JPH06172393A - 宿主炭水化物含量が減少したＨＢｓＡｇエスケープ変異体ワクチン - Google Patents
宿主炭水化物含量が減少したＨＢｓＡｇエスケープ変異体ワクチンInfo
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- JPH06172393A JPH06172393A JP4155565A JP15556592A JPH06172393A JP H06172393 A JPH06172393 A JP H06172393A JP 4155565 A JP4155565 A JP 4155565A JP 15556592 A JP15556592 A JP 15556592A JP H06172393 A JPH06172393 A JP H06172393A
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
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- C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
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Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【目的】取り込まれた炭水化物含量を実質的に減少させ
る粒子を形成する変異体ＨＢＶ表面タンパク質の提供。 【構成】エントラップされた炭水化物又は糖タンパク質
含量が実質的に減少した、免疫的に活性な粒子を形成す
るＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質の免疫ａエピトープ
変異体、当該Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質の免疫ａ
エピトープ変異体を包含しているＢ型肝炎ウイルスに対
するワクチン、タンパク質グリコシル化が遺伝的に欠落
している組替え体酵母細胞を利用する当該ワクチンの生
産ならびに、上記免疫変異体ａエピトープＢ型肝炎ウイ
ルスタンパク質を包含する免疫診断用試薬。 【効果】ＨＢＶ関連感染の治療及び／又は予防用ワクチ
ンとして、免疫診断用抗原として有用である。
る粒子を形成する変異体ＨＢＶ表面タンパク質の提供。 【構成】エントラップされた炭水化物又は糖タンパク質
含量が実質的に減少した、免疫的に活性な粒子を形成す
るＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質の免疫ａエピトープ
変異体、当該Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質の免疫ａ
エピトープ変異体を包含しているＢ型肝炎ウイルスに対
するワクチン、タンパク質グリコシル化が遺伝的に欠落
している組替え体酵母細胞を利用する当該ワクチンの生
産ならびに、上記免疫変異体ａエピトープＢ型肝炎ウイ
ルスタンパク質を包含する免疫診断用試薬。 【効果】ＨＢＶ関連感染の治療及び／又は予防用ワクチ
ンとして、免疫診断用抗原として有用である。
Description
【０００１】Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）は、幾種類か
のヒトの肝疾患の原因となる感染性の作因である。ＨＢ
Ｖに感染した多くの人は、急性疾患をおこし、その後回
復する。しかし、少数の感染者は、感染から浄化するこ
となく、感染の慢性保菌者となる。ＨＢＶ感染は、世界
の多くの場所での風土病であり、慢性感染した母体か
ら、自らもしばしば慢性感染する新生児へと周生期に感
染が起こるひん度が高い。その数は、世界中で３億人以
上と見積もられている。この保菌者のうちから、長期に
わたって慢性Ｂ型肝炎をわずらった結果（硬変症、及び
／又は肝細胞ガンで）毎年何十万人が死亡する。
のヒトの肝疾患の原因となる感染性の作因である。ＨＢ
Ｖに感染した多くの人は、急性疾患をおこし、その後回
復する。しかし、少数の感染者は、感染から浄化するこ
となく、感染の慢性保菌者となる。ＨＢＶ感染は、世界
の多くの場所での風土病であり、慢性感染した母体か
ら、自らもしばしば慢性感染する新生児へと周生期に感
染が起こるひん度が高い。その数は、世界中で３億人以
上と見積もられている。この保菌者のうちから、長期に
わたって慢性Ｂ型肝炎をわずらった結果（硬変症、及び
／又は肝細胞ガンで）毎年何十万人が死亡する。
【０００２】Ｂ型肝炎δウイルスは、ＨＢＶとともに感
染した場合には、一般に致命的となる急性で深刻な疾患
をひきおこす作因である。δウイルスは、（自分自身の
遺伝物質からは）ヴィリオンエンベロープとして働くタ
ンパク質をエンコードせずに、ともに感染したＨＢＶが
エンコードしたエンベロープタンパク質を包膜して、後
述するＨＢＶタンパク質（及びたぶんその変異体）と密
接な構造的、免疫学的関係を共有する。現在まで、他の
感染性作因が同様な関係をＨＢＶと共有するかどうかわ
かっていない。しかし、幅広い血情学的反応性又は高い
免疫能力を持つタンパク質が、たとえわずかであるか部
分的であってもＨＢＶとの抗原交差反応性を有する一群
の作因によってひきおこされる疾患（又は感染）の診断
又は予防（又は治療）法において有効なのは明らかであ
る。
染した場合には、一般に致命的となる急性で深刻な疾患
をひきおこす作因である。δウイルスは、（自分自身の
遺伝物質からは）ヴィリオンエンベロープとして働くタ
ンパク質をエンコードせずに、ともに感染したＨＢＶが
エンコードしたエンベロープタンパク質を包膜して、後
述するＨＢＶタンパク質（及びたぶんその変異体）と密
接な構造的、免疫学的関係を共有する。現在まで、他の
感染性作因が同様な関係をＨＢＶと共有するかどうかわ
かっていない。しかし、幅広い血情学的反応性又は高い
免疫能力を持つタンパク質が、たとえわずかであるか部
分的であってもＨＢＶとの抗原交差反応性を有する一群
の作因によってひきおこされる疾患（又は感染）の診断
又は予防（又は治療）法において有効なのは明らかであ
る。
【０００３】更に変異体ＨＢＶはワクチン誘発免疫の存
在下で複製してワクチン接種した個体に病気を引き起こ
すことが報告されている。これらの変異体ＨＢＶはＨＢ
ｓＡｇ又は他のエンベロープポリペプチドの主要な抗原
及び防御エピトープに変化が生じる変異を有している。
このような変化はエピトープを変性するのでワクチン誘
発中和抗体はもはや結合することができない。〔カーマ
ン(Carman)W.等、１９９０年、ランセット、第３３６
巻、３２５〜３２９頁〕。
在下で複製してワクチン接種した個体に病気を引き起こ
すことが報告されている。これらの変異体ＨＢＶはＨＢ
ｓＡｇ又は他のエンベロープポリペプチドの主要な抗原
及び防御エピトープに変化が生じる変異を有している。
このような変化はエピトープを変性するのでワクチン誘
発中和抗体はもはや結合することができない。〔カーマ
ン(Carman)W.等、１９９０年、ランセット、第３３６
巻、３２５〜３２９頁〕。
【０００４】ＨＢヴィリオンは、コアタンパク質、及び
エンベロープ又は表面タンパク質の２種の構造タンパク
質から成る。この主要な表面タンパク質又はヴィリオ
ン、つまりデーン粒子(Dane particle) であるだけでな
く、エンベロープタンパク質はまた、オーストラリア抗
原又は２２nm粒子の主要成分でもある。これらのエンベ
ロープタンパク質は、少なくとも３８９アミノ酸（ａ
ａ）をエンコードする大きなウイルスオープン・リーデ
ィング・フレーム（ＯＲＦ）の翻訳生成物である。この
ＯＲＦは３つの部分に区分されるが、いずれもインヴィ
ヴォで翻訳開始部位として働らき得るＡＴＧコドンから
始まる。これらの部分を、それらの遺伝子内の５’−
３’順序によって、ｐｒｅＳ１（１０８ａａ）、ｐｒｅ
Ｓ２（５５ａａ）及びＳ（２２６ａａ）と呼ぶ。つま
り、これらの部分は、Ｓ又はＨＢｓＡｇ（２２６ａ
ａ）、ｐｒｅＳ２＋Ｓ（２８１ａａ）及びｐｒｅＳ１＋
ｐｒｅＳ２＋Ｓ（３８９ａａ）と呼ばれる３つのポリペ
プチドを定義するが、これらは又、それぞれｐ２４／ｇ
ｐ２７、ｐ３０／ｇｐ３３／ｇｐ３６及びｐ３９／ｇｐ
４２と呼ばれる（又、主要(major) 、中型(middle)及び
大型(large) タンパク質とも呼ばれる）。
エンベロープ又は表面タンパク質の２種の構造タンパク
質から成る。この主要な表面タンパク質又はヴィリオ
ン、つまりデーン粒子(Dane particle) であるだけでな
く、エンベロープタンパク質はまた、オーストラリア抗
原又は２２nm粒子の主要成分でもある。これらのエンベ
ロープタンパク質は、少なくとも３８９アミノ酸（ａ
ａ）をエンコードする大きなウイルスオープン・リーデ
ィング・フレーム（ＯＲＦ）の翻訳生成物である。この
ＯＲＦは３つの部分に区分されるが、いずれもインヴィ
ヴォで翻訳開始部位として働らき得るＡＴＧコドンから
始まる。これらの部分を、それらの遺伝子内の５’−
３’順序によって、ｐｒｅＳ１（１０８ａａ）、ｐｒｅ
Ｓ２（５５ａａ）及びＳ（２２６ａａ）と呼ぶ。つま
り、これらの部分は、Ｓ又はＨＢｓＡｇ（２２６ａ
ａ）、ｐｒｅＳ２＋Ｓ（２８１ａａ）及びｐｒｅＳ１＋
ｐｒｅＳ２＋Ｓ（３８９ａａ）と呼ばれる３つのポリペ
プチドを定義するが、これらは又、それぞれｐ２４／ｇ
ｐ２７、ｐ３０／ｇｐ３３／ｇｐ３６及びｐ３９／ｇｐ
４２と呼ばれる（又、主要(major) 、中型(middle)及び
大型(large) タンパク質とも呼ばれる）。
【０００５】ＨＢＶのエンベロープタンパク質は、Ｎ−
グリコシド結合によって限定されたペプチド認識部位と
結合する炭水化物側鎖を有する糖タンパク質である〔He
ermannら、J.Virol.５２、３９６（１９８４）及びStib
beら、J.Virol.４６、６２６（１９８３〕。したがっ
て、自然感染において生産されるＨＢＶポリペプチド
は、ｐ２４／ｇｐ２７（Ｓポリペプチドとそのグリコシ
ル化誘導体）、ｇｐ３３／ｇｐ３６（ｐｒｅＳ２部分だ
けがグリコシル化したｐｒｅＳ２＋Ｓポリペプチドと、
ｐｒｅＳ２部位だけでなくＳ部位もグリコシル化した該
ポリペプチド）及びｐ３９／ｇｐ４２（ｐｒｅＳ１＋ｐ
ｒｅＳ２＋ＳペプチドとそのｐｒｅＳ１部分がグリコシ
ル化した誘導体）の各種から成る。市販の血しょう由来
ワクチンは、実質的に（ｐ２４モノマーとそのグリコシ
ル化誘導体ｇｐ２７から成る）Ｓ部分だけを含むタンパ
ク質から成り、一方、現在までにうまく開発された酵母
由来ワクチンは、（もっぱらグリコシル化していないｐ
２４種から成る）Ｓポリペプチドだけから成る。
グリコシド結合によって限定されたペプチド認識部位と
結合する炭水化物側鎖を有する糖タンパク質である〔He
ermannら、J.Virol.５２、３９６（１９８４）及びStib
beら、J.Virol.４６、６２６（１９８３〕。したがっ
て、自然感染において生産されるＨＢＶポリペプチド
は、ｐ２４／ｇｐ２７（Ｓポリペプチドとそのグリコシ
ル化誘導体）、ｇｐ３３／ｇｐ３６（ｐｒｅＳ２部分だ
けがグリコシル化したｐｒｅＳ２＋Ｓポリペプチドと、
ｐｒｅＳ２部位だけでなくＳ部位もグリコシル化した該
ポリペプチド）及びｐ３９／ｇｐ４２（ｐｒｅＳ１＋ｐ
ｒｅＳ２＋ＳペプチドとそのｐｒｅＳ１部分がグリコシ
ル化した誘導体）の各種から成る。市販の血しょう由来
ワクチンは、実質的に（ｐ２４モノマーとそのグリコシ
ル化誘導体ｇｐ２７から成る）Ｓ部分だけを含むタンパ
ク質から成り、一方、現在までにうまく開発された酵母
由来ワクチンは、（もっぱらグリコシル化していないｐ
２４種から成る）Ｓポリペプチドだけから成る。
【０００６】２２nmＨＢｓＡｇ粒子は、慢性保菌者の血
しょうから精製されている。血しょうが粒子に陽性であ
ることから、これらの慢性保菌者をＨＢｓ+ と呼ぶ。感
染した人が十分な免疫反応を得れば、感染を浄化してＨ
Ｂｓ- となることができる。ＨＢｓに対する抗体を形成
したので、これらの人々を抗ＨＢｓ+ と呼ぶ。このよう
に、抗ＨＢｓ+ は、疾患からの回復と疾患の再感染に対
する免疫性、そしてＨＢＶ再感染に対する免疫性に関係
している。したがって、ＨＢワクチンによる抗ＨＢｓ誘
導又は形成は、ＨＢＶ感染に対する防御をもたらすと考
えられる。
しょうから精製されている。血しょうが粒子に陽性であ
ることから、これらの慢性保菌者をＨＢｓ+ と呼ぶ。感
染した人が十分な免疫反応を得れば、感染を浄化してＨ
Ｂｓ- となることができる。ＨＢｓに対する抗体を形成
したので、これらの人々を抗ＨＢｓ+ と呼ぶ。このよう
に、抗ＨＢｓ+ は、疾患からの回復と疾患の再感染に対
する免疫性、そしてＨＢＶ再感染に対する免疫性に関係
している。したがって、ＨＢワクチンによる抗ＨＢｓ誘
導又は形成は、ＨＢＶ感染に対する防御をもたらすと考
えられる。
【０００７】この仮説は、実験的にテスト可能である。
ヒト以外では、ＨＢｓ+ 等の定量可能なマーカーや肝酵
素の高い血清中レベルが示すように、チンパンジーが完
全にＨＢＶ感染をおこす数少ない種の１つである。チン
パンジーを、精製ＨＢｓＡｇ粒子の３回の投与でワクチ
ン注射した後、感染性ＨＢＶを静脈注射して対抗させ
る。擬薬のワクチンを接種をした動物が急性ＨＢＶ感染
の兆候を示したのに対して、ＨＢｓＡｇ−ワクチン注射
した動物は感染の兆候を全く示さない。したがって、こ
の実験で、ｐ２４（又はｐ２４とｐ２７）から成るＨＢ
ｓＡｇ粒子は、防御免疫性の誘導に十分である。この結
果にうながされて、ＨＢｓＡｇ粒子から成るＨＢワクチ
ンを生産した製造者がある。
ヒト以外では、ＨＢｓ+ 等の定量可能なマーカーや肝酵
素の高い血清中レベルが示すように、チンパンジーが完
全にＨＢＶ感染をおこす数少ない種の１つである。チン
パンジーを、精製ＨＢｓＡｇ粒子の３回の投与でワクチ
ン注射した後、感染性ＨＢＶを静脈注射して対抗させ
る。擬薬のワクチンを接種をした動物が急性ＨＢＶ感染
の兆候を示したのに対して、ＨＢｓＡｇ−ワクチン注射
した動物は感染の兆候を全く示さない。したがって、こ
の実験で、ｐ２４（又はｐ２４とｐ２７）から成るＨＢ
ｓＡｇ粒子は、防御免疫性の誘導に十分である。この結
果にうながされて、ＨＢｓＡｇ粒子から成るＨＢワクチ
ンを生産した製造者がある。
【０００８】抗ＨＢｓの生産をもたらす適当なエピトー
プ表示は酵母由来肝炎Ｂワクチンの優れた免疫原性と関
連がある重要な特性である。これらの中でａエピトープ
が最も重要であり、これはＨＢＶの全てのサブタイプ
（ａｙｒ、ａｙｗ、ａｄｒ、ａｄｗ）に存在する配座決
定基であり、Ｓポリペプチドの１２４〜１４７アミノ酸
に位置する。１つの特異“ａ”エピトープに部位指定さ
れるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）はチンパンジーのＨ
ＢＶ感染性を中和することが示されている〔タボー(Tab
or).E.等、１９８３年、J.Infect.Dis. 第１４７巻、５
３１頁〕。抗ａ抗体はＨＢｓＡｇによって最も多量にも
たらされ、これらの誘発は全てのサブタイプに起因する
病気の防御に関係している。
プ表示は酵母由来肝炎Ｂワクチンの優れた免疫原性と関
連がある重要な特性である。これらの中でａエピトープ
が最も重要であり、これはＨＢＶの全てのサブタイプ
（ａｙｒ、ａｙｗ、ａｄｒ、ａｄｗ）に存在する配座決
定基であり、Ｓポリペプチドの１２４〜１４７アミノ酸
に位置する。１つの特異“ａ”エピトープに部位指定さ
れるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）はチンパンジーのＨ
ＢＶ感染性を中和することが示されている〔タボー(Tab
or).E.等、１９８３年、J.Infect.Dis. 第１４７巻、５
３１頁〕。抗ａ抗体はＨＢｓＡｇによって最も多量にも
たらされ、これらの誘発は全てのサブタイプに起因する
病気の防御に関係している。
【０００９】ＨＢＶの抗原サブタイプは血清学的に規定
され、ＨＢｓＡｇをコードするゲノム領域の１個の塩基
変化によることが知られている。従って主要な抗原変化
はゲノムに対する小さな変化から生じる。これらのサブ
タイプは天然に存在し、特定の地理分布を有する。この
領域の合成環状ペプチドは線状ペプチドより抗原性が高
く、ＨＢｓＡｇ抗原性は洗浄剤(detergent) で処理した
場合に失われ〔バイアス(Vyas).G. 等、１９７２年、サ
イエンス、第１７８巻、１３００〜１頁〕、これらの知
見はエピトープがコンホメーションであることを意味す
る。１個のアミノ酸変化をＨＢｓＡｇ分子に導入するこ
とができるインビトロ変異誘発によって１４７位のシス
テインと１４２位のプロリンがこの領域の完全な抗原性
表示に非常に重要であることが知られている〔アッシュ
トン−リチャート(Ashton-Richardt).P.等、１９８９
年、J.Med.Virol.第２９巻、１９６〜２０３頁〕。
され、ＨＢｓＡｇをコードするゲノム領域の１個の塩基
変化によることが知られている。従って主要な抗原変化
はゲノムに対する小さな変化から生じる。これらのサブ
タイプは天然に存在し、特定の地理分布を有する。この
領域の合成環状ペプチドは線状ペプチドより抗原性が高
く、ＨＢｓＡｇ抗原性は洗浄剤(detergent) で処理した
場合に失われ〔バイアス(Vyas).G. 等、１９７２年、サ
イエンス、第１７８巻、１３００〜１頁〕、これらの知
見はエピトープがコンホメーションであることを意味す
る。１個のアミノ酸変化をＨＢｓＡｇ分子に導入するこ
とができるインビトロ変異誘発によって１４７位のシス
テインと１４２位のプロリンがこの領域の完全な抗原性
表示に非常に重要であることが知られている〔アッシュ
トン−リチャート(Ashton-Richardt).P.等、１９８９
年、J.Med.Virol.第２９巻、１９６〜２０３頁〕。
【００１０】未変性又は組換え体のＨＢｓＡｇからなる
ＨＢＶワクチンが非常に有効であることは知られてい
る。ワクチン接種を受けた人の約５％に十分な抗ＨＢｓ
応答が現われないが、このような応答を有する人は防御
されたとみなされる。十分な抗ＨＢｓレベルを有する人
の場合、その後の感染でＨＢＶ感染は生じない。従って
全員がワクチンに対して十分に応答したとみなされる南
イタリア（及び恐らく世界の他の地域）の若干のワクチ
ン接種を受けた人がその後ＨＢＶ複製のマーカーを有す
ることは興味深いことである。
ＨＢＶワクチンが非常に有効であることは知られてい
る。ワクチン接種を受けた人の約５％に十分な抗ＨＢｓ
応答が現われないが、このような応答を有する人は防御
されたとみなされる。十分な抗ＨＢｓレベルを有する人
の場合、その後の感染でＨＢＶ感染は生じない。従って
全員がワクチンに対して十分に応答したとみなされる南
イタリア（及び恐らく世界の他の地域）の若干のワクチ
ン接種を受けた人がその後ＨＢＶ複製のマーカーを有す
ることは興味深いことである。
【００１１】ウイルスは感染の過程で絶えず変化してい
る。慢性ＨＢＶ感染にかかっている患者は血清中に種々
の遺伝子型を有する。免疫応答が多くのウイルスエピト
ープ（いくつかは中和している）に特定される事実はウ
イルス集団を絶えず変化しているものから選択される変
異体を生じる。しかしながらそのような変異体は全て複
製することができないであろう。エピトープがウイルス
生存にも必要である場合、例えば細胞侵入に必要である
場合、この位置で変異したウイルスは生存することがで
きない。中和免疫を受けないように変異した複製感染性
ウイルスはエスケープ変異体と呼ばれるがそのような変
異体は抗体による選択がないために検出頻度が低いにも
かかわらずワクチン接種しない個体に生じることは自明
のことである。このような変異は例えばインフルエンザ
ウイルスの流行に定期的に見られる抗原変動の原因であ
る。
る。慢性ＨＢＶ感染にかかっている患者は血清中に種々
の遺伝子型を有する。免疫応答が多くのウイルスエピト
ープ（いくつかは中和している）に特定される事実はウ
イルス集団を絶えず変化しているものから選択される変
異体を生じる。しかしながらそのような変異体は全て複
製することができないであろう。エピトープがウイルス
生存にも必要である場合、例えば細胞侵入に必要である
場合、この位置で変異したウイルスは生存することがで
きない。中和免疫を受けないように変異した複製感染性
ウイルスはエスケープ変異体と呼ばれるがそのような変
異体は抗体による選択がないために検出頻度が低いにも
かかわらずワクチン接種しない個体に生じることは自明
のことである。このような変異は例えばインフルエンザ
ウイルスの流行に定期的に見られる抗原変動の原因であ
る。
【００１２】エスケープ変異体は確認されており〔カー
マン(Carman). W.等、前出）、ＨＢｓＡｇの１４５位の
グリシンをアルギニンにアミノ酸置換され、この領域に
特異的なモノクローナル抗体の結合は非常に減少する。
アミノ酸領域１２４〜１３７に対する抗体の結合の減少
は変異がａ決定基の領域のいくつかのエピトープに影響
するコンホメーション変化を生じたことを示す。これら
の変異の程度及び類似しているが同一ではない他の変異
体が存在しているかどうかは現在知られていない。
マン(Carman). W.等、前出）、ＨＢｓＡｇの１４５位の
グリシンをアルギニンにアミノ酸置換され、この領域に
特異的なモノクローナル抗体の結合は非常に減少する。
アミノ酸領域１２４〜１３７に対する抗体の結合の減少
は変異がａ決定基の領域のいくつかのエピトープに影響
するコンホメーション変化を生じたことを示す。これら
の変異の程度及び類似しているが同一ではない他の変異
体が存在しているかどうかは現在知られていない。
【００１３】ＨＢワクチンの市販の供給を拡大するため
に、製造者は組み換えＤＮＡ技術を用いて、ウイルスエ
ンベロープタンパク質の発現を媒介した。微生物系のう
ちで、大腸菌(Eschevichia coli)と酵母(S.cerevisiae)
が多くの組み換え由来タンパク質の発現に最も広く用い
られる。大腸菌(E.coli)中に免疫学的に活性なＨＢｓＡ
ｇ粒子を発現させる多くの試みは成功していない。しか
し、酵母（S.cerevisiae) は、免疫学的に活性なＨＢｓ
Ａｇ粒子を発現させる能力において大きな有用性を示
す。これらの（もっぱらｐ２４から成る）粒子は、ワク
チンに処方されると、多様な血清型の活動性のＨＢＶの
対抗からチンパンジーを完全に防御することがわかって
いる。さらに、酵母由来Ｓ粒子もまた免疫学的に活性で
あり、血しょう由来ＨＢｓＡｇと同じくらいヒトの臨床
試験において疾患又は感染の予防に効果がある。〔Stev
ens ら、JAMA、２５７：２６１２〜２６１６（１９８
７）〕。したがって、組み換えＨＢｓＡｇ合成をうなが
すホスト種としての酵母(S.cerevisiae)の有用性は、確
立している。さらに、酵母中でのヒトの治療剤とワクチ
ンの発現は、生産物の開発に非常に有用である。なぜな
ら、酵母は内毒素を持たず、人間に対して病源性がない
ので工業的規模での発酵が行なえるし、連続継代性ホ乳
類細胞系統（その多くはウイルス的に形質転換されて、
マウスに腫瘍発生性があり、又、すべて原始腫瘍遺伝子
を持つ）の使用にまつわる多くの安全性を考えなくてよ
いからである。
に、製造者は組み換えＤＮＡ技術を用いて、ウイルスエ
ンベロープタンパク質の発現を媒介した。微生物系のう
ちで、大腸菌(Eschevichia coli)と酵母(S.cerevisiae)
が多くの組み換え由来タンパク質の発現に最も広く用い
られる。大腸菌(E.coli)中に免疫学的に活性なＨＢｓＡ
ｇ粒子を発現させる多くの試みは成功していない。しか
し、酵母（S.cerevisiae) は、免疫学的に活性なＨＢｓ
Ａｇ粒子を発現させる能力において大きな有用性を示
す。これらの（もっぱらｐ２４から成る）粒子は、ワク
チンに処方されると、多様な血清型の活動性のＨＢＶの
対抗からチンパンジーを完全に防御することがわかって
いる。さらに、酵母由来Ｓ粒子もまた免疫学的に活性で
あり、血しょう由来ＨＢｓＡｇと同じくらいヒトの臨床
試験において疾患又は感染の予防に効果がある。〔Stev
ens ら、JAMA、２５７：２６１２〜２６１６（１９８
７）〕。したがって、組み換えＨＢｓＡｇ合成をうなが
すホスト種としての酵母(S.cerevisiae)の有用性は、確
立している。さらに、酵母中でのヒトの治療剤とワクチ
ンの発現は、生産物の開発に非常に有用である。なぜな
ら、酵母は内毒素を持たず、人間に対して病源性がない
ので工業的規模での発酵が行なえるし、連続継代性ホ乳
類細胞系統（その多くはウイルス的に形質転換されて、
マウスに腫瘍発生性があり、又、すべて原始腫瘍遺伝子
を持つ）の使用にまつわる多くの安全性を考えなくてよ
いからである。
【００１４】パン酵母(S.cerevisiae)は、糖タンパク質
を合成できる真核生物である。酵母中のタンパク質グリ
コシル化は、最近の多くの文献がとりあげている〔とく
に、Kukuruzinskaら、Ann.Rev.Biochem., （１９８７）
５６、９１５〜４４；Tannenら、BBA.（１９８７）９０
６、８１〜９９〕。このグリコシル化、又はポリペプチ
ド上の適当な受容体アミノ酸（ａａ）へのグリカンの付
加は、特定のセリン（Ｓｅｒ）かスレオニン（Ｔｈｒ）
残基（Ｏ−結合の場合）、又は特定のアスパラギン（Ａ
ｓｎ）残基（Ｎ−結合の場合）のどちらでも起こる。Ｓ
ｅｒ又はＴｈｒ残基でのＯ結合付加の特異性はよくわか
っておらず、ケースバイケースで経験的に決定してい
る。
を合成できる真核生物である。酵母中のタンパク質グリ
コシル化は、最近の多くの文献がとりあげている〔とく
に、Kukuruzinskaら、Ann.Rev.Biochem., （１９８７）
５６、９１５〜４４；Tannenら、BBA.（１９８７）９０
６、８１〜９９〕。このグリコシル化、又はポリペプチ
ド上の適当な受容体アミノ酸（ａａ）へのグリカンの付
加は、特定のセリン（Ｓｅｒ）かスレオニン（Ｔｈｒ）
残基（Ｏ−結合の場合）、又は特定のアスパラギン（Ａ
ｓｎ）残基（Ｎ−結合の場合）のどちらでも起こる。Ｓ
ｅｒ又はＴｈｒ残基でのＯ結合付加の特異性はよくわか
っておらず、ケースバイケースで経験的に決定してい
る。
【００１５】Ｎ結合グリコシル化のシグナル配列は、ア
ミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
（式中Ｘはどのアミノ酸でもよい）のいずれかとして十
分に定義されている。多くのオートロガス固有のグリコ
シル化タンパク質（この中にはマンノプロテイン、又は
マンノペプチドと呼ばれるタンパク質を含む）を合成す
るだけでなく、酵母は、（異種、又は外来のタンパク質
がＮ又はＯ結合グリコシル化のいずれかに対する適当な
グリコシル化シグナル配列を持てば）、組み換え技術で
発現させた異種のタンパク質のグリコシル化もできる。
ミノ酸配列Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ又はＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ
（式中Ｘはどのアミノ酸でもよい）のいずれかとして十
分に定義されている。多くのオートロガス固有のグリコ
シル化タンパク質（この中にはマンノプロテイン、又は
マンノペプチドと呼ばれるタンパク質を含む）を合成す
るだけでなく、酵母は、（異種、又は外来のタンパク質
がＮ又はＯ結合グリコシル化のいずれかに対する適当な
グリコシル化シグナル配列を持てば）、組み換え技術で
発現させた異種のタンパク質のグリコシル化もできる。
【００１６】自然感染中に生成するｐｒｅＳ２＋Ｓポリ
ペプチドは、ちょうど２つの“コア”〔約３キロダルト
ン（ＫＤ）のサイズの〕Ｎ−結合グリカンを、１つはＳ
領域に、２つ目はｐｒｅＳ２領域のアミノ酸残基４のＡ
ｓｎに持つ。このＳ領域中の認識部位は、RecombivaxＨ
Ｂ（登録商標）でも酵素の合成する組み換えｐｒｅＳ２
＋Ｓでもグリコシル化しない。しかし、このｐｒｅＳ２
領域のアミノ酸残基４の部位は、酵母によって認識され
てグリコシル化する。
ペプチドは、ちょうど２つの“コア”〔約３キロダルト
ン（ＫＤ）のサイズの〕Ｎ−結合グリカンを、１つはＳ
領域に、２つ目はｐｒｅＳ２領域のアミノ酸残基４のＡ
ｓｎに持つ。このＳ領域中の認識部位は、RecombivaxＨ
Ｂ（登録商標）でも酵素の合成する組み換えｐｒｅＳ２
＋Ｓでもグリコシル化しない。しかし、このｐｒｅＳ２
領域のアミノ酸残基４の部位は、酵母によって認識され
てグリコシル化する。
【００１７】ｐｒｅＳ１領域は、ｐｒｅＳ１領域のアミ
ノ酸残基４にＮ結合グリコシル化部位を、そして血清型
ａｄｗのアミノ酸残基２６に潜在的部位を有する。この
分野に通じる者には、ｐｒｅＳ２グリコシル化に関して
示す議論が、ｐｒｅＳ１及びＳ領域の各種の配列と同様
にｐｒｅＳ２領域の各種配列にもあてはまることは明ら
かである。
ノ酸残基４にＮ結合グリコシル化部位を、そして血清型
ａｄｗのアミノ酸残基２６に潜在的部位を有する。この
分野に通じる者には、ｐｒｅＳ２グリコシル化に関して
示す議論が、ｐｒｅＳ１及びＳ領域の各種の配列と同様
にｐｒｅＳ２領域の各種配列にもあてはまることは明ら
かである。
【００１８】組み換えｐｒｅＳ２＋Ｓを合成する酵母
は、ウイルス感染時に固有ポリペプチドに加えられるも
のに似た“コア”グリカンを加える。しかし、酵母ホス
ト細胞がグリコシル化に対して“野性型”である場合
（すなわち、ほとんどすべての広く用いられる酵母株が
そうであるように、固有なグリコシル化に必要な酵素の
完全な補体を持つ場合）、かなりの数のこれらのグリカ
ンは、酵母が自らの構造マンノプロテインを作るのに用
いるのと同じ方法で、多数の付加的マンノース残基で伸
長する。このグリカンの付加的伸長が、ｐｒｅＳ２＋Ｓ
ポリペプチド等の外来遺伝子生成物上で起こると、過グ
リコシル化と呼ばれる。この分野に通じる者には、酵母
について示す議論が多種なグリコシル化パターンの対象
となり得る他のホスト細胞（たとえば、昆虫、菌類な
ど）にもあてはまることは明らかである。
は、ウイルス感染時に固有ポリペプチドに加えられるも
のに似た“コア”グリカンを加える。しかし、酵母ホス
ト細胞がグリコシル化に対して“野性型”である場合
（すなわち、ほとんどすべての広く用いられる酵母株が
そうであるように、固有なグリコシル化に必要な酵素の
完全な補体を持つ場合）、かなりの数のこれらのグリカ
ンは、酵母が自らの構造マンノプロテインを作るのに用
いるのと同じ方法で、多数の付加的マンノース残基で伸
長する。このグリカンの付加的伸長が、ｐｒｅＳ２＋Ｓ
ポリペプチド等の外来遺伝子生成物上で起こると、過グ
リコシル化と呼ばれる。この分野に通じる者には、酵母
について示す議論が多種なグリコシル化パターンの対象
となり得る他のホスト細胞（たとえば、昆虫、菌類な
ど）にもあてはまることは明らかである。
【００１９】さらに、野性型酵母ホスト細胞が発現した
ＨＢＶ表面タンパク質の２２nm粒子の組み換え形態が、
２２nm粒子内にかなりの量の酵母細胞炭水化物（少なく
とも一部は酵母ホスト細胞の構造マンノペプチドに由来
するもの）を取り込んでることが示されている。この取
り込んだ炭水化物は、グリコシル化タンパク質上の酵母
炭水化物部分に対する抗体を発生させて、取り込んだ酵
母炭水化物を含むワクチン免疫源がほとんどのホ乳類の
種に存在する抗酵母抗体と反応し、そうして、免疫源及
びワクチンとしての有効性を減じる可能性があるという
問題が生じる。
ＨＢＶ表面タンパク質の２２nm粒子の組み換え形態が、
２２nm粒子内にかなりの量の酵母細胞炭水化物（少なく
とも一部は酵母ホスト細胞の構造マンノペプチドに由来
するもの）を取り込んでることが示されている。この取
り込んだ炭水化物は、グリコシル化タンパク質上の酵母
炭水化物部分に対する抗体を発生させて、取り込んだ酵
母炭水化物を含むワクチン免疫源がほとんどのホ乳類の
種に存在する抗酵母抗体と反応し、そうして、免疫源及
びワクチンとしての有効性を減じる可能性があるという
問題が生じる。
【００２０】過グリコシル化及び完全なマンノプロテイ
ンとマンノペプチドの取り込みは、以下のどの方法によ
っても、ふせぐことができて、ＨＢＶｐｒｅＳとＳポリ
ペプチド、及びこれに対応する粒子においてグリコシル
化を制限することができる。
ンとマンノペプチドの取り込みは、以下のどの方法によ
っても、ふせぐことができて、ＨＢＶｐｒｅＳとＳポリ
ペプチド、及びこれに対応する粒子においてグリコシル
化を制限することができる。
【００２１】第１に、Ｎ結合過グリコシル化は、外因性
物質（たとえばツニカマイシン）が成長培地中に存在す
ることによって、組み換えホスト成長時に防止又は制限
できる。第２に、組み換え、又は固有な起源のポリペプ
チドを化学的に（たとえば無水トリフルオロメタン−ス
ルホン酸、又は無水フッ化水素）、あるいは酵素的に
（たとえばＮ−グリカナーゼ、Ｅｎｄｏ−Ｆ又はＥｎｄ
ｏ−Ｈを用いて）、あるいは物理的に（たとえば音波処
理）、脱グリコシル化できる。第３に、グリコシル化の
認識部位をＤＮＡレベルの突然変異誘発で変化させたり
欠失させたりして、コアグリコシル化、及び同時に過グ
リコシル化をふせぐことができる。グリコシル化認識配
列を（酵母中で活性の適当なプロモーターによって）変
えた修飾ｐｒｅＳ＋ＳＯＲＦは、酵母ホスト細胞内に形
質転換する。得られたｐｒｅＳ＋Ｓポリペプチドはグリ
コシル化していない。第４に、グリコシル化に必要な決
定的酵素を欠くホスト細胞が同定され得る。これは、本
発明を説明するものであるが、しかし本発明をこれに限
定するものではない。このような酵母の１つ（ｍｎｎ９
突然変異体）が同定されているが〔Ballou.L. ら（１９
８０）J.Biol.Chem.２５５、pp５９８６〜５９９１〕、
これは、Ｎ結合グリカンの伸長（過グリコシル化）に必
要なグリコシル化経路の決定的酵素を欠いており、化学
分析によって、この突然変異体は外部鎖(outer chain)
のマンノース残基がなく“コア”炭水化物だけを有する
マンノプロテインを作ることが示されている〔Ballou.
C.E. ら、（１９８６）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,８
３、pp３０８１〜３０８５；Tsai.P. ら（１９８４）J.
Biol.Chem.２５９、pp３８０５〜３８１１〕。Ｓ又はｐ
ｒｅＳ＋Ｓポリペプチドに対するＯＲＦ（酵母中で活性
な適当なプロモーターによる転写）を用いて、このよう
なｍｎｎ９突然変異酵母を形質転換する。得られたｐｒ
ｅＳ＋Ｓポリペプチドは“コア”グリコシル化のみで過
グリコシル化していない。
物質（たとえばツニカマイシン）が成長培地中に存在す
ることによって、組み換えホスト成長時に防止又は制限
できる。第２に、組み換え、又は固有な起源のポリペプ
チドを化学的に（たとえば無水トリフルオロメタン−ス
ルホン酸、又は無水フッ化水素）、あるいは酵素的に
（たとえばＮ−グリカナーゼ、Ｅｎｄｏ−Ｆ又はＥｎｄ
ｏ−Ｈを用いて）、あるいは物理的に（たとえば音波処
理）、脱グリコシル化できる。第３に、グリコシル化の
認識部位をＤＮＡレベルの突然変異誘発で変化させたり
欠失させたりして、コアグリコシル化、及び同時に過グ
リコシル化をふせぐことができる。グリコシル化認識配
列を（酵母中で活性の適当なプロモーターによって）変
えた修飾ｐｒｅＳ＋ＳＯＲＦは、酵母ホスト細胞内に形
質転換する。得られたｐｒｅＳ＋Ｓポリペプチドはグリ
コシル化していない。第４に、グリコシル化に必要な決
定的酵素を欠くホスト細胞が同定され得る。これは、本
発明を説明するものであるが、しかし本発明をこれに限
定するものではない。このような酵母の１つ（ｍｎｎ９
突然変異体）が同定されているが〔Ballou.L. ら（１９
８０）J.Biol.Chem.２５５、pp５９８６〜５９９１〕、
これは、Ｎ結合グリカンの伸長（過グリコシル化）に必
要なグリコシル化経路の決定的酵素を欠いており、化学
分析によって、この突然変異体は外部鎖(outer chain)
のマンノース残基がなく“コア”炭水化物だけを有する
マンノプロテインを作ることが示されている〔Ballou.
C.E. ら、（１９８６）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,８
３、pp３０８１〜３０８５；Tsai.P. ら（１９８４）J.
Biol.Chem.２５９、pp３８０５〜３８１１〕。Ｓ又はｐ
ｒｅＳ＋Ｓポリペプチドに対するＯＲＦ（酵母中で活性
な適当なプロモーターによる転写）を用いて、このよう
なｍｎｎ９突然変異酵母を形質転換する。得られたｐｒ
ｅＳ＋Ｓポリペプチドは“コア”グリコシル化のみで過
グリコシル化していない。
【００２２】酵母中で発現した場合、Ｓポリペプチドは
グリコシル化も過グリコシル化もしていないが、それら
から成る粒子は酵母マンノペプチド由来の取り込んだ炭
水化物を高いレベルで有している。したがって、過グリ
コシル化しない酵母細胞中で、ｐｒｅＳを含むポリペプ
チドと同様にＳポリペプチドの発現は、発現した２２nm
粒子内の炭水化物が低いレベルになっている。
グリコシル化も過グリコシル化もしていないが、それら
から成る粒子は酵母マンノペプチド由来の取り込んだ炭
水化物を高いレベルで有している。したがって、過グリ
コシル化しない酵母細胞中で、ｐｒｅＳを含むポリペプ
チドと同様にＳポリペプチドの発現は、発現した２２nm
粒子内の炭水化物が低いレベルになっている。
【００２３】酵母(S.cerevisiae)は、免疫学的に活性な
２２nm粒子を発現する能力で大いに有用性を示す。これ
らの粒子はワクチンに処方されると、活動性のＨＢＶに
よる対抗からチンパンジーを完全に防御できることがわ
かっている。さらに、酵母由来のＨＢｓＡｇは、血清由
来のＨＢｓＡｇのようにヒトの臨床試験において免疫学
的に効果がある。したがって、組み換えＨＢｓＡｇの合
成を指示するホスト種としての酵母（S.cerevisiae) の
有用性は十分に確立している。
２２nm粒子を発現する能力で大いに有用性を示す。これ
らの粒子はワクチンに処方されると、活動性のＨＢＶに
よる対抗からチンパンジーを完全に防御できることがわ
かっている。さらに、酵母由来のＨＢｓＡｇは、血清由
来のＨＢｓＡｇのようにヒトの臨床試験において免疫学
的に効果がある。したがって、組み換えＨＢｓＡｇの合
成を指示するホスト種としての酵母（S.cerevisiae) の
有用性は十分に確立している。
【００２４】多様な組み換え微生物発現システムにおい
て、多くの異なったポリペプチドの合成がホスト細胞に
有害であることがわかっている。その結果、このような
ポリペプチドの発現に対する選択的圧力があり、そのた
め大規模にこのような組み換え培養を行なって蓄積する
唯一の細胞は、外来ポリペプチドの発現をしないか又は
ごく少量の外来ポリペプチドしか発現しないので培養が
そのポリペプチドの源泉として不経済になってしまうよ
うな細胞である。場合によっては、悪影響が大きいため
に、発現が強力な構成プロモーターによって行なわれる
場合には、新たに形質転換した細胞は選択プレート上で
は増殖したりコロニーを形成したりしない。これらの悪
影響は、誘導プロモーターを用いてこのようなポリペプ
チドの合成を行なうことにより、ふせぐことができる。
多くの誘導可能な遺伝子が酵母（S.cerevisiae）には存
在する。４つのよく特徴づけられた誘導可能な遺伝子系
は、ガラクトース（ＧＡＬ）利用遺伝子、アルコール・
デヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）遺伝子、α交配因子遺
伝子、及びｐｈｏ５遺伝子である。
て、多くの異なったポリペプチドの合成がホスト細胞に
有害であることがわかっている。その結果、このような
ポリペプチドの発現に対する選択的圧力があり、そのた
め大規模にこのような組み換え培養を行なって蓄積する
唯一の細胞は、外来ポリペプチドの発現をしないか又は
ごく少量の外来ポリペプチドしか発現しないので培養が
そのポリペプチドの源泉として不経済になってしまうよ
うな細胞である。場合によっては、悪影響が大きいため
に、発現が強力な構成プロモーターによって行なわれる
場合には、新たに形質転換した細胞は選択プレート上で
は増殖したりコロニーを形成したりしない。これらの悪
影響は、誘導プロモーターを用いてこのようなポリペプ
チドの合成を行なうことにより、ふせぐことができる。
多くの誘導可能な遺伝子が酵母（S.cerevisiae）には存
在する。４つのよく特徴づけられた誘導可能な遺伝子系
は、ガラクトース（ＧＡＬ）利用遺伝子、アルコール・
デヒドロゲナーゼ２（ＡＤＨ２）遺伝子、α交配因子遺
伝子、及びｐｈｏ５遺伝子である。
【００２５】酵母（S.cerevisiae）は、成長のための炭
素源としてガラクトースを利用するための要因となる酵
素をエンコードする５遺伝子を持つ。ＧＡＬ１、ＧＡＬ
２、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０遺伝子は、それ
ぞれ、ガラクトキナーゼ、ガラクトース、パーミアー
ゼ、ホスホグルコムターゼの主要イソ酵素、ウリジルト
ランスフェラーゼ及びウリジン、ジホスホガラクトース
−４−エピメラーゼをエンコードする。ガラクトースが
存在しない場合、これらの酵素の発現はほとんど検出さ
れない。細胞がグルコースで成長した後にガラクトース
が培養に加えられると、（ＧＡＬ５が約５倍誘導される
他は）これらの３つの酵素はＲＮＡ転写のレベルで同調
的に少なくとも１０００倍誘導される。ＧＡＬ１、ＧＡ
Ｌ２、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０遺伝子は分子
レベルでクローニングされて配列決定されている。それ
ぞれの解読領域の５’側に対する調節及びプロモーター
配列は、ＩａｃＺ遺伝子の解読領域に隣接して位置す
る。これらの実験は、ガラクトース誘導に必要かつ十分
なこれらのプロモーター及び調節配列を定義した。
素源としてガラクトースを利用するための要因となる酵
素をエンコードする５遺伝子を持つ。ＧＡＬ１、ＧＡＬ
２、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０遺伝子は、それ
ぞれ、ガラクトキナーゼ、ガラクトース、パーミアー
ゼ、ホスホグルコムターゼの主要イソ酵素、ウリジルト
ランスフェラーゼ及びウリジン、ジホスホガラクトース
−４−エピメラーゼをエンコードする。ガラクトースが
存在しない場合、これらの酵素の発現はほとんど検出さ
れない。細胞がグルコースで成長した後にガラクトース
が培養に加えられると、（ＧＡＬ５が約５倍誘導される
他は）これらの３つの酵素はＲＮＡ転写のレベルで同調
的に少なくとも１０００倍誘導される。ＧＡＬ１、ＧＡ
Ｌ２、ＧＡＬ５、ＧＡＬ７及びＧＡＬ１０遺伝子は分子
レベルでクローニングされて配列決定されている。それ
ぞれの解読領域の５’側に対する調節及びプロモーター
配列は、ＩａｃＺ遺伝子の解読領域に隣接して位置す
る。これらの実験は、ガラクトース誘導に必要かつ十分
なこれらのプロモーター及び調節配列を定義した。
【００２６】酵母（S.cerevisiae）はまた３’遺伝子を
持つが、これらはそれぞれアルコール・デヒドロゲナー
ゼ（ＡＤＨ）のイソ酵素をエンコードする。これら酵素
のひとつＡＤＨIIは、酸化的成長時に炭素源としてエタ
ノールを酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が利用する
能力を与える。ＡＤＨＩＩイソ酵素をエンコードするＡ
ＤＨ２遺伝子の発現は、グルコースによって異化産物抑
制されるので、グルコースが０．１％(w/v) のレベルで
存在する発酵成長時にはほとんどＡＤＨ２の転写はな
い。グルコースが消耗されて抑制を行なわない炭素源が
存在すると、ＡＤＨ２遺伝子の転写は１００ないし１０
００倍に誘導される。この遺伝子は分子レベルでクロー
ニングされて配列決定しており、転写の脱抑制に必要か
つ十分な抑制及びプロモーター配列が定義されている。
持つが、これらはそれぞれアルコール・デヒドロゲナー
ゼ（ＡＤＨ）のイソ酵素をエンコードする。これら酵素
のひとつＡＤＨIIは、酸化的成長時に炭素源としてエタ
ノールを酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が利用する
能力を与える。ＡＤＨＩＩイソ酵素をエンコードするＡ
ＤＨ２遺伝子の発現は、グルコースによって異化産物抑
制されるので、グルコースが０．１％(w/v) のレベルで
存在する発酵成長時にはほとんどＡＤＨ２の転写はな
い。グルコースが消耗されて抑制を行なわない炭素源が
存在すると、ＡＤＨ２遺伝子の転写は１００ないし１０
００倍に誘導される。この遺伝子は分子レベルでクロー
ニングされて配列決定しており、転写の脱抑制に必要か
つ十分な抑制及びプロモーター配列が定義されている。
【００２７】α交配因子は、ＭＡＴαとＭＡＴａ細胞の
交配に必要な酵母（S.cerevisiae）の性フェロモンであ
る。このトリデカペプチドは、粗面小胞体内に導びかれ
て、グリコシル化されてタンパク質分解的に処理されて
から最終的な完全な形態で細胞から分泌されるプレプロ
フェロモンとして発現する。この生化学的終路は、外来
ポリペプチドの発現方法として利用される。α交配因子
遺伝子は、分子レベルでクローニングされていて、その
プレプロリーダー配列は多様なポリペプチドの発現と分
泌に利用されている。同様に、ｐｈｏ５遺伝子が低リン
酸濃度で誘導可能なことがわかっており、これはまた、
酵母内で外来タンパク質を生理的に制御して発現するの
に有用である。
交配に必要な酵母（S.cerevisiae）の性フェロモンであ
る。このトリデカペプチドは、粗面小胞体内に導びかれ
て、グリコシル化されてタンパク質分解的に処理されて
から最終的な完全な形態で細胞から分泌されるプレプロ
フェロモンとして発現する。この生化学的終路は、外来
ポリペプチドの発現方法として利用される。α交配因子
遺伝子は、分子レベルでクローニングされていて、その
プレプロリーダー配列は多様なポリペプチドの発現と分
泌に利用されている。同様に、ｐｈｏ５遺伝子が低リン
酸濃度で誘導可能なことがわかっており、これはまた、
酵母内で外来タンパク質を生理的に制御して発現するの
に有用である。
【００２８】粗面小胞体とゴルジ体の断面から予想され
るように、外来タンパク質はＮ，Ｏどちらの結合のグリ
コシル化も受けることができる。α交配因子プロモータ
ーは、表現型αの細胞内でのみ活性である。酵母には
（ＳＩＲとして知られる）４つの遺伝部位があり、ａ及
びα情報の他の通常はサイレントなコピーの抑制に必要
なタンパク質を合成する。この抑制作用をさまたげる温
度感受性（ｔｓ）突然変異が、これらの部位の少なくと
も１つの遺伝子生成物に存在する。この突然変異体では
３５℃での成長は抑制を無効にするため、α交配因子プ
ロモーターが不活性の表現型ａ／αの細胞が生じる。温
度を２３℃に変えると、細胞の表現型がαに戻って、プ
ロモーターは活性となる。ｔｓＳＩＲ突然変異を有する
株の使用が、数種の外来ポリペプチドの抑制発現のため
に行なわれている。
るように、外来タンパク質はＮ，Ｏどちらの結合のグリ
コシル化も受けることができる。α交配因子プロモータ
ーは、表現型αの細胞内でのみ活性である。酵母には
（ＳＩＲとして知られる）４つの遺伝部位があり、ａ及
びα情報の他の通常はサイレントなコピーの抑制に必要
なタンパク質を合成する。この抑制作用をさまたげる温
度感受性（ｔｓ）突然変異が、これらの部位の少なくと
も１つの遺伝子生成物に存在する。この突然変異体では
３５℃での成長は抑制を無効にするため、α交配因子プ
ロモーターが不活性の表現型ａ／αの細胞が生じる。温
度を２３℃に変えると、細胞の表現型がαに戻って、プ
ロモーターは活性となる。ｔｓＳＩＲ突然変異を有する
株の使用が、数種の外来ポリペプチドの抑制発現のため
に行なわれている。
【００２９】本発明の目的はエントラップされた（取り
込まれた）炭水化物含量が実質的に減少した粒子を形成
する変異体ＨＢＶ表面タンパク質を提供することであ
る。本発明のもう１つの目的は粒子を形成しまたエント
ラップされた炭水化物含量を実質的に減少することがで
きる変異体ＨＢＶ表面タンパク質を酵母宿主中で生産す
る方法を提供することである。また本発明の目的は変異
体ＨＢＶ又はＨＢＶと血清学的に関係のある他の薬剤に
よる病気及び／又は感染の防御の能動的及び受動的両治
療のためのエントラップされた炭水化物含量が実質的に
減少した変異体ＨＢＶ表面タンパク質粒子を包含してい
る変異体ＨＢＶに対するワクチンを提供し、そのような
病気及び／又は感染の診断用試薬の開発のための抗原及
び免疫原を提供することである。更に本発明の目的は組
換え体宿主細胞の大規模な生育条件及び組換え変異体Ｈ
ＢＶ表面タンパク質の精製を提供することである。本発
明のこれら及び他の目的は以下の記載から明らかになろ
う。
込まれた）炭水化物含量が実質的に減少した粒子を形成
する変異体ＨＢＶ表面タンパク質を提供することであ
る。本発明のもう１つの目的は粒子を形成しまたエント
ラップされた炭水化物含量を実質的に減少することがで
きる変異体ＨＢＶ表面タンパク質を酵母宿主中で生産す
る方法を提供することである。また本発明の目的は変異
体ＨＢＶ又はＨＢＶと血清学的に関係のある他の薬剤に
よる病気及び／又は感染の防御の能動的及び受動的両治
療のためのエントラップされた炭水化物含量が実質的に
減少した変異体ＨＢＶ表面タンパク質粒子を包含してい
る変異体ＨＢＶに対するワクチンを提供し、そのような
病気及び／又は感染の診断用試薬の開発のための抗原及
び免疫原を提供することである。更に本発明の目的は組
換え体宿主細胞の大規模な生育条件及び組換え変異体Ｈ
ＢＶ表面タンパク質の精製を提供することである。本発
明のこれら及び他の目的は以下の記載から明らかになろ
う。
【００３０】変異体ＨＢＶ表面タンパク質は野生型又は
タンパク質をグリコシル化する能力が遺伝的に欠落して
いる組換え体酵母宿主中で高収率で発現されている。酵
母細胞中の変異体ＨＢＶ表面タンパク質の発現は特徴的
なＨＢｓＡｇ粒子の形成を生じる。酵母細胞中のこれら
の粒子の形成は粒子内で酵母細胞物質のエントラップメ
ント（取り込み）を生じる。“野生型”酵母細胞を用い
ると実質量の酵母細胞炭水化物がＨＢｓＡｇ粒子内でエ
ントラップされるようになる。実質量の炭水化物を含有
する粒子からなるＨＢＶワクチンの生産を妨げるために
タンパク質をグリコシル化する能力が遺伝的に欠落して
いる組換え体酵母細胞から産生し精製した。このような
宿主によって産生した変異体ＨＢＶ表面タンパク質は野
生型酵母細胞中で産生した粒子より実質的に少ない炭水
化物を含有する粒子を形成する。これらの変異体ＨＢＶ
表面タンパク質はＨＢＶ関連の感染の治療及び／又は予
防用ワクチンとしてまた天然の抗酵母抗体との反応性の
低下及び変異体ウイルスに対する反応性の改良による免
疫診断用抗原として有用である。
タンパク質をグリコシル化する能力が遺伝的に欠落して
いる組換え体酵母宿主中で高収率で発現されている。酵
母細胞中の変異体ＨＢＶ表面タンパク質の発現は特徴的
なＨＢｓＡｇ粒子の形成を生じる。酵母細胞中のこれら
の粒子の形成は粒子内で酵母細胞物質のエントラップメ
ント（取り込み）を生じる。“野生型”酵母細胞を用い
ると実質量の酵母細胞炭水化物がＨＢｓＡｇ粒子内でエ
ントラップされるようになる。実質量の炭水化物を含有
する粒子からなるＨＢＶワクチンの生産を妨げるために
タンパク質をグリコシル化する能力が遺伝的に欠落して
いる組換え体酵母細胞から産生し精製した。このような
宿主によって産生した変異体ＨＢＶ表面タンパク質は野
生型酵母細胞中で産生した粒子より実質的に少ない炭水
化物を含有する粒子を形成する。これらの変異体ＨＢＶ
表面タンパク質はＨＢＶ関連の感染の治療及び／又は予
防用ワクチンとしてまた天然の抗酵母抗体との反応性の
低下及び変異体ウイルスに対する反応性の改良による免
疫診断用抗原として有用である。
【００３１】本発明はＨＢＶに対するワクチン又は診断
用として有用な実質的に減少した量のエントラップされ
た炭水化物を含有することができる抗原性変異体ＨＢＶ
表面タンパク質粒子の製造方法に関する。
用として有用な実質的に減少した量のエントラップされ
た炭水化物を含有することができる抗原性変異体ＨＢＶ
表面タンパク質粒子の製造方法に関する。
【００３２】デーン粒子（血清型ａｄｗ）をウイルスＯ
ＲＦ単離のためのＨＢＶ核酸源に利用した。この分野に
通じる者には明らかなように、本発明は、ＨＢＶ株又は
ウイルスの遺伝的多様性による他の血清学的反応性を持
ったウイルスの核酸の使用も含む。もともとＨＢヴィリ
オン中に存在する切れ目を持ち(nicked)ギャップのある
(gapped)形態の核酸からＨＢＶゲノムの共有結合して閉
じた環状二重鎖ＤＮＡを生成するために、生体内起源の
ポリメラーゼ反応を用いた。ＤＮＡを単離して、Ｅｃｏ
ＲＩで完全に切断し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位内
へクローニングすることによって、ｐＨＢＶ／ＡＤＷ−
１を作った。ｐｒｅＳ領域のＥｃｏＲＩ部位に環状順列
形態のＨＢＶゲノムを持つ組み換えプラスミドを選択し
た。ｐｒｅＳ２領域の５５のアミノ酸、及びＳ領域の２
２６のアミノ酸をエンコードする完全なＯＲＦを、Ｅｃ
ｏＲＩとＡｃｃＩでｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を切断した後
に、まず得られた０．８キロベース対（kbp)フラグメン
トを精製して構成した。このフラグメントは、開始コド
ン、アミノ末端の３つのアミノ酸、カルボキシ末端の３
つのアミノ酸、及び翻訳ターミネーターコドンだけを欠
失しているｐｒｅＳ２＋Ｓポリペプチドをエンコードす
る。
ＲＦ単離のためのＨＢＶ核酸源に利用した。この分野に
通じる者には明らかなように、本発明は、ＨＢＶ株又は
ウイルスの遺伝的多様性による他の血清学的反応性を持
ったウイルスの核酸の使用も含む。もともとＨＢヴィリ
オン中に存在する切れ目を持ち(nicked)ギャップのある
(gapped)形態の核酸からＨＢＶゲノムの共有結合して閉
じた環状二重鎖ＤＮＡを生成するために、生体内起源の
ポリメラーゼ反応を用いた。ＤＮＡを単離して、Ｅｃｏ
ＲＩで完全に切断し、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位内
へクローニングすることによって、ｐＨＢＶ／ＡＤＷ−
１を作った。ｐｒｅＳ領域のＥｃｏＲＩ部位に環状順列
形態のＨＢＶゲノムを持つ組み換えプラスミドを選択し
た。ｐｒｅＳ２領域の５５のアミノ酸、及びＳ領域の２
２６のアミノ酸をエンコードする完全なＯＲＦを、Ｅｃ
ｏＲＩとＡｃｃＩでｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を切断した後
に、まず得られた０．８キロベース対（kbp)フラグメン
トを精製して構成した。このフラグメントは、開始コド
ン、アミノ末端の３つのアミノ酸、カルボキシ末端の３
つのアミノ酸、及び翻訳ターミネーターコドンだけを欠
失しているｐｒｅＳ２＋Ｓポリペプチドをエンコードす
る。
【００３３】オリゴヌクレオチドを合成してこのフラグ
メントと結合させて、酵母由来の１０bpの非翻訳５’隣
接配列を含むＨｉｎｄIII フラグメントに変えて、完全
なｐｒｅＳ２＋ＳＯＲＦを選択してターミネーションコ
ドンを直接にＡＤＨ１転写ターミネーター中の固有Ｈｉ
ｎｄIII 部位に結合させた。こうして全く付加的な介在
塩基のない完全な固有の酵母由来の接合体を作った。
メントと結合させて、酵母由来の１０bpの非翻訳５’隣
接配列を含むＨｉｎｄIII フラグメントに変えて、完全
なｐｒｅＳ２＋ＳＯＲＦを選択してターミネーションコ
ドンを直接にＡＤＨ１転写ターミネーター中の固有Ｈｉ
ｎｄIII 部位に結合させた。こうして全く付加的な介在
塩基のない完全な固有の酵母由来の接合体を作った。
【００３４】 伝子ＧＡＰ６３（ＧＡＰ）の非翻訳リーダー（ＮＴＬ）
に対する配列に対応するように選んだ〔Holland.J.Bio
l.Chem., ２２５、２５９６（１９８０）〕が、これは
またＧＡＰ遺伝子ファミリーに対する共通配列である。
全く付加的な塩基の介在がないｐｒｅＳ２＋ＳＯＲＦの
開始コドンにＮＴＬを直接に結合するように構成を行な
った。したがってこの分野に通じる者には明らかなよう
に、ＨＢＶ表面タンパク質の発現のためのＮＴＬ配列の
選択には適当な発現レベルをもたらす他の配列も含まれ
る。
に対する配列に対応するように選んだ〔Holland.J.Bio
l.Chem., ２２５、２５９６（１９８０）〕が、これは
またＧＡＰ遺伝子ファミリーに対する共通配列である。
全く付加的な塩基の介在がないｐｒｅＳ２＋ＳＯＲＦの
開始コドンにＮＴＬを直接に結合するように構成を行な
った。したがってこの分野に通じる者には明らかなよう
に、ＨＢＶ表面タンパク質の発現のためのＮＴＬ配列の
選択には適当な発現レベルをもたらす他の配列も含まれ
る。
【００３５】ＤＮＡ配列分析で、ｐＨＢｐｒｅＳＧＡＰ
３４７／１９ＴのＤＮＡがエンコードするｐｒｅＳ２＋
Ｓ配列とはちがったアミノ酸をもたらす２つの塩基の置
換がわかった〔Valenzuelaら、Biotechnology 、３
（４）、３１７〜３２０（１９８５）〕。両方の構成に
ついて同一のポリペプチドを評価するために、これらの
ヌクレオチド置換基、すなわち、（ＬｅｕでなくＰｈｅ
をエンコードする）ＨＢＶｐｒｅＳ２＋Ｓの８４６bpＯ
ＲＦの塩基６４におけるＣにかわるＴ、及び（Ｇｌｎで
なくＨｉｓをエンコードする）塩基３５２におけるＡの
かわりのＣを、部位特異的突然変異誘発で変化させた
〔Zollerら、Nucleic Acids Research１０：６４８７〜
６５００（１９８２）〕。このエンコードされた最適な
構成に対するアミノ酸配列を、今度は検定した。この分
野に通じる者には明らかなように、本発明はこの配列に
限られるものではなく、ＨＢＶ関連抗原性のあるポリペ
プチドをＤＮＡがエンコードするようなすべての配列を
含む。
３４７／１９ＴのＤＮＡがエンコードするｐｒｅＳ２＋
Ｓ配列とはちがったアミノ酸をもたらす２つの塩基の置
換がわかった〔Valenzuelaら、Biotechnology 、３
（４）、３１７〜３２０（１９８５）〕。両方の構成に
ついて同一のポリペプチドを評価するために、これらの
ヌクレオチド置換基、すなわち、（ＬｅｕでなくＰｈｅ
をエンコードする）ＨＢＶｐｒｅＳ２＋Ｓの８４６bpＯ
ＲＦの塩基６４におけるＣにかわるＴ、及び（Ｇｌｎで
なくＨｉｓをエンコードする）塩基３５２におけるＡの
かわりのＣを、部位特異的突然変異誘発で変化させた
〔Zollerら、Nucleic Acids Research１０：６４８７〜
６５００（１９８２）〕。このエンコードされた最適な
構成に対するアミノ酸配列を、今度は検定した。この分
野に通じる者には明らかなように、本発明はこの配列に
限られるものではなく、ＨＢＶ関連抗原性のあるポリペ
プチドをＤＮＡがエンコードするようなすべての配列を
含む。
【００３６】ｐＵＣ１９及びＨＢｓＡｇ解読領域を含む
３．３kbp の大型ＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩと
ＳｔｙＩで切断した後にｐｒｅＳ２をエンコードするＤ
ＮＡフラグメントから分離して、分取アガロースゲル電
気泳動で精製した。その後、合成ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドをｐＵＣ１９−ＨＢｓＡｇフラグメントに結合し
た。この合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、５’Ｅｃｏ
ＲＩと３’ＳｔｙＩ粘着末端を持つと同時に５’Ｅｃｏ
ＲＩ部位につづいてすぐＨｉｎｄIII 部位を持つ。さら
に、この合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＨＢｓＡｇ
ＡＴＧコドンに加えて、ＳｔｙＩ部位を含めた９つの上
流ヌクレオチドと２１の下流ヌクレオチドを持つ。
３．３kbp の大型ＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩと
ＳｔｙＩで切断した後にｐｒｅＳ２をエンコードするＤ
ＮＡフラグメントから分離して、分取アガロースゲル電
気泳動で精製した。その後、合成ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドをｐＵＣ１９−ＨＢｓＡｇフラグメントに結合し
た。この合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、５’Ｅｃｏ
ＲＩと３’ＳｔｙＩ粘着末端を持つと同時に５’Ｅｃｏ
ＲＩ部位につづいてすぐＨｉｎｄIII 部位を持つ。さら
に、この合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、ＨＢｓＡｇ
ＡＴＧコドンに加えて、ＳｔｙＩ部位を含めた９つの上
流ヌクレオチドと２１の下流ヌクレオチドを持つ。
【００３７】このオリゴヌクレオチドはＨＢｓＡｇの完
全な解読領域を再構成し、ＨｉｎｄIII での切断による
ｐＵＣ１９ベースのベクターから、あとでそのままとり
のぞくことができる。
全な解読領域を再構成し、ＨｉｎｄIII での切断による
ｐＵＣ１９ベースのベクターから、あとでそのままとり
のぞくことができる。
【００３８】前述の結合した合成ＤＮＡオリゴヌクレオ
チドを持ったｐＵＣ１９−ＨＢｓＡｇＤＮＡフラグメン
トを用いて大腸菌(E.coli)を形質転換した。完全な再構
成ＨＢｓＡｇ解読領域を持つ組み換えプラスミドを選択
した。この完全なＨＢｓＡｇオープン・リーディング・
フレーム（ＯＲＦ）を、ＨｉｎｄIII で切断して組み換
えプラスミドからとりのぞいた後に、単離して、分取ア
ガロース・ゲル電気泳動で０．７kbp のＨＢｓＡｇＤＮ
Ａを精製して、ＧＡＬ１０プロモーター発現ベクターの
中にクローニングした。
チドを持ったｐＵＣ１９−ＨＢｓＡｇＤＮＡフラグメン
トを用いて大腸菌(E.coli)を形質転換した。完全な再構
成ＨＢｓＡｇ解読領域を持つ組み換えプラスミドを選択
した。この完全なＨＢｓＡｇオープン・リーディング・
フレーム（ＯＲＦ）を、ＨｉｎｄIII で切断して組み換
えプラスミドからとりのぞいた後に、単離して、分取ア
ガロース・ゲル電気泳動で０．７kbp のＨＢｓＡｇＤＮ
Ａを精製して、ＧＡＬ１０プロモーター発現ベクターの
中にクローニングした。
【００３９】ｐｒｅＳ１又はｐｒｅＳ２をコードする領
域を含まず変異体“ａ”エピトープＨＢｓＡｇＯＲＦを
含むｐＵＣ１９ベースプラスミドは次の通り構築され
た。前述の完全ＨＢｓＡｇをコードする領域を含むｐＵ
Ｃ１９−ＨＢｓＡｇプラスミドをポリメラーゼ鎖反応
（ＰＣＲ）の鋳型として用いて、ＨＢｓＡｇの１４５ア
ミノ酸にＧｌｙからＡｒｇにアミノ酸置換が生じる５８
７位（ＨＢＶゲノムのユニークなＥｃｏＲＩ部位から数
えた）に１個の塩基置換を含むＤＮＡを合成した。変異
体ＨＢｓＡｇの完全コード領域はＨｉｎｄIII で切断し
てｐＵＣ１９ベースベクターからそのまま取り出すこと
ができる。ｐＵＣ１９−変異体ＨＢｓＡｇプラスミドは
Ｅ．コリを形質転換するために用いた。完全変異体ＨＢ
ｓＡｇをコードする領域を有する組換え体プラスミドを
選択した。完全変異体ＨＢｓＡｇＯＲＦをＨｉｎｄIII
で切断してこの組換え体プラスミドから取り出した後、
ＧＡＬ１０プロモーター発現ベクターにクローン化する
ために分離用アガロースゲル電気泳動によって０．７kb
p の変異体ＨＢｓＡｇＤＮＡを分離精製した。
域を含まず変異体“ａ”エピトープＨＢｓＡｇＯＲＦを
含むｐＵＣ１９ベースプラスミドは次の通り構築され
た。前述の完全ＨＢｓＡｇをコードする領域を含むｐＵ
Ｃ１９−ＨＢｓＡｇプラスミドをポリメラーゼ鎖反応
（ＰＣＲ）の鋳型として用いて、ＨＢｓＡｇの１４５ア
ミノ酸にＧｌｙからＡｒｇにアミノ酸置換が生じる５８
７位（ＨＢＶゲノムのユニークなＥｃｏＲＩ部位から数
えた）に１個の塩基置換を含むＤＮＡを合成した。変異
体ＨＢｓＡｇの完全コード領域はＨｉｎｄIII で切断し
てｐＵＣ１９ベースベクターからそのまま取り出すこと
ができる。ｐＵＣ１９−変異体ＨＢｓＡｇプラスミドは
Ｅ．コリを形質転換するために用いた。完全変異体ＨＢ
ｓＡｇをコードする領域を有する組換え体プラスミドを
選択した。完全変異体ＨＢｓＡｇＯＲＦをＨｉｎｄIII
で切断してこの組換え体プラスミドから取り出した後、
ＧＡＬ１０プロモーター発現ベクターにクローン化する
ために分離用アガロースゲル電気泳動によって０．７kb
p の変異体ＨＢｓＡｇＤＮＡを分離精製した。
【００４０】発現カセット（ｐＧＡＬ１０−ｔＡＤＨ
１）は、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１０プロモーターか
ら下流の唯一のＨｉｎｄIII 部位に挿入された外来遺伝
子の発現を行なう。前記の（ＨｉｎｄIII 末端を持つ）
ＨＢｓＡｇＯＲＦを、ベクターのＨｉｎｄIII 部位に結
合した。この発現カセットを大腸菌(E.coli)のシャトル
・ベクターｐＣ１／１（前出Beggs)のＳｐｈＩ部位の間
に挿入して、このベクターを酵母（S.cerevisiae）株Ｃ
Ｆ５２又はＣＦ５４に導入して、形質転換したクローン
を選択した。
１）は、ガラクトース誘導性ＧＡＬ１０プロモーターか
ら下流の唯一のＨｉｎｄIII 部位に挿入された外来遺伝
子の発現を行なう。前記の（ＨｉｎｄIII 末端を持つ）
ＨＢｓＡｇＯＲＦを、ベクターのＨｉｎｄIII 部位に結
合した。この発現カセットを大腸菌(E.coli)のシャトル
・ベクターｐＣ１／１（前出Beggs)のＳｐｈＩ部位の間
に挿入して、このベクターを酵母（S.cerevisiae）株Ｃ
Ｆ５２又はＣＦ５４に導入して、形質転換したクローン
を選択した。
【００４１】上述の変異体ＳＯＲＦをコードする断片は
前述のように〔クニスケルン(Kniskern)等、ジーン、第
４６巻、１３５〜１４１頁（１９８６年）〕、（ａ）Ｇ
ＡＰ４９１プロモーターの約１．１kbp 、（ｂ）酵母由
来フランキング配列１０bp（ｃ）ＳのウイルスＯＲＦの
６８１bp及び（ｄ）酵母ＡＤＨ１ターミネーターの約
０．４kbp からなる発現カセットを構築するために用い
た。
前述のように〔クニスケルン(Kniskern)等、ジーン、第
４６巻、１３５〜１４１頁（１９８６年）〕、（ａ）Ｇ
ＡＰ４９１プロモーターの約１．１kbp 、（ｂ）酵母由
来フランキング配列１０bp（ｃ）ＳのウイルスＯＲＦの
６８１bp及び（ｄ）酵母ＡＤＨ１ターミネーターの約
０．４kbp からなる発現カセットを構築するために用い
た。
【００４２】３種の異なる発現ベクターを用いて、ＨＢ
ｓＡｇ発現カセットを構成した。前述のＧＡＰ４９１プ
ロモーター発現カセット〔Kniskernら、１９８６Gene４
６、pp１３５〜１４１〕は、ｐＢＲ３２２骨格内の約
１．１kbp のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターと約３５０bpの酵
母アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）ターミネ
イターから成り、プロモーターとターミネーターの間に
唯一のＨｉｎｄIII 部位を持つ。実施例２のＨＢｓＡｇ
ＯＲＦを唯一のＨｉｎｄIII 部位に結合して、その存在
と定位を制限エンドヌクレアーゼ分析とサザンブロット
法で確認した。
ｓＡｇ発現カセットを構成した。前述のＧＡＰ４９１プ
ロモーター発現カセット〔Kniskernら、１９８６Gene４
６、pp１３５〜１４１〕は、ｐＢＲ３２２骨格内の約
１．１kbp のグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロ
ゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモーターと約３５０bpの酵
母アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ＡＤＨ１）ターミネ
イターから成り、プロモーターとターミネーターの間に
唯一のＨｉｎｄIII 部位を持つ。実施例２のＨＢｓＡｇ
ＯＲＦを唯一のＨｉｎｄIII 部位に結合して、その存在
と定位を制限エンドヌクレアーゼ分析とサザンブロット
法で確認した。
【００４３】別の方法としては、前記構成中の１．１kb
p のＧＡＰプロモーターを（０．５kbp の）ＧＡＬ１０
プロモーター(Schultzら、１９８７、Gene、５４、pp１
１３〜１２３）に代えるか、もしくはこのＧＡＰプロモ
ーターを（１．２５kbp の）ＡＤＨ２プロモーター（Kn
iskernら、１９８８、Hepatology、８、８２〜８７）に
代えた（第１図参照）。
p のＧＡＰプロモーターを（０．５kbp の）ＧＡＬ１０
プロモーター(Schultzら、１９８７、Gene、５４、pp１
１３〜１２３）に代えるか、もしくはこのＧＡＰプロモ
ーターを（１．２５kbp の）ＡＤＨ２プロモーター（Kn
iskernら、１９８８、Hepatology、８、８２〜８７）に
代えた（第１図参照）。
【００４４】どちらの場合にも、特異的プロモーター、
ＨＢｓＡｇＯＲＦ、及びＡＤＨ１ターミネーターを含む
発現カセットをシャトルベクターｐＣ１／１（Beggs 、
前出；Rosenberg ら、前出）にクローニングして、酵母
発現ベクターを作り、そしてこれを後述するように酵母
（S.cerevisiae）の形質転換に用いた。これらの形質転
換細胞を評価と後の実験のために凍結保存して確保し
た。親株ＣＦ５２を以下のように作った：ＹＥＨＤ完全
培地プレート上で混合することにより、α交配型株ＣＺ
５／ＬＢ３４７−１Ｃ（ｍｎｎ９- 、ＳＵＣＺ- ）をａ
型株２１５０−２−３（ｌｅｕ２- 、ａｄｅｌ- ）と交
配させた。倍数体を選択するために、唯一の炭素源とし
て２％スクロースを含むｌｅｕ- 最小培地に交配した株
をレプリカ平板法で植えつけた。単一のコロニーを単離
した後、倍数体を胞子形成させて、標準的技術で子嚢を
切り取った。ＫＨＹ−１０７株を単一胞子として単離し
て、ｃｉｒ+ 、ａｄｅｌ+ 、ｌｅｕ２- 及びｍｎｎ９-
として特徴づけた(Shiff株技術）。
ＨＢｓＡｇＯＲＦ、及びＡＤＨ１ターミネーターを含む
発現カセットをシャトルベクターｐＣ１／１（Beggs 、
前出；Rosenberg ら、前出）にクローニングして、酵母
発現ベクターを作り、そしてこれを後述するように酵母
（S.cerevisiae）の形質転換に用いた。これらの形質転
換細胞を評価と後の実験のために凍結保存して確保し
た。親株ＣＦ５２を以下のように作った：ＹＥＨＤ完全
培地プレート上で混合することにより、α交配型株ＣＺ
５／ＬＢ３４７−１Ｃ（ｍｎｎ９- 、ＳＵＣＺ- ）をａ
型株２１５０−２−３（ｌｅｕ２- 、ａｄｅｌ- ）と交
配させた。倍数体を選択するために、唯一の炭素源とし
て２％スクロースを含むｌｅｕ- 最小培地に交配した株
をレプリカ平板法で植えつけた。単一のコロニーを単離
した後、倍数体を胞子形成させて、標準的技術で子嚢を
切り取った。ＫＨＹ−１０７株を単一胞子として単離し
て、ｃｉｒ+ 、ａｄｅｌ+ 、ｌｅｕ２- 及びｍｎｎ９-
として特徴づけた(Shiff株技術）。
【００４５】ＫＨＹ１０７（ｃｉｒ０）をBroach〔“Me
thods in Enzymology ”１０１PartＣ、pp３０７〜３２
５（１９８３）〕が述べるようにＫＨＹ１０７（ｃｉｒ
+ ）株からとり出した。キュアーした株を切断したｕｒ
ａ３遺伝子のくみ込みによってｕｒａ３- にした。こう
して得た株ＫＨＹ−１０７ｕｒａ３Δを濃厚な培地で成
長させて自発的突然変異を蓄積させて、カナバニン耐性
突然変異体を選択した。突然変異株ＣＦ５５は、相補性
テストによってｃａｎ１- とわかった。ＧＡＬ１０ｐＧ
ＡＬ４発現カセットをＣＦ５５のＨＩＳ３遺伝子にくみ
こんで（“Method in Enzymology”、１９９０、１８５
pp２９７〜３０９）最終ホスト株ＣＦ５２（Ｍａｔａ
ｌｅｕ２−２、１１２ｕｒａ３Δ ｃａｎ１ｈｉｓ３
Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ＵＲＡ３、ｃｉｒ゜）を
産する。形質転換細胞は、評価と後の実験のために凍結
保存して確保した。
thods in Enzymology ”１０１PartＣ、pp３０７〜３２
５（１９８３）〕が述べるようにＫＨＹ１０７（ｃｉｒ
+ ）株からとり出した。キュアーした株を切断したｕｒ
ａ３遺伝子のくみ込みによってｕｒａ３- にした。こう
して得た株ＫＨＹ−１０７ｕｒａ３Δを濃厚な培地で成
長させて自発的突然変異を蓄積させて、カナバニン耐性
突然変異体を選択した。突然変異株ＣＦ５５は、相補性
テストによってｃａｎ１- とわかった。ＧＡＬ１０ｐＧ
ＡＬ４発現カセットをＣＦ５５のＨＩＳ３遺伝子にくみ
こんで（“Method in Enzymology”、１９９０、１８５
pp２９７〜３０９）最終ホスト株ＣＦ５２（Ｍａｔａ
ｌｅｕ２−２、１１２ｕｒａ３Δ ｃａｎ１ｈｉｓ３
Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ＵＲＡ３、ｃｉｒ゜）を
産する。形質転換細胞は、評価と後の実験のために凍結
保存して確保した。
【００４６】凍結保存しておいた組み換え酵母をＹＥＨ
Ｄ培地で成長させた〔Carty ら、J.Industrial Micro.,
２、１１７〜１２１（１９８７）〕。定常期まで成長さ
せた後に、細胞を収穫した。リゼイトを調製して、ドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離して、ＨＢｓＡｇに対する
抗体を用いて免疫ブロッティングした。ＳＯＲＦの翻訳
生成物の予想される分子量と一致する約２４ＫＤの分子
量のポリペプチドが見つかった。さらに、親酵母ではな
く組み換え酵母のリゼイトは、ラジオイミュノアッセイ
(AusriaR）によってＳに対して陽性だった。部分的に精
製した酵母リゼイトを電子顕微鏡で調べると、高密度の
典型的ＨＢｓＡｇ粒子が見られた。
Ｄ培地で成長させた〔Carty ら、J.Industrial Micro.,
２、１１７〜１２１（１９８７）〕。定常期まで成長さ
せた後に、細胞を収穫した。リゼイトを調製して、ドデ
シル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分離して、ＨＢｓＡｇに対する
抗体を用いて免疫ブロッティングした。ＳＯＲＦの翻訳
生成物の予想される分子量と一致する約２４ＫＤの分子
量のポリペプチドが見つかった。さらに、親酵母ではな
く組み換え酵母のリゼイトは、ラジオイミュノアッセイ
(AusriaR）によってＳに対して陽性だった。部分的に精
製した酵母リゼイトを電子顕微鏡で調べると、高密度の
典型的ＨＢｓＡｇ粒子が見られた。
【００４７】酵母由来プロモーターは、ＨＢｓＡｇ及び
関連遺伝子の転写を開始させる。したがって、この分野
に通じる者には明らかであるが、どの酵母由来プロモー
ター配列も（たとえば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ
２、Ｐｈｏ５、等、ただしこれらに限定されない）ＧＡ
Ｐ４９１プロモーターで代用できる。又、この分野に通
じる者には明らかであるが、免疫学的、又はＲＩＡ、又
はエンザイムイミノアッセイ（ＥＩＡ）等の適当なアッ
セイ方法を用いて、このシステムのＨＢｓＡｇ及び関連
ポリペプチドの発現をアッセイして、最大収量を得る培
養の収穫時期を最適化するべきである。
関連遺伝子の転写を開始させる。したがって、この分野
に通じる者には明らかであるが、どの酵母由来プロモー
ター配列も（たとえば、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ
２、Ｐｈｏ５、等、ただしこれらに限定されない）ＧＡ
Ｐ４９１プロモーターで代用できる。又、この分野に通
じる者には明らかであるが、免疫学的、又はＲＩＡ、又
はエンザイムイミノアッセイ（ＥＩＡ）等の適当なアッ
セイ方法を用いて、このシステムのＨＢｓＡｇ及び関連
ポリペプチドの発現をアッセイして、最大収量を得る培
養の収穫時期を最適化するべきである。
【００４８】ＧＡＰ４９１プロモーターは、ＨＢｓＡｇ
を含む数種の外来タンパク質の酵母内での発現に有用で
ある〔Bitterら、Gene、３２：２６３〜２７４、（１９
８４）：Wampler ら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 、８２：
６８３０〜６８３４、（１９８５）〕。可溶酵母タンパ
ク質の約４０％までＨＢｃＡｇを発現するという前述の
結果（Kniskernら、前出）に基づき、我々は、適当な酵
母ホスト細胞中のＨＢｓＡｇ及び関連タンパク質の発現
を行なうためにこのプロモーターを用いた。
を含む数種の外来タンパク質の酵母内での発現に有用で
ある〔Bitterら、Gene、３２：２６３〜２７４、（１９
８４）：Wampler ら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 、８２：
６８３０〜６８３４、（１９８５）〕。可溶酵母タンパ
ク質の約４０％までＨＢｃＡｇを発現するという前述の
結果（Kniskernら、前出）に基づき、我々は、適当な酵
母ホスト細胞中のＨＢｓＡｇ及び関連タンパク質の発現
を行なうためにこのプロモーターを用いた。
【００４９】この分野に通じる者には明らかなように、
ＨＢＶ表面タンパク質発現に用いる適切な酵母株には多
様なものが含まれる。適当な酵母株には、プロテアーゼ
欠乏等の遺伝的及び表現型の特性を持ったものや異なっ
たグリコシル化能力のあるものなどが含まれるがこれに
限定されない。
ＨＢＶ表面タンパク質発現に用いる適切な酵母株には多
様なものが含まれる。適当な酵母株には、プロテアーゼ
欠乏等の遺伝的及び表現型の特性を持ったものや異なっ
たグリコシル化能力のあるものなどが含まれるがこれに
限定されない。
【００５０】組み換え酵母発現ＨＢＶタンパク質のグリ
コシル化を調整して定義するために、酵母株ＣＦ５２
（Ｍａｔａ ｌｅｕ２−２、１１２Ｕｒａ３Δｃａｎ１
ｈｉｓ３Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ｕｒａ３、ｃ
ｉｒ゜）を前述のように構成した。
コシル化を調整して定義するために、酵母株ＣＦ５２
（Ｍａｔａ ｌｅｕ２−２、１１２Ｕｒａ３Δｃａｎ１
ｈｉｓ３Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ｕｒａ３、ｃ
ｉｒ゜）を前述のように構成した。
【００５１】発現プラスミドｐＣ１／１ｐＧＡＬ１０Ｈ
ＢｓＡｇ−ｔＡＤＨ−１を用いてＣＦ５２（Ｍａｔａ、
ｌｅｕ２−２、１１２ｕｒａ３Δ ｃａｎ１ ｈｉｓ３
Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ｕｒａ３、ｃｉｒ゜、ｍ
ｎｎ９−）を形質転換した。形質転換したクローンを、
１Ｍソルビトールを含む最少培地（ｌｅｕ- ）上で選択
した。クローニングした形質転換細胞を、後の評価とあ
とにつづく実験のために１７％グリセロール中に凍結保
存して確保した。
ＢｓＡｇ−ｔＡＤＨ−１を用いてＣＦ５２（Ｍａｔａ、
ｌｅｕ２−２、１１２ｕｒａ３Δ ｃａｎ１ ｈｉｓ３
Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ｕｒａ３、ｃｉｒ゜、ｍ
ｎｎ９−）を形質転換した。形質転換したクローンを、
１Ｍソルビトールを含む最少培地（ｌｅｕ- ）上で選択
した。クローニングした形質転換細胞を、後の評価とあ
とにつづく実験のために１７％グリセロール中に凍結保
存して確保した。
【００５２】グリコシル化野性型コントロールを得るた
めに、発現プラスミドをまた用いて酵母株ＣＦ５４を形
質転換して、これを確立している技術でＣＦ５２株から
単離したが、これはｍｎｎ９＋に対する自発的復帰変異
体である（したがって、グリコシル化に対しては野性型
であり、他についてはＣＦ５２株と同一の遺伝子型であ
る）。形質転換してクローニングした単離物を、後の評
価やさらなる実験のために１７％グリセロール中に凍結
保存して確保した。
めに、発現プラスミドをまた用いて酵母株ＣＦ５４を形
質転換して、これを確立している技術でＣＦ５２株から
単離したが、これはｍｎｎ９＋に対する自発的復帰変異
体である（したがって、グリコシル化に対しては野性型
であり、他についてはＣＦ５２株と同一の遺伝子型であ
る）。形質転換してクローニングした単離物を、後の評
価やさらなる実験のために１７％グリセロール中に凍結
保存して確保した。
【００５３】発現プラスミドを含む形質転換酵母クロー
ンをｌｅｕ- 選択寒天平板（ｍｎｎ９- 変異体の場合１
Ｍソルビトールを含む）上に広げ、３０℃で２〜３日間
インキュベートした。これらの酵母を複合ＹＥＨＤ（カ
ーチー等、前出）培地（０．１〜１Ｍソルビトールを含
む）の５〜７ml培養液に植えこの培養液を通気しながら
１２〜１８時間インキュベートした。０．１Ｍソルビト
ールを含む５０mlの複合ＹＥＨＤ培地（以後ＹＥＨＤＳ
と呼ぶ）とＧＡＬ１０プロモータープラスミドに対する
２％ガラクトースを含有するフラスコに上記培養を植え
（初期Ａ600 ＝０．１になるように）、最終Ａ600 が１
０〜１６になるまで３０℃で振盪（３５０rpm ）しなが
ら４８〜７２時間インキュベートした。１０Ａ600 単位
の試料を管中に分取し、酵母細胞を２０００xg、１０分
間遠心して沈降させた。試料を直接検定するか又は−７
０℃で凍結保存した。検定の際には、沈降物を２mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有す
るリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）０．４mlに懸濁し、１．
５mlのエッペンドルフ管に移した。酵母細胞を１）２０
０〜３００mgの洗浄したガラスビーズ（０．４５mm）を
加え、ボルテックスミキサー上で１５分間攪拌する、
２）トリトンＸ−１００を０．５％添加する、３）ボル
テックスミキサー上で２分間攪拌するそして４）４℃で
１０分間インキュベートすることにより破砕した。細胞
破片及びガラスビーズを除去し、上清をタンパク質〔ロ
ーリー(Lowry) 等、J.Biol.Chem.第１９３巻、２６５頁
（１９５１年）〕及びＳ（ＡＵＳＲＩＡR ）について検
定した。
ンをｌｅｕ- 選択寒天平板（ｍｎｎ９- 変異体の場合１
Ｍソルビトールを含む）上に広げ、３０℃で２〜３日間
インキュベートした。これらの酵母を複合ＹＥＨＤ（カ
ーチー等、前出）培地（０．１〜１Ｍソルビトールを含
む）の５〜７ml培養液に植えこの培養液を通気しながら
１２〜１８時間インキュベートした。０．１Ｍソルビト
ールを含む５０mlの複合ＹＥＨＤ培地（以後ＹＥＨＤＳ
と呼ぶ）とＧＡＬ１０プロモータープラスミドに対する
２％ガラクトースを含有するフラスコに上記培養を植え
（初期Ａ600 ＝０．１になるように）、最終Ａ600 が１
０〜１６になるまで３０℃で振盪（３５０rpm ）しなが
ら４８〜７２時間インキュベートした。１０Ａ600 単位
の試料を管中に分取し、酵母細胞を２０００xg、１０分
間遠心して沈降させた。試料を直接検定するか又は−７
０℃で凍結保存した。検定の際には、沈降物を２mMフェ
ニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）を含有す
るリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）０．４mlに懸濁し、１．
５mlのエッペンドルフ管に移した。酵母細胞を１）２０
０〜３００mgの洗浄したガラスビーズ（０．４５mm）を
加え、ボルテックスミキサー上で１５分間攪拌する、
２）トリトンＸ−１００を０．５％添加する、３）ボル
テックスミキサー上で２分間攪拌するそして４）４℃で
１０分間インキュベートすることにより破砕した。細胞
破片及びガラスビーズを除去し、上清をタンパク質〔ロ
ーリー(Lowry) 等、J.Biol.Chem.第１９３巻、２６５頁
（１９５１年）〕及びＳ（ＡＵＳＲＩＡR ）について検
定した。
【００５４】ｍｎｎ９−表現型のホスト細胞内の前述の
すべての組み換えクローン由来のポリペプチドを免疫ブ
ロット分析すると、あきらかに約２４ＫＤの分子サイズ
の１つのバンドを示した。
すべての組み換えクローン由来のポリペプチドを免疫ブ
ロット分析すると、あきらかに約２４ＫＤの分子サイズ
の１つのバンドを示した。
【００５５】組み換えタンパク質に関して、定性的及び
定量的グリコシル化パターンは、ホスト細胞種、そして
種内の細胞系統の関数であり、大部分それらに左右され
る。すなわち、この分野に通じる者には明らかなよう
に、ホスト株の選択はグリコシル化経路の酵素の突然変
異が同定できる酵母(S.cerevisiae)以外の種や細胞系統
が含まれる。又、この分野に通じる者には明らかなよう
に、酵母(S.cerevisiae)のホスト株の選択には、グリコ
シル化経路の酵素の突然変異が同定できるすべての株が
含まれる。
定量的グリコシル化パターンは、ホスト細胞種、そして
種内の細胞系統の関数であり、大部分それらに左右され
る。すなわち、この分野に通じる者には明らかなよう
に、ホスト株の選択はグリコシル化経路の酵素の突然変
異が同定できる酵母(S.cerevisiae)以外の種や細胞系統
が含まれる。又、この分野に通じる者には明らかなよう
に、酵母(S.cerevisiae)のホスト株の選択には、グリコ
シル化経路の酵素の突然変異が同定できるすべての株が
含まれる。
【００５６】次いで形質転換クローンはｐＵＣ１９−Ｈ
ＢｓＡｇＤＮＡの存在とｐ２４ＨＢｓＡｇの発現に対し
てスクリーンした。細胞をＧＡＬ１０プロモータープラ
スミドの場合にはガラクトースを含有するＹＥＨＤＳ培
地中で生育させて発現後のグルコースの消耗を誘発させ
た。溶菌液を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で展開
し、ニトロセルロースにウェスタンブロットした。ｐ２
４産物は誘発形質転換体にのみ存在し、抗ｐ２４血清と
の反応性によってＳタンパク質に特異的であることがわ
かった。これらの１つを更に分析に選択した。更にその
上親Ｓ．セレビシエではない形質転換体の溶菌液はラジ
オイムノアッセイによりＨＢｓＡｇに陽性であった。
ＢｓＡｇＤＮＡの存在とｐ２４ＨＢｓＡｇの発現に対し
てスクリーンした。細胞をＧＡＬ１０プロモータープラ
スミドの場合にはガラクトースを含有するＹＥＨＤＳ培
地中で生育させて発現後のグルコースの消耗を誘発させ
た。溶菌液を調製し、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリア
クリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で展開
し、ニトロセルロースにウェスタンブロットした。ｐ２
４産物は誘発形質転換体にのみ存在し、抗ｐ２４血清と
の反応性によってＳタンパク質に特異的であることがわ
かった。これらの１つを更に分析に選択した。更にその
上親Ｓ．セレビシエではない形質転換体の溶菌液はラジ
オイムノアッセイによりＨＢｓＡｇに陽性であった。
【００５７】このことは、酵母(S.cerevisiae)内のＨＢ
ｓＡｇ及び関連表面タンパク質の発現を指示するために
ＧＡＬ１０プロモーターを利用する発現ベクターの有用
性をはっきり示している。この分野に通じる者には明ら
かなように、調節可能なＧＡＬ１０プロモーター、ある
いは互いに区別できない機序で働くＧＡＬ１、ＧＡＬ
２、ＧＡＬ７又はＭＥＬ１プロモーターは、組み換えタ
ンパク質の合成を開始する前に組み換え酵母(S.cerevis
iae)培養の成長を生産規模の量までスケールアップする
ことを可能にして、ホスト細胞への悪影響を最小にす
る。さらに、この分野に通じる者には明らかなように、
別の調節プロモーター（ＡＤＨ２とα交配因子を含むが
これに限定されない）を含む発現ベクターは他の方法で
生理学的に誘導又は脱抑制可能であり、Ｓ及びｐｒｅＳ
を含むペプチドの発現の指示に利用することができる。
さらにこの分野に通じる者には明らかなように、ＧＡＰ
ＤＨほど強力でない構成プロモーター（ＣＹＣ１を含む
が、これに限定されない）は、Ｓ及びｐｒｅＳを含むタ
ンパク質をより低い細胞タンパク質のパーセンテージで
発現させて、生理学的な悪影響である過剰発現をふせ
ぐ。この分野に通じる者には明らかなように、ウエスタ
ン−ブロット法又はラジオイミュノアッセイ等の適切な
アッセイ方法を用いて、このシステムでのＳ及びｐｒｅ
Ｓを含むポリペプチドの発現をアッセイして、最大収量
を得る培養の収穫時間を最適化しなければならない。
ｓＡｇ及び関連表面タンパク質の発現を指示するために
ＧＡＬ１０プロモーターを利用する発現ベクターの有用
性をはっきり示している。この分野に通じる者には明ら
かなように、調節可能なＧＡＬ１０プロモーター、ある
いは互いに区別できない機序で働くＧＡＬ１、ＧＡＬ
２、ＧＡＬ７又はＭＥＬ１プロモーターは、組み換えタ
ンパク質の合成を開始する前に組み換え酵母(S.cerevis
iae)培養の成長を生産規模の量までスケールアップする
ことを可能にして、ホスト細胞への悪影響を最小にす
る。さらに、この分野に通じる者には明らかなように、
別の調節プロモーター（ＡＤＨ２とα交配因子を含むが
これに限定されない）を含む発現ベクターは他の方法で
生理学的に誘導又は脱抑制可能であり、Ｓ及びｐｒｅＳ
を含むペプチドの発現の指示に利用することができる。
さらにこの分野に通じる者には明らかなように、ＧＡＰ
ＤＨほど強力でない構成プロモーター（ＣＹＣ１を含む
が、これに限定されない）は、Ｓ及びｐｒｅＳを含むタ
ンパク質をより低い細胞タンパク質のパーセンテージで
発現させて、生理学的な悪影響である過剰発現をふせ
ぐ。この分野に通じる者には明らかなように、ウエスタ
ン−ブロット法又はラジオイミュノアッセイ等の適切な
アッセイ方法を用いて、このシステムでのＳ及びｐｒｅ
Ｓを含むポリペプチドの発現をアッセイして、最大収量
を得る培養の収穫時間を最適化しなければならない。
【００５８】粒子形態のＨＢｓＡｇを認識するヤギ抗体
と結合した免疫アフィニティー・カラムを用いて、形質
転換酵母(S.cerevisiae)からのＳ及びＳ関連タンパク質
を精製する。溶出生成物はラジオイミノアッセイでＨＢ
ｓＡｇ陽性であり、電子顕微鏡では粒子形態であった。
ＨＢｓＡｇとｐｒｅＳ抗原の両方、又はＨＢｓＡｇだけ
を含むこのような粒子形態は、ＨＢＶワクチン及び診断
用試薬として効果がある。
と結合した免疫アフィニティー・カラムを用いて、形質
転換酵母(S.cerevisiae)からのＳ及びＳ関連タンパク質
を精製する。溶出生成物はラジオイミノアッセイでＨＢ
ｓＡｇ陽性であり、電子顕微鏡では粒子形態であった。
ＨＢｓＡｇとｐｒｅＳ抗原の両方、又はＨＢｓＡｇだけ
を含むこのような粒子形態は、ＨＢＶワクチン及び診断
用試薬として効果がある。
【００５９】Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質又はその
変異株を解読する発現ベクターで形質転換した酵母細胞
を成長させて収穫した。望ましければ、ＰＢＳ等のバッ
ファー溶液で細胞を洗浄して細胞ペーストを形成し、通
常は−７０℃で凍結して、細胞を保存できる。
変異株を解読する発現ベクターで形質転換した酵母細胞
を成長させて収穫した。望ましければ、ＰＢＳ等のバッ
ファー溶液で細胞を洗浄して細胞ペーストを形成し、通
常は−７０℃で凍結して、細胞を保存できる。
【００６０】ＨＢｓＡｇ及び関連タンパク質の精製は、
通常以下のようにはじめる。形成した、又は凍結してお
いた細胞ペーストのバッチを、バッファーに、このまし
くはＴＲＩＳに、約８．５ないし１１．０の高い範囲の
pHで、好ましくは約１０．５のpHで懸濁させる（バッフ
ァーは適当なプロテアーゼ阻害剤を含んでいてよい）。
その後、細胞を、好ましくは機械的手段で摩砕する。大
規模に用いるにはビーズによるおだやかな破砕方法は不
適当であることがわかっている。高圧ホモジナイザー(G
aulin 又はStanstedホモジナイザーを用いた約１０，０
００ないし２０，０００psi)での摩砕は、操作が迅速で
十分であるために好ましい。
通常以下のようにはじめる。形成した、又は凍結してお
いた細胞ペーストのバッチを、バッファーに、このまし
くはＴＲＩＳに、約８．５ないし１１．０の高い範囲の
pHで、好ましくは約１０．５のpHで懸濁させる（バッフ
ァーは適当なプロテアーゼ阻害剤を含んでいてよい）。
その後、細胞を、好ましくは機械的手段で摩砕する。大
規模に用いるにはビーズによるおだやかな破砕方法は不
適当であることがわかっている。高圧ホモジナイザー(G
aulin 又はStanstedホモジナイザーを用いた約１０，０
００ないし２０，０００psi)での摩砕は、操作が迅速で
十分であるために好ましい。
【００６１】酵母細胞の摩砕で未精製抽出物を得る。次
に未精製抽出物のpHを調整する。pHは８．０ないし１
１．０の範囲、好ましくは１０．５に調整する。
に未精製抽出物のpHを調整する。pHは８．０ないし１
１．０の範囲、好ましくは１０．５に調整する。
【００６２】この時点で未精製抽出物に界面活性剤を加
えてもよい。界面活性剤を加えることによって、不要な
細胞片から酵母細胞膜を分離しやすくなる。ｐｒｅＳ２
＋Ｓタンパク質は、他の形態の表面タンパク質と同様
に、酵母細胞膜といっしょになっていることがわかって
いる。多様な中性又は非イオン性界面活性剤を用いるこ
とができるが、これにはＴＲＩＴＯＮ−Ｎ系、ＴＲＩＴ
ＯＮ−Ｘ系、ＢＲＩＪ系、ＴＷＥＥＮ系又はＥＭＡＳＯ
Ｌ系の界面活性剤、デオキシコラート、オクチルグルコ
ピラノシド又はＮＯＮＩＤＥＴ−Ｎｐ−４０が含まれる
が、これらに限定されない。ＣＨＡＰＳ又はＣＨＡＰＳ
Ｏ等の両性イオン界面活性剤も、適当な活性剤として利
用できる。
えてもよい。界面活性剤を加えることによって、不要な
細胞片から酵母細胞膜を分離しやすくなる。ｐｒｅＳ２
＋Ｓタンパク質は、他の形態の表面タンパク質と同様
に、酵母細胞膜といっしょになっていることがわかって
いる。多様な中性又は非イオン性界面活性剤を用いるこ
とができるが、これにはＴＲＩＴＯＮ−Ｎ系、ＴＲＩＴ
ＯＮ−Ｘ系、ＢＲＩＪ系、ＴＷＥＥＮ系又はＥＭＡＳＯ
Ｌ系の界面活性剤、デオキシコラート、オクチルグルコ
ピラノシド又はＮＯＮＩＤＥＴ−Ｎｐ−４０が含まれる
が、これらに限定されない。ＣＨＡＰＳ又はＣＨＡＰＳ
Ｏ等の両性イオン界面活性剤も、適当な活性剤として利
用できる。
【００６３】界面活性剤を用いる場合、好ましい界面活
性剤は、約０．５％の濃度のＴＲＩＴＯＮＸ−１００で
ある。強張しておかなければならないが、本発明の方法
はこの工程での界面活性剤の使用を必要とするものでは
なく、界面活性剤の使用は任意である。
性剤は、約０．５％の濃度のＴＲＩＴＯＮＸ−１００で
ある。強張しておかなければならないが、本発明の方法
はこの工程での界面活性剤の使用を必要とするものでは
なく、界面活性剤の使用は任意である。
【００６４】次に、プロテアーゼ阻害剤が溶菌中に存在
しないならば、抽出物を熱処理してよい。熱処理は、一
定範囲の温度と処理時間以上で有効である。通常、４５
℃ないし６０℃の温度範囲を用いるが、５０℃が好まし
い温度である。熱処理の時間は通常２０ないし４０分で
あるが、好ましくは３０分間である。抽出物を適当な容
器に入れて、この容器を熱浴に浸して熱処理するか、又
は熱交換器を用いる。次にこの物質を、好ましくは氷水
浴させるか熱交換器を用いるかして、約１０℃まで冷却
する。この分野に通じる者には明らかなように、本発明
の方法によれば、熱処理と細胞片をとりのぞく工程の順
序をかえても、この方法の結果に大きな影響はない。別
の方法としては、全酵母細胞を中性pHバッファー中で加
熱して、前述のように摩砕して界面活性剤を加えてもよ
い。
しないならば、抽出物を熱処理してよい。熱処理は、一
定範囲の温度と処理時間以上で有効である。通常、４５
℃ないし６０℃の温度範囲を用いるが、５０℃が好まし
い温度である。熱処理の時間は通常２０ないし４０分で
あるが、好ましくは３０分間である。抽出物を適当な容
器に入れて、この容器を熱浴に浸して熱処理するか、又
は熱交換器を用いる。次にこの物質を、好ましくは氷水
浴させるか熱交換器を用いるかして、約１０℃まで冷却
する。この分野に通じる者には明らかなように、本発明
の方法によれば、熱処理と細胞片をとりのぞく工程の順
序をかえても、この方法の結果に大きな影響はない。別
の方法としては、全酵母細胞を中性pHバッファー中で加
熱して、前述のように摩砕して界面活性剤を加えてもよ
い。
【００６５】熱処理した未精製抽出物から細胞片を取り
のぞくことは、後の精製工程での物理的吸収をふせぐた
めに必要である。遠心分離、マイクロフィルター濾過又
は透明な抽出物を与える濾過により細胞片を取りのぞく
ことができる。遠心分離は、いろいろな時間で、いろい
ろな遠心力で行なうことができる。４℃で３０００xg、
１５分間の遠心分離で十分なことがわかっている。ま
た、遠心分離の前に抽出物を希釈して未精製酵母細胞抽
出物が通常持つ粘性を減少させるのも好ましい。希釈に
よって、この方法の後の工程は全く変わらない。
のぞくことは、後の精製工程での物理的吸収をふせぐた
めに必要である。遠心分離、マイクロフィルター濾過又
は透明な抽出物を与える濾過により細胞片を取りのぞく
ことができる。遠心分離は、いろいろな時間で、いろい
ろな遠心力で行なうことができる。４℃で３０００xg、
１５分間の遠心分離で十分なことがわかっている。ま
た、遠心分離の前に抽出物を希釈して未精製酵母細胞抽
出物が通常持つ粘性を減少させるのも好ましい。希釈に
よって、この方法の後の工程は全く変わらない。
【００６６】マイクロフィルター濾過は、濾過と透析を
同時に行なえる利点がある。Microgen Inc. 製のＫＲＯ
ＳＦＬＯ又はAmiconあるいはＡ／ＧTechnology製のすべ
ての中空繊維カートリッジ等、いくつかのタイプのマイ
クロフィルター濾過キットがこの工程に適している。好
ましいマイクロ・フィルター濾過方法は、約０．１ない
し０．２ミクロンの孔径のプレートとフレームから成る
マイクロフィルター濾過キットであるProstak Durapore
膜(Millipore) に、注入圧約２ないし７psi で、約０．
１Ｍ ＴＲＩＳ、（pH約１０．４）と約０．１％ＴＲＩ
ＴＯＮＸ−１００を含むバッファーを用いて抽出物を濾
過することである。
同時に行なえる利点がある。Microgen Inc. 製のＫＲＯ
ＳＦＬＯ又はAmiconあるいはＡ／ＧTechnology製のすべ
ての中空繊維カートリッジ等、いくつかのタイプのマイ
クロフィルター濾過キットがこの工程に適している。好
ましいマイクロ・フィルター濾過方法は、約０．１ない
し０．２ミクロンの孔径のプレートとフレームから成る
マイクロフィルター濾過キットであるProstak Durapore
膜(Millipore) に、注入圧約２ないし７psi で、約０．
１Ｍ ＴＲＩＳ、（pH約１０．４）と約０．１％ＴＲＩ
ＴＯＮＸ−１００を含むバッファーを用いて抽出物を濾
過することである。
【００６７】遠心分離の上澄み、又はマイクロ・フィル
ター濾過の濾過をこの方法の次の工程に入る前に濃縮し
てもよい。濃縮は、透析、濾過、凍結乾燥、限外濾過及
び透析濾過(diafiltration) を含むいくつかの方法で行
なうことができるが、これらに限定されない。本発明の
好ましい濃縮方法は、透明にした抽出物を１０5 分子量
カットオフ中空繊維限外濾過システムに通すことであ
る。透明化した抽出物の体積は、マイクロ・フィルター
濾過生成物に関しては約６．５倍、希釈、遠心分離生成
物に関しては約２倍の割合で減少して、濃縮した保持物
質を与える。濃縮後、保持物質を透析濾過してさらに低
分子量の混入物をとりのぞく。透析濾過は、１０5 分子
量カットオフ中空繊維システムを用いて行なう。
ター濾過の濾過をこの方法の次の工程に入る前に濃縮し
てもよい。濃縮は、透析、濾過、凍結乾燥、限外濾過及
び透析濾過(diafiltration) を含むいくつかの方法で行
なうことができるが、これらに限定されない。本発明の
好ましい濃縮方法は、透明にした抽出物を１０5 分子量
カットオフ中空繊維限外濾過システムに通すことであ
る。透明化した抽出物の体積は、マイクロ・フィルター
濾過生成物に関しては約６．５倍、希釈、遠心分離生成
物に関しては約２倍の割合で減少して、濃縮した保持物
質を与える。濃縮後、保持物質を透析濾過してさらに低
分子量の混入物をとりのぞく。透析濾過は、１０5 分子
量カットオフ中空繊維システムを用いて行なう。
【００６８】ＴＲＩＴＯＮＸ−１００を加えた場合、透
析、ある種の有機溶媒を加えること、凍結、クロマトグ
ラフィーによる分離、そしてExtractogel(Pierce) やＸ
ＡＤ樹脂(Romicon) 等の界面活性剤に特異的に結合する
ゲル又は樹脂との接触を含む、しかしこれらに限定され
ないいくつかの従来の方法でＴＲＩＴＯＮＸ−１００を
とりのぞくことができる。本発明のＴＲＩＴＯＮＸ−１
００を取りのぞく好ましい方法は、ＴＲＩＴＯＮＸ−１
００を含む熱処理した抽出物をＸＡＤ−２又はＸＡＤ−
４樹脂（ポリスチレンジビニルベンゼン）のカートリッ
ジ内を循還させることである。熱処理した抽出物を約１
０時間４℃でＸＡＤカートリッジ内を循還させた後、適
当な容器、たとえば密閉ガラスビンに回収する。
析、ある種の有機溶媒を加えること、凍結、クロマトグ
ラフィーによる分離、そしてExtractogel(Pierce) やＸ
ＡＤ樹脂(Romicon) 等の界面活性剤に特異的に結合する
ゲル又は樹脂との接触を含む、しかしこれらに限定され
ないいくつかの従来の方法でＴＲＩＴＯＮＸ−１００を
とりのぞくことができる。本発明のＴＲＩＴＯＮＸ−１
００を取りのぞく好ましい方法は、ＴＲＩＴＯＮＸ−１
００を含む熱処理した抽出物をＸＡＤ−２又はＸＡＤ−
４樹脂（ポリスチレンジビニルベンゼン）のカートリッ
ジ内を循還させることである。熱処理した抽出物を約１
０時間４℃でＸＡＤカートリッジ内を循還させた後、適
当な容器、たとえば密閉ガラスビンに回収する。
【００６９】細胞が高pH緩衝液中で破壊した場合には抽
出液のpHをpH約７．０〜７．９、好ましくはpH約７．７
に調整する。pH約７．７に調整した後本発明に従って高
pHで熱処理すると次の工程で使用される幅広い孔のシリ
カに対するエンベロープタンパク質の吸着を非常に促進
する。熱処理抽出液のpH調整はトリトンＸ−１００除去
工程前に手順の結果に影響せずに行なうことができる。
従って当業者には本発明の方法に従ってpH調整とトリト
ンＸ−１００の除去工程を行なう順序をこの手順の結果
に著しく影響せずに逆にすることができることは明白で
あろう。
出液のpHをpH約７．０〜７．９、好ましくはpH約７．７
に調整する。pH約７．７に調整した後本発明に従って高
pHで熱処理すると次の工程で使用される幅広い孔のシリ
カに対するエンベロープタンパク質の吸着を非常に促進
する。熱処理抽出液のpH調整はトリトンＸ−１００除去
工程前に手順の結果に影響せずに行なうことができる。
従って当業者には本発明の方法に従ってpH調整とトリト
ンＸ−１００の除去工程を行なう順序をこの手順の結果
に著しく影響せずに逆にすることができることは明白で
あろう。
【００７０】こうしてＨＢｓＡｇを混入物から容易に分
離してほぼ純粋なＨＢｓＡｇを得る。好ましい混入物の
除去方法は、ＨＢｓＡｇを大孔径シリカに吸着させるこ
とである。本発明のもっとも好ましい方法は、ＨＢｓＡ
ｇを孔径約１０００ないし１５００オングストローム、
シリカ粒子径約３０ないし１３０ミクロンの範囲の大孔
径シリカ(Amicon)に吸着させることである。ＨＢｓＡｇ
は容易にシリカの孔に入って保持される。したがって、
酵母細胞タンパク質混入物は容易に洗い流すことができ
る。
離してほぼ純粋なＨＢｓＡｇを得る。好ましい混入物の
除去方法は、ＨＢｓＡｇを大孔径シリカに吸着させるこ
とである。本発明のもっとも好ましい方法は、ＨＢｓＡ
ｇを孔径約１０００ないし１５００オングストローム、
シリカ粒子径約３０ないし１３０ミクロンの範囲の大孔
径シリカ(Amicon)に吸着させることである。ＨＢｓＡｇ
は容易にシリカの孔に入って保持される。したがって、
酵母細胞タンパク質混入物は容易に洗い流すことができ
る。
【００７１】大孔径シリカへの表面タンパク質の吸着
は、クロマトグラフィー的やり方でも又、クロマトグラ
フィーを用いないバッチ単位のやり方でも行なえる。ク
ロマトグラフィーによる吸着は、pH調整した抽出物を、
カラムクロマトグラフィー装置内の大孔径シリカのベッ
ドに通して行なう。通常、約１リットルの熱処理した抽
出物を流速約２００ml／時で、約３００ml（乾燥重量約
１００ｇ）の大孔径シリカビーズを入れたジャケットカ
ラム装置にかける。
は、クロマトグラフィー的やり方でも又、クロマトグラ
フィーを用いないバッチ単位のやり方でも行なえる。ク
ロマトグラフィーによる吸着は、pH調整した抽出物を、
カラムクロマトグラフィー装置内の大孔径シリカのベッ
ドに通して行なう。通常、約１リットルの熱処理した抽
出物を流速約２００ml／時で、約３００ml（乾燥重量約
１００ｇ）の大孔径シリカビーズを入れたジャケットカ
ラム装置にかける。
【００７２】クロマトグラフィーを用いない大孔径シリ
カへの吸着は、熱処理した抽出物を適当な容器、たとえ
ば密閉ガラスびん中でシリカと混合して行なう。好まし
い方法は、ガラスビン中の熱処理抽出物約１リットルに
３００mlの大孔径シリカを加えて、たえず混合しながら
インキュベートすることである。吸着はいろいろな時間
と温度で適切に行なえるが、好ましくは約４〜８℃で約
１．５時間行なう。
カへの吸着は、熱処理した抽出物を適当な容器、たとえ
ば密閉ガラスびん中でシリカと混合して行なう。好まし
い方法は、ガラスビン中の熱処理抽出物約１リットルに
３００mlの大孔径シリカを加えて、たえず混合しながら
インキュベートすることである。吸着はいろいろな時間
と温度で適切に行なえるが、好ましくは約４〜８℃で約
１．５時間行なう。
【００７３】未吸着物のない表面タンパク質が吸着した
シリカの洗浄もまた、クロマトグラフィーを使わずに行
なうことができるが、前述のようにクロマトグラフィー
吸着用カラム装置にシリカを注入することができる。バ
ッチ単位の洗浄は、大孔径シリカから熱処理抽出物を排
出して、シリカに吸着したＨＢｓＡｇの遊離をひき起こ
さない数倍体積のバッファーを加えて行なう。好ましい
バッファーはＰＢＳである。シリカを排出して洗浄工程
を３ないし５回くりかえす。ＨＢｓＡｇが吸着したシリ
カのクロマトグラフィーによる洗浄は、２８０nmの消滅
が確実となるまでＰＢＳを流速約２００ml／時でシリカ
に通じて行なう。
シリカの洗浄もまた、クロマトグラフィーを使わずに行
なうことができるが、前述のようにクロマトグラフィー
吸着用カラム装置にシリカを注入することができる。バ
ッチ単位の洗浄は、大孔径シリカから熱処理抽出物を排
出して、シリカに吸着したＨＢｓＡｇの遊離をひき起こ
さない数倍体積のバッファーを加えて行なう。好ましい
バッファーはＰＢＳである。シリカを排出して洗浄工程
を３ないし５回くりかえす。ＨＢｓＡｇが吸着したシリ
カのクロマトグラフィーによる洗浄は、２８０nmの消滅
が確実となるまでＰＢＳを流速約２００ml／時でシリカ
に通じて行なう。
【００７４】pH約８．５ないし９．０のバッファー溶液
を用いて、ＨＢｓＡｇを洗浄した大孔径シリカから溶離
する。好ましくは、約０．０５Ｍホウ酸塩から成るpH約
８．７のバッファー溶液を用いて表面タンパク質を脱着
する。ＨＢｓＡｇの脱着は、広範囲にわたる温度で容易
になる。約５５℃での脱着が好ましい。
を用いて、ＨＢｓＡｇを洗浄した大孔径シリカから溶離
する。好ましくは、約０．０５Ｍホウ酸塩から成るpH約
８．７のバッファー溶液を用いて表面タンパク質を脱着
する。ＨＢｓＡｇの脱着は、広範囲にわたる温度で容易
になる。約５５℃での脱着が好ましい。
【００７５】クロマトグラフィーを用いない脱着は、pH
８．７の０．０５Ｍホウ酸塩バッファー１２００mlと洗
浄したＨＢｓＡｇが吸着した大孔径シリカ約７００mlを
混合して行なう。脱着は約２５分間つづける。その後溶
出液を集めて、この脱着工程を２回くりかえし、溶出液
を冷却する。
８．７の０．０５Ｍホウ酸塩バッファー１２００mlと洗
浄したＨＢｓＡｇが吸着した大孔径シリカ約７００mlを
混合して行なう。脱着は約２５分間つづける。その後溶
出液を集めて、この脱着工程を２回くりかえし、溶出液
を冷却する。
【００７６】クロマトグラフィーによる脱着は、洗浄し
たシリカのジャケットカラムを約５５℃にあたためて行
なう。pH８．７の０．０５Ｍホウ酸塩バッファーを５５
℃にあたためた後、流速５００ml／時でカラムにかけ
る。次に溶出液を回収して冷却する。溶出液の体積は通
常だいたい大孔径シリカに通じた熱処理抽出物と同じで
ある。
たシリカのジャケットカラムを約５５℃にあたためて行
なう。pH８．７の０．０５Ｍホウ酸塩バッファーを５５
℃にあたためた後、流速５００ml／時でカラムにかけ
る。次に溶出液を回収して冷却する。溶出液の体積は通
常だいたい大孔径シリカに通じた熱処理抽出物と同じで
ある。
【００７７】溶出したＨＢｓＡｇはたいてい濃縮するの
が好ましい。好ましい濃縮方法は、pH８．７の０．０５
Ｍホウ酸塩バッファーを用いて、溶出液を１０5 分子量
カットオフ中空繊維透析濾過装置に通すことである。溶
出した表面タンパク質の体積は、一般にこの装置では１
６分の１に減少する。透析濾過保持物を、必要ならば、
マイクロ−フィルター濾過で滅菌できる。
が好ましい。好ましい濃縮方法は、pH８．７の０．０５
Ｍホウ酸塩バッファーを用いて、溶出液を１０5 分子量
カットオフ中空繊維透析濾過装置に通すことである。溶
出した表面タンパク質の体積は、一般にこの装置では１
６分の１に減少する。透析濾過保持物を、必要ならば、
マイクロ−フィルター濾過で滅菌できる。
【００７８】ＨＢｓＡｇの炭水化物成分をDuboisら（An
al.Chem., ２８、pp３５０、１９５６）の方法で決定す
る。この方法の一般的原理は、遊離した、又は遊離し得
る還元基を持つメチルエーテルを含む単糖、オリゴ糖、
多糖及びそれらの誘導体が、フェノールと濃硫酸で処理
するとオレンジイエローに発色するということである。
一定のフェノール濃度で生じる発色の度合は、存在する
糖の量に比例する。
al.Chem., ２８、pp３５０、１９５６）の方法で決定す
る。この方法の一般的原理は、遊離した、又は遊離し得
る還元基を持つメチルエーテルを含む単糖、オリゴ糖、
多糖及びそれらの誘導体が、フェノールと濃硫酸で処理
するとオレンジイエローに発色するということである。
一定のフェノール濃度で生じる発色の度合は、存在する
糖の量に比例する。
【００７９】ＨＢＶ表面タンパク質の試料の炭水化物成
分を決定するために、１０ないし７０μg のタンパク質
を含む１mlの溶液を試験管に入れた。一連の炭水化物の
スタンダードとブランクの試薬を用意する。５％フェノ
ール溶液１mlを各試験管に入れて、試験管を混合し、９
６％硫酸溶液５mlを加えて混合する。試験管を室温で１
０分間インキュベートして混合し、２５ないし３０℃で
２０分間インキュベートする。試料を（ヘキソースとメ
チル化ヘキソースについてはＡ490 、ペントース、ウロ
ン酸及びそれらのメチル化誘導体についてはＡ480 で）
分光光度計で読み、ＨＢｓＡｇ試料中の炭水化物量を、
炭水化物スタンダードとの比較で決定する。
分を決定するために、１０ないし７０μg のタンパク質
を含む１mlの溶液を試験管に入れた。一連の炭水化物の
スタンダードとブランクの試薬を用意する。５％フェノ
ール溶液１mlを各試験管に入れて、試験管を混合し、９
６％硫酸溶液５mlを加えて混合する。試験管を室温で１
０分間インキュベートして混合し、２５ないし３０℃で
２０分間インキュベートする。試料を（ヘキソースとメ
チル化ヘキソースについてはＡ490 、ペントース、ウロ
ン酸及びそれらのメチル化誘導体についてはＡ480 で）
分光光度計で読み、ＨＢｓＡｇ試料中の炭水化物量を、
炭水化物スタンダードとの比較で決定する。
【００８０】“野性型”組み換え酵母細胞（ＣＦ５４）
が生成したＨＢｓＡｇとＣＦ５２（ｍｎｎ９−）組み換
え酵母細胞が生成したＨＢｓＡｇ両方の炭水化物成分を
前記のように分析した。この結果にもとづき、各試料中
に存在するタンパク質に対する炭水化物量の比を、炭水
化物のマイクログラム数を試料中のタンパク質のマイク
ログラム数で割って計算した。この比の計算で、ｍｎｎ
９- 組み換え酵母細胞で生成したＨＢｓＡｇは、つねに
組み換え“野性型”酵母細胞で生成したＨＢｓＡｇの炭
水化物成分の１０分の１を含むことがわかった。これら
の結果、ｍｎｎ９- 突然変異酵母細胞が生成するＨＢｓ
Ａｇは、“野性型”酵母細胞が生成したＨＢｓＡｇにく
らべて十分に減少した量の炭水化物を含むことがわか
る。
が生成したＨＢｓＡｇとＣＦ５２（ｍｎｎ９−）組み換
え酵母細胞が生成したＨＢｓＡｇ両方の炭水化物成分を
前記のように分析した。この結果にもとづき、各試料中
に存在するタンパク質に対する炭水化物量の比を、炭水
化物のマイクログラム数を試料中のタンパク質のマイク
ログラム数で割って計算した。この比の計算で、ｍｎｎ
９- 組み換え酵母細胞で生成したＨＢｓＡｇは、つねに
組み換え“野性型”酵母細胞で生成したＨＢｓＡｇの炭
水化物成分の１０分の１を含むことがわかった。これら
の結果、ｍｎｎ９- 突然変異酵母細胞が生成するＨＢｓ
Ａｇは、“野性型”酵母細胞が生成したＨＢｓＡｇにく
らべて十分に減少した量の炭水化物を含むことがわか
る。
【００８１】以下の実施例は本発明を説明するものであ
り、これに制限を加えるものではない。以下の実施例中
で触れる各参考文献の内容は、ここで引用例として組み
込む。
り、これに制限を加えるものではない。以下の実施例中
で触れる各参考文献の内容は、ここで引用例として組み
込む。
【００８２】実施例１ ｐＢＲ３２２におけるＨＢＶＤＮＡのクローニング ＨＢＶデーン粒子（血清型ａｄｗ）をヒト（キャリア）
の血漿から単離精製し、二本鎖ＤＮＡをランダース(Lan
ders) ら〔ジャーナル・オブ・バイロロジー(J.Virolog
y)、第２３巻、第３６８−３７６頁、１９７７年〕及び
ルスカ(Hruska)ら（ジャーナル・オブ・バイロロジー、
第２１巻、１９７７年）の方法に従いデーン粒子中の内
在ポリメラーゼにより合成した。そのＤＮＡはＳＤＳ中
プロテイナーゼＫで切断し、フェノール／クロロホルム
抽出及びエタノール沈降を行って単離した。ＨＢＶゲノ
ムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して単一の３．２kbp 断片
を得、これをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に組込んで
クローニングし、ｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を形成する。Ｈ
ＢＶＤＮＡの存在はＥｃｏＲＩ切断、ニトロセルロース
へのサザンブロットトランスファー及び〔32Ｐ〕標識特
異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成
により確認した。
の血漿から単離精製し、二本鎖ＤＮＡをランダース(Lan
ders) ら〔ジャーナル・オブ・バイロロジー(J.Virolog
y)、第２３巻、第３６８−３７６頁、１９７７年〕及び
ルスカ(Hruska)ら（ジャーナル・オブ・バイロロジー、
第２１巻、１９７７年）の方法に従いデーン粒子中の内
在ポリメラーゼにより合成した。そのＤＮＡはＳＤＳ中
プロテイナーゼＫで切断し、フェノール／クロロホルム
抽出及びエタノール沈降を行って単離した。ＨＢＶゲノ
ムＤＮＡをＥｃｏＲＩで切断して単一の３．２kbp 断片
を得、これをｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ部位に組込んで
クローニングし、ｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１を形成する。Ｈ
ＢＶＤＮＡの存在はＥｃｏＲＩ切断、ニトロセルロース
へのサザンブロットトランスファー及び〔32Ｐ〕標識特
異的オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリッド形成
により確認した。
【００８３】実施例２ ｐＧＡＰ−ｔＡＤＨ−２発現ベクターにおけるｐｒｅＳ
２＋Ｓ遺伝子のクローニング プラスミドｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１（実施例１記載）をＥ
ｃｏＲＩ及びＡｃｃＩで切断し、０．８kbp 断片をプレ
パラティブアガロースゲル電気泳動で精製した。更にｐ
ＵＣプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、
直鎖ベクターをプレパラティブアガロースゲル電気泳動
で精製した。ｐｒｅＳ２＋ＳＯＲＦの５’部分を再組立
てするため、ＥｃｏＲＩ部位から上流へＡＴＧ、１０bp
ＮＴＬ配列、ＨｉｎｄIII 部位を経てＥｃｏＲＩ末端に
至るＯＲＦを再構成する一対のオリゴヌクレオチドを合
成した。これらオリゴヌクレオチドの配列は下記であ
る：
２＋Ｓ遺伝子のクローニング プラスミドｐＨＢＶ／ＡＤＷ−１（実施例１記載）をＥ
ｃｏＲＩ及びＡｃｃＩで切断し、０．８kbp 断片をプレ
パラティブアガロースゲル電気泳動で精製した。更にｐ
ＵＣプラスミドをＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩで切断し、
直鎖ベクターをプレパラティブアガロースゲル電気泳動
で精製した。ｐｒｅＳ２＋ＳＯＲＦの５’部分を再組立
てするため、ＥｃｏＲＩ部位から上流へＡＴＧ、１０bp
ＮＴＬ配列、ＨｉｎｄIII 部位を経てＥｃｏＲＩ末端に
至るＯＲＦを再構成する一対のオリゴヌクレオチドを合
成した。これらオリゴヌクレオチドの配列は下記であ
る：
【化１】 ｐｒｅＳ２＋ＳＯＲＦの３’部分を再組立てするため、
ＡｃｃＩ部位から翻訳ターミネーター、ＨｉｎｄIII 部
位を経てＢａｍＨＩ末端に至るＯＲＦを再構成する２番
目の１対のオリゴヌクレオチドを合成した。これらオリ
ゴヌクレオチドの配列は下記である：
ＡｃｃＩ部位から翻訳ターミネーター、ＨｉｎｄIII 部
位を経てＢａｍＨＩ末端に至るＯＲＦを再構成する２番
目の１対のオリゴヌクレオチドを合成した。これらオリ
ゴヌクレオチドの配列は下記である：
【化２】 オリゴヌクレオチド対をアニーリングさせてからｐＵＣ
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断ベクターに結合させた。得
られたベクター（２．８kbp)をプレパラティブアガロー
スゲル電気泳動で精製した。上記の０．８kbp ＥｃｏＲ
Ｉ−ＡｃｃＩ断片をこのベクターと結合させた。ｐｒｅ
Ｓ２＋ＳＯＲＦの存在及び向きは制限エンドヌクレアー
ゼ分析及びサザンブロットにより確認した。ＤＮＡ配列
分析（サンガーら、１９７７年）から、２つの塩基置換
があるためにプラスミドＨＢｐｒｅＳＧＡＰ３４７／１
９ＴのＤＮＡがコードする配列とアミノ酸が違ってくる
ことが判明した。両方の構築物において同一のポリペプ
チドを評価するため、塩基６４がＣでなくＴ（Ｌｅｕで
はなくＰｈｅをコードする）となり塩基３５２がＡでな
くＣ（ＧｌｎではなくＨｉｓをコードする）となったこ
れらの置換を部位特定変異誘発で変化させた〔ゾラー及
びスミス、１９８２年、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ、第１０巻、第６４８７−６５００頁（Zoller and
Smith、１９８２、Nucleic Acids Research、１０、pp
６４８７−６５００）〕。ｐｒｅＳ２コード領域を含ま
ないＨＢｓＡｇコード領域含有プラスミドを下記のよう
に組立てた：ｐＵＣＨＢｐｒｅＳ２＋Ｓプラスミド（前
記）をＥｃｏＲＩ及びＳｔｙＩ制限エンドヌクレアーゼ
で切断した。ｐＵＣ及びＨＢｓＡｇコード領域を含む大
ＤＮＡ断片（３．３kbp)をｐｒｅＳ２コードＤＮＡ断片
から分離し、プレパラティブアガロースゲル電気泳動で
精製した。次いで下記合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド
対：
ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ切断ベクターに結合させた。得
られたベクター（２．８kbp)をプレパラティブアガロー
スゲル電気泳動で精製した。上記の０．８kbp ＥｃｏＲ
Ｉ−ＡｃｃＩ断片をこのベクターと結合させた。ｐｒｅ
Ｓ２＋ＳＯＲＦの存在及び向きは制限エンドヌクレアー
ゼ分析及びサザンブロットにより確認した。ＤＮＡ配列
分析（サンガーら、１９７７年）から、２つの塩基置換
があるためにプラスミドＨＢｐｒｅＳＧＡＰ３４７／１
９ＴのＤＮＡがコードする配列とアミノ酸が違ってくる
ことが判明した。両方の構築物において同一のポリペプ
チドを評価するため、塩基６４がＣでなくＴ（Ｌｅｕで
はなくＰｈｅをコードする）となり塩基３５２がＡでな
くＣ（ＧｌｎではなくＨｉｓをコードする）となったこ
れらの置換を部位特定変異誘発で変化させた〔ゾラー及
びスミス、１９８２年、ヌクレイック・アシッズ・リサ
ーチ、第１０巻、第６４８７−６５００頁（Zoller and
Smith、１９８２、Nucleic Acids Research、１０、pp
６４８７−６５００）〕。ｐｒｅＳ２コード領域を含ま
ないＨＢｓＡｇコード領域含有プラスミドを下記のよう
に組立てた：ｐＵＣＨＢｐｒｅＳ２＋Ｓプラスミド（前
記）をＥｃｏＲＩ及びＳｔｙＩ制限エンドヌクレアーゼ
で切断した。ｐＵＣ及びＨＢｓＡｇコード領域を含む大
ＤＮＡ断片（３．３kbp)をｐｒｅＳ２コードＤＮＡ断片
から分離し、プレパラティブアガロースゲル電気泳動で
精製した。次いで下記合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド
対：
【化３】 をｐＵＣＨＢｓＡｇ断片を結合させた。この合成オリゴ
ヌクレオチド対は５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＳｔｙＩ付着
末端を含み、５’ＥｃｏＲＩ部位の直後にＨｉｎｄIII
部位を有する。加えて、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド
対はＨＢｓＡｇＡＴＧコドン、それより上流１０bpの非
翻訳リーダー配列及びそれより下流のＳｔｙＩ部位含有
２１ヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチド対は
ＨＢｓＡｇの完全コード領域を再構成し、ＨｉｎｄIII
切断によりｐＵＣベースベクターからその領域を無傷で
取り出すことを可能にする。この結合ＤＮＡオリゴヌク
レオチド対を有するｐＵＣ−ＨＢｓＡｇＤＮＡを大腸菌
を形質転換するのに用いた。完全再組立てＨＢｓＡｇコ
ード領域を有する組換えプラスミドを選択した。発現ベ
クターにクローニングするために完全ＨＢｓＡｇオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＨｉｎｄIII 切
断した後プレパラティブアガロースゲル電気泳動により
（０．７kbp)ＨＢｓＡｇＤＮＡを単離、精製して組換え
プラスミドから取り出した。
ヌクレオチド対は５’ＥｃｏＲＩ及び３’ＳｔｙＩ付着
末端を含み、５’ＥｃｏＲＩ部位の直後にＨｉｎｄIII
部位を有する。加えて、合成ＤＮＡオリゴヌクレオチド
対はＨＢｓＡｇＡＴＧコドン、それより上流１０bpの非
翻訳リーダー配列及びそれより下流のＳｔｙＩ部位含有
２１ヌクレオチドを含む。このオリゴヌクレオチド対は
ＨＢｓＡｇの完全コード領域を再構成し、ＨｉｎｄIII
切断によりｐＵＣベースベクターからその領域を無傷で
取り出すことを可能にする。この結合ＤＮＡオリゴヌク
レオチド対を有するｐＵＣ−ＨＢｓＡｇＤＮＡを大腸菌
を形質転換するのに用いた。完全再組立てＨＢｓＡｇコ
ード領域を有する組換えプラスミドを選択した。発現ベ
クターにクローニングするために完全ＨＢｓＡｇオープ
ンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＨｉｎｄIII 切
断した後プレパラティブアガロースゲル電気泳動により
（０．７kbp)ＨＢｓＡｇＤＮＡを単離、精製して組換え
プラスミドから取り出した。
【００８４】実施例３ ＨＢｓＡｇａエピトープ変異体のクローニング プレＳ１又はプレＳ２をコードする領域を含まず変異体
“ａ”エピトープＨＢｓＡｇＯＲＦを含むｐＵＣ１９ベ
ースプラスミドを以下のように構築した。前述の完全Ｈ
ＢｓＡｇをコードする領域を含むｐＵＣ１９−ＨＢｓＡ
ｇプラスミドをパーキンエルマー／セタスGeneAmp ＤＮ
Ａ増幅試薬キットを用い製造業者の勧める手順に従って
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ合成を開始
させるために用いた。プライミングはＳｔｙＩ〜Ｂｓｔ
ｘＩ部位の２つのオリゴヌクレオチドで行なった。Ｂｓ
ｔｘＩ部位の第１オリゴヌクレオチドは配列番号８の配
列を有し１個の塩基変化（ＧをＣに）を含み、ＨＢｓＡ
ｇをコードするＤＮＡに導入したＨＢｓＡｇのエピトー
プ領域中１４５アミノ酸のＧｌｙをＡｒｇにアミノ酸置
換を生じる。第２ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＳｔｙＩ
部位からの配列、配列番号９、で合成した。このオリゴ
ヌクレオチドはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて
ＨＢｓＡｇＤＮＡのＳｔｙＩ部位からＢｓｔｘＩ部位ま
でのＤＮＡ合成を開始するために用いＤＮＡを製造業者
の手順に従ってＧからＣへの置換を含む第１オリゴヌク
レオチドプライマーから産生した。二本鎖ＤＮＡ（約４
５０bp長）を分離し、分離用アガロースゲル電気泳動で
精製し、ＳｔｙＩとＢｓｔｘＩで切断し、分離、精製し
たｐＵＣＨＢｓＡｇベクターに連結し上述のＳｔｙＩと
ＢｓｔｘＩで切断して“ａ”エピトープを取り出した。
得られたベクターは制限エンドヌクレアーゼマッピング
及びＤＮＡシークエンシングにより修飾された“ａ”エ
ピトープを含むことを確認した。
“ａ”エピトープＨＢｓＡｇＯＲＦを含むｐＵＣ１９ベ
ースプラスミドを以下のように構築した。前述の完全Ｈ
ＢｓＡｇをコードする領域を含むｐＵＣ１９−ＨＢｓＡ
ｇプラスミドをパーキンエルマー／セタスGeneAmp ＤＮ
Ａ増幅試薬キットを用い製造業者の勧める手順に従って
ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）によるＤＮＡ合成を開始
させるために用いた。プライミングはＳｔｙＩ〜Ｂｓｔ
ｘＩ部位の２つのオリゴヌクレオチドで行なった。Ｂｓ
ｔｘＩ部位の第１オリゴヌクレオチドは配列番号８の配
列を有し１個の塩基変化（ＧをＣに）を含み、ＨＢｓＡ
ｇをコードするＤＮＡに導入したＨＢｓＡｇのエピトー
プ領域中１４５アミノ酸のＧｌｙをＡｒｇにアミノ酸置
換を生じる。第２ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＳｔｙＩ
部位からの配列、配列番号９、で合成した。このオリゴ
ヌクレオチドはポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）を用いて
ＨＢｓＡｇＤＮＡのＳｔｙＩ部位からＢｓｔｘＩ部位ま
でのＤＮＡ合成を開始するために用いＤＮＡを製造業者
の手順に従ってＧからＣへの置換を含む第１オリゴヌク
レオチドプライマーから産生した。二本鎖ＤＮＡ（約４
５０bp長）を分離し、分離用アガロースゲル電気泳動で
精製し、ＳｔｙＩとＢｓｔｘＩで切断し、分離、精製し
たｐＵＣＨＢｓＡｇベクターに連結し上述のＳｔｙＩと
ＢｓｔｘＩで切断して“ａ”エピトープを取り出した。
得られたベクターは制限エンドヌクレアーゼマッピング
及びＤＮＡシークエンシングにより修飾された“ａ”エ
ピトープを含むことを確認した。
【００８５】実施例４ ３種の異なる発現ベクターにおける変異体ＨＢｓＡｇＯ
ＲＦのクローニング ３種の異なる発現ベクターを用いて変異体ＨＢｓＡｇ発
現カセットを組立てた。すでに述べたＧＡＰ４９１プロ
モーター発現カセット〔ニスカーンら、１９８６年、ジ
ーン、第４６巻、第１３５−１４１頁（Kniskern et a
l.,１９８６、Gene、４６、pp１３５−１４１）〕はｐ
ＢＲ３２２を主体とし約１．１kbp のグリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモ
ーター及び約３５０bpの酵母アルコールデヒドロゲナー
ゼＩ（ＡＤＨ１）ターミネーターから構成され、プロモ
ーターとターミネーターとの間に唯一のＨｉｎｄIII 部
位を有する。実施例２で得たＨＢｓＡｇＯＲＦを唯一の
ＨｉｎｄIII 部位で結合させ、その存在及び向きを制限
エンドヌクレアーゼ分析及びサザンブロットで確認し
た。一方（０．５kbp)ＧＡＬ１０プロモーター〔シュル
ツ(Schultz) ら、１９８７年、ジーン、第５４巻、第１
１３−１２３頁〕を１．１kbp ＧＡＰプロモーターの代
わりに用いて上記の組立てを行った。また（１．２５kb
p)ＡＤＨ２プロモーター〔ニスカーンら、１９８８年、
ヘパトロジー(Hepatology)、第８巻、第８２−８７頁〕
をＧＡＰプロモーターの代わりに用いて組立てを行った
（図１参照）。各ケースとも、特定プロモーター、ＨＢ
ｓＡｇＯＲＦ及びＡＤＨ１ターミネーター含有発現カセ
ットをシャトルベクターｐＣ１／１（ベッグス、前掲；
ローゼンバーグら、前掲）に組込んでクローニングし、
酵母発現ベクターを得、これを用いて下記のようにＳ．
セレビシアエを形質転換させた。
ＲＦのクローニング ３種の異なる発現ベクターを用いて変異体ＨＢｓＡｇ発
現カセットを組立てた。すでに述べたＧＡＰ４９１プロ
モーター発現カセット〔ニスカーンら、１９８６年、ジ
ーン、第４６巻、第１３５−１４１頁（Kniskern et a
l.,１９８６、Gene、４６、pp１３５−１４１）〕はｐ
ＢＲ３２２を主体とし約１．１kbp のグリセルアルデヒ
ド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プロモ
ーター及び約３５０bpの酵母アルコールデヒドロゲナー
ゼＩ（ＡＤＨ１）ターミネーターから構成され、プロモ
ーターとターミネーターとの間に唯一のＨｉｎｄIII 部
位を有する。実施例２で得たＨＢｓＡｇＯＲＦを唯一の
ＨｉｎｄIII 部位で結合させ、その存在及び向きを制限
エンドヌクレアーゼ分析及びサザンブロットで確認し
た。一方（０．５kbp)ＧＡＬ１０プロモーター〔シュル
ツ(Schultz) ら、１９８７年、ジーン、第５４巻、第１
１３−１２３頁〕を１．１kbp ＧＡＰプロモーターの代
わりに用いて上記の組立てを行った。また（１．２５kb
p)ＡＤＨ２プロモーター〔ニスカーンら、１９８８年、
ヘパトロジー(Hepatology)、第８巻、第８２−８７頁〕
をＧＡＰプロモーターの代わりに用いて組立てを行った
（図１参照）。各ケースとも、特定プロモーター、ＨＢ
ｓＡｇＯＲＦ及びＡＤＨ１ターミネーター含有発現カセ
ットをシャトルベクターｐＣ１／１（ベッグス、前掲；
ローゼンバーグら、前掲）に組込んでクローニングし、
酵母発現ベクターを得、これを用いて下記のようにＳ．
セレビシアエを形質転換させた。
【００８６】実施例５ 酵母Ｓ．セレビシアエＣＦ５２（ｍｎｎ９- ）変異酵母
株の作成 酵母Ｓ．セレビシアエ株ＫＨＹ１０７（ｃｉｒ+ 、ａｄ
ｅ１+ 、ｌｅｕ２- 及びｍｎｎ９- ）は下記のように作
成した：α接合型株ＣＺ５／ＬＢ３４７−１Ｃ（ｍｎｎ
９- 、ＳＵＣＺ- ）をＹＥＨＤ完全培地プレート上でａ
型株２１５０−２−３（ｌｅｕ２- 、ａｄｅ１- ）と混
合してその株と接合させた。二倍体を選択するため、接
合株を唯一の炭素源として２％スクロースを含むｌｅｕ
- 最少培地上にレプリカし培養した。シングルコロニー
を単離し、二倍体に胞子形成させ、子嚢を標準技術で切
開した。ＫＨＹ−１０７株は単一胞子として単離され、
ｃｉｒ+ 、ａｄｅ１+ 、ｌｅｕ２- 及びｍｎｎ９- と性
質が同定された（シッフ染色技術による）。ＫＨＹ１０
７（ｃｉｒ０）をブローチ(Broach)〔メソッズ・イン・
エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 、第１０１
巻、パートＣ、第３０７−３２５頁、１９８３年〕の記
載したように株ＫＨＹ１０７（ｃｉｒ+ ）から誘導し
た。修正された株は破壊されたｕｒａ３遺伝子を組込む
ことでｕｒａ３- とした。得られた株ＫＨＹ−１０７ｕ
ｒａ３Δは自然変異を蓄積させるため栄養培地で増殖さ
せ、カナバニン耐性変異株を選択した。変異株ＣＦ５５
は相補性試験によりｃａｎ１- であることが示された。
ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４発現カセットをＣＦ５５のＨＩＳ
３遺伝子に組込み、最終宿主株ＣＦ５２（Ｍａｔａ、ｌ
ｅｕ２−２、１１２ｕｒａ３Δ、ｃａｎ１ｈｉｓ３
Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ＵＲＡ３、ｃｉｒ゜）を
得た。
株の作成 酵母Ｓ．セレビシアエ株ＫＨＹ１０７（ｃｉｒ+ 、ａｄ
ｅ１+ 、ｌｅｕ２- 及びｍｎｎ９- ）は下記のように作
成した：α接合型株ＣＺ５／ＬＢ３４７−１Ｃ（ｍｎｎ
９- 、ＳＵＣＺ- ）をＹＥＨＤ完全培地プレート上でａ
型株２１５０−２−３（ｌｅｕ２- 、ａｄｅ１- ）と混
合してその株と接合させた。二倍体を選択するため、接
合株を唯一の炭素源として２％スクロースを含むｌｅｕ
- 最少培地上にレプリカし培養した。シングルコロニー
を単離し、二倍体に胞子形成させ、子嚢を標準技術で切
開した。ＫＨＹ−１０７株は単一胞子として単離され、
ｃｉｒ+ 、ａｄｅ１+ 、ｌｅｕ２- 及びｍｎｎ９- と性
質が同定された（シッフ染色技術による）。ＫＨＹ１０
７（ｃｉｒ０）をブローチ(Broach)〔メソッズ・イン・
エンザイモロジー(Methods in Enzymology) 、第１０１
巻、パートＣ、第３０７−３２５頁、１９８３年〕の記
載したように株ＫＨＹ１０７（ｃｉｒ+ ）から誘導し
た。修正された株は破壊されたｕｒａ３遺伝子を組込む
ことでｕｒａ３- とした。得られた株ＫＨＹ−１０７ｕ
ｒａ３Δは自然変異を蓄積させるため栄養培地で増殖さ
せ、カナバニン耐性変異株を選択した。変異株ＣＦ５５
は相補性試験によりｃａｎ１- であることが示された。
ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４発現カセットをＣＦ５５のＨＩＳ
３遺伝子に組込み、最終宿主株ＣＦ５２（Ｍａｔａ、ｌ
ｅｕ２−２、１１２ｕｒａ３Δ、ｃａｎ１ｈｉｓ３
Δ：：ＧＡＬ１０ｐＧＡＬ４−ＵＲＡ３、ｃｉｒ゜）を
得た。
【００８７】実施例６ ＣＦ５２ｍｎｎ９- 変異酵母におけるＨＢｓＡｇの酵母
形質転換及び種菌確立 実施例４で記載されたｐＣ１／１ｐＧＡＬ１０ＨＢｓＡ
ｇ−ｔＡＤＨ−１プラスミドを用いてＳ．セレビシアエ
株ＣＦ５２を形質転換させた。クローンを最少培地（１
Ｍソルビトール含有ｌｅｕ- ）で選択し、凍結ストック
（１７％グリセロール中）として確立し、下記のように
評価した。
形質転換及び種菌確立 実施例４で記載されたｐＣ１／１ｐＧＡＬ１０ＨＢｓＡ
ｇ−ｔＡＤＨ−１プラスミドを用いてＳ．セレビシアエ
株ＣＦ５２を形質転換させた。クローンを最少培地（１
Ｍソルビトール含有ｌｅｕ- ）で選択し、凍結ストック
（１７％グリセロール中）として確立し、下記のように
評価した。
【００８８】実施例７ 酵母ＣＦ５２（ｍｎｎ９- ）におけるＧＡＬ１０プロモ
ーターに続くＨＢｓＡｇ遺伝子の増殖及び発現 実施例６に記載された発現プラスミド含有酵母のクロー
ンを１Ｍソルビトール含有ｌｅｕ- 選択寒天プレート上
におき、３０℃で２〜３日間インキュベートした。これ
らの酵母を複合ＹＥＨＤＳ（ＹＥＨＤ＋１Ｍソルビトー
ル）５〜７mlに接種し、培養物を通気下３０℃で１２〜
１８時間インキュベートした。５０mlＹＥＨＤＳ＋２％
ガラクトース培地含有フラスコに初期Ａ600 が０．１と
なるよう上記培養物を接種し、振盪下（３５０rpm)最終
Ａ600 ＝１０〜１６まで３０℃で７２時間インキュベー
トした。１０Ａ600 単位のサンプルを管内にいれ、酵母
細胞を２０００xgで１０分間遠心してペレットにした。
そのペレットは直接調べるか又は将来のアッセイのため
に−７０℃で貯蔵した。アッセイ時には、そのペレット
を２mMＰＭＳＦ含有リン酸緩衝液０．４mlに再懸濁し
た。酵母細胞は：１）洗浄されたガラスビーズ（０．４
５mm）２００〜３００mgを添加、２）渦巻式ミキサーで
１５分間攪拌、３）０．５％(v/v) となるようトリトン
Ｘ−１００を添加、４）渦巻式ミキサーで２分間攪拌及
び５）４℃で１０〜１５分間のインキュベートにより破
壊した。細胞砕片及びガラスビーズを１３，０００xgで
１０分間の遠心により除去した。清澄化された上澄液を
とり、タンパク質〔ローリーら、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、第１９３巻、第２６５
頁、１９５１年(Lowry et al.,J.Biol.Chem., １９３、
２６５（１９５１）の方法による〕及びＨＢｓＡｇにつ
いては、ＡＵＳＲＩＡR アッセイ〔アボット(Abbott)〕
により分析した。典型的なアッセイ結果を以下に示す。 表Ｉ 種記述 AUSRIA SP.ATC. P24 レベル UG/ML UG/MGタンパク質 イムノブロット pGAL10 2.0,1.3,0.6 0.34,0.20,0.11 +++ pADH2 1.7,1.0,1.0 0.25,0.18,0.16 +++ 非変異体Ｓ 4.5 0.61 + pGAL10(adw)
ーターに続くＨＢｓＡｇ遺伝子の増殖及び発現 実施例６に記載された発現プラスミド含有酵母のクロー
ンを１Ｍソルビトール含有ｌｅｕ- 選択寒天プレート上
におき、３０℃で２〜３日間インキュベートした。これ
らの酵母を複合ＹＥＨＤＳ（ＹＥＨＤ＋１Ｍソルビトー
ル）５〜７mlに接種し、培養物を通気下３０℃で１２〜
１８時間インキュベートした。５０mlＹＥＨＤＳ＋２％
ガラクトース培地含有フラスコに初期Ａ600 が０．１と
なるよう上記培養物を接種し、振盪下（３５０rpm)最終
Ａ600 ＝１０〜１６まで３０℃で７２時間インキュベー
トした。１０Ａ600 単位のサンプルを管内にいれ、酵母
細胞を２０００xgで１０分間遠心してペレットにした。
そのペレットは直接調べるか又は将来のアッセイのため
に−７０℃で貯蔵した。アッセイ時には、そのペレット
を２mMＰＭＳＦ含有リン酸緩衝液０．４mlに再懸濁し
た。酵母細胞は：１）洗浄されたガラスビーズ（０．４
５mm）２００〜３００mgを添加、２）渦巻式ミキサーで
１５分間攪拌、３）０．５％(v/v) となるようトリトン
Ｘ−１００を添加、４）渦巻式ミキサーで２分間攪拌及
び５）４℃で１０〜１５分間のインキュベートにより破
壊した。細胞砕片及びガラスビーズを１３，０００xgで
１０分間の遠心により除去した。清澄化された上澄液を
とり、タンパク質〔ローリーら、ジャーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー、第１９３巻、第２６５
頁、１９５１年(Lowry et al.,J.Biol.Chem., １９３、
２６５（１９５１）の方法による〕及びＨＢｓＡｇにつ
いては、ＡＵＳＲＩＡR アッセイ〔アボット(Abbott)〕
により分析した。典型的なアッセイ結果を以下に示す。 表Ｉ 種記述 AUSRIA SP.ATC. P24 レベル UG/ML UG/MGタンパク質 イムノブロット pGAL10 2.0,1.3,0.6 0.34,0.20,0.11 +++ pADH2 1.7,1.0,1.0 0.25,0.18,0.16 +++ 非変異体Ｓ 4.5 0.61 + pGAL10(adw)
【００８９】実施例８ 発酵槽におけるＨＢｓＡｇ産生Ｓ．セレビシアエ（ｍｎ
ｎ９- ）の大規模培養 凍結された組換え酵母培養物を１Ｍソルビトール含有ｌ
ｅｕ- プレート上に接種した。プレートを２８℃で２〜
３日間にわたり下を向けてインキュベートした。プレー
ト上の増殖物をＹＥＨＤＳに再懸濁し、再懸濁された増
殖物を５００mlＹＥＨＤＳ及び２％ガラクトース含有２
リットルエーレンマイヤーフラスコ中に移した。フラス
コを制御環境振とうインキュベーター中２８℃及び３５
０rpm で１８〜２２時間インキュベートした。次いでこ
れらの種培養物を用いて、産生段階容器に接種した。１
以上のフラスコからの接種原（１〜５％v/v)を各々ＹＥ
ＨＤＳ１０リットル又は２００リットル含有の１６又は
２５０リットル発酵槽中に移した。１６リットル発酵槽
は５００rpm 、空気５リットル／min 、２８℃で操作し
た。２５０リットル発酵槽は１６０rpm 、空気６０リッ
トル／min 、２８℃で操作した。種培養物を接種後４０
〜４６時間目に発酵槽から回収した。通常１５．０Ａ
660 単位の光学密度値が得られた。中空繊維濾過装置を
用いて細胞を濃縮した後緩衝塩溶液により細胞を洗浄し
て回収した。細胞スラリーは下記のように調べるか又は
次の処理及び分析のために−７０℃で凍結貯蔵した。２
０％洗浄細胞スラリーの少量サンプル（０．６ml）を
１．５mlエッペンドルフ管中でガラスビーズ（０．４５
〜０．５２mm）を用いて破壊した。ＰＭＳＦ（２００mM
ストック６．５μｌ）をプロテアーゼ阻害剤として加え
た。破壊後に一部を管から取出し、免疫ブロット分析用
に−７０℃で凍結した。管内の残留サンプルにトリトン
Ｘ−１００を最終濃度０．５％まで加え、サンプルをし
ばらく混ぜ、４℃で２０〜４０分間インキュベートし
た。細胞砕片を遠心により除去し、清澄化された細胞抽
出物の
ｎ９- ）の大規模培養 凍結された組換え酵母培養物を１Ｍソルビトール含有ｌ
ｅｕ- プレート上に接種した。プレートを２８℃で２〜
３日間にわたり下を向けてインキュベートした。プレー
ト上の増殖物をＹＥＨＤＳに再懸濁し、再懸濁された増
殖物を５００mlＹＥＨＤＳ及び２％ガラクトース含有２
リットルエーレンマイヤーフラスコ中に移した。フラス
コを制御環境振とうインキュベーター中２８℃及び３５
０rpm で１８〜２２時間インキュベートした。次いでこ
れらの種培養物を用いて、産生段階容器に接種した。１
以上のフラスコからの接種原（１〜５％v/v)を各々ＹＥ
ＨＤＳ１０リットル又は２００リットル含有の１６又は
２５０リットル発酵槽中に移した。１６リットル発酵槽
は５００rpm 、空気５リットル／min 、２８℃で操作し
た。２５０リットル発酵槽は１６０rpm 、空気６０リッ
トル／min 、２８℃で操作した。種培養物を接種後４０
〜４６時間目に発酵槽から回収した。通常１５．０Ａ
660 単位の光学密度値が得られた。中空繊維濾過装置を
用いて細胞を濃縮した後緩衝塩溶液により細胞を洗浄し
て回収した。細胞スラリーは下記のように調べるか又は
次の処理及び分析のために−７０℃で凍結貯蔵した。２
０％洗浄細胞スラリーの少量サンプル（０．６ml）を
１．５mlエッペンドルフ管中でガラスビーズ（０．４５
〜０．５２mm）を用いて破壊した。ＰＭＳＦ（２００mM
ストック６．５μｌ）をプロテアーゼ阻害剤として加え
た。破壊後に一部を管から取出し、免疫ブロット分析用
に−７０℃で凍結した。管内の残留サンプルにトリトン
Ｘ−１００を最終濃度０．５％まで加え、サンプルをし
ばらく混ぜ、４℃で２０〜４０分間インキュベートし
た。細胞砕片を遠心により除去し、清澄化された細胞抽
出物の
【００９０】実施例９ 組換えＨＢｓＡｇの大規模精製 凍結細胞ペースト（組換えＳタンパク質産生細胞）約２
５０ｇをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１７％湿重量／容量
（約１５００ml）に再懸濁した。細胞を水浴に浸して４
５℃に加熱した。細胞を４５℃で１５分間保ち、しかる
後氷で約１０℃に冷却した。次いで細胞をゴーリン(Gau
lin)ホモジナイザーに２回通して破壊した。ホモジナイ
ズ後、１０％トリトンＸ−１００を最終濃度０．３％ま
で加え、約１５分間混ぜた。次いで細胞抽出物を３６０
０xg、４℃で２０分間遠心し、上清を集めた。次いで上
清をＸＡＤ−２樹脂約２００ｇ含有カラムに通してトリ
トンＸ−１００を除去した。次いで流出液を孔径約１５
００Å及び粒径約５０ミクロンの広孔シリカ約１５０ｇ
含有のカラムに直接通過させた。用いたカラムは５cm径
〔ファルマシア(Pharmacia) 〕であり、流速約２００ml
／hrで行った。シリカカラムはＡ280 がベースラインに
戻るまでＰＢＳで洗浄した。Ｓタンパク質を溶出させる
にはまずＡ280 の上昇が観察されるまで、流速約５００
ml／hrで冷ホウ酸緩衝液（５０mM、pH８．７、４℃）を
流した。Ａ280 が上昇し始めたら、カラムを５５℃に加
熱し、５５℃緩衝液をカラムに約５００ml／hrで流し
た。Ｓタンパク質含有溶出液（約１リットル）を氷上で
集めた。次いで溶出液を分子分画量１０5 の中空糸膜透
析濾過ユニットを用いてpH８．７の５０mMホウ酸緩衝液
に対して透析濾過し約２００mlまで濃縮した。次いでＳ
タンパク質を０．２ミクロンフィルターで濾過し、貯蔵
した。生成物は安定であることがわかり、ウェスターン
ブロット分析で観察される有意の分解はなかった。
５０ｇをリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で１７％湿重量／容量
（約１５００ml）に再懸濁した。細胞を水浴に浸して４
５℃に加熱した。細胞を４５℃で１５分間保ち、しかる
後氷で約１０℃に冷却した。次いで細胞をゴーリン(Gau
lin)ホモジナイザーに２回通して破壊した。ホモジナイ
ズ後、１０％トリトンＸ−１００を最終濃度０．３％ま
で加え、約１５分間混ぜた。次いで細胞抽出物を３６０
０xg、４℃で２０分間遠心し、上清を集めた。次いで上
清をＸＡＤ−２樹脂約２００ｇ含有カラムに通してトリ
トンＸ−１００を除去した。次いで流出液を孔径約１５
００Å及び粒径約５０ミクロンの広孔シリカ約１５０ｇ
含有のカラムに直接通過させた。用いたカラムは５cm径
〔ファルマシア(Pharmacia) 〕であり、流速約２００ml
／hrで行った。シリカカラムはＡ280 がベースラインに
戻るまでＰＢＳで洗浄した。Ｓタンパク質を溶出させる
にはまずＡ280 の上昇が観察されるまで、流速約５００
ml／hrで冷ホウ酸緩衝液（５０mM、pH８．７、４℃）を
流した。Ａ280 が上昇し始めたら、カラムを５５℃に加
熱し、５５℃緩衝液をカラムに約５００ml／hrで流し
た。Ｓタンパク質含有溶出液（約１リットル）を氷上で
集めた。次いで溶出液を分子分画量１０5 の中空糸膜透
析濾過ユニットを用いてpH８．７の５０mMホウ酸緩衝液
に対して透析濾過し約２００mlまで濃縮した。次いでＳ
タンパク質を０．２ミクロンフィルターで濾過し、貯蔵
した。生成物は安定であることがわかり、ウェスターン
ブロット分析で観察される有意の分解はなかった。
【００９１】
【００９２】配列番号：１ 配列の長さ：１０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：ACAAAACAAA
【００９３】配列番号：２ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGCAGTGG
【００９４】配列番号：３ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：GTTCGAATGT TTTGTTTTAC GTCACCTTAA
【００９５】配列番号：４ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：ATACATTTAA AGCTTG
【００９６】配列番号：５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：TGTAAATTTC GAACCTAG
【００９７】配列番号：６ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：AATTCAAGCT TACAAAACAA AATGGAGAAC ATCACATCAG
GATTC
GATTC
【００９８】配列番号：７ 配列の長さ：４５ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：GTTCGAATGT TTTGTTTTAC CTCTTGTAGT GTAGTCCTAA
GGATC
GGATC
【００９９】配列番号：８ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：CCAGGACGAT GGGATGGGAA TACAGGTGCA ATTTCGATCC
【０１００】配列番号：９ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：１本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ 配列：AGGATTCCTA GGACCCCTGC TCGTGTT
【図１】ＧＡＬ１０プロモーター、変異体ＨＢｓＡｇを
コードする領域のクローニングにユニークなＨｉｎｄII
I 部位及びｔＡＤＨ−１ターミネーターを含むプラスミ
ドｐＧＡＬ１０−ｖＨＢｓＡｇ−ｔＡＤＨ１の図式であ
る。
コードする領域のクローニングにユニークなＨｉｎｄII
I 部位及びｔＡＤＨ−１ターミネーターを含むプラスミ
ドｐＧＡＬ１０−ｖＨＢｓＡｇ−ｔＡＤＨ１の図式であ
る。
【手続補正書】
【提出日】平成５年２月２６日
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ 9015−2Ｊ 33/576 Ｂ 9015−2Ｊ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (72)発明者 アーピ ハゴピアン アメリカ合衆国，19446 ペンシルヴァニ ア，ランスデール，ハートレイ ドライヴ 771
Claims (18)
- 【請求項１】 免疫的に活性な粒子を形成するＢ型肝炎
ウイルス表面タンパク質の免疫ａエピトープ変異体。 - 【請求項２】 エントラップされた炭水化物又は糖タン
パク質含量が実質的に減少した請求項１記載のＢ型肝炎
ウイルス表面タンパク質。 - 【請求項３】 タンパク質グリコシル化が遺伝的に欠落
している組換え体酵母細胞中で生産される請求項２記載
のＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質。 - 【請求項４】 酵母細胞の遺伝欠落がｍｎｎ９遺伝子に
ある請求項３記載のＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質。 - 【請求項５】 精製表面タンパク質のタンパク質に対す
る炭水化物比が０．５未満である請求項２記載のＢ型肝
炎ウイルス表面タンパク質。 - 【請求項６】 免疫変異体ａエピトープがＢ型肝炎ウイ
ルス表面タンパク質の１２４と１４７アミノ酸間のアミ
ノ酸変性、置換、欠失又は付加から生じる請求項１記載
のＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質。 - 【請求項７】 Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原の１４５位に
アミノ酸置換を有する請求項６記載のＢ型肝炎ウイルス
表面タンパク質。 - 【請求項８】 １４５位のアミノ酸がグリシンからアル
ギニンに置換される請求項７記載のＢ型肝炎ウイルス表
面タンパク質。 - 【請求項９】 実質的に減少しエントラップされた炭水
化物又は糖タンパク質含量が実質的に減少した粒子を形
成するＢ型肝炎ウイルス表面タンパク質の免疫ａエピト
ープ変異体を包含しているヒトに有用なＢ型肝炎ウイル
スに対するワクチン。 - 【請求項１０】 免疫変異体ａエピトープがＢ型肝炎ウ
イルス表面タンパク質の１２４と１４７アミノ酸間のア
ミノ酸変性、置換、欠失又は付加から生じる請求項９記
載のワクチン。 - 【請求項１１】 Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質の１
４５位にアミノ酸置換を有する請求項１０記載のワクチ
ン。 - 【請求項１２】 １４５位のアミノ酸がグリシンからア
ルギニンに置換される請求項１１記載のワクチン。 - 【請求項１３】 タンパク質グリコシル化が遺伝的に欠
落している組換え体酵母細胞中で生産される請求項９記
載のワクチン。 - 【請求項１４】 遺伝欠落がｍｎｎ９遺伝子にある請求
項１３記載のワクチン。 - 【請求項１５】 表面タンパク質のタンパク質に対する
炭水化物比が０．５未満である請求項９記載のワクチ
ン。 - 【請求項１６】 実質的に減少しエントラップされた宿
主細胞炭水化物又は糖タンパク質含量が実質的に減少し
た粒子を形成する免疫変異体ａエピトープＢ型肝炎ウイ
ルスタンパク質を包含し、天然の抗酵母抗体との反応性
が低下する免疫診断用試薬。 - 【請求項１７】 精製表面タンパク質のタンパク質に対
する炭水化物比が０．５未満である請求項１６記載の免
疫診断用試薬。 - 【請求項１８】 Ｂ型肝炎ウイルス表面タンパク質がグ
リシンからアルギニンに１４５位のアミノ酸置換を含む
請求項１７記載の免疫診断用試薬。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US69292291A | 1991-04-29 | 1991-04-29 | |
| US692922 | 1991-04-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06172393A true JPH06172393A (ja) | 1994-06-21 |
Family
ID=24782598
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4155565A Pending JPH06172393A (ja) | 1991-04-29 | 1992-04-30 | 宿主炭水化物含量が減少したＨＢｓＡｇエスケープ変異体ワクチン |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0511855A1 (ja) |
| JP (1) | JPH06172393A (ja) |
| CA (1) | CA2067003A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2001099835A (ja) * | 1999-09-30 | 2001-04-13 | Internatl Reagents Corp | 界面活性剤の除去手段 |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL86833A0 (en) * | 1987-06-22 | 1988-11-30 | Medico Labs | Peptide containing immunogenic particles |
| EP0491077A1 (en) * | 1990-12-19 | 1992-06-24 | Medeva Holdings B.V. | A composition used as a therapeutic agent against chronic viral hepatic diseases |
| EP0533263A3 (en) * | 1991-09-20 | 1994-06-08 | Merck & Co Inc | A multivalent hepatitis b virus vaccine |
| JP3626996B2 (ja) | 1992-05-23 | 2005-03-09 | グラクソスミスクライン・バイオロジカルス・ソシエテ・アノニム | Ｂ型肝炎表面抗原および他の抗原からなる複合ワクチン |
| CA2158866A1 (en) * | 1993-03-24 | 1994-09-29 | Jennifer Anne Waters | Hepatitis b escape mutant specific binding molecules |
| US6030616A (en) * | 1993-03-24 | 2000-02-29 | Imperial College Of Science, Technology & Medicine | Hepatitis B escape mutant specific binding molecules |
| US5595739A (en) * | 1993-05-07 | 1997-01-21 | Abbott Laboratories | Hepatitis B virus mutants, reagents and methods for detection |
| GB9401987D0 (en) * | 1994-02-02 | 1994-03-30 | Imperial College | Modified nucleic acid |
| YU30495A (sh) * | 1994-05-16 | 1997-12-05 | Merck & Co. Inc. | Postupak za dobijanje hbv površinskih proteina |
| EP0919568A1 (en) * | 1997-12-01 | 1999-06-02 | Sorin Diagnostics S.r.l. | Escape mutant of the surface antigen of hepatitis B virus |
| WO2000023105A2 (en) | 1998-10-16 | 2000-04-27 | Smithkline Beecham Biologicals S.A. | Adjuvant systems and vaccines |
| CN100520409C (zh) * | 2005-09-06 | 2009-07-29 | 珠海丽珠试剂有限公司 | 新型乙型肝炎病毒表面抗原确认试剂盒 |
| ATE511398T1 (de) | 2006-09-07 | 2011-06-15 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Inaktiviertes poliovirus mischimpfstoff |
| MX2009011837A (es) | 2007-05-02 | 2010-04-22 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Vacuna. |
| GB201105981D0 (en) | 2011-04-08 | 2011-05-18 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel process |
| CN113201051B (zh) * | 2021-04-27 | 2022-08-02 | 复旦大学 | 一种乙肝病毒表面蛋白突变体及其在抗乙肝病毒中的应用 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02150292A (ja) * | 1988-06-03 | 1990-06-08 | Merck & Co Inc | 非高度グリコシル化ｂ型肝炎ビールス蛋白の生産方法 |
| JPH05505805A (ja) * | 1990-03-29 | 1993-08-26 | インペリアル カレッジ イノベーションズ リミテッド | Ｂ型肝炎ワクチン |
-
1992
- 1992-04-24 CA CA002067003A patent/CA2067003A1/en not_active Abandoned
- 1992-04-29 EP EP92303882A patent/EP0511855A1/en not_active Withdrawn
- 1992-04-30 JP JP4155565A patent/JPH06172393A/ja active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH02150292A (ja) * | 1988-06-03 | 1990-06-08 | Merck & Co Inc | 非高度グリコシル化ｂ型肝炎ビールス蛋白の生産方法 |
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|---|---|---|---|---|
| JP2001099835A (ja) * | 1999-09-30 | 2001-04-13 | Internatl Reagents Corp | 界面活性剤の除去手段 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0511855A1 (en) | 1992-11-04 |
| CA2067003A1 (en) | 1992-10-30 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 19950111 |