CN100520409C - 新型乙型肝炎病毒表面抗原确认试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及联合应用抗乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)的特异性抗体(抗-HBs抗体)和HBsAg免疫检测试剂对HBsAg免疫检测结果为有反应性的样本进行确认的检测方法及相关的检测试剂盒，以确定有反应性的样本是否为阳性，即真正含有HBsAg。本发明还涉及HBsAg酶免疫检测结果在“灰区”范围内的样本的确认检测方法及相关检测试剂盒。

Description

新型乙型肝炎病毒表面抗原确认试剂盒

发明领域

本发明涉及乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis Virus B SurfaceAntigen，简称HBsAg)免疫检测方法与试剂盒，特别涉及HBsAg酶免疫检测呈“阳性”(有反应性)或在“灰区”范围内的样本检测结果得到确认的检测方法与试剂盒。

背景技术

乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus，简称HBV)是乙型肝炎的病原体。HBsAg是HBV的重要血清学标志。在血清(或其他体液)中存在HBsAg表明受检者感染HBV。HBsAg实验室检测方法主要为免疫测定，常用的是放射免疫法(RIA)和酶免疫检测(EIA)，目前尤以酶免疫检测使用最为广泛。

HBsAg酶免疫检测的基本原理和操作步骤如下(参见图1)：在聚苯乙烯微板的反应孔内包被针对HBsAg的特异性抗体(抗-HBs)，在反应孔中加入待测样本，保温反应、洗涤后加入酶标记的抗-HBs，如果样本中含有HBsAg，则在反应孔上通过桥接，形成抗-HBs—HBsAg—抗-HBs·酶复合物，再通过酶催化底物进行显色反应。样本的吸光度值大于Cutoff值(阳性判断值)为阳性(有反应性)，小于Cutoff值为阴性。

在以上经典的两步法酶免疫检测中有两个特异性的抗原抗体反应，第一个是样本中的HBsAg与反应孔上包被的抗-HBs反应，洗涤去除样本中未结合到反应孔上的物质，再加入酶标记抗-HBs进行第二个反应，即反应孔上的HBsAg与酶标记抗-HBs的反应。

由于抗原抗体反应和酶与底物反应的强度与反应的时间和温度在一定范围内成正比，因此酶免疫检测的敏感性与测定中反应的温度和时间有直接关系。

为了简化检测步骤和缩短检测时间，国产的HBsAg酶免疫检测试剂多采用一步快速法，即将样本和酶标记抗-HBs同时加入，两次抗原抗体反应合并为一次，如图2。

这种一步快速法总体上讲也能满足临床需要，但由于缺乏了两步法中第一步反应后的洗涤，样本中如有非特异性干扰物存在，测定中可能促发假阳性反应。另外，为了缩短反应时间，快速法试剂成份的改变也增加了非特异性反应出现的可能性。

在HBsAg的酶免疫检测中，很多原因可导致假阳性反应。例如样本中可能存在非特异性的干扰物质。此外，如果HBsAg酶免疫检测试剂的包被抗体和酶标记抗体都使用了鼠源性单克隆抗体，则部分人群体内含有的人抗鼠抗体(HAMA)会桥接包被抗体和酶标记抗体，也能造成假阳性反应。由于HBsAg阳性可作为HBV感染的一种依据，国外对于HBsAg酶免疫检测呈阳性的样本称为有反应性，一般都要进行确认，排除假阳性反应后才能报告HBsAg阳性。

国外HBsAg酶免疫检测试剂的实际敏感度一般显著高于其标示的敏感度，加之国外试剂的精密度较好(Cutoff值附近的变异系数小于10％)，因此低于Cutoff值的样本即可判为HBsAg阴性，而高于或等于Cutoff值的样本则须进行确认以排除假阳性。

国产HBsAg酶免疫检测试剂由于采用了短反应时间的一步法，更增加了出现非特异性反应的可能。国产HBsAg酶免疫检测试剂的实际敏感度一般与其标示的敏感度相接近，精密度也略差(出厂时要求变异系数小于15％，临床测定中的变异系数可能更高)，因此测定数值在Cutoff值上下一定范围内的样本就无法确定其是有反应性还是无反应性，而出现所谓的“灰区”问题。为此，样本检测结果如在此“灰区”范围内，HBsAg的确认试验不仅要确认属于“有反应性”的样本是否为HBsAg阳性，也要排除实际属于“无反应性”的HBsAg阴性样本。因此与国外的试剂盒比较，对国产HBsAg酶免疫检测试剂盒有反应性的(即所谓的“阳性”)检测结果的确认更加复杂并十分必要。

因此为进一步确认HBsAg酶免疫检测的有反应性的结果，排除目前该检测方法中存在的假阳性，本发明旨在建立一种HBsAg的确认方法并生产开发出相应的确认试剂，对HBsAg酶免疫检测结果呈有反应性(阳性)或在“灰区”范围内的样本进行确认，从而克服目前不能对国产HBsAg酶免疫检测试剂有反应性的样本进行确认的缺陷。

发明内容

本发明通过使用特异性抗体(抗-HBs)中和检测样本中的HBsAg，再进行HBsAg免疫检测，以达到对HBsAg免疫检测有反应性的样本进行确认的目的。

本发明的第一方面涉及一种确认HBsAg有反应性的检测样本为HBsAg阳性的免疫检测方法，包括：

向所述样本中加入特异性抗-HBs抗体；

另外向所述样本中加入不含特异性抗-HBs抗体的对照试剂作为对照；

对所述加入特异性抗-HBs抗体的样本及不加入特异性抗-HBs抗体的对照分别进行HBsAg免疫检测；及

将加入所述特异性抗-HBs抗体的样本检测结果与不加入所述特异性抗-HBs抗体的对照检测结果进行比较，

其中加入所述特异性抗-HBs抗体的样本检测结果比对照的免疫检测结果有至少30％的下降，优选下降至少为50％，提示所述样本为HBsAg阳性。

优选地，本发明所述免疫检测是HBsAg酶免疫检测，所述检测结果为吸光度值。

优选地，本发明所述抗-HBs试剂的浓度可选范围为500IU/L至5000IU/L。

在本发明的一个实施方案中，本发明所述方法进一步包括在免疫检测前将所述样本用溶剂进行稀释的步骤。优选所述稀释的比例为1:50，1:100，1:1000，1:10000，或在此范围内的稀释度。

在本发明的另一实施方案中，所述有反应性为HBsAg酶免疫检测结果在“灰区”范围。

在本发明的一个实施方案中，当所述有反应性为HBsAg酶免疫检测结果在“灰区”范围时，优选将所述检测结果的吸光度值提高至高于“灰区”的上限，其包括选自以下的步骤：1)延长所述样本与所述特异性抗体的反应时间至30分钟～2小时；2)提高所述样本与所述特异性抗体的反应温度至35℃～42℃；3)对所述样本与所述特异性抗体反应后进行洗涤，然后再加入所述酶标记抗体；4)延长加入所述酶标记抗体后的抗原抗体反应时间至30分钟～4小时；5)提高加入所述酶标记抗体后的抗原抗体反应温度至35℃～42℃；6)延长所述酶标记抗体与底物的反应时间至30分钟～1小时；以及7)加大所述样本的加入量至50μl～500μl。

本发明的第二方面涉及一种对HBsAg酶免疫检测结果为有反应性的样本进行HBsAg确认的试剂盒，该试剂盒包括：

特异性抗-HBs抗体试剂；及

说明本发明所述对有反应性的样本进行HBsAg确认的操作步骤与检测结果的说明书。

本发明试剂盒待确认样本的有反应性是指HBsAg酶免疫检测结果在“灰区”范围或高于“灰区”范围。

在一个实施方案中，当所述待确认样本的有反应性在“灰区”范围时，试剂盒的说明书还包括说明能够使检测结果的吸光度提高至高于“灰区”的上限的选自以下的步骤：1)延长所述样本与所述特异性抗体的反应时间至30分钟～2小时；2)提高所述样本与所述特异性抗体的反应温度至35℃～42℃；3)对所述样本与所述特异性抗体反应后进行洗涤，然后再加入所述酶标记抗体；4)延长加入所述酶标记抗体后的抗原抗体反应时间至30分钟～4小时；5)提高加入所述酶标记抗体后的抗原抗体反应温度至35℃～42℃；6)延长所述酶标记抗体与底物的反应时间至30分钟～1小时；以及7)加大所述样本的加入量至50μl～500μl。

附图的简要说明

图1所示为两步法EIA测定HBsAg的示意图。

图2所示为一步快速法EIA测定HBsAg的示意图。

具体实施方式

本发明是在HBsAg免疫检测试剂盒尤其是在HBsAg酶免疫检测试剂盒与检测方法的基础上开发出的新产品与新方法。目的是使HBsAg免疫检测结果，尤其是HBsAg酶免疫检测试剂盒检测结果呈有反应性(所谓“阳性”)或在“灰区”范围内的样本得到HBsAg确认。

本发明中，所述检测结果在HBsAg酶免疫检测中以吸光度值(A值)表示，吸光度值大于Cutoff值(阳性判断值)为有反应性(即所谓的“阳性”)，小于Cutoff值为阴性。

本发明中，所述的HBsAg酶免疫检测检测方法包括两步法、一步法及快速一步法，优选快速一步法。

本发明所述的“灰区”，为本领域所述技术人员公认的可疑阳性和可疑阴性区间，这一区间根据HBsAg酶免疫检测的不精密度(变异系数)等的不同而变。例如在某一特定条件下将“灰区”定义为对HBsAg测得的吸光度值介于Cutoff值×0.7至Cutoff值×2之间，即“灰区”。“灰区”的范围与测定方法(包括使用的试剂和技术操作)所引起的结果的不精确有关。可根据国家或各地方相关规定，或根据实验室的实际情况来选定。更大或更小的“灰区”也在本发明的范围之内。

本发明试剂盒含有或方法中使用抗-HBs的特异性抗体试剂，可选择地，所述抗-HBs可是单克隆或多克隆抗体，该抗体可以是人源或动物源抗体，例如人源抗-HBs、大鼠抗-HBs、小鼠抗-HBs、兔抗-HBs、山羊抗-HBs、绵羊抗-HBs、马抗-HBs、猴抗-HBs等，本发明优选使用多克隆抗体。

本发明的抗-HBs的特异性抗体试剂在进行检测时，可选择地与利用抗体检测HBsAg的试剂联合使用，例如HBsAg酶免疫检测试剂盒(以下简称HBsAg EIA Kit)。因此优选地本发明的试剂盒或方法是联合HBsAgEIAKit或方法使呈HBsAg有反应性或在“灰区”范围内的血清或血浆样本得到确认检测，即证明其是HBsAg阳性。

本发明的试剂盒还涉及联合使用HBsAg EIA Kit的方法，包括两步法、一步法及快速一步法的HBsAg EIA Kit方法均可以用于本发明所述试剂盒的操作程序中。

在本发明的优选实施方案中，可在HBsAg EIA Kit(以丽珠HBsAgELISA试剂盒为例)的微孔板上加入所述样本后，向其中分别加入不含抗-HBs的对照试剂或含抗-HBs的特异性抗体试剂与样本进行反应，加入不含抗-HBs与含抗-HBs的微孔分别设为对照孔和检测孔；也可向所述样本中加入不含抗-HBs的对照试剂和含抗-HBs的特异性抗体试剂与样本进行反应后，再分别加入到所述HBsAg EIA Kit(以丽珠HBsAg ELISA试剂盒为例)的微孔板中(分别设为对照孔和检测孔)。检测孔中的特异性抗体与微孔反应板上的固相抗体竞争样本中的HBsAg，从而使结合到微孔反应板上的HBsAg量减少；而对照孔中不存在竞争，因此样本中的HBsAg能正常地结合到微孔反应板上。随后按一般酶免疫检测，加入酶标记抗-HBs反应后加底物液显色，用酶标仪测得吸光度值(A值)。如样本中有HBsAg存在，则检测孔的A值会明显低于对照孔，若检测孔中和后的抑制率较高，例如至少为30％，优选至少为50％，则样本中的HBsAg存在得到确认，即该有反应性的检测结果成为阳性检测结果。

在本发明的优选实施方案中，通常采用一般操作程序，该操作程序特别适合当有反应性的样本检测A值>Cutoff值×2(超过“灰区”上限)时的HBsAg检测；当A值介于Cutoff值×0.7至Cutoff值×2之间时，即检测值可能位于“灰区”，可附加采用“灰区”操作程序(在不同的地区、不同的实验室及使用不同的HBsAg EIA Kit时，“灰区”范围可有所不同)。

在本发明的实施方案中，通常按一般操作步骤，其包括：

将向原倍样本和/或稀释样本中加入含本发明特异性抗-HBs(检测孔)或不含该抗体(对照孔)的试剂；

然后对上述加入含有或不含有特异性抗-HBs试剂的样本进行HBsAg酶免疫检测；

比较所述加入含有或不含有特异性抗-HBs试剂的样本的吸光度值。

如果含有特异性抗-HBs比不含有特异性抗-HBs的检测值优选降低50％(抑制率)，可确认为HBsAg阳性。本领域所述技术人员应理解，由于加入特异性抗-HBs的目的是与HBsAg酶标抗体竞争结合HBsAg，因此降低50％是比较安全的检测值，但是低于此降低值的其它的能够说明有竞争抑制关系的降低值也是本发明的范围，例如至少30％。

在本发明的一个实施方案中，本发明所述操作程序还包括对阳性参考品进行上述检测的平行分析。例如，在HBsAg EIA Kit中检测到的参考阳性对照孔A值应较高，优选必须大于0.50和小于1.50，且抑制率必须大于50％，优选大于80％，否则上述实验结果无效。所述阳性参考品选自经确认为HBsAg阳性的人血清。

在本发明的实施方案中，可利用稀释生物样本的溶剂对样本进行稀释。不改变样本的检测性质的稀释溶剂是本领域所属技术人员公知的，例如人血清、各种动物血清或动物血清蛋白溶液、PBS、生理盐水等等。所述稀释比例为1:50、1:100、1:1000、1:10000的稀释或在此范围内的稀释度。优选1:100。

在本发明的一个实施方案中，若1:100比例的稀释样本的抑制率<50％，而其对照孔的检测值较高，例如A值≥2.0，则应对该样本进行更大倍数(例如1000倍、10000倍)的稀释，再重复上述一般操作程序。

在本发明的另一实施方案中，若原倍样本的抑制率<50％，1:100倍稀释样本的对照孔检测值较低，例如A值<Cutoff值×2，则应对该样本进行1:50倍稀释，再重复一般操作步骤。

本发明的另一实施方案还涉及“灰区”操作程序。如果本发明所述待确认样本HBsAg检测结果在“灰区”范围内，且检测值例如A值较低时，在加本发明所述特异性抗-HBs抗体后的HBsAg测定中难于用计算抑制率的方法进行确认，那么须改变反应条件，使对照孔的检测值超出“灰区”范围。使对照孔的检测值超出“灰区”范围的方法的特征是：1)延长样本与特异性抗体(抗-HBs)的反应时间(30分钟～2小时)；2)提高样本与特异性抗体(抗-HBs)的反应温度(35℃～42℃)；3)样本与特异性抗体(抗-HBs)反应后进行洗涤，然后再加入酶标记抗体；4)延长加入酶标记抗体后的抗原抗体反应时间(30分钟～4小时)；5)提高加入酶标记抗体后的抗原抗体反应温度(35℃～42℃)；6)延长酶标记抗体与底物的反应时间(30分钟～1小时)；和7)加大样本的加入量(50μl～500μl)。

因此本发明所述的“灰区”操作程序基本与一般操作步骤相同，优选地其与一般操作步骤的不同点为加入酶标记物后温育时间相对延长，例如120分钟。

在本发明的实施方案中，检测吸光度值的仪器是本领域所属技术人员公知的，例如酶标仪。

实施例

实施例1 一般操作程序

A.操作步骤：

取出确认试剂盒及HBsAg酶免疫检测试剂盒(丽珠HBsAg EIA Kit)，平衡(15-20分钟)至室温。

每次试验设空白孔一孔，空白孔中仅加入对照试剂100μl。

用生理盐水1:100稀释样本，检测时需同时测定原倍样本及稀释样本。

原倍样本需设定对照孔和检测孔各1孔，100倍稀释样本也需设定对照孔和检测孔各1孔(见表1)。

每次实验设参考阳性1份，同样设置对照孔和检测孔各1孔(见表1)。

在对照孔中加入对照试剂50μl，检测孔中加入特异性抗体试剂50μl(见表1)。

将100倍稀释样本加入到1孔对照孔(孔1)和1孔检测孔(孔2)中，每孔50μl；将原倍样本加入到1孔对照孔(孔3)和1孔检测孔(孔4)中，每孔50μl(见表1)。

将阳性参考品(HBsAg强阳性以及HIV、HCV，TP抗体阴性的血清，经灭活后稀释制得，含约5ng/mlHBsAg)加入到参考阳性的对照孔(孔5)和检测孔中(孔6)，每孔50μl(见表1)。

轻拍混匀，或置于振荡器上混匀(10-15秒)；置37℃温育30分钟。

每孔加入酶标记物(HBsAg EIA Kit组分)50μl；轻拍混匀，或置于振荡器上混匀(10-15秒)。

温育，参照HBsAg EIA Kit说明书(见附件1)。

洗板，手洗或采用洗板机洗板，参照HBsAg EIA Kit说明书。

显色，参照HBsAg EIA Kit说明书。

终止，参照HBsAg EIA Kit说明书。

比色，用空白孔校零，再读取各孔A值。

表1

 

孔号	1	2	3	4	5	6
							设置	100倍稀释样本对照孔	100倍稀释样本检测孔	原倍样本对照孔	原倍样本检测孔	参考阳性对照孔	参考阳性检测孔
对照试剂	50μl	/	50μl	/	50μl	/
							特异性抗体试剂	/	50μl	/	50μl	/	50μl
样本	100倍稀释样本50μl	100倍稀释样本50μl	原倍样本50μl	原倍样本50μl	阳性参考品50μl	阳性参考品50μl

B.一般程序的结果计算：

注：检测孔的A值大于对照孔的A值时，抑制率按0计算。

C.一般操作程序的结果判定：

1.参考阳性对照孔A值必须大于0.50，且抑制率必须大于80％，否则实验结果无效。

2.若原倍样本对照孔A值<Cutoff值×2，则采用原倍样本按“灰区”操作程序进行试验。

3.若原倍样本或100倍稀释样本的抑制率>50％，则可确认为HBsAg阳性。

4.若原倍样本的抑制率<50％；100倍稀释样本的抑制率<50％且其对照孔的A值<2.0；则可确认为HBsAg阴性。

5.若100倍稀释样本的抑制率<50％，而其对照孔的A值≥2.0，则应对该样本进行更大倍数(1000倍、10000倍)的稀释，再重复一般确认操作程序。

6.若原倍样本的抑制率<50％，100倍稀释样本的对照孔A值<Cutoff值×2，则应对该样本进行1:50稀释，再重复一般确认操作程序。50倍稀释样本的抑制率≥50％可确认为HBsAg阳性，<50％可确认为HBsAg阴性。

实施例2“灰区”操作程序

A.具体操作如下：

取出确认试剂盒及HBsAg酶免疫检测试剂盒(丽珠HBsAg EIA Kit)，平衡(15-20分钟)至室温。

每次试验设空白孔一孔，空白孔中仅加入对照试剂100μl。

每个样本设定对照孔和检测孔各1孔。

每次实验设参考阳性1份，同样设置对照孔和检测孔各1孔。

在对照孔中加入对照试剂50μl，检测孔中加入特异性抗体试剂50μl。

将原倍样本加入到1孔对照孔和1孔检测孔中，每孔50μl。

将阳性参考品加入到参考阳性的对照孔和检测孔中，每孔50μl。

轻拍混匀，或置于振荡器上混匀(10-15秒)；置37℃温育30分钟。

每孔加入酶标记物(HBsAg EIA Kit组分)50μl。

轻拍混匀，或置于振荡器上混匀(10-15秒)，置37℃温育120分钟。

洗板，手洗或采用洗板机洗板，参照HBsAg EIA Kit说明书。

显色，参照HBsAg EIA Kit说明书。

终止，参照HBsAg EIA Kit说明书。

比色，用空白孔校零，再读取各孔A值。

B.灰区”操作程序的结果计算：

同一般程序的结果计算。

C.“灰区”操作程序的结果判定：

参考阳性对照孔A值必须大于1.0，且抑制率必须大于80％，否则实验结果无效。

原倍样本的抑制率>50％，且对照孔A值>Cutoff值×2(本实施例认定的“灰区”上限)，则可确认为HBsAg阳性。

原倍样本的抑制率<50％，且对照孔A值>Cutoff值×2，则可确认为HBsAg阴性。

原倍样本的抑制率>50％，对照孔A值<Cutoff值×2，表明该样本仍为可疑阳性。

实施例3 样本试验一

某份血清样本，用丽珠HBsAg EIA Kit测得的A值为2.493。丽珠HBsAg EIA Kit的Cutoff值为0.105，该样本的A值大于Cutoff值×2，采用一般确认操作程序。试验中，参考阳性对照孔A值为0.520(大于0.5)，检测孔A值为0.022，按公式计算抑制率为95.77％(大于80％)，实验有效；原倍样本的对照孔A值为2.121，检测孔A值为0.097，抑制率为95.43％；100倍稀释样本的对照孔A值为0.034，检测孔A值为0.005，抑制率为85.3％。原倍样本和100倍稀释样本经中和试验后的抑制率均大于50％，故该份血清样本被确认为HBsAg阳性。

实施例4 样本试验二

某份血清样本，用丽珠HBsAg EIA Kit测得的A值为2.929。该样本的A值大于Cutoff值×2，采用一般操作程序。试验中，参考阳性对照孔A值为0.520(大于0.5)，检测孔A值为0.022，抑制率为95.77％(大于80％)，实验有效；原倍样本的对照孔A值为2.668，检测孔A值为2.797，抑制率为0；100倍稀释样本的对照孔A值为0.880，检测孔A值为0.038，抑制率为95.68％。经中和试验后，原倍样本的抑制率小于50％，但100倍稀释样本的抑制率大于50％，故该份血清样本被确认为HBsAg阳性。

实施例5 样本试验三

某份血清样本，用丽珠HBsAg EIA Kit测得的A值为3.172。该样本的A值大于Cutoff值×2，采用一般操作程序。试验中，参考阳性对照孔A值为0.655(大于0.5)，检测孔A值为0.031，抑制率为95.27％(大于80％)，实验有效；原倍样本的对照孔A值为3.017，检测孔A值为2.998，抑制率为0.63％；1:100倍稀释样本的对照孔A值为2.860，检测孔A值为1.870，抑制率为34.62％，可基本确认为HBsAg阳性。但原倍样本和100倍稀释样本经中和试验后的抑制率均小于50％，且100倍稀释样本对照孔的A值大于2.0，故对该份样本再进行1:1000稀释后重复进行操作。1000倍稀释样本的对照孔A值为2.399，检测孔A值为0.091，抑制率为96.21％，大于50％，故该份血清样本被确认为HBsAg阳性。

实施例6 样本试验四

某份血浆样本，用丽珠HBsAg EIA Kit测得的A值为0.576。该样本的A值大于Cutoff值×2，采用一般操作程序。试验中，参考阳性对照孔A值为0.655(大于0.5)，检测孔A值为0.031，抑制率为95.27％(大于80％)，实验有效；原倍样本的对照孔A值为0.567，检测孔A值为1.062，抑制率为0；100倍稀释样本的对照孔A值为0.389，检测孔A值为0.535，抑制率为0。原倍样本和100倍稀释样本的抑制率均小于50％，且100倍稀释样本对照孔的A值<2.0，故该份血浆样本被确认为HBsAg阴性(假阳性)。

实施例7 样本试验五

某份血清样本，用丽珠HBsAg EIA Kit测得的A值为0.174。丽珠HBsAg EIA Kit的Cutoff值为0.105，该样本的A值小于Cutoff值×2，但大于Cutoff值×0.7，采用“灰区”操作程序。试验中，参考阳性对照孔A值为1.172(大于1.0)，检测孔A值为0.062，抑制率为94.71％(大于80％)，实验有效；样本的对照孔A值为0.753，超过了Cutoff值×2的“灰区”上限，检测孔A值为0.021，抑制率为97.21％，大于50％，故该份血清样本被确认为HBsAg阳性。

实施例8 样本试验六

某份血清样本，用丽珠HBsAg EIA Kit测得的A值为0.107。丽珠HBsAg EIA Kit的Cutoff值为0.105，该样本的A值小于Cutoff值×2，但大于Cutoff值×0.7，采用“灰区”操作程序。试验中，参考阳性对照孔A值为1.172(大于1.0)，检测孔A值为0.062，抑制率为94.71％(大于80％)，实验有效；样本的对照孔A值为0.196，超过了Cutoff值，但未超过Cutoff值×2的“灰区”上限，故该份血清样本为可疑阳性。

Claims (20)

1.一种确认HBsAg为阳性的免疫检测方法，包括：

提供HBsAg免疫测定结果为有反应性的样本；

向所述样本中加入特异性抗-HBs抗体；

另外向所述样本中加入不含特异性抗-HBs抗体的对照试剂作为对照；

对所述加入特异性抗-HBs抗体的样本及不加入特异性抗-HBs抗体的对照分别进行HBsAg免疫检测；及

将加入所述特异性抗-HBs抗体的样本检测结果与不加入所述特异性抗-HBs抗体的对照检测结果进行比较，

其中加入所述特异性抗-HBs抗体的样本检测结果比对照的免疫检测结果下降至少30％，提示所述样本为HBsAg阳性。

2.如权利要求1所述方法，其中所述免疫检测是HBsAg酶免疫检测，所述检测结果为吸光度值。

3.如权利要求1或2所述方法，其中所述下降至少为50％。

4.如权利要求1或2所述的方法，还包括在免疫检测前将所述样本用溶剂进行稀释的步骤。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述稀释的比例为1:50，1:100，1:1000或1:10000。

6.如权利要求1或2所述的方法，其中所述有反应性也包括HBsAg酶免疫检测的结果在“灰区”范围的情况。

7.如权利要求6所述的方法，其中所述的“灰区”的下限为Cutoff值×0.7，“灰区”的上限为Cutoff值×2。

8.如权利要求6所述的方法，还包括选自以下的能够使检测结果的吸光度值提高至高于“灰区”的上限的步骤：1)延长所述样本与所述特异性抗体的反应时间至30分钟～2小时；2)提高所述样本与所述特异性抗体的反应温度至35℃～42℃；3)对所述样本与所述特异性抗-HBs抗体反应后进行洗涤，然后再加入所述酶标记抗体；4)延长加入所述酶标记抗体后的抗原抗体反应时间至30分钟～4小时；5)提高加入所述酶标记抗体后的抗原抗体反应温度至35℃～42℃；6)延长所述酶标记抗体与底物的反应时间至30分钟～1小时；以及7)加大所述样本的加入量至50μl～500μl。

9.如权利要求7所述的方法，还包括选自以下的能够使检测结果的吸光度值提高至高于“灰区”的上限的步骤：1)延长所述样本与所述特异性抗体的反应时间至30分钟～2小时；2)提高所述样本与所述特异性抗体的反应温度至35℃～42℃；3)对所述样本与所述特异性抗-HBs抗体反应后进行洗涤，然后再加入所述酶标记抗体；4)延长加入所述酶标记抗体后的抗原抗体反应时间至30分钟～4小时；5)提高加入所述酶标记抗体后的抗原抗体反应温度至35℃～42℃；6)延长所述酶标记抗体与底物的反应时间至30分钟～1小时；以及7)加大所述样本的加入量至50μl～500μl。

10.如权利要求1或2所述的方法，其中所述的特异性抗-HBs抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

11.如权利要求10所述的方法，其中所述的抗体为来源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、马、兔、羊的抗体。

12.如权利要求11所述的方法，其中所述的抗体与HBsAg酶免疫检测步骤中所用的抗体为相同或不相同来源。

13.一种HBsAg确认试剂盒，用于对HBsAg酶免疫检测结果为有反应性的样本进行HBsAg的确认，该试剂盒包括：

特异性抗-HBs抗体试剂和不含特异性抗-HBs抗体的对照试剂；及HBsAg酶联免疫试剂盒。

14.如权利要求13所述的试剂盒，其中进一步包括在免疫检测前将所述样本进行稀释的溶剂。

15.如权利要求14所述的试剂盒，其中所述稀释溶剂能够将所述样本按选自1:50，1:100，1:1000和1:10000的比例稀释。

16.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述有反应性包括HBsAg酶免疫检测的结果在“灰区”范围的情况。

17.如权利要求16所述的试剂盒，其中所述“灰区”的下限为Cutoff值×0.7，所述“灰区”的上限为Cutoff值×2。

18.如权利要求13-17中任一权利要求所述的试剂盒，其中所述的特异性抗-HBs抗体为单克隆抗体或多克隆抗体。

19.如权利要求18所述的试剂盒，其中所述的抗体为来源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、马、兔、羊的抗体。

20.如权利要求19所述的试剂盒，其中所述的抗体与HBsAg酶免疫检测步骤中的抗体为相同或不同来源。

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