KR0159716B1 - B형 간염 표면 항원의 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 B형 간염 표면 항원(HBs 항원)을 정제하는 방법에 관한 것으로, HBs 항원이 발현된 효모 세포를 파쇄하여 세포 파쇄액을 얻고, 상기 파쇄액을 원심분리하여 HBs 항원을 함유하는 상등액을 얻은 다음, 상기 상등액에 중성 비이온 계면활성제 및 실리카를 가하여 HBs 항원을 흡착시킨 후, HBs 항원이 흡착된 실리카로부터 HBs 항원을 탈착시킴으로써 HBs 항원을 고순도로 정제할 수 있다.

Description

B형 간염 표면 항원의 정제방법

본 발명은 B형 간염 표면 항원(이하 HBs 항원)을 정제하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재조합 효모에서 발현되는 HBs 항원을 정제하는데 있어서 실리카 흡착시 계면활성제를 첨가하여 HBs 항원만을 선택적으로 흡착 및 탈착시킴으로써 그순도를 높이는 방법에 관한 것이다.

B형 간염은 전세계적으로 심각한 공중 보건상의 문제가 되는 질병으로, B형 간염 바이러스(HBV)의 보균자 수는 약 2-3억에 달하는데, 특히 아시아와 아프리카 전지역은 전체 인구의 약 10% 정도가 HBV 보균자이다. 이와 같이 중요한 B형 간염에 대하여 현재까지는 효과적인 치료제가 없으므로 예방 차원에서 백신의 중요성이 부각되고 있다.

1955년 블럼버그 등이 B형 간염 환자의 혈액에서 오스트랄리아(Australia) 항원을 발견하고, 1971년 크루그만 등이 HBV를 함유하고 있는 사람 혈청을 가열 처리하여 능동 면역을 시도함으로써 B형 간염 백신의 개발 가능성을 보여준 이래, B형 간염 보균자의 혈장으로부터 HBs 항원을 분리 정제한 1세대 B형 간염 백신이 상업화되었다.(Hilleman, M. R., et al., Develop. Biol. Standard, 54 , 3(1983)). 그러나 혈장 유래 백신은 정제 및 혈청내 바이러스의 불활성화 과정이 번거롭고 많은 비용이 들 뿐 아니라, 혈액의 공급이 충분치 못하고 혈액을 통해 전염될 수 있는 다른 병원균을 접종자에게 감염시킬 위험성이 있는 등의 문제점을 갖고 있다.

따라서, 이러한 문제점을 갖는 혈장 유래 백신 대신 유전 공학 기법을 이용한 재조합 B형 간염 백신을 개발할 필요성이 대두되었다. 발렌주엘라 등에 의해 효모에서 HBs 항원 단백질 생산이 성공적으로 이루어져(Valenzuela, P., et al., Nature, 298, 347(1982)) 2세대 백신으로 불리는 재조합 B형 간염 백신이 생산 판매되고 있으나, 대량 생산에 적합한 정제 공정을 위해서는 아직도 개선할 여지가 많은 실정이다.

일반적으로 B형 간염 보균자의 혈장에서는 직경 22nm의 구형 입자, 동일한 직경을 갖는 원통형 입자 및 직경 42nm의 데인 입자로 불리우는 바이러스 입자의 3 가지 형태의 항원이 발견된다. 직경 22nm의 구형 및 원통형 입자는 HBs 항원으로만 구성되어 있으나 데인 입자는 HBs 항원 및 HBc 항원(B형 간염 핵 항원), 그리고 DNA형의 핵산으로 구성되어 있다.이들 구형, 원통형 및 데인 입자는 보균자의 혈장내에 대개 10,000:10:1의 비율로 존재하는데, 혈장 유래 백신은 이들 입자 중에서도 22nm의 구형 입자를 백신화한 것이다.

22nm의 구형 입자는 S 단백질, M 단백질, L 단백질이라고 하는 3 가지 단백질로 이루어져 있다. 이들 단백질은 본래 바이러스가 갖고 있는 4개의 ORF(open reading frame)로 구성되는 유전자 중에서 하나의 동일한 ORF로부터 만들어진 것으로, 단백질 합성이 개시되는 시작 코돈에 따라 각 단백질이 구분된다. 구형 입자의 구성에 있어 각 단백질이 차지하는 비율은 서로 다른데, S 단백질이 주요 구성 성분이며 M 단백질과 L 단백질은 소량 존재한다. 데인 입자와 원통형 입자에서도 S 단백질이 가장 많은 비율을 차지하고 있긴 하나 L 단백질도 주요 구성 성분으로 포함되어 있다.

재조합 B형 간염 백신은 혈장 유래 백신과 마찬가지로 22nm의 구형 입자이나 이를 구성하는 표면 항원은 S 단백질로만 이루어져 있고 입자의 직경이 약간 작다. 또한 혈장 유래 표면 항원은 각 단백질과 그의 당화된 형태의 단백질로도 구성되어 있으나, 재조합 표면 항원은 전혀 당화가 되어 있지 않다. 그러나 효모에서 발현되는 재조합 HBs 항원은 침강 속도(sedimentation rate)와 부유 밀도(buoyant density)가 혈장 유래 HBs 항원과 동일하여 밀도나 지질 함량 등의 물리 화학적 성질이 동일할 뿐 아니라 항원성 및 면역 반응성이 높은 입자로 밝혀져(Nature, 298, 347-350(1982)), 이러한 성질에 있어서 표면 항원의 성분이나 당화 유무가 별로 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.

재조합 생물체에 의해 발현되는 재조합 HBs 항원 단백질을 백신화하기 위해서는 재조합 생물체 유래의 불순 단백질을 제거하는 정제 과정이 필수적인데, 통상적으로 재조합 HBs 항원의 정제에는 왐플러등의 방법(Wampler, E. D. et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 82, 6830(1985)) 및 스티븐 등의 방법(Stephenne, J. et al., Vaccine, 8(Suppl.), S69(1990))이 이용된다. 이들 방법에서는 HBs 항원의 정제 순도를 높이기 위해서 소수성 상호 작용에 기초한 부틸 아가로즈 컬럼 크로마토그래피나 전자 친화력을 이용한 음이온 컬럼 크로마토그래피를 이용하는데, 이러한 방법은 HBs 항원이 이들 고정 담체에 전부 흡착되기 어렵고 또한 일단 담체에 흡착된 항원은 잘 용출이 되지 않기 때문에 수율이 낮을 뿐 아니라, 이들 고정 담체의 단위당 흡착될 수 있는 HBs 항원의 양이 적다는 단점이 있다.

이외에도 항원 항체 반응에 의한 친화 크로마토그래피 분리 에 의해 HBs 항원을 정제하는 방법(Howsen, B. et al., Jounal of immunological Method, 8, 185(1975))이 제안되었다. 이 방법은 정제 효율은 극히 양호한 반면, 백신을 대규모로 생산하는 경우에는 크로마토그래피용 HBs 항체를 얻기 위해서 대량의 성인 혈청이 필요하고 HBs 항체를 고도로 정제해야 하며 시아노겐 브로마이드(CNBr) 등을 사용하여 고정 담체에 결합시켜 친화성 고정 담체를 형성시켜야 하기 때문에 대량 생산에는 적합하지 않다. 뿐만 아니라, 이 친화 겔을 사용한 컬럼 크로마토그래피는 HBs 항원과 겔과의 결합이 비교적 약하기 때문에 용출시에 HBs 항체와 HBs 항체-HBs 항원 반응 생성물이 발생할 수 있으며, 이것이 백신에 혼입되는 경우에는 자가 면역 질환이나 신장병증을 유발시킬 염려가 있다.

B형 간염 표면 항원을 정제하는데 있어서 초기 정제 과정중에 실리카를 이용한 예는 많이 보고되었다(대한민국 특히 공고번호 92-7673 호 등). 그러나 기존의 실리카 처리 과정은 단순히 표면 항원이 용해되어 있는 용액에 실리카를 첨가하고 흡착시키는 방법으로, 그후 실리카로부터 표면항원을 탈착시킬 경우 많은 불순물들이 잔존하여 순도가 매우 낮을 뿐 아니라(단백질 순도 1.5%), 우레아, SDC(sodium deoxycholate)와 같은 물질을 사용하여 후속 공정에 나쁜 영향을 미친다는 문제점이 있다.

이에, 본 발명자들은 이러한 문제점을 개선하고 보다 효율적으로 고순도 HBs 항원을 정제하기 위해 거듭 연구한 결과, 실리카 처리시 계면활성제를 첨가하여 표면 항원만을 선택적으로 흡착 및 탈착시킴으로써, 표면 항원의 순도가 90% 이상으로 크게 향상됨을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 산업적 규모로 수행될 수 있는 방식으로 B형 간염 표면 항원을 고순도로 정제하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에서는 B형 간염 표면 항원(HBs 항원)이 발현된 효모 세포를 파쇄하여 세포 파쇄액을 얻고, 상기 파쇄액을 원실분리하여 HBs 항원을 함유하는 상동액을 얻은 다음, 상기 상동액에 중성 비이온 계면활성제 및 실리카를 가하여 HBs 항원을 흡착시킨 후, HBs 항원이 흡착된 실리카로부터 HBs 항원을 탈착시키는 단계를 포함하는, B형 간염 표면 항원의 정제 방법을 제공한다.

본 발명의 공정은 B형 간염 바이러스 보균자 혈장이나, HBs 항원을 발현할 수 있는 임의의 형질전환된 효모의 배양액으로부터 표면 항원을 정제하는데 유효하다. 형질전환된 효모로 적절한 것은 캔디다(Candida), 클로에케라(Kloeckera), 사카로마이세스(Saccharomyces), 쉬조사카로마이세스(Schizosaccharomyces), 로도토룰라(Rhodotorula), 한세눌라(Hansenula), 토룰로피스(Torulopis), 피치아(Pichia) 및 클뤼베로마이세스(Kluyveromyces) 속에 속하는 효모들로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 이들 중 특히 바람직한 것은 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisie)이다.

본 발명의 공정을 상세히 설명하면 다음과 같다.

우선 통상적인 방법에 의해 HBs 항원이 발현된 효모 세포를 파쇄한다. 예를 들면, HBs 항원이 발현된 효모세포를 효모 세포와 완충용액의 비율이 1:1 내지 1:10이 되도록 완충용액에 혼합한 후 유리알파쇄기(glass bead beator)를 이용하여 세포벽을 파쇄한다. 세포파쇄액에 중성 계면활성제(Tween계, Triton께 등)를 0.1 내지 1% 첨가하고 저온실에서 10 시간 내지 수일 동안 교반시킨 후 원심분리하여 세포내 침전물은 버리고 HBs 항원이 함유된 상동액을 취한다.

HBs 항원 함유 상등액의 pH를 NaOH 등을 이용하여 5 내지 7.5로 조정한 후 계면활성제를 첨가한다. 이때 계면활성제로는 중성 비이온 계면활성제, 예를 들면 트윈-20(Tween-20), 트리톤 X-100(Triton X-100) 등을 사용할 수 있으며, 0.05 내지 0.5%의 농도로 참가하는 것이 바람직하다.

이어서, 상기 용액에 실리카를 첨가, 혼합하고 상온 내지는 저온실에서 3 내지 16 시간 동안 교반하여 표면 항원을 흡착시킨다.

본 발명에 사용될 수 있는 실리카로는 100 내지 500㎡/g의 호용가능한 표면적을 갖는 미립상 수화 실리카 또는 무수 실리카가 포함된다. 미립상 실리카로는 에어로실 380(Aerosil 380; 데구사(Degusa)사, 미국 뉴저지)을 사용할 수 있다.

그런 다음 상기와 같이 실리카 처리된 상등액으로부터 표면 항원-실리카 결합체를 원심분리법 등과 같은 통상의 방법으로 분리한 후, 실리카로부터 오염물질을 제거하기 위해 pH 6 내지 8의 완충용액, 바람직하게는 인산나트륨-염화나트륨 완충용액으로 실리카를 1 내지 3회 세척한다.

실리카로부터 오염 단백질이 제거된 후, pH 8.8 내지 11.0, 바람직하게는 pH 9.3 내지 10.5의 완충용액, 예를 들면 카보네이트 또는 보레이트 완충용액을 실리카와 약 2시간 이상 접촉시킴으로써 표면 항원을 탈착시킨다. 이렇게 탈착된 용액에서 표면 항원은 90% 이상의 순도를 갖는다.

이상과 같은 방법으로 정제된 B형 간염 표면 항원을 백신 용도로 사용하기 위해서 다음과 같은 통상의 방법에 따라 더 정제할 수도 있다.

실리카에서 탈착된 HBs 항원 용액을 페닐기가 붙어 있는 컬럼에 통과시켜 표면 항원을 부착시키고 80% 에틸렌 글리콜이 함유된 완충용액을 흘려 보내 용출시킨 후, 겔 여과 컬럼 크로마토그래피를 수행하면 95% 이상의 순도를 갖는 표면 항원으로 정제할 수 있다. 또는, 실리카로부터 탈착된 HBs 용액을 농축한 후, CsCl 농도 구배를 이용한 초원심분리를 수행함으로써 보다 순수한 HBs 항원으로 정제할 수 있다.

이와 같이 본 발명에 따라 정제된 B형 간염 표면 항원은 백신 제조에 직접 사용될 수 있는 정도의 순도를 갖는다.

이하, 하기 실시예에 의거하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들 만으로 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1 내지 6]

B형 간염 표면 항원 유전자가 포함된 발현 벡터 pYSAG101에 의해 형질전환된 사카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae) 균주(대한민국 특허 공고 90-5959 호 참조)를 배양하여 얻은 효모세포 5kg을 -70℃의 냉동고에서 꺼내어 10ℓ 완충용액(0.5% 트리톤 X-100, 0.5M NaCl, 100mM EDTA, 0.1M 포스페이트, pH 7.0, 0.01% 티메로살)에 현탁시킨 후, 유리알이 들어 있는 세포파쇄기(Dynomill, WAB사, 스위스)에 0.5ℓ/분의 유속으로 2회 통과시켜 세포 파쇄액을 얻었다. 이 용액에 5N NaOH를 첨가 하여 pH를 11로 맞춘 후 3시간 동안 교반하였다. 다시 5N HCl을 첨가하여 pH를 3.8로 조정한 후 고속 원심분리기(Beckmantk, Rotor:JA-14, 미국)로 6000rpm에서 15분간 원심분리하여 HBs 항원이 함유되어 있는 상등액을 취하였다.

상기에서 얻은 상등액에 NaOH를 첨가하여 pH를 7로 맞춘 다음 이 용액을 100㎖씩 취하여 계면활성제인 트윈-20(Tween-20) 또는 트리톤 X-100(Triton X-100)을 하기 표1에 나타낸 바와 같은 농도로 나타내었다.

계면활성제가 첨가된 HBs 항원 용액 각각에 실리카(aerosil 380)분말을 각각 6㎖씩 넣고 저온실(4℃)에서 12시간 동안 교반하여 표면 항원을 실리카에 흡착시켰다. 이 용액을 5000rpm에서 10분간 원심분리하여 실리카를 취한 후 50㎖의 PBS 용액으로 2번 세척하여 불순물을 제거하였다.

이어서 실리카에 흡착된 표면 항원을 탈착시키기 위해 50mM 카보네이트 완충용액(pH 9.3) 20㎖를 가하고 3시간 동안 상온에서 교반한 후 다시 원심분리하여 침전된 실리카를 제거하였다. 실리카가 탈착된 HBs 항원 함유 용액의 표면 항원 활성도, 당 함량 및 흡광도를 측정하여 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다.

[비교예]

HBs 항원을 실리카에 흡착시키기 전에 계면활성제를 참가하지 않는 것을 제외하고는 실시예 1 내지 6과 동일하게 실시하여 HBs 항원을 정제하여 표면 항원 농도, 활성도, 당 함량 및 흡광도를 측정하여 그 결과를 표 1에 나타내었다.

* ND : 측정되지 않음

상기 결과에서 알 수 있듯이, 실리카 처리전에 계면활성제를 첨가하면 당 농도가 크게 낮아져 순도가 높아지고 투명도가 높아져 다음 정제 단계에서 바로 사용할 수 있다.

[실시예 7]

실시예 1과 같이 처리하여 얻은 세포 파쇄액 25ℓ에 0.5% 트리톤 X-100을 첨가하고 저온실에서 7일 동안 교반하였다. 이 용액중 1ℓ를 취하고 여기에 5N NaOH를 첨가하여 pH를 11로 맞춘 후 3 시간동안 휘저어 주었다. 다시 5N HCl을 첨가하여 pH를 3.8로 적정한 후 고속 원심분리기(Beckman사, Rotor:JA. 14, 미국)로 6000rpm에서 15분간 원심분리하여 B형 간염 표면 항원이 있는 상등액을 취하였다.

상등액에 NaOH를 첨가하여 pH를 7로 맞춘 후 트윈-20을 0.2% 첨가하여 섞어 주었다. 실리카 분말 60㎖를 증류수 60㎖에 현탁시킨 액을 상기 용액에 첨가하고 상온에서 3 시간 동안 교반하였다. 교반된 용액을 상온에서 원심분리하여 상등액은 버리고 침전된 표면 항원이 흡착된 실리카를 얻었다. 이를 500㎖ PBS 용액에 현탁시켜 이물질을 제거하고, 원심분리한 후 다시 500ml의 10mM 포스페이트 완충용액(pH 7.0)에 실리카를 현탁시켜 세척하였다.

세척한 후 침전된 실리카를 200ml의 0.1M 카보네이트 완충용액에 알갱이가 없도록 현탁시킨 후 1N NaOH를 첨가하여 pH를 높여가면서 10ml씩 취하였다. 이때 pH는 각각 9, 9.3, 9.5, 9.8 10.0 및 10.2로 하였다. 각각의 용액을 3 시간 동안 상온에서 교반시킨 후 원심분리하여 실리카를 제거하고 실리카로부터 탈착된 표면 항원 농도를 측정하여 표 2에 나타내었다.

상기 표 2에서 보듯이, pH가 높아짐에 따라 탈착된 표면 항원 농도가 증가함을 알 수 있으나, pH가 10이상이 되면 용액의 투명도가 떨어지게 된다.

[실시예 8 내지 13]

실시예 7에서 사용하고 남은 세포 파쇄액 중 1ℓ를 취하여 5N NaOH를 가하여 pH를 11로 맞추고 다시 1N HCl로 pH를 4.3으로 낮춘 후 원심분리하여 맑은 상등액을 얻고 NaOH를 첨가하여 pH를 6.8로 조정하였다. 이 용액에 트윈-20 0.2%와 실리카 60㎖를 첨가하고 저온실에서 16시간 동안 교반하여 표면 항원을 실리카에 흡착시켰다. 표면 항원이 흡착된 실리카를 원심분리하여 얻은 후 1ℓ PBS에 현탁시키고 20분간 교반하였다. 교반한 용액 100㎖를 취하여 원심분리한 후 상등액을 버리고 침전된 실리카에 하기 표 3에 나타낸 바와 같은 탈착 완충용액 20ml를 가하여 현탁시킨 다음 상온에서 3시간 동안 교반시킨 후 탈착된 표면 항원 농도를 측정하였다. 결과는 표 3에 나타내었다.

[실시예 14]

실시예 7에서 사용하고 남은 세포 파쇄액 중 10ℓ를 취하여 5N NaOH로 pH를 11로 맞춘 후 3시간 동안 교반하고, 1N HCl을 첨가하여 pH를 4.3으로 낮추었다. 이 용액을 원심분리하여 맑은 상등액을 얻은 후 pH를 6.8로 조정하고 트윈-20 0.2%와 실리카 500㎖를 첨가하였다. 저온실에서 16시간 동안 교반하여 표면 항원을 실리카에 흡착시킨 후, 표면 항원이 흡착된 실리카를 원심분리하여 얻은 다음 5ℓ PBS로 두 번 세척하였다. 세척된 실리카에 2ℓ의 0.1M 카보네이트 완충용액(pH 9.8)을 가하여 충분히 혼합하고 3시간 동안 상온에서 교반한 후, 원심분리하여 실리카를 제거하고 표면 항원이 탈착된 용액을 얻었다. 이 용액을 페닐-세파로즈 겔 컬럼 크로마토그래피와 세파로즈 CL-4B 겔 여과 크로마토그래피에 통과시켜 순수한 B형 간염 표면 항원을 정제하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 재조합 효모로부터 발현된 HBs 항원을 정제하는데 있어 계면활성제를 첨가한 후 실리카 흡착 공정을 수행하면 표면 항원만이 선택적으로 흡착 및 탈착되어 HBs 항원이 고순도로 정제됨을 알 수 있다. 따라서 본 발명의 방법은 백신 제조에 직접 사용되기에 충분한 순도와 물성을 갖는 HBs 항원 입자를 효율적으로 정제하여 산업적 규모에 사용하기에 적합한 방법이다.

Claims (4)

1. B형 간염 표면 항원(HBs 항원)이 발현된 효모 세포를 파쇄하여 세포 파쇄액을 얻고, 상기 파쇄액을 원심분리하여 HBs 항원을 함유하는 상등액을 얻은 다음, 상기 상등액에 중성 비이온 계면활성제 및 실리카를 가하여 HBs 항원을 흡착시킨 후, HBs 항원이 흡착된 실리카로부터 HBs 항원을 탈착시키는 단계를 포함하는, B형 간염 표면 항원의 정제 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 계면활성계가 0.05 내지 0.5%의 농도로 첨가되는 것을 특징으로하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 카보네이트 또는 보레이트 완충용액에서 상기 HBs 항원이 흡착된 실리카로부터 HBs 항원을 탈착시키는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 완충 용액의 pH가 8.8 내지 11.0인 것을 특징으로 하는 방법.