CN101943700A - 乙型肝炎病毒表面抗原呈阳性的确认方法和试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种HBsAg呈阳性的确认方法和试剂盒，通过对HBsAg化学发光免疫检测过程中的有反应性或在“灰区”范围内的样本进行检测确认，可以有效排除化学发光免疫检测过程中存在的假阳性对结果判断的影响。

Description

乙型肝炎病毒表面抗原呈阳性的确认方法和试剂盒

【技术领域】

本发明涉及乙型肝炎病毒表面抗原(Hepatitis Virus B SurfaceAntigen，HBsAg)免疫检测领域，特别涉及一种使HBsAg化学发光免疫测定呈有反应性或在“灰区”范围内的样本检测结果得到确认的检测方法与试剂盒。

【背景技术】

乙型肝炎病毒(Hepatitis Virus B，HBV)是乙型肝炎的病原体。HBsAg是HBV感染的重要血清学标志。在血清(或其他体液)中存在HBsAg表明受检者感染HBV。HBsAg实验室检测方法主要为免疫测定，常用的是放射性免疫法(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)和化学发光免疫检测(CLIA)。化学发光免疫分析是近十年来在世界范围内发展非常迅速的非放射性免疫分析。它具有高灵敏度、检测范围宽、操作简便快速、标记物稳定性好、无污染、仪器简单经济等优点。CLIA发展迅猛，已占各种免疫分析的首位，是目前放射免疫分析和酶联免疫分析最佳的取代者。灵敏度高是化学发光免疫分析关键的优越性，其灵敏度可达10-16mol/L(RIA为10-12mol/L)。化学发光免疫分析能够检出酶联免疫分析方法无法检出的物质，对疾病的早期诊断具有十分重要的意义。CLIA发光强度在4～6个量级之间与测定物质浓度间呈线性关系，这与显色的酶免疫分析吸光度(OD值)为2.0的范围相比，优势明显。

HBsAg化学发光免疫检测的基本原理和操作步骤如下(参见图1)：在聚苯乙烯微孔板的反应孔内包被针对HBsAg的特异性抗体(抗-HBs)，在反应孔中加入待测样本，保温反应、洗涤后加入酶标记的抗-HBs，如果样本中含有HBsAg，则在反应孔中形成抗-HBs-HBsAg-抗-HBs·酶复合物。在酶的催化作用下，发光底物发生化学反应并释放出大量的能量，产生激发态的中间体，当中间体回到稳定的基态时，可同时发射出光子。利用发光信号测量仪器即可测量RLU(Relative LightUnit，相对光单位)，该RLU与样品中的待测物质的量成正比。样本的RLU值大于Cutoff值(临界值)为阳性，小于Cutoff值为阴性。

在HBsAg的化学发光免疫检测中，很多原因可导致假阳性反应。如样本中可能存在非特异性干扰物质如：嗜异性抗体、嗜靶抗原自身抗体、医源性诱导的抗鼠IgG抗体和交叉反应物质等。另外一些外源性干扰物质或操作不当均能引起假阳性反应。为了简化检测步骤和缩短检测时间，国产的HBsAg化学发光免疫检测试剂多采用一步法，即样本和酶标记抗-HBs同时加入，如图2所示。这种一步快速法总体上讲也能满足临床需要，但由于缺乏了两步法中第一步反应后的洗涤，样本中如有非特异性干扰物存在，测定中可能促发假阳性反应。另外，为了缩短时间，快速法试剂成分的改变也增加了非特异性反应出现的可能。

由于HBsAg阳性可作为HBV感染的一种依据，国外对于HBsAg化学发光免疫检测呈阳性的样本称为有反应性，一般都要进行确认，排除假阳性后才能报告HBsAg阳性。

国外HBsAg化学发光免疫检测试剂的实际敏感度一般显著高于其标示的敏感度，加之国外试剂的精密度较好(Cutoff值附近的变异系数小于10％)，因此低于Cutoff的样本即可判为HBsAg阴性，而高于或等于Cutoff值的样本则需进行确认以排除假阳性。国内HBsAg化学发光免疫检测试剂的实际敏感度一般与标示的敏感度相近，精密度略差(出厂时要求变异系数小于15％，临床测定中的变异系数可能更高)，因此测定数值在Cutoff值附近一定范围内的样本就无法确定其是有反应性还是无反应性，而出现“灰区”问题。因此，样本检测结果如果在“灰区”内，HBsAg的确认试验不仅要确认属于“有反应性”的样本是否为HBsAg阳性，也要排除实际属于“无反应性的”HBsAg阴性样本。

【发明内容】

基于此，有必要提供一种HBsAg呈阳性的确认方法，以进一步确认HBsAg化学发光免疫检测的有反应性的结果，排除传统的该检测方法中存在的假阳性。

同时，还有必要提供一种HBsAg呈阳性的确认试剂盒。

一种HBsAg呈阳性的确认方法，包括如下步骤：提供HBsAg化学发光免疫检测的测定结果为有反应性的样本；向样本中加入特异性抗-HBs；另外向样本中加入不含特异性抗-HBs的对照试剂作为对照；对加入特异性抗-HBs的样本及加入对照试剂的样本分别进行HBsAg的化学发光免疫检测；比较加入特异性抗-HBs的样本及加入对照试剂的样本的RLU，若加入特异性抗-HBs的样本的RLU比加入对照试剂的样本的RLU下降至少30％，提示样本为HBsAg阳性。

优选的，上述下降至少为50％时，提示样本为HBsAg阳性。

优选的，还包括在进行化学发光免疫检测前将样本用溶剂进行稀释的步骤。

优选的，上述稀释的比例为1∶50，1∶100，1∶1000，1∶10000，或在此范围内的任意稀释度。

优选的，有反应性包括HBsAg化学发光免疫检测结果在“灰区”范围的情况。

优选的，“灰区”范围的下限为Cutoff值×0.7，“灰区”范围的上限为Cutoff值×2。

优选的，还包括选自以下的能够使化学发光免疫检测结果的RLU提高至高于“灰区”上限的步骤：1)延长样本与特异性抗-HBs的反应时间至30min-2h；2)提高样本与特异性抗-HBs的反应温度至35℃-42℃；3)样本与特异性抗-HBs反应后进行洗涤，然后再加入酶标记抗体；4)延长加入酶标记抗体后的反应时间至30min-4h；5)提高加入酶标记抗体后的反应温度至35℃-42℃；6)加大样本的加入量至50-500μl。

优选的，特异性抗-HBs为来源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、马、兔或羊的抗体。

一种HBsAg呈阳性的确认试剂盒，用于对HBsAg化学发光免疫检测结果为有反应性的样本进行阳性确认，包括特异性抗-HBs抗体试剂、HBsAg化学发光免疫检测试剂及说明权利要求1方法的操作步骤与检测结果的说明书。

优选的，加入特异性抗-HBs的样本的RLU比加入对照试剂的样本的RLU下降至少50％，提示样本为HBsAg阳性。

优选的，说明书还包括在进行化学发光免疫检测前将样本用溶剂进行稀释的步骤并将稀释样本进行同样的化学发光免疫检测的说明。

优选的，稀释的比例为1∶50，1∶100，1∶1000，1∶10000，或在此范围内的任意稀释度。

优选的，有反应性包括HBsAg化学发光免疫检测结果在“灰区”范围的情况。

优选的，“灰区”范围的下限为Cutoff值×0.7，“灰区”范围的上限为Cutoff值×2。

优选的，试剂盒的说明书中还包括选自以下的能够使化学发光免疫检测结果的RLU值提高至高于“灰区”上限的步骤的说明：1)延长样本与特异性抗-HBs的反应时间至30min-2h；2)提高样本与特异性抗-HBs的反应温度至35℃-42℃；3)样本与特异性抗-HBs反应后进行洗涤，然后再加入酶标记抗体；4)延长加入酶标记抗体后的反应时间至30min-4h；5)提高加入酶标记抗体后的反应温度至35℃-42℃；6)加大样本的加入量至50-500μl。

优选的，特异性抗-HBs为来源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、马、兔或羊的抗体。

通过对HBsAg化学发光免疫检测过程中的有反应性或在“灰区”范围内的样本进行检测确认，可以有效排除化学发光免疫检测过程中存在的假阳性对结果的判断。

【附图说明】

图1为两步法CLIA测定HBsAg的示意图。

图2为一步快速法CLIA测定HBsAg的示意图。

【具体实施方式】

以下主要结合实施方案及具体实施例对本发明的HBsAg呈阳性的确认方法和试剂盒作进一步的说明。

本发明是在HBsAg化学发光免疫检测试剂盒与检测方法的基础上开发的新产品与新方法。目的是使HBsAg化学发光免疫检测试剂盒检测结果呈有反应性的或在“灰区”范围内的样本得到确认。

本发明的实施方案中，通常采用一般操作程序，该一般操作程序适合样本RLU值＞Cutoff值×2时的检测；当样本RLU值介于Cutoff值×0.7和Cutoff值×2之间时，可采用“灰区”操作程序。在不同的地区、不同的实验室及使用不同的HBsAg CLIA Kit(HBsAg化学发光免疫检测试剂盒)时，“灰区”范围可能有所不同。

本发明的实施方案中的一般操作程序，包括如下步骤：

向样本中加入特异性抗-HBs(检测孔)或不含特异性抗-HBs的对照试剂；

对所述加入特异性抗-HBs的样本及加入对照试剂的样本分别进行HBsAg免疫检测；

对加入特异性抗-HBs的样本检测结果及加入对照试剂的样本检测结果进行比较；

如果加入特异性抗-HBs的样本检测结果比加入对照试剂的样本检测结果下降至少50％，可确认样本为HBsAg阳性。本领域技术人员应理解，由于加入特异性抗-HBs的目的是与HBsAg酶标记抗体竞争结合HBsAg，因此降低50％是比较安全的检测值，但是低于此降低值的其他能够说明有竞争性关系的降低值也是本发明的范围，例如至少30％。

本发明实施方案中，包括对阳性对照进行检测。阳性对照对照孔RLU值应大于Cutoff值×10，且抑制率必须大于80％，否则实验结果无效。所述阳性对照为HBsAg强阳性以及anti-HIV、anti-HCV、anti-TP阴性的血清，经灭活后稀释制得，含HBsAg约5ng/ml。

本发明的另一实施方案还涉及“灰区”操作程序。该程序与一般操作程序基本相同，与一般操作程序不同点为加入酶标记物后温育时间相对延长，如120min。

本发明实施方案中，检测所需仪器为光谱范围为300nm～600nm的化学发光读数仪。

以下为具体实施例部分：

实施例1一般操作程序：

A.操作步骤：

取出确认试剂盒及HBsAg化学发光免疫检测试剂盒(丽珠HBsAg CLIAKit)，平衡(15-20min)至室温。

用生理盐水1∶100稀释样本，检测时需同时测定原倍样本及稀释样本。

每次试验设空白一孔(孔9)，空白孔中仅加入对照试剂100μl。

原倍样本及稀释样本需设定对照孔和检测孔各1孔。

每次试验设阳性对照一份，阴性对照(丽珠HBsAg CLIA Kit组分，为HBsAg阴性以及anti-HIV、anti-HCV、anti-TP阴性的血清，经灭活后使用，阴性对照读值×2.1即为Cutoff值)一份，同样为其设对照孔和检测孔各1孔。

在对照孔中加入对照试剂50μl，检测孔中加入特异性抗体试剂50μl(见表1)。

将100倍稀释样本加入到1孔对照孔(孔1)和1孔检测孔(孔2)，每孔50μl；将原倍样本加入到1孔对照孔(孔3)和1孔检测孔(孔4)，每孔50μl(见表1)。

将阳性对照加入到1孔对照孔(孔5)和1孔检测孔(孔6)，每孔50μl(见表1)。

轻拍混匀，或置于振荡器上混匀，置37℃温育30min。

每孔加入酶标记物(HBsAg CLIA Kit组分)50μl；轻拍混匀，或置于振荡器上混匀。

温育，参照HBsAg CLIAKit说明书。

洗板，参照HBsAg CLIAKit说明书。

读值，参照HBsAg CLIAKit说明书。

表1

B.结果计算：

注：检测孔的RLU值大于对照孔的RLU值时，抑制率按0计算。

C.结果判定：

1.阳性对照孔RLU值必须大于Cutoff值×10，且抑制率必须大于80％，否则实验结果无效。

2.若原倍样本对照孔RLU值＜Cutoff值×2，则采用原倍样本按“灰区”操作程序进行试验。

3.若原倍样本或100倍稀释样本的抑制率＞50％，则可确认为HBsAg阳性。

4.若原本样本抑制率＜50％，100倍稀释样本的抑制率＜50％，且其对照孔的RLU值＜Cutoff值×40，则可确认为HBsAg阴性。

5.若100倍稀释样本的抑制率＜50％，且其对照孔的RLU值≥Cutoff值×40，则应对样本进行更大倍数稀释(1000倍、10000倍)，再重复一遍确认操作程序。

6.若原倍样本的抑制率＜50％，100倍稀释样本对照孔的RLU值＜Cutoff值×2，则应对样本进行1∶50稀释，再重复一遍确认操作程序。50倍稀释样本的抑制率≥50％，则可确认为HBsAg阳性，抑制率＜50％则可确认为HBsAg阴性。

实施例2“灰区”操作程序

A.操作步骤

取出确认试剂盒及HBsAg化学发光免疫检测试剂盒(丽珠HBsAg CLIAKit)，平衡(15-20min)至室温。

每次试验设空白一孔，空白孔中仅加入对照试剂100μl。

每个样本需设定对照孔和检测孔各1孔。

每次试验设阳性对照一份，阴性对照一份，同样为其设对照孔和检测孔各1孔。

在对照孔中加入对照试剂50μl，检测孔中加入特异性抗体试剂50μl。

将原倍样本加入到1孔对照孔和1孔检测孔中，每孔50μl。

将阳性对照加入到1孔对照孔和1孔检测孔，每孔50μl。

轻拍混匀，或置于振荡器上混匀，置37℃温育30min。

每孔加入酶标记物(HBsAg CLIA Kit组分)50μl；轻拍混匀，或置于振荡器上混匀，置37℃温育120min。

洗板，参照HBsAg CLIA Kit说明书。

读值，参照HBsAg CLIAKit说明书。

B.结果计算：

同一般程序的结果计算。

C.“灰区”操作程序的结果判定：

1.阳性对照孔RLU值必须大于Cutoff值×20，且抑制率必须大于80％，否则实验结果无效。

2.若原倍样本的抑制率＞50％，且对照孔RLU值＞Cutoff值×2，则可确认为HBsAg阳性。

3.若原本样本抑制率＜50％，且对照孔RLU值＞Cutoff值×2，则可确认为HBsAg阴性。

4.若原倍样本的抑制率＞50％，且对照孔RLU值＜Cutoff值×2，表明该样本仍为HBsAg可疑阳性。

实施例3样本试验一：

某份血清样本，用丽珠HBsAg CLIA Kit测得RLU值为10172320，Cutoff值为80367，大于Cutoff值×2，采用-般确认操作程序。试验中，阳性对照对照孔RLU值为3402082，大于Cutoff值×10，检测孔RLU值110249，按公式计算抑制率为96.7％(大于80％)，试验有效；原倍样品的对照孔RLU值为9955876，检测孔RLU值为23065，抑制率为99.7％；100倍稀释样本的对照孔RLU值为129754，检测孔RLU值为20033，抑制率为84.6％。原倍样本和100倍稀释样本经本中和试剂试验后抑制率均大于50％，故该份血清样本确认为HBsAg阳性。

实施例4样本试验二：

某份血清样本，用丽珠HBsAgCLIA Kit测得RLU值为12154308，Cutoff值为82370，大于Cutoff值×2，采用一般确认操作程序。试验中，阳性对照对照孔RLU值为3545473，大于Cutoff值×10，检测孔RLU值113642，按公式计算抑制率为96.8％(大于80％)，实验有效；原倍样品的对照孔RLU值为10031460，检测孔RLU值为10172320，抑制率为0；100倍稀释样本的对照孔RLU值为1529754，检测孔RLU值为20033，抑制率为98.7％。经中和试验后，原倍样本抑制率小于50％，但100倍稀释样本抑制率大于50％，故该份血清样本确认为HBsAg阳性。

实施例5样本试验三：

某份血清样本，用丽珠HBsAg CLLA Kit测得RLU值为13641825，Cutoff值为83018，大于Cutoff值×2，采用一般确认操作程序。试验中，阳性对照对照孔RLU值为3663408，大于Cutoff值×10，检测孔RLU值114481，按公式计算抑制率为96.9％(大于80％)，实验有效；原倍样品的对照孔RLU值为12010753，检测孔RLU值为10172320，抑制率为15.3％；100倍稀释样本的对照孔RLU值为11001594，检测孔RLU值为7207613，抑制率为34.5％，可基本确认为HBsAg阳性，但原倍样本和100倍稀释样本经中和试验后抑制率均小于50％，且100倍稀释对照孔的RLU值≥Cutoff值×40，故对该样本再进行1∶1000稀释后重复进行操作。故该份血清样本确认为HBsAg阳性。1000倍稀释样本的对照孔RLU值为8979943，检测孔RLU值为24067，抑制率为99.7％，大于50％，故该份血清样本被确认为HBsAg阳性。

实施例6样本试验四：

某份血清样本，用丽珠HBsAg CLIA Kit测得RLU值为1596375，Cutoff值为81037，大于Cutoff值×2，采用一般确认操作程序。试验中，阳性对照对照孔RLU值为3346710，大于Cutoff值×10，检测孔RLU值106781，按公式计算抑制率为96.8％(大于80％)，实验有效；原倍样品的对照孔RLU值为1552307，检测孔RLU值为1520079，抑制率为2.1％；100倍稀释样本的对照孔RLU值为534156，检测孔RLU值为520033，抑制率为2.6％。原倍样本和100倍稀释样本经本中和试剂试验后抑制率均小于50％，且100倍稀释对照孔的RLU值小于Cutoff值×40，故该份血清样本确认为HBsAg阴性。

实施例7样本试验五：

某份血清样本，用丽珠HBsAg CLIAKit测得RLU值为129461，Cutoff值为80366，小于Cutoff值×2，大于Cutoff值×0.7，采用“灰区”操作程序。试验中，阳性对照对照孔RLU值为8637892，大于Cutoff值×20，检测孔RLU值103172，按公式计算抑制率为98.8％(大于80％)，实验有效；样品的对照孔RLU值为536417，超过了Cutoff值×2，检测孔RLU值为23207，抑制率为95.7％，大于50％，故该份血清样本确认为HBsAg阳性。

实施例8样本试验六：

某份血清样本，用丽珠HBsAg CLIA Kit测得RLU值为70348，Cutoff值为81207，小于Cutoff值×2，大于Cutoff值×0.7，采用“灰区”操作程序。试验中，阳性对照对照孔RLU值为7421384，大于Cutoff值×20，检测孔RLU值113307，按公式计算抑制率为98.5％(大于80％)，实验有效；样品的对照孔RLU值为140982，超过了Cutoff值，但未超过Cutoff值×2的“灰区”上限，故该份血清样本为HBsAg可疑阳性。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (16)

1.一种HBsAg呈阳性的确认方法，其特征在于，包括如下步骤：

提供HBsAg化学发光免疫检测的测定结果为有反应性的样本；

向所述样本中加入特异性抗-HBs；

另外向所述样本中加入不含特异性抗-HBs的对照试剂作为对照；

对所述加入特异性抗-HBs的样本及加入对照试剂的样本分别进行HBsAg的化学发光免疫检测；

比较加入特异性抗-HBs的样本及加入对照试剂的样本的RLU，若加入特异性抗-HBs的样本的RLU比加入对照试剂的样本的RLU下降至少30％，提示所述样本为HBsAg阳性。

2.如权利要求1所述的HBsAg呈阳性的确认方法，其特征在于，所述下降至少为50％。

3.如权利要求1或2所述的HBsAg呈阳性的确认方法，其特征在于，还包括在进行化学发光免疫检测前将所述样本用溶剂进行稀释的步骤。

4.如权利要求3所述的HBsAg呈阳性的确认方法，其特征在于，所述稀释的比例为1∶50，1∶100，1∶1000，1∶10000，或在此范围内的任意稀释度。

5.如权利要求1所述的HBsAg呈阳性的确认方法，其特征在于，所述有反应性包括HBsAg化学发光免疫检测结果在“灰区”范围的情况。

6.如权利要求5所述的HBsAg呈阳性的确认方法，其特征在于，所述“灰区”范围的下限为Cutoff值×0.7，“灰区”范围的上限为Cutoff值×2。

7.如权利要求1所述的HBsAg呈阳性的确认方法，其特征在于，还包括选自以下的能够使化学发光免疫检测结果的RLU值提高至高于“灰区”上限的步骤：1)延长所述样本与所述特异性抗-HBs的反应时间至30min-2h；2)提高所述样本与所述特异性抗-HBs的反应温度至35℃-42℃；3)所述样本与所述特异性抗-HBs反应后进行洗涤，然后再加入所述酶标记抗体；4)延长加入所述酶标记抗体后的反应时间至30min-4h；5)提高加入所述酶标记抗体后的反应温度至35℃-42℃；6)加大所述样本的加入量至50-500μl。

8.如权利要求1-7任意一项所述的HBsAg呈阳性的确认方法，其特征在于，所述特异性抗-HBs为来源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、马、兔或羊的抗体。

9.一种HBsAg呈阳性的确认试剂盒，用于对HBsAg化学发光免疫检测结果为有反应性的样本进行阳性确认，包括特异性抗-HBs抗体试剂、HBsAg化学发光免疫检测试剂及说明权利要求1或2所述HBsAg呈阳性的确认方法的操作步骤与检测结果的说明书。

10.如权利要求9所述的HBsAg呈阳性的确认试剂盒，其特征在于，所述加入特异性抗-HBs的样本的RLU比加入对照试剂的样本的RLU下降至少50％，提示所述样本为HBsAg阳性。

11.如权利要求9或10所述的HBsAg呈阳性的确认试剂盒，其特征在于，所述说明书中还包括在进行化学发光免疫检测前将所述样本用溶剂进行稀释的步骤并将稀释后样本进行同样的化学发光免疫检测的说明。

12.如权利要求11所述的HBsAg呈阳性的确认试剂盒，其特征在于，所述稀释的比例为1∶50，1∶100，1∶1000，1∶10000，或在此范围内的任意稀释度。

13.如权利要求9所述的HBsAg呈阳性的确认方法，其特征在于，所述有反应性包括HBsAg化学发光免疫检测结果在“灰区”范围的情况。

14.如权利要求13所述的HBsAg呈阳性的确认试剂盒，其特征在于，所述“灰区”范围的下限为Cutoff值×0.7，“灰区”范围的上限为Cutoff值×2。

15.如权利要求9所述的HBsAg呈阳性的确认试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的说明书中还包括选自以下的能够使化学发光免疫检测结果的RLU值提高至高于“灰区”上限的步骤的说明：1)延长所述样本与所述特异性抗-HBs的反应时间至30min-2h；2)提高所述样本与所述特异性抗-HBs的反应温度至35℃-42℃；3)所述样本与所述特异性抗-HBs反应后进行洗涤，然后再加入所述酶标记抗体；4)延长加入所述酶标记抗体后的反应时间至30min-4h；5)提高加入所述酶标记抗体后的反应温度至35℃-42℃；6)加大所述样本的加入量至50-500μl。

16.如权利要求9-15任意一项所述的HBsAg呈阳性的确认试剂盒，其特征在于，所述特异性抗-HBs为来源于人、小鼠、大鼠、豚鼠、马、兔或羊的抗体。

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