチメロサール０．０５％（Ｗ／■）を含有する。

この報告例に記載した方法で製造したＨＢｓＡｇ１ｍｇ
当たりのＤＮＡ量は２０膜ｇよりも少ない。

この値は、１００万のＤＮＡ処理によるクリアランス（
浄化）係数、１ｍ？／ｌである細胞培養液中のＨＢｓＡ
ｇ　濃度およびドツト・プロット・ノ＼イブリダイゼー
ションによって２０膜ｇと算出された細胞培養液１ｊ当
たりのＤＮＡ量を用いて決定した。ドツト・プロット・
ハイブリダイゼーションによって、この生成物中のＤＮ
Ａを直接測定すると、ＨＢｓＡｇｌ■当たりのＤＮＡは
ｔｏｐｇよりも少ないことが判明する。

このＨＢｓＡｇ生成物の４℃における安定性は６ケ月以
−ヒの観察でも、なんら有意の減少をも認めなかった。

１０ｍＭトリス−Ｃ／（ｐＨ７，５）、０、１５　Ｍ　
ＮａＣ／　　およびここに概略を説明した方法で精製し
た０、　０２５　ｍＷ／ｍｌのＨＢｓＡｇからなる溶液
を６０℃で１０時間加熱しで、イライサ（ＥＬＩＳＡ）
およびアボット、オースリア］’（（ＡｂｂｏｔＡＵＳ
ＲＩＡ　　■）の両横定法により力価を測定し、その消
失はほとんど無視し得るものであった。

また、このＨＢｓＡｇは５ＤＳ−ＰＡＧＥにより、９８
％より高い純度を示すことが特徴である。

実施例２ この実施例は、第２図に示した方法により、血清を含有
している細胞培養培地からＨＢｓＡｇを精製する方法を
示す。

細胞培養液に添加する血清濃度の範囲は、０〜７．５％
（■／■）、である。この実施例の第９〜１４手順は、
下記に示す諸点を除き、実施例１に記載した第１〜６手
順と本質的に同じである。

第１０手順において、血清を含有している細胞培養液は
、ＰＭ−１００型またはＰＭ−ＩＱ型の膜を有するロミ
コン（Ｒｏｍｉｃｏｎ　）中空ファイバー・システムを
使用する限外濾過により濃縮する。

限外濾過は２５ｐｓｉ　　までの加圧下に環境温度で行
なう。細胞培養液は濃縮され、貯留液は系外に排出され
る。システムを精製水で洗滌し、ＨＢｓＡｇを定量的に
回収するため、洗滌水は貯留液にプールする。血清７．
５％を含有している細胞培養培地の場合、ＰＭ−１００
型膜を使用する透過率は６〜１０１／時／ｆ【２となる
。添加血清が１％（ｖ　／　ｖ　）に等しいか、または
それより多く含有している細胞培養液において、２０ま
たはそれより大きい濃縮率を達成するには、以下に述べ
る精製手順において最適の収率をあげる必要がある。

濃縮した細胞培養液は、実施例１の記載と同様３こ、硫
酸アンモニウムで分別化する。

第１３手順では、実施例１の第５手順と同様に、ＨＢｓ
Ａｇを硫酸アンモニウムで沈澱させる。第１４手順では
、実施例１の第６手順と同様に、生成物を透析する。透
析用媒質は１．ＱＭＮａＣ／を含有しティる１　０　ｍ
Ｍ　）リス−ＣＩ　（ｐＨ７，５）であり、透析は２〜
８℃で行なわれる。

第１５手順では、透析液を免疫親和性カラムにかけ、カ
ラムを１．□ＭＮａＣｌ含有１０ｍＭ）ＩＪス−Ｃ／　
（ＰＨ７，５）で洗滌する。カラムに結合したＨＢｓＡ
ｇはｌ、　Ｑ　Ｍ　Ｎａ、Ｃ／を含有している０、１Ｍ
酢酸ナトリウム（ｐＨ４，０）で溶出する。この方法は
、なんら有意差な（ａ冷凍温度（２〜８℃）または室温
で行なわれる。

第１６手順では、第１５手順で得た溶出液を、０．１８
　Ｍ　ＮａＣＪを含有している１　０　ｍＭ　ｌ−リス
−Ｃ１（ｐＨ７，５）に対して透析する。別法としで、
同じ緩衝液に対し、アミコンＹＭ−３ＱまたはＰＭ−１
Ｑ膜を使用して透析ρ過を行なう。

第１７手順では、透析した溶出液をＤＥ−５２カラムｌ
こ通す。この媒１ではＨＢｓＡｇ　はＤＥ−５２に結合
しない。０．１８　Ｍ　ＮａＣｌを含有している１　０
　ｍＭ　）リス−ＣＩ！（ｐＨ７，５）でカラムを洗滌
すると、ＨＢｓＡｇが定量的に回収される。

ＨＢｓＡｇ　　１０〜２０ｍｇ１こ対してＤＥ−５２約
１−を使用する。

実施例２の全体を通算しで、ＨＢｓＡｇの収率は約８０
％である。実施例１または実施例２に記載した方法で製
造したいずれの生成物の純度も、はぼ同等である。

実施例３ マウスの力価検定により、実施例１のリン酸アルミニウ
ム・アジュバント・ワクチンを、（ａ）この方法でリン
酸アルミニウムを水酸化アルミニラムに代えて調製した
水酸化アルミニウム・アジュバント・ワクチン、および
（ｂ）メルク、シャープ、アンド、ドーム社（Ｍｅｒｋ
　　５ｈａｒｐ　ａｎｄ　Ｄｏｈｍｅ　）によって市販
されているヘプタバクスＢ　（ＨｅｐｔａｖａｘＢ）と
比較した。その結果は第１表に示した通り、市販製剤と
比較して、この発明のワクチンの力価が高まっているこ
とが証明された。

第１表　マウス力価検定３ 血清陽転率（％） ０、０３０　　　　　　５　　　　２０　　　　　７５
０、１５６　　　　　　５５　　　　８５　　　　　９
５０．６２５　　　　　　８５　　　　８５　　　　１
００２．５　　　　　　　９０　　　　９５　　　　１
００ＥＤ５（ａ’　　　　　１．５０μｇ　　　０．０
９３μｇ　　０．０３９μｇ相対力価　　　　　１．０
　　　　　１．６　　　３．８３アルミニウムゲル・ア
ジュバントを含有するワクチン１ｒｎ！、づつをマウス
に腹腔内注射した。注射後２８日目に、マウスを瀉血し
、その血漿画分を、オーサブ（Ａｕ５ａｂ　）放射線免
疫検定法〔アボット・ラボラトリーズ（ＡｂｂｏｔｔＬ
ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ　）　ｌｉコより７、抗ＨＢｓ
抗体の存在を試験した。

５１群２０匹のマウスを使用、。

ば ｃＥＤ５ｏ△マウスの５０％が血清陽性となるワクチン
投与量を表わしている。

【図面の簡単な説明】

第１図および第２図はいずれも組み換え体細胞培養から
ＨＢｓＡｇを精製する方法の手順を示す工程系統図であ
る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、（ａ）ＨＢｓＡｇを生産する組み換え体細胞培地中
   の宿主細胞残屑からＨＢｓＡｇを分離し、（ｂ）手順（
   ａ）で分離したＨＢｓＡｇを濃縮し、（ｃ）手順（ｂ）
   で得た濃縮物にタンパク沈澱剤を加えて混入タンパク質
   の第１画分を沈澱させて該第１タンパク質画分を除去し
   、 （ｄ）手順（ｃ）で得た可溶性画分中のタンパク沈澱剤
   濃度を高めてＨＢｓＡｇを沈澱させ、（ｅ）手順（ｄ）
   で沈澱したＨＢｓＡｇを再溶解し、このようにして調製
   したＨＢｓＡｇ含有溶液を透析し、 （ｆ）手順（ｅ）で透析したＨＢｓＡｇ含有溶液をアニ
   オン交換床に通すことによつて該溶液を分別し、ＨＢｓ
   Ａｇ含有画分を少なくとも１画分収得し、そして （ｇ）手順（ｆ）で得たＨＢｓＡｇ画分をさらに精製し
   て、精製ＨＢｓＡｇ生成物を調製する諸手順から成るＨ
   ＢｓＡｇの精製方法。 ２、手順（ａ）の培地が、実質的に血清を全く含んでい
   ない第１項に記載の方法。 ３、手順（ｇ）を、サイズ分画化によつて行なう第１項
   に記載の方法。 ４、手順（ｇ）のサイズ分画化をゲル浸透クロマトグラ
   フィーによつて行なう第３項に記載の方法。 ５、アニオン交換床がＤＥＡＥセルロースからなる第１
   項〜第４項のいずれかに記載の方法。 ６、該細胞がＣＨＯ細胞である第１項〜第４項のいずれ
   かに記載の方法。 ７、手順（ｂ）を限外濾過によつて行なう第１項に記載
   の方法。 ８、沈澱剤が硫酸アンモニウムからなる第１項に記載の
   方法。 ９、タンパク沈澱剤がポリエチレングリコールからなる
   第１項に記載の方法。 １０、（ａ）ＨＢｓＡｇを生産する組み換え体細胞培養
   培地中の宿主細胞残屑からＨＢｓＡｇを分離し、 （ｂ）分離したＨＢｓＡｇを、ＨＢｓＡｇに特異性を有
   するモノクロナール抗体を含有している免疫親和性吸着
   剤カラムに通して、ＨＢｓＡｇを吸着させ、そして混入
   不純物を除去し、 （ｃ）該カラムに溶離液を通して、吸着しているＨＢｓ
   Ａｇを溶離させ、そして （ｄ）該溶出液をアニオン交換床に通すことにより、該
   溶出液中のＨＢｓＡｇを分画して精製されたＨＢｓＡｇ
   含有画分を少なくとも１画分収得する諸手順から成るＨ
   ＢｓＡｇの精製方法。 １１、手順（ａ）の後であつて、手順（ｂ）の前に、分
   離したＨＢｓＡｇを濃縮する第１０項に記載の方法。 １２、手順（ｅ）の後であつて、手順（ｇ）の前に以下
   の操作を行なう第１１項に記載の方法： （ｅ）該濃縮液にタンパク沈殿剤を加えて汚染タンパク
   質の第１画分を沈殿させ、そして該第１タンパク質画分
   を除去し、 （ｆ）手順（ｅ）からの可溶画分中のタンパク質沈殿剤
   の濃度を増大させてＨＢｓＡｇを沈殿させ、そして （ｇ）手順（ｆ）からの沈殿したＨＢｓＡｇを再溶解し
   、この様にして形成させたＨＢｓＡｇ含有溶液を透析す
   る。 １３、精製したＨＢｓＡｇ含有画分中のＨＢｓＡｇをサ
   イズ分画して更に精製する第１１項に記載の方法。 １４、該サイズ分画をゲル浸透クロマトグラフィーによ
   つて行なう第１３項に記載の方法。 １５、第１項〜第１４項のいずれかに記載の方法によつ
   て生産された精製ＨＢｓＡｇ生産物。 １６、第１５項のＨＢｓＡｇを含有するワクチン。 １７、燐酸アルミニウムアジユバント、水酸化アルミニ
   ウムアジユバントおよびその混合物からなるアジユバン
   トと混合された第１６項に記載のワクチン。 １８、該アジユバントが燐酸アルミニウムアジユバント
   からなる第１７項に記載のワクチン。