CN101545906A - 乙肝核心抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种乙肝核心抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。根据本发明试剂盒的组分包括：乙肝核心抗体校准品、乙肝核心抗原包被的磁微粒、酶标记物、化学发光底物和浓缩洗涤液。本发明有效的利用了磁微粒固相分离体系和化学发光免疫分析技术来检测乙肝核心抗体，该试剂盒具有检测简便快速、灵敏度高、特异性强、稳定等特点，可以很好的满足临床诊断的需要，适于在产业上有效推广应用。

Description

乙肝核心抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及免疫分析医学领域，具体地，本发明提供了一种乙肝核心抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法。本发明的试剂盒结合了免疫磁微粒技术和化学发光免疫分析技术。

背景技术

乙型肝炎是一种严重的常见的肝脏疾病，在全球影响到数百万人。目前全球人口中，超过20亿人已经在其生命中的某个时期感染过HBV，其中，大约3.5亿仍然为慢性感染者，成为病毒的携带者。全世界四分之三的人口生活在感染的高发区。每年HBV急性临床病例超过4百万。携带者中大约25％，也就是每年100万人死于慢性活动性肝炎、肝硬化或原发性肝癌。

目前已经建立了三个临床上有价值的抗原-抗体系统应用于乙型肝炎：乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)和针对HBsAg的抗体(表面抗体，anti-HBs)；针对乙肝核心抗原(HBcAg)的抗体(Anti-HBc IgM和Anti-HBc IgG)；乙肝e抗原(HBeAg)和针对HBeAg的抗体(Anti-HBe)。上述指标的联合应用可以判断患者是否感染HBV，是否具有免疫力，传染性如何，应用于孕妇，可以有效的保证新生儿免受HBV感染。

乙型肝炎核心抗体(Anti-HBc)是针对乙型肝炎核心抗原(HBcAg)的抗体，不具有保护性，但却是乙型肝炎感染的可靠指标，分为Anti-HBc IgG和Anti-HBc IgM，前者低滴度时作为既往感染的指标，用于乙型肝炎流行病学的调查，高滴度时作为乙型肝炎感染的指标；后者出现于新感染早期，是乙型肝炎早期诊断的指标，同时也是乙型肝炎急性感染和复制活跃的指针。定量测定乙型肝炎核心抗体含量，对于乙型肝炎的临床诊断、治疗效果评价、严格筛选供血血源、阻断乙型肝炎的传播等有一定的参考价值。

目前用于检测乙肝核心抗体的免疫方法主要有酶免疫测定(enzymeimmunoassay，EIA)、放射免疫测定(radioimmunoassay，RIA)、免疫荧光测定(fluoroimmunoassay，FIA)以及化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)。这些超微量检测技术的基本理论大体相同，但是所用示踪剂及所发出的信号各不相同。根据大量的试验结果及临床应用资料，从实用性、稳定性、准确性及发展前景来看，依次为：化学发光免疫分析、荧光免疫分析、放射免疫分析以及酶免疫分析。

放射免疫分析技术因其使用放射性元素作为标记物，因此对环境有一定污染性，并存在操作复杂，测定结果不稳定，试剂保存时间短等缺点。酶免疫分析法灵敏度低，影响因素较多，易造成假阴性和假阳性。化学发光免疫分析法是一种较先进而有效的方法，可使检测灵敏度达到10^-18摩尔水平，而且检测范围可达6个数量级，又因为酶标记物稳定，可长期使用，因而得到了越来越多的关注。

在实际的免疫检测中，由于待测样品中所含的杂质成分较多，一定程度上影响了检测灵敏度和准确性，所以从复杂的背景中快速分离、纯化出目的待测物，是临床检验工作者面临的难题之一。免疫磁微粒技术是利用高分子材料合成一定粒度大小的磁性固相微粒作载体，以物理吸附、化学偶联等方法包被上具有特异性亲合力的各种免疫活性物质(抗原或抗体)，使其致敏为免疫磁微粒，具有分离速度快、效率高、可重复性好；操作简单、不需要昂贵的仪器设备；不影响被分离细胞或其它生物材料的生物学性状和功能等特点，在外加磁场作用下定向运动，使得某些特殊成分得以分离、浓集或纯化。采用微小的磁微粒作为固相可增加包被表面积，从而增加抗原或抗体的吸附量，既加快了反应速度，也使清洗和分离更简便。

作为用于化学发光免疫分析检测技术的一种通用固相分离方法，磁微粒可大大提高有效包被量从而节省原料，同时可拓宽检测的线性范围，从而有效避免弯钩效应的发生。将免疫磁微粒技术与化学发光免疫分析技术结合检测待测物，可大大提高检测的灵敏度和准确性，它以微米级磁微粒为载体，利用表面有机物提供的羧基活性基团与蛋白质氨基共价结合，采用抗体进行“搭桥”成免疫磁微粒，可进行抗原、抗体反应。该技术的新颖之处有：(1)利用顺磁铁微粒为固相载体，外包被抗原，增加抗原、抗体的接触面积及底物发光面积，提高反应的灵敏度，并采用旋转磁场使磁微粒起搅拌作用及分离结合抗原-抗体与游离抗体的作用；(2)在液相反应中，使用发光增强剂，将水分子从发光底物的发光位点排开，同时还可缩短发光的达峰时间。

化学发光免疫分析结合免疫磁微粒固相分离体系是一种检测乙肝核心抗体的先进而有效的方法，有助于促进化学发光免疫分析技术在临床检验、检测中的应用与发展。

发明内容

本发明对上述问题进行了分析研究，利用免疫磁微粒技术与化学发光免疫分析技术相结合的方法来检测乙肝核心抗体，提供了一种能够简便、快速、灵敏、稳定地检测乙肝核心抗体的测定试剂盒，该试剂盒适于在产业上有效地推广应用。

本发明的目的是提供一种免疫磁微粒技术结合化学发光免疫分析测定乙肝核心抗体的磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒。

根据本发明的试剂盒包括：乙肝核心抗体校准品；乙肝核心抗原包被磁微粒；辣根过氧化物酶标记的乙肝核心抗体单克隆抗体；化学发光底物和浓缩洗涤液。

根据本发明的试剂盒，其中，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，

A液是0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-碘苯硼酸；

B液是0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液，包括3.5mM过氧化脲、0.1％Tween20。

根据本发明的试剂盒，其中，所述浓缩洗涤液为含吐温20的磷酸盐缓冲液。

本发明的再一目的是提供一种制备上述试剂盒的方法。

根据本发明制备上述试剂盒的方法包括以下步骤：

1)以乙肝核心抗体阳性人血清配制校准品；

2)用乙肝核心抗原包被磁微粒；

3)用辣根过氧化物酶标记乙肝核心抗体单克隆抗体；

4)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物；

5)配制浓缩洗涤液；

6)分装上述校准品、磁微粒、酶标记物、化学发光底物和浓缩洗涤液；以及

7)组装为成品。

根据本发明的方法，所述磁微粒为2～3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有活性基团如氨基(NH₂-)、羧基(-COOH)的聚合物，其使用浓度为4～8mg/mL；

所述抗原包被磁微粒是通过戊二醛两步法将乙肝核心抗原包被于磁微粒上；

以封闭液封闭包被的磁微粒，所述封闭液为含有0.2％～1.0％牛血清白蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸缓冲液；

根据本发明的方法，在所述以辣根过氧化物酶标记乙肝核心抗体单克隆抗体的步骤3)中，采用过碘酸钠法。

根据本发明的方法，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，

A液是0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM 4-碘苯硼酸；

B液是0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液，包括3.5mM过氧化脲、0.1％Tween20。

根据本发明的方法，所述浓缩洗涤液为含吐温20的磷酸盐缓冲液。

具体的上述试剂盒可以包括校准品、抗原包被的磁微粒、酶标记物、化学发光底物与浓缩洗涤液。其中，所述校准品的原料为乙肝核心抗体阳性人血清；磁微粒上包被的为乙肝核心抗原；标记乙肝核心抗体单克隆抗体的酶为辣根过氧化物酶；化学发光底物为鲁米诺体系；浓缩洗涤液为20倍PBST洗液。

本发明“乙肝核心抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒”可以非常有效地检测出患者体内的乙肝核心抗体的含量，可以根据乙肝核心抗体含量的多少判断治疗效果及其病情的变化。本发明的试剂盒(化学发光法与免疫磁微粒结合)具有简便、快速、灵敏、稳定等优点，且各项指标均达到同类试剂盒的分析法水平。并且，根据本发明的检测系统为开放式操作，简便快速，不需要昂贵的全自动化学发光测量仪，特别适合广大的中小医院推广使用，为临床诊断和科研工作提供一种非常有价值的检测手段。

根据本发明的试剂盒，待测样品中的乙肝核心抗体与辣根过氧化物酶标记的乙肝核心抗体单抗竞争与乙肝核心抗原包被的磁微粒结合，形成“抗原抗体”复合结构，之后与化学发光底物作用产生光信号，在管式发光仪中对乙肝核心抗体进行高灵敏、高特异检测。本发明采用“竞争一步法”反应模式，有效地利用了化学发光技术结合磁微粒技术原理，定量检测人体血清、血浆样品中乙肝核心抗体含量，确保了检测的灵敏度。使用的磁微粒具有超顺磁、高分散、表面积大的特点。对样品的前处理要求低，样品前处理过程简单可靠，可快速、高通量检测大批样品，便于操作和生产。本发明的试剂盒结构简单，使用方便，价格便宜，携带便利，与市场上的酶联免疫试剂盒、线性范围宽，适用于大批量检测样品。

附图说明

图1为实施例1所制备的试剂盒中的校准品线性图(双对数标准曲线)。

具体实施方式

实施例1 制备本发明的乙肝核心抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒

一、乙肝核心抗体校准品的制备

用小牛血清将乙肝核心抗体高值阳性血清稀释成校准品，浓度分别为0NCN/mL、0.4NCN/mL、0.8NCN/mL、2NCN/mL、4NCN/mL、12NCN/mL，共6瓶。

二、乙肝核心抗原包被磁微粒的制备

将粒径为2～3μm的磁微粒用戊二醛进行活化，室温搅拌，混匀3小时后，加磁场，静置20～25min，倒出上清，用pH值为7.4的0.01mol/L磷酸盐缓冲液清洗三次，并用该溶液进行悬浮，浓度为40～80mg/mL；每毫升悬浮液中加入乙肝核心原40～100μg，在4℃下搅拌过夜后，加磁场，静置10～15min，倒出上清，用含有0.2％～1.0％牛血清白蛋白、0.02mol/L的磷酸缓冲液(pH为7.2)于室温封闭3～4小时；最后用pH值为7.4、含吐温-20和Proclin-300的磷酸盐洗涤缓冲液清洗3～5次，并用该溶液配制成4～8mg/mL的工作液。磁微粒在4℃保存。

三、辣根过氧化物酶标记的乙肝核心抗体单克隆抗体的制备

乙肝核心抗体单克隆抗体用过碘酸钠法与辣根过氧化物酶偶联，经PBS缓冲液充分透析后，加等体积甘油，-20℃以下保存备用。酶稀释液由12.12g的Tris和5‰的牛血清白蛋白组成，含1‰proclin-300；经方阵法确定辣根过氧化物酶标记乙肝核心抗体单克隆抗体的工作浓度为1:1000～5000。

四、化学发光底物

本发明所使用的辣根过氧化物酶(HRP)的化学发光底物液的配制方法：

A液是0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，包括10mM鲁米诺、0.3mM4-羟基联苯、0.05mM4-碘苯硼酸；

B液是0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液，包括3.5mM过氧化脲、0.1％Tween20。

使用方法：使用前A液与B液根据使用量等体积混合。

五、浓缩洗涤液

浓缩洗涤液是含有58g Na₂HPO₄·12H₂O，2g NaH₂PO₄·2H₂O，0.1％吐温-20，0.1％Proclin-300防腐剂的磷酸盐缓冲液(PBST)，pH值为7.4，使用时用蒸馏水稀释20倍。

六、半成品及成品组成

上述步骤所得产品分装即为半成品。抽出三份经过准确性、灵敏度、精密性及稳定性检定合格才能组装成乙肝核心抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒，组装成试剂盒后还需抽检合格后才能出厂。

实施例2 本发明的试剂盒的使用方法

一、样品前处理

取人的空腹晨血清样品，3000rpm离心5min，取上层液50μL进行分析。

二、检测方法

使用本试剂盒进行实验前，需先取出抗原包被的磁微粒、校准品/待测样品、酶标记的乙肝核心抗体单克隆抗体，在室温放置15～30分钟；之后，将恒温温箱或者水浴锅调至37℃；再后，准备好合适的微量加样器及对应吸头并且检查化学发光仪是否正常工作以及配制工作洗涤液。

使用本试剂盒按照实施例2的方法进行实验的具体操作步骤如下：

将圆底聚苯乙烯试管编号后，向试管中加入50μL血清样品或系列校准品溶液，校准品每管加0NCU/mL、0.4NCU/mL、0.8NCU/mL、2NCU/mL、4NCU/mL、12NCU/mL各50μL，再加入抗原包被的磁微粒与酶标记的乙肝核心抗体单克隆抗体各50μL，37℃振荡反应60min。之后，将试管架置于磁分离器上分离5min，然后倒转分离器倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体。每管加入洗涤液500μL，充分混匀，置于磁分离器上分离5min，倒出上清液，将倒转的试管放在滤纸上吸干，拍击分离器以除去挂壁液体，重复3次。各管加入化学发光底物200～400μL，充分混匀，置于磁分离器内，待磁微粒富集于底部后，暗处放置10min，而后在管式化学发光测量仪上依序测量各管的发光强度(RLU)。以校准品浓度的Log值为横坐标，RLU的Log值为纵坐标绘出标准曲线(双对数曲线)，以各待测血清RLU值在标准曲线上查出该血清的乙肝核心抗体的浓度，见附图1，其中，Y为发光强度，X为乙肝核心抗体浓度(单位为NCU/mL)，相关系数r＝-0.9999，Logit(Y)＝-3.8730Log(X)-0.6144。

实施例3 本发明的试剂盒的方法学检定

按照本领域中常规的制造及检定规程对实施例1中制备的试剂盒进行检定，结果如下：

1、试剂盒准确度测定

按照实施例1的试剂盒检测国家标准参考品血清，考察阴性及阳性参考品的符合率，根据国家标准，要求15份阴性参考品阴性率不小于15/15，15份阳性参考品阳性率不低于14/15。结果如表1所示，表明实施例1的试剂盒阴阳性参考品的符合率达到国家标准。

表1 实施例1的试剂盒检测国家参考品血清结果

2、试剂盒灵敏度测定

使用国家参考品中的3份系列稀释的灵敏度参考品血清，考察试剂盒的灵敏度。根据国家标准，要求3份系列稀释血清阳性率应均大于2份。结果如表2所示，表明实施例1的试剂盒的灵敏度达到国家标准。

表2实施例1的试剂盒的灵敏度

3、试剂盒精密性测定

用国家参考品中的精密度血清，考察试剂盒的精密性。按照实施例2的方法重复至少10孔进行检测，检测三次，分别计算变异系数。结果如表3所示，表明所制备的乙肝核心抗体化学发光免疫分析测定试剂盒的分析内变异系数小于10％。

表3实施例1的试剂盒的精密性

 

实验次数	分析内变异(CV)
		1	4.2％
2	6.1％
		3	5.3％
平均值	5.2％

4、试剂盒稳定性实验

将实施例1的试剂盒于37℃放置3天、6天、10天后，检测国家参考品血清，结果表明各项指标均可以达到国家标准。

以上说明“乙肝核心抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒”的灵敏度、精密度、准确性、特异性和稳定性是完全符合临床要求的。

实施例4 本发明的试剂盒与酶联免疫试剂盒临床血样测值比对

用本发明的试剂盒和市售乙肝核心抗体酶联免疫试剂盒对1080例临床血清样品同时进行检测，结果总符合率为99.3％。检测结果如下：

表4 本发明试剂盒与酶联免疫试剂盒临床血样测值比对结果

另将检测结果不符的7例血样，用新创公司的乙肝核心抗体ELISA试剂盒和Abbott乙肝核心抗体酶联试剂进行了复核，结果本发明试剂盒这7份血样的检测结果与新创、Abbott完全相符，为阴性。

综上，利用本发明的试剂盒进行检测，灵敏度高，特异性强，操作简单，无放射性污染，试剂盒成本低，临床适用性强，更适用于我国临床检测及筛查实验室，可有效地诊断乙型肝炎核心抗体含量，对于乙型肝炎的临床诊断、治疗效果评价、严格筛选供血血源、阻断乙型肝炎的传播等有一定的参考价值。

Claims (8)

1、乙肝核心抗体磁微粒化学发光免疫分析测定试剂盒，其特征在于，所述试剂盒是由乙肝核心抗体校准品、乙肝核心抗原包被的磁微粒、辣根过氧化物酶标记的乙肝核心抗体单克隆抗体、辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物、浓缩洗涤液所组成。

2、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，

A液是0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，包括10mM鲁米诺、0.3mM 4-羟基联苯、0.05mM 4-碘苯硼酸；

B液是0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液，包括3.5mM过氧化脲、0.1％ Tween20。

3、如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含吐温20的磷酸盐缓冲液。

4、一种制备权利要求1所述试剂盒的方法，其特征在于包括以下步骤：

1)以乙肝核心抗体阳性人血清配制校准品；

2)用乙肝核心抗原包被磁微粒；

3)用辣根过氧化物酶标记乙肝核心抗体单克隆抗体；

4)配制辣根过氧化物酶所作用的化学发光底物；

5)配制浓缩洗涤液；

6)分装上述校准品、磁微粒、酶标记物、化学发光底物和浓缩洗涤液；以及

7)组装为成品。

5、如权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述用乙肝核心抗原包被磁微粒的步骤2)中：

所述磁微粒为2～3μm粒径、四氧化三铁内核、表面包裹带有活性基团的聚合物，其使用浓度为4～8mg/mL；

所述抗原包被磁微粒是通过戊二醛两步法将乙肝核心抗原包被于磁微粒上；

以封闭液封闭包被的磁微粒，所述封闭液为含有0.2％～1.0％牛血清白蛋白、pH值为7.2的0.02mol/L磷酸缓冲液。

6、如权利要求4所述的方法，其特征在于，在所述用辣根过氧化物酶标记乙肝核心抗体单克隆抗体的步骤3)中，采用的是过碘酸钠法。

7、如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述化学发光底物包含A液和B液，其中，

A液是0.2M pH8.7硼酸-硼砂缓冲液，包括10mM鲁米诺、0.3mM 4-羟基联苯、0.05mM 4-碘苯硼酸；

B液是0.2M pH7.2磷酸盐缓冲液，包括3.5mM过氧化脲、0.1％ Tween20。

8、如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述浓缩洗涤液为含吐温20的磷酸盐缓冲液。

Images